Deteccin rpida de bacterias oxidantes de

amonaco en las aguas residuales

Cuijuan Zhao, Wenjun Song, Jiping Wei, and Bozhi Li

Resumen La oxidacin de amoniaco a nitrito es un paso clave en el proceso de

eliminacin biolgica de nitrgeno en los sistemas biolgicos de tratamiento de
agua residuales. Con el fin de reducir la concentracin de NH 4+-N en las aguas
residuales. Un mtodo nuevo y rpido para la deteccin de AOB de las aguas
residuales se describe en este estudio, AOB fueron aisladas da la planta de
tratamiento de aguas residuales del hospital Haihe y Jizhuangzi. Gracias a la
utilizando de 96 pocillos de placas de ELISA y el instrumento de medicin nzymelabelling, la velocidad de deteccin fue rpida y el tiempo de deteccin fue cort.
Como resultado, 7 bacterias eficientes fueron identificadas, cuya
tasa de
eliminacin de nitrgeno amoniacal fue de 70% a 80 %. Estos resultados podran
proporcionar informacin til y valiosa sobre el proceso de nitrificacin, que
desempea un papel importante en los sistemas de tratamiento biolgico de aguas
residuales.
Palabras Clave -- agua residual, bacterias de oxidacin amoniacal, deteccin
rpida, identificacin

AbstractThe ammonia oxidizing to nitrite is a key step in biological nitrogen

removal process in biological waster water treatment systems. In order to reduce
the concentration of NH4+-N in the sewage. An novel and rapid method for
screening of AOB from the sewage is described in this study, AOB were isolated
from Haihe hospital and Jizhuangzi sewage treatment plant. Due to the using of 96well ELISA plate and nzyme-labelling measuring instrument, the speed of screen
was fasted and the time of screen was to be shorten. As a result, 7 efficient
bacteria were screened, which ammonia nitrogen removal rate was from 70% to
80%. These results might provide useful and valuable information about the
nitritation process, which plays an important role in biological wastewater treatment
systems.
Index TermsSewage, ammonia oxidizing bacteria, rapid screening, identification.

I. INTRODUCCIN
El aumento de la poblacin, el progreso agrcola y la urbanizacin han dado lugar a
una mayor carga de nitrgeno a los ros a travs de los desechos acuosos de varias
industrias, la agricultura, el hospital y los desechos domsticos [1] , [2] . El
nitrgeno en las aguas residuales suele estar presente como nitrgeno orgnico o
iones como el NH4 +, NO2- y NO3- .
La descarga de efluentes que contienen altas concentraciones de nitrgeno es
indeseable porque causa una excesiva demanda de oxgeno, provoca la
eutrofizacin, daa el ecosistema, debilita la vitalidad del cuerpo de agua , priva a
las aplicaciones de uso del agua [3] y aumenta la formacin de nitrosaminas que
son cancergenas [4] , [5] .
La eliminacin biolgica de nitrgeno es una parte importante de los procesos de
tratamiento de aguas residuales debido al impacto significativo de los compuestos

de nitrgeno en el medio acutico y en la planta de tratamiento de aguas residuales

[6], [7]. La nitrificacin-desnitrificacin biolgica es el proceso ms utilizado para la
eliminacin de nitrgeno en las aguas residuales [8]. Los estudios han demostrado
que la composicin y la diversidad de las comunidades microbianas es importante
en la transformacin del nitrgeno y la eliminacin [9], [10]. El proceso de
nitrificacin-desnitrificacin es un proceso microbiano que consta de dos fases [11].
El primero, conocido como nitrificacin , es un proceso aerbico realizado por
bacterias Gram negativas , en el que de amonio es oxidado a nitrito (NO2 -) Por
medio de Bacterias Oxidantes de Amonaco (AOB).
Las bacterias oxidantes de amonaco (AOB) desempean un papel importante en la
conversin de nitrgeno en los residuos biolgicos en sistemas de tratamiento de
agua. Las AOB producen productos microbianos solubles y xidos nitrosos,
respectivamente, posteriormente nitrito se oxida a nitrato (NO3-)
Utilizando Bacterias Oxidantes de Nitrito (NOB). La AOB y NOB usan CO 2 o carbono
inorgnico como fuente de carbono para la sntesis celular [12] y el amonaco o
nitrito como fuente de energa [13].
La segunda fase es la desnitrificacin, microbiana un proceso anxico por el cual se
reducen los nitratos a nitrgeno molecular proceso secuencial. Estos nitratos se
convierten primero a nitritos (NO2-), A continuacin, al xido ntrico (NO) [14], [15],
despus de eso al xido nitroso (N2O) y finalmente a nitrgeno molecular (N2), que
se libera a la atmsfera.
En los ltimos aos, algunos de los nuevos procesos [16] - [18]. Tal como la
remocin alta de amoniaco sobre nitritos (SHARON) y oxidacin anaerobia de
amonio (ANAMMOX), han sido investigado ampliamente [19] - [23], adems,
Nitrosomonas eutropha ya fue considerada por tener la capacidad para nitrificacin
y desnitrificacin simultnea [24], [25].
Los objetivos de este estudio fueron investigar un nuevo y rpido mtodo para la
deteccin de AOB de las aguas residuales, pudiendo aumentar bacterias eficaces
que puedan remover nitrgeno amoniacal de las aguas residuales, a fin de
contribuir a la curacin de la contaminacin grave de amonaco.
II. Materiales y mtodos
A. Materiales e Instrumentos
La muestra fue tomada del tanque de aireacin del Hospital Tianjin Haihe y el
tanque de aireacin de la planta de tratamiento de aguas residuales de Tianjin
Jizhuangzi, la muestra en este experimento es como el material experimental, las
cepas experimentadas del hospital Haihe sern nombradas comenzando con H, a
su vez, con nmeros arbigos del 1 al 100, las cepas cribadas de la planta de
tratamiento de aguas residuales Jizhuangzi sern nombradas comenzando con J
secuencialmente con nmeros arbigos 1 al 100 (que puede ser nombrado en un
orden aleatorio, ningn significado especial). Greiner Microlon 96 pocillos de la
placa ELISA (Alemania), 96 pocillos placa de cultivo de pozo profundo, lluvia de
fuego de fusil, SPECTRmax PLUS instrumento de medicin etiquetado enzima (la
compaa de dispositivos moleculares de EE.UU.).
B. Diagrama de Flujo Experimental
1. La separacin de las bacterias oxidantes de amonaco

El sustrato usado para el medio de aislamiento slido contena (por litro):

(NH4)2SO4, 472 g; KH2PO4, 7.25 g; Na2HPO4, 11.32 g; glucosa, 12 g; MgSO4, 200 g;
CaCl2, 20 g; NaHCO3, 85 g; elementos traza A (FeSO 4 5 g, EDTA 5 g); elementos
traza B (EDTA 15 g, ZnSO47H2O 4.3 g, CoCl6H2O 2.4 g, MnCl2 6.29 g, CuSO45H2O 2.5 g,
Na2MoO42H2O 2.2 g, NiCl26H2O 1.9 g, H3BO3 0.14 g); Agar, 17 g.

El pH del medio de aislamiento se ajust a aproximadamente 8,0 por 5% Na 2CO3 y HCl. Los medios de
aislamiento se cargaron al matraz de 500 ml, se empaquetaron, esterilizndose a 115 C por 25 min.
Muestras de aguas residuales se diluyeron a diluciones de 10 -4, 10-5,10-6 3 veces, 80 l de muestra diluida
se aislaron a 30C por 48h. Las placas de revestimiento recuento de colonias por separado en el 30-300
fueron seleccionados, que se acerc a medio de aislamiento slido las estrellas puros hasta que una sola
colonia, una sola colonia fue marcado en la placa plana y marc un total de 86 colonias individuales.

Resultados y discusin
A. El cribado de cepas
86 cepas fueron separadas por medio de aislamiento, estas 86 cepas se
cultivaron en 96 pocillos de placa de cultivo de pozo profundo, la
concentracin de nitrito se determin con el reactivo de Griess por el
mtodo colorimtrico, se muestra el cambio de color (Fig. 2).

Fig. 2. El resultado de la deteccin.

La concentracin de nitrito aument o por encima de 0,2 mg / L, cuando la actividad
de nitrificacin fue mucho mayor que los dems, luego las 48 cepas fueron
seleccionadas por este mtodo rpido, fueron enumerados como H-3, H-4, H-7, H10, H-11, H-12, H-17, H-20, H-22, H-25, H-27, H-28, H-29, H-30, H-33, H-34, H-37, H38, H-44, H-47, H-48, H-49, H-51, H-52, H-55, H-57, J-1, J-3, J-4, J-9, J-13, J-14, J-16, J19, J-20, J-22, J-25, J-26, J-28, J-33, J-34, J-37, J-38, J-41, J-42, J-47, J-48 y J-49
respectivamente, de su concentracin de nitrito se muestra (Tabla 1).
B. La re deteccin de cepas

Las 48 cepas que eran de la primera proyeccin se re detectaron, se inocularon con

la nueva deteccin de medio, que contena 98 mg /L de NH4 +-N, concentraciones
de NH4+- N , NO2-N y NO3-N se midieron, se muestran los valores numricos
concretos (Tabla 2), a continuacin, se calcula la remocin de nitrgeno del
amonaco, se seleccionaron 7 bacterias eficientes, del H-17, H-30, H-37, J-1, J-13, J41 y J-49, su tasa de eliminacin de nitrgeno amoniacal fueron 70,41%, 73,47%,
82,65%, 84,69%, 70,41%, 80,61% y 84,69% respectivamente. Estas bacterias
eficientes proporcionarn til e informacin valiosa sobre el proceso nitrificacin,
que desempea un papel importante en los sistemas de tratamiento de aguas
residuales biolgicas.

TABLA I: Concentracin de Nitratos

NO2--N
CEPAS
H-3
H-4
H-7
H-10
H-11
H-12
H-17
H-20
H-22
H-25
H-27
H-28
H-29
H-30
H-33
H-34
H-37
H-38
H-44
H-47
H-48
H-49
H-51
H-52
H-55
H-57

(mg/L)
0.225
0.241
0.263
0.218
0.264
0.229
0.283
0.216
0.209
0.271
0.228
0.269
0.237
0.286
0.253
0.282
0.293
0.249
0.217
0.238
0.246
0.263
0.254
0.247
0.228
0.265

NO2--N
CEPAS
J-1
J-3
J-4
J-9
J-13
J-14
J-16
J-19
J-20
J-22
J-25
J-26
J-28
J-33
J-34
J-37
J-38
J-41
J-42
J-47
J-48
J-49

(mg/L)
0.294
0.236
0.241
0.237
0.283
0.219
0.267
0.281
0.239
0.208
0.227
0.264
0.273
0.251
0.218
0.267
0.236
0.291
0.213
0.254
0.269
0.294

TABLA II: Nitrgeno Amoniacal removido de las cepas

CEPAS

NH4+-N NO2--N
(mg/L) (mg/L)

NO3- -N
(mg/L)

NH4+-N
eficiencia
de
remocin
(%)

H-7
H-11
H-17
H-25
H-28
H-30
H-33
H-34
H-37
H-49
H-51
H-57
J-1
J-13
J-16
J-19
J-26
J-28
J-33
J-37
J-41
J-47
J-48
J-49

47
45
29
39
41
26
50
31
17
47
49
44
15
29
42
33
45
38
52
42
19
49
41
15

0.263
0.264
0.283
0.271
0.269
0.286
0.253
0.282
0.293
0.263
0.254
0.265
0.294
0.283
0.267
0.281
0.264
0.273
0.251
0.267
0.291
0.254
0.269
0.294

0.412
0.397
0.376
0.381
0.377
0.398
0.357
0.369
0.403
0.395
0.375
0.357
0.390
0.409
0.388
0.382
0.361
0.398
0.375
0.384
0.416
0.425
0.393
0.371

52.04
54.08
70.41
60.20
58.16
73.47
48.98
68.38
82.65
52.04
50.00
55.10
84.69
70.41
57.14
66.33
54.08
61.22
46.94
57.14
80.61
50.00
58.16
84.69

C. La identificacin de bacterias eficientes

7 eficientes bacterias se identifican por aislamiento de ADN, amplificacin, anlisis
de secuenciacin, el electroferograma de 7 bacterias eficientes se muestra (Fig. 3).
Despus de la secuenciacin de anlisis, como resultado en H-17, H-30, H-37, J-1, J13, J-41 y J-49 fue Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Nitrosomonas
eutropha, Nitrosospira sp, Micrococcus sp, Bacillus sp, Providencia rettgeri.

Fig.3 electroferograma de las eficientes

CONCLUSIN
En este trabajo se establecen un mtodo rpido y eficaz para la deteccin de AOB
de las aguas residuales, este nuevo mtodo puede ser utilizado para la planta de
tratamiento de aguas residuales a gran escala, por otra parte se puede obtener una
tasa razonablemente alto de xito en el aislamiento de AOB.
El propsito de este estudio es de esperar que con la proyeccin de AOB y la
investigacin gentica, se pueda obtener bacterias eficientes que puedan remover
nitrgeno amoniacal de las aguas residuales, de manera que se contribuya a la
descontaminacin de amonaco grave.
AGRADECIMIENTOS
Los autores desean agradecer el gran proyecto cientfico y tecnolgico de Tianjin
Binhai New Area (N 2011-BK120042) y el Laboratorio Clave Tianjin de Biotecnologa
Alimentaria, Universidad de Comercio de Tianjin, Tianjin, China por el apoyo parcial
de este estudio.

[1] W. A. Battaglin, C. Kendall, C. C. Y. Chang, S. R. Silva, and D. H. Campbell,

Chemical and isotopic
evidence of nitrogen transformation in the Mississppi
River, Hydrol Processes, vol. 15, pp. 1285-300, 2001.
[2] C. A. Klocker, S. S. Kaushal, P. M. Groffman, P. M. Mayer, and R. P. Morgan,
Nitrogen uptake and denitrification in restored and unrestored streams in urban
Maryland, USA. Aquat Sci, vol. 71, pp.411-24, 2009.

[3] D. N. Miller and R. L. Smith, Microbial characterization of nitrification in a

shallow, nitrogen-contaminated aquifer, Cape Cod, Massachusetts and detection of
a novel cluster associated with nitrifying Betaproteobacteria, J Contam Hydrol, vol.
103, pp. 182-93, 2009.
[4] A. Dapena, J. L. Campos, A. Mosquera, and R. Mendez, Anammox process for
nitrogen removal from anaerobically digested fish canning effluents, Water Sci.
Technol, vol. 53, pp. 265-74, 2006.
[5] A. Dapena, J. L. Campos, A. Mosquera, M. Jetten, and R. Mendez, Stability of the
AMAMMOX process in a gas-lift reactor and a SBR,J. Biotechnol, vol. 110, pp. 159170, 2004.
[6] B. J. Ni and H. Q. Yu, An approach for modeling two-step denitrification in
activated sludge systems, Chem. Eng. Sci, vol. 63, pp.1449-1459, 2008.
[7] Y. H. Ahn, Sustainable nitrogen elimination biotechnologies: A review, Process.
Biochem, vol. 41, pp.1709-1721, 2006.
[8] N. Bernet, N. Delgenes, C. Akunna, J. P. Delgenes, and R. Moletta, Combined
anaerobic-aerobic SBR for the treatment of piggery wastewater, Water Res, vol. 34,
pp.611-619, 2000.
[9] J. Kjellin, S. Hallin, and A. Wrman, Spatial variations in denitrification activity in
wetland sediments explained by hydrology and denitrifying community structure,
Water Res, vol. 41, pp. 4710-20, 2007.
[10] A. Iribar, J. M. S. Prez, E. Lyautey, and F. Garabtian, Differentiated free-living
and sediment-attached bacterial community structure inside and outside
denitrification hotspots in the river-groundwater interface, Hydrobiologia, vol. 598,
pp. 109-21, 2008.
[11] S. Wyffels, P. Boeckx, K. Pynaert, D. Zhang, O. V. Cleemput, G. Chen, and W.
Verstraete, Nitrogen removal from sludge reject water by a two-stage oxygenlimited autotrophic nitrification denitrification
process, Water Science and
Technology, vol. 49, pp. 57-64, 2004.
[12] M. Gerardi, Nitrification and Denitrification in the Activated Sludge Process,
1sted. Enviromental Protection, New York, 2002.
[13] L. Jennifer, A. Faulwetter, V. Gagnonb, C. Sundbergc, F. Chazarencd, M. Burra,
J.Brissonb, A. Campera, and O. Steina, Microbial processes
influencing
performance of treatment wetlands: a review, Ecol. Eng, vol. 35, pp. 987-1004,
2009.
[14] J. Foley, D. Dehaas, Z. G. Yuan, and P. Lant, Nitrous oxides generation in fullscale biological nutrient removal wastewater treatment plants, Water Res, vol. 44,
pp. 831-844, 2010.
[15] S. W. Kim, M. Miyahara, S. Fushinobu, T. Wakagi, and H. Shoun, Nitrousoxides
emission from nitrifying activated sludge dependent on denitrification by ammoniaoxidizing bacteria, Bioresour. Technol, vol. 101, pp. 3958-3963, 2010.
[16] I. Schmidt, O. Sliekers, M. Schmid, E. Bock, J. Fuerst, J. G. Kuenen, M. S. M.
Jetten, and M. Strous, New concepts of microbial treatment processes for

thenitrogen removal in wastewater, FEMS Microbiology Reviews, vol. 27, pp. 481492, 2003.
[17] A. A. Khardenavis, A. Kapley, and H. J. Purohit, Simultaneous nitrification and
denitrification by diverse Diaphorobacter sp, Applied
Microbiology and
Biotechnology, vol. 77, pp. 403-409, 2007.
[18] J. K. Kim, K. J. Park, K. S. Cho, S. W. Nam, T. J. Park, and R. Bajpai, Aerobic
nitrificationdenitrification by heterotrophic Bacillus strains,
Bioresource
Technology, vol. 96, pp. 1897-1906, 2005.
[19] I. Schmidt, E. Bock, and M. S. M. Jetten, Ammonia oxidation by Nitrosomonas
eutropha with NO2 as oxidant is not inhibited byacetylene, Microbiology, vol. 147,
pp. 2247-2253, 2001.
[20] M. S. M. Jetten, New pathways for ammonia conversion in soil and aquatic
systems, Plant Soil, vol. 230, pp. 9-19, 2001.
[21] I. Schmidt, O. Sliekers, M. Schmid, E. Bock, J. Fuerst, J. G. Kuenen, M. S. M.
Jetten, and M. Strous, New concepts of microbial treatment processes for the
nitrogen removal in wastewater, FEMS Microbiol. Rev, vol. 27, pp. 481-492, 2003.
[22] Y. H. Ahn, Sustainable nitrogen elimination biotechnologies: A review,
Process. Biochem, vol. 41, pp. 1709-1721, 2006.
[23] W. R. L. V. D. Star, W. R. Abma, D. Blommers, J. W. Mulder, T. Tokutomi, M.
Strous, C. Picioreanu, and M. C. M. V. Loosdrecht, Startup of reactors for anoxic
ammonium oxidation: experiences from the first full-scale anammox reactor in
Rotterdam, Water Res, vol. 41,pp. 4149-4163, 2007.
[24] I. Schmidt, O. Sliekers, M. Schmid, E. Bock, J. Fuerst, J. G. Kuenen, M. S. M.
Jetten, and M. Strous, New concepts of microbial treatment processes for the
nitrogen removal in wastewater, FEMS Microbiology Reviews, vol. 27, pp. 481-492,
2003.
[25] S. J. You, C. L. Hsu, S. H. Chuang, and C. F. Ouyang, Nitrification efficiency and
nitrifying bacteria abundance in combined AS-biofilm and A2O systems, Water
Research, vol. 37, pp. 2281-2290, 2003.
[26] S. H. Yuen and A. G. Pollard, Determination of nitrogen in agricultural materials
by the nessler reagent. II.-Micro-determinations in Plant Tissue and in Soil Extracts,
J. Sci. Fd Agric, vol. 5, pp. 364-369, 1954.
[27] D. Giustarini, R. Rossi, A. Milzani, and I. D.Donne, Nitrite and Nitrate
Measurement by Griess Reagent in Human Plasma: Evaluation of Interferences and
Standardization, Methods in Enzymology, vol. 440, pp. 361-380, 2008.

[28] F. A. J. Armstrong and A. Chem, Determination of nitrate in water ultraviolet

spectrophotometry, Analytical Chemistry, vol. 35, pp.1292-1294, 1963.