UNIVERSIDADE FEDERAL DO RECNCAVO DA BAHIA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM MICROBIOLOGIA

AGRCOLA

CARLOS RAIMUNDO DOS SANTOS SOUZA

Isolamento de microrganismos: tcnica de diluio seriada

Cruz das Almas - BA

2015

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RECNCAVO DA BAHIA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM MICROBIOLOGIA
AGRCOLA

CARLOS RAIMUNDO DOS SANTOS SOUZA

Isolamento de microrganismos: tcnica de diluio seriada

Relatrio solicitado pela professora Ana

Cristina F. Soares, ministrante da aula sobre
contagem de microrganismos, na disciplina
Tcnicas Laboratoriais em Microbiologia, como
requisito parcial de avaliao.

Cruz das Almas - BA

2015

Sumrio

1.

INTRODUO ..................................................................................................... 4

2.

OBJETIVOS .......................................................................................................... 5

2.1 Objetivo geral........................................................................................................ 5

2.2 Objetivos especficos ............................................................................................. 5
3.

MATERIAIS E MTODOS .................................................................................. 5

4.

RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................................ 6

5.

CONSIDERAES FINAIS ................................................................................. 8

6.

REFERNCIAS .................................................................................................... 9

1. INTRODUO

Os microrganismos so, em sua totalidade e individualidade, impossveis de

serem vistos a olho nu. Entretanto, esta caracterstica pode ser alterada quando estes
microrganismos crescem em populaes com inmeros indivduos, constituindo as
colnias, e tornando-se perfeitamente observveis.
Corriqueiramente

associamos

estes

diminutos

organismos

apenas

enfermidades mais graves, s mais desconfortveis contaminaes. Apesar disso,

diversos microrganismos atuam de forma fundamental na manuteno dos ecossistemas
e na ciclagem de vrios elementos qumicos essenciais para a vida no nosso planeta.
Estes microrganismos constituem a base da cadeia alimentar tanto nos ecossistemas
marinhos quanto em lagos e rios. Alguns micrbios desempenham papel indispensvel
nos processos fotossintticos, contribuindo para a gerao e transferncia de energia
atravs das cadeias alimentares e produo de oxignio, fundamental para a vida na
Terra. Alm disso, diversas espcies mantm ntima relao benfica com os humanos,
pois so auxiliares na digesto (TORTORA, FUNKE & CASE, 2012, p. 2).
Segundo o National Institute of Allergy and Infectious Diseases (2009, p. 3) de
Atlanta:
estes organismos microscpicos so encontrados em plantas e
animais, assim como no corpo humano. Alguns micrbios causam
doenas em humanos, plantas, e animais. Outros so essenciais para a
qualidade de vida, e ns no existiramos sem eles.

Os microrganismos podem ser encontrados na natureza em conjuntos de

populaes mais ou menos complexas. Para o estudo de suas particularidades, tornamse aplicveis tcnicas de isolamento em culturas puras. A aplicao de culturas e
isolamento para o estudo dos micrbios so procedimentos bsicos dentro dos estudos
microbiolgicos (ABELHO, 2013, p. 2).
Fakruddin et al (2013, p.1) afirmam que:
Antes do advento das tcnicas da biologia molecular, microrganismos
eram geralmente caracterizados baseando-se nas caractersticas
morfolgicas, fisiolgicas e culturais deles. [...] Identificao e
classificao dos microrganismos so de grande importncia na
microbiologia agrcola e ecologia microbiana.

2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral

Realizar a contagem de microrganismos em culturas propensas ao surgimento de

agentes fngicos e bacterianos.

2.2 Objetivos especficos

Aplicar o mtodo de diluies seriadas;

Estabelecer o nmero de unidades formadoras de colnias dos meios analisados.

3. MATERIAIS E MTODOS

Para a obteno de uma menor densidade celular por unidade de volume,

utilizou-se a tcnica de diluio seriada, que consiste na realizao de diluies
decimais sucessivas da amostra, em condies estreis, o que permitir-se- que as
clulas fiquem isoladas e originem colnias formadas por clulas iguais. Sendo assim, a
suspenso original foi diluda em uma sequncia de tubos de diluies. Os tubos
subseqentes tiveram um dcimo do nmero de clulas do tubo que o antecedia. As
diluies utilizadas foram as de fator 10-2, 10-3 e 10-4 (Figura 1).

Figura 1 - O mtodo das diluies decimais sucessivas.

Fonte: Adaptado de Tortora, Funke & Case, 2012, p. 175.

A suspenso foi preparada com 10g de solo e 9ml de soluo salina, uma
concentrao de 0.9%. Desta suspenso retirou-se 1ml e o adicionou em um primeiro
tubo de ensaio com 9ml da soluo. Logo depois, retirou-se deste tubo mais 1ml, o qual
foi adicionado em um segundo tubo, contendo tambm 9ml da soluo. E deste segundo
tubo foi retirado tambm 1ml, o qual foi acrescentado em um terceiro tubo. Em seguida,
amostras de cada diluio foram inoculadas em trs placas de petri com auxlio de
pipetas e espalhadas homogeneamente com a ala de Drigalsky (Figura 2A e 2B,
respectivamente).

Figura 2 Inoculao (2A); e espalhamento em placas (2B).

As placas de petri receberam meio de cultura Mrter e gar nutriente. O meio de

cultura Mrter foi utilizado para a inoculao de fungos, pois este meio recebeu o
cloranfenicol e o rosa bengala, os quais selecionam este microrganismo. J os agentes
bacterianos foram inoculados em placas com meio gar nutriente, um meio no seletivo
(sem antibiticos) e rico em nutrientes.

4. RESULTADOS E DISCUSSES

As observaes e contagens das colnias fngicas e bacterianas formadas, foram

realizadas dois dias aps a inoculao nas placas.
Quanto ao nmero de colnias constitudas, em correspondncia aos fatores de
diluio aplicados, os resultados foram praticamente idnticos para fungos e bactrias.
Constatou-se nas placas com inoculao da soluo no diluda, a formao e

sobreposio de colnias fngicas e bacterianas, impossibilitando a contagem (Figura

3A). O mesmo foi observado para as placas inoculadas com a diluio ao fator 10-1
(Figura 3B), formando-se um tapete. As placas inoculadas com diluio ao fator 10-2
foram as que mais apresentaram nmero de colnias dentro do aceitvel, entre 25 e 300
colnias (Figura 3C). J para as placas com fator 10-3, foi possvel observar o
surgimento de colnias, entretanto ficaram fora do valor limtrofe (Figura 3D). Para o
fator 10-4 (Figura 3E) foi impossvel realizar a contagem dentro do nmero mnimo e
mximo de colnias para a realizao do clculo UFC. Isso se deve ao fato de que
quanto mais diludo, menor a densidade celular e a possibilidade de formao de
colnias.

Figura 3 Placas com o Rosa Bengala, seletivas para fungos e gar nutriente para bactrias (3A, 3B,
3C, 3D, 3E). Soluo de solo inoculada em placa (3A); Inoculao da diluio ao fator 10-1 (3B);
Inoculao da diluio ao fator 10-2 (3C); Inoculao da diluio ao fator 10-3 (3D); Inoculao da
diluio ao fator 10-4 (3E).

Como dito anteriormente, as diluies ao fator 10-2 foram as que tiveram um

nmero maior de colnias formadas, tanto para fungos quanto para bactrias. Sendo
assim, para efeito de aplicao do clculo, tomou-se como base este fator. Quando da
realizao do clculo da unidade formadora de colnias, utilizou-se a frmula UFC =
NC . FD/v. alquota. O clculo foi realizado utilizando a mdia entre a quantidade do
nmero de colnias bacterianas e fngicas formadas. Entretanto, considerou-se apenas
duplicatas para bactrias e triplicata para fungos, pois nas demais no houve contagem
dentro do nmero aceitvel (Tabela 1).

Tabela 1 mdias do nmero de colnias para o fator 10-2.

Fator
10

-1

10

-2

10

-3

10

-4

Grupo I Bactrias
P1
P2
P3
155
136
21*
17*
9*
6*
4*

Fator
-1

10

145,5
19
6,33

10-2
-3

10

10-4

Grupo II Fungos
P1
P2
P3
28
28
36
-

30,67

P1, P2, P3 = Placas analisadas.

= mdia do nmero de colnias.
= placas incontveis.
* = placas com nmero de colnias fora do limite aceitvel (25 a 300).

Para as bactrias, obteve-se um nmero de unidades formadoras de colnias da

ordem de 1,4x105UFC/ml. J para os agentes fngicos, o nmero de unidades
formadoras de colnias foi da ordem de 3,1x104UFC/ml.

5. CONSIDERAES FINAIS

Ficou evidente que quanto mais uma amostra diluda, menor a densidade
celular e menor as chances de formao de colnias, sejam elas fngicas ou bacterianas.
O nmero de colnias por diluio tem influncia direta do tempo para observao, uma
vez que agentes fngicos e bacterianos tm crescimento rpido, ou seja, quanto maior o
tempo desde a inoculao, maior ser o crescimento e sobreposio de colnias.

6. REFERNCIAS

ABELHO, M. Protocolos de Microbiologia Ambiental. Escola Superior Agrria.

Instituto
Politcnico
de
Coimbra.
2013,
p.
2.
Disponvel
em:
http://www.esac.pt/Abelho/MicroAmbiental/Protocolos%5B1%5D_2012_2013.pdf.Ace
ssado em: 19/09/2015.

FAKRUDDIN, Md. et al. Identification and characterization of microorganisms: DNAfingerprinting methods. Songklanakarin Journal of Science and Technology. 2013, p. 1.

TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 10 ed. Artmed, Porto

Alegre. 2012, p. 965.

UNDERSTANDING MICROBES IN SICKNESS AND IN HEALTH. National Institute of

Allergy and Infectious Diseases. 2009, p. 44.