Biotecnologa

Monografa

Unidad n 16: Productos orgnicos

producidos por fermentacin. Etanol y
Biocombustibles

Integrantes:
Hernndez, Gustavo Adrin
Moya, Renzo
Encina, Matas
Fornasin, Emiliano
Pirn, Walter
Barbieri, Juan Pablo

Biotecnologa
Monografa
Unidad n16: Productos orgnicos producidos por fermentacin.
Etanol. Biocombustibles
Los biocombustibles
Introduccin
Actualmente, los combustibles fsiles y la energa nuclear proporcionan cada ao
alrededor del 90% de la energa que se utiliza en el mundo. Pero las reservas de
combustibles fsiles son limitadas y, en mayor o menor grado, contaminantes.
Desde mediados del siglo XX, con el crecimiento de la poblacin, la extensin de la
produccin industrial, y el uso masivo de tecnologas, comenz a crecer la preocupacin
por el agotamiento de las reservas de petrleo y el deterioro ambiental. Desde entonces,
se impuls el desarrollo de energas alternativas basadas en recursos naturales
renovables y menos contaminantes, como la luz solar, las mareas, el agua, y la biomasa.
Qu son los biocombustibles?
A diferencia de los combustibles fsiles, que provienen de la materia orgnica acumulada
durante enormes perodos de tiempo, los biocombustibles provienen de una fuente
renovable, la biomasa. La biomasa es la materia orgnica que constituye todos los seres
vivos, sus productos y desechos. Se dice que es una fuente de energa renovable porque
su formacin no lleva miles de aos, y por lo tanto la tasa de utilizacin no es mucho
mayor a la de su formacin. En la Tabla 1 se muestran los principales tipos de
biocombustibles.
Slidos
Paja
Lea
Astillas
Briquetas
Carbn vegetal

Lquidos
Alcoholes
Biohidrocarburos
Aceites vegetales y
steres derivados
Aceites de pirlisis

Gaseosos
Gas de gasgeno
Biogs
Hidrgeno

En gran parte del mundo, la lea (o carbn vegetal) que se obtiene a partir de la madera
sigue siendo el principal biocombustible empleado para la cocina, la calefaccin y la luz.
Esta fuente de energa es un recurso renovable si se obtiene a partir de bosques
convenientemente reforestados. Asimismo, muchos vehculos utilizan biocombustibles a
base de metanol y etanol mezclado con gasolina. Se puede obtener etanol a partir de la
caa de azcar, de la remolacha o del maz. En algunos pases, como la India y la China,
se produce biogs a partir de la fermentacin natural de desechos orgnicos
(excrementos de animales y residuos vegetales). Otra fuente importante de

biocombustibles son los aceites de los cultivos oleaginosos, como la soja, el girasol y la
colza, que pueden convertirse en biodiesel.
Obtencin de los biocombustibles
Segn la naturaleza de la biomasa, y el tipo de combustible deseado, se pueden utilizar
diferentes mtodos para obtener biocombustibles: mecnicos (astillado, trituracin,
compactacin), termoqumicos (combustin, pirolisis y gasificacin), biotecnolgicos
(fermentacin y digestin microbiana anaerbica) y extractivos. En la Tabla 2 se presentan
los principales procesos de obtencin de biocombustibles, los productos derivados y sus
aplicaciones.
Procesos de obtencin de biocombustibles
Mecnicos
Tcnicas

Productos

Aplicacion
es

Termoqumicos
Astillado
Pirolisis
Trituracin
Compactacin
Leas
Astillas
Briquetas
Aserrn

Carbn
Aceites

Biotecnolgicos
Gasificacin Fermentaci Digestin
n
anaerobia
Gas de
gasgeno

Etanol
Varios

Biogs

Extractivos
Extraccin
fsicoqumica
Aceites
steres
Hidrocarburos

Calefaccin Calefaccin Calefaccin Transporte Calefaccin Transporte

Electricidad Electricidad Electricidad
Industria Electricidad
Industria
qumica
qumica
Transporte Transporte
Industria
Industria
qumica
qumica

Los principales biocombustibles

1. El bioetanol
El bioetanol es un alcohol, y se obtiene como la cerveza y otras bebidas
alcohlicas. Los carbohidratos son transformados en azcares simples, los que se
convierten por fermentacin en etanol, que luego es destilado en su forma final. Se
produce principalmente a partir de caa de azcar o maz (en algunos casos
mezclado con otros cereales), cuyos hidratos de carbono son fermentados a
etanol por las levaduras del gnero Saccharomyces.
2. El Biodiesel
El biodiesel es un ster que puede producirse a partir de aceites vegetales, como
el de soja, colza, girasol, y otros, y tambin a partir de grasas animales. Su
elaboracin se basa en la reaccin de transesterificacin de los glicridos,
utilizando catalizadores. Desde el punto de vista qumico, los aceites vegetales
son triglicridos, es decir, tienen tres cadenas de cidos grasos unidas a un
alcohol, el glicerol. En la reaccin de transesterificacin, una molcula de
triglicrido reacciona con tres molculas de metanol o etanol para dar tres
molculas de monosteres y una de glicerol. Estos steres metlicos o etlicos
(biodiesel) se mezclan con el diesel convencional (o gasoil) o se utilizan como
3

combustible puro en cualquier motor diesel. El glicerol desplazado se recupera

como un subproducto de la reaccin.
3. El Biogs
El biogs es una mezcla que se desprende de tanques o digestores, y esta
constituida por metano (CH4) en una proporcin que oscila entre un 50% y un 70
% en volumen, y dixido de carbono (CO2), conteniendo pequeas proporciones
de otros gases como hidrgeno (H2), nitrgeno (N2), oxgeno (O2) y sulfuro de
hidrgeno (H2S). Este puede ser empleado para generar energa elctrica o
mecnica mediante su combustin, sea en plantas industriales o para uso
domstico debido a su alto contenido en metano.

Fermentacin acetona-butanol
Introduccin
Durante los ltimos aos se han usado en muy gran escala ciertos Clostridium spp. Para
la produccin de los disolventes industriales acetona y butanol. Muchos clostridios llevan
a cabo la fermentacin de los azucares dando dixido de carbono, hidrogeno y acido
butrico. Algunos realizan reacciones posteriores, convirtiendo el cido butrico en butanol
y el cido actico en acetona y etanol. El desarrollo comercial de la denominada
fermentacin acetona-butanol, producida por Clostridium acetobutylicum, se inici en
Inglaterra justo antes de la primera Guerra Mundial y se extendi rpidamente durante ella
porque se necesitaba acetona como disolvente para la fabricacin de explosivos.
Despus de la guerra, la demanda de acetona disminuy, pero el proceso se mantuvo
porque otro de los productos principales de la fermentacin, el butanol, empez a
utilizarse como disolvente para las pinturas de nitrocelulosa de secado rpido, usadas en
la creciente industria automovilstica. Un producto secundario de la fermentacin, la
vitamina riboflavina , tambin ayudo a mantener su rentabilidad.
Hoy en da esta industria ha desaparecido virtualmente como resultado de mtodos
competitivos, solo en parte microbiolgicos, para la sntesis de los principales productos.
Tanto la acetona como el butanol se producen en grandes cantidades a partir del petrleo
y un proceso microbiano basado en la utilizacin de levaduras es la fuente principal de
riboflavina.
Recientemente con la subida de los precios del petrleo y con las mejoras genticas en
las cepas de clostridios, de nuevo se piensa que la fermentacin de la acetona-butanol
pudiera resultar rentable.
La fermentacin de la acetona- butanol hizo importantes contribuciones tecnolgicas a la
microbiologa industrial. Fue el primer proceso a gran escala en el que la eliminacin en el
depsito de cultivo de otros microorganismos resultaba de capital importancia para el
xito de la operacin. El medio utilizado para el cultivo de Clostridium acetobutylicum
es tambin favorable para el desarrollo de bacterias del cido lctico, si estos organismos
4

empiezan a crecer rpidamente inhiben el posterior desarrollo de los clostridios mediante

la formacin de cido lctico. Mas grave todava es una infeccin de virus bacterianos, a
los que son muy sensibles a los clostridios. Por lo tanto, la fermentacin de la acetonabutanol puede realizarse con xito solo bajo condiciones de un cuidadoso control
microbiolgico. El establecimiento de esta industria llevo a la primera utilizacin con xito
de los mtodos de cultivo puro a escala masiva, que luego se mejoraron y refinaron en
conexin con la produccin industrial de antibiticos.
Bacterias empleadas en la produccin
Las cepas ms usadas para la fermentacin industrial ABE (acetona-butanol-etanol) son
principalmente del gnero Clostridium: Clostridium acetobutylicum, Clostridium
beijerinkii, Clostridium saccharobutylicum y Clostridium saccharobutylacetonicum.
Las especies de acetobutylicum y beijerinkii son adecuadas para la fermentacin acetonabutanol a partir de maz mientras que las saccharobutylicum y saccharobutylacetonicum
utilizan melaza como sustrato.
Como se mencion anteriormente, C. acetobutylicum es la especie ms estudiada la
secuencia completa de su genoma fue liberada en el 2001. Es una especie anaerbica
obligada, con forma de bastn, que posee un cromosoma de 3.94 Mbp y un plsmido de
192 Kbp. En cepas silvestres ste plsmido resulta indispensable para la solventognesis.
El C. acetobutylicum tiene la ventaja de ser muy diverso en los sustratos que metaboliza;
utilizando glucosa, galactosa, celobiosa, manosa, xilosa y arabinosa. Adems, es tambin
diversa la batera de enzimas que libera al medio, incluyendo: y -amilasas, y glucosidasas, pululanasas, amilopululanasas, entre otras.

Etapas del proceso

La fermentacin consta de dos etapas claves:
Acidognesis. Asociada con un rpido crecimiento del celular. Se producen
mayoritariamente cidos butrico y actico junto con CO2 e H2.
Solventognesis. Transformacin de los cidos a solventes. Iniciacin de la esporulacin.
Se producen los solventes generalmente en una relacin 3:6:1 de acetona:butanol:etanol.
El Clostridium acetobutylicum produce disolventes neutros (acetona, butanol y etanol)
unto a butirato, acetato, CO2; e H2 en la fermentacin de azcares. Es la llamada
fermentacin acetona-butanol que ha sido objeto de gran atencin a escala industrial.
En la primera etapa de la fermentacin se producen los cidos. Luego aparecen los
disolventes, hacindose constante el pH del medio y aumentando la produccin de CO2;
con respecto al H2, as como la produccin total de gases. Esto es debido a la formacin
de acetona. El acetoacetil-Coa se convierte en acetoacetato que luego se descarboxila
dando acetona y CO2. A fin de compensar el bloqueo en la reoxidacin de NADH que se
produce al transformarse parte del acetoacetil-CoA en acetona, parte del acetoacetiI-Coa
5

se convierte en butiril-Coa. El mismo se reduce a butiraldehdo con la misma aldehdo

deshidrogenasa que reduce el acetil-CoA a acetaldehdo. Posteriormente, la alcohol
deshidrogenasa dependiente de NADH + H+ convierte el butiraldehdo en butano
.Asimismo el butirato del medio puede incorporarse, transformndose en butiriI-CoA y
nalmente en butanol. Ello conlleva un aumento del pH del medio.

Materias primas utilizadas

La materias primas tradicionales que se han utilizado en el proceso ABE han
sido materias de origen no celulsico, como las melazas de remolacha, la caa de azcar,
el almidn de cereales, el sorgo o el suero lcteo.
Sin embargo, las materias primas de origen lignocelulsica son sumamente interesantes,
ya que la lignocelulosa es el componente ms abundante en la biomasa terrestre y su
coste es bajo, aunque para poder ser utilizada a nivel industrial requiere todava un mayor
grado de avance tecnolgico.

Existen diversas fuentes de material lignocelulsica, que va desde residuos agrcolas

como paja de trigo o de maz hasta residuos forestales, de madera, licores de la industria
del papel, residuos de la industria algodonera, bagazo de caa de azcar, fibra de maz
etc. El principal problema radica en que debido a su compleja estructura requieren
tratamientos previos que faciliten el acceso a los azcares fermentables.
Modalidades de fermentacin
Bach: Dependiendo de las condiciones de cultivo y el tipo de sustrato empleado, las
fermentaciones tipo lote toman de 2 a 6 das en completarse. Concentracin final de
butanol: 12-20 g/L, productividad ~ 0.5 g/L/h. Pueden ser separados por destilacin del
medio de fermentacin.

FED Bach: Mejora el problema de inhibicin por sustrato.

Continuo: Dificultades por la formacin de metabolitos bifsicos, toxicidad de los

solventes, posible degeneracin de los microorganismos y baja velocidad de crecimiento
de Clostridia.

Fermentadores de tanque agitado

Este tipo de fermentadores es muy empleado en todas las escalas de produccin.

Generalmente, constan de un recipiente cilndrico cerrado en su parte superior con una

tapa que puede ser elipsoidal o semiesfrica y suelen ser diseados con el fondo
redondeado para eliminar zonas de estancado. Habitualmente slo 70-80% del volumen
del fermentador se llena con lquido .EI mezclado se debe al movimiento rotatorio de los
agitadores unidos a un eje situado concntricamente con el recipiente (eje de potencia);
ste eje es accionado con un motor. La seleccin del tipo de agitador depende de varios
factores, en especial la viscosidad del uido y la sensibilidad del sistema al esfuerzo de
corte. Asimismo, el nmero de agitadores depende del volumen de trabajo del
fermentador.
En los fermentadores de tanque agitado es importante tener en cuenta el diseo del
dispositivo (sparger) de entrada de gases (aire, nitrgeno, dixido de carbono, etc), al
medio, debido a que con ste se garantiza las condiciones aerobias o anaerobias que se
requieran en el proceso. Un problema a menudo en los sistemas aireados es la formacin
de espuma, la cual puede prevenirse con la adicin de antiespumantes o la instalacin de
un cortador de espumas en la parte superior del eje de potencia.
A continuacin se muestra la relacin de dimensiones estndares de fermentadores

Factores que afectan la fermentacin ABE

Entre las variables que afectan la fermentacin ABE se encuentra el pH, la temperatura, la
concentracin de sustrato y la concentracin de productos.
El pH es muy importante durante la fermentacin acetona-butanol, ya que la
solventognesis inicia con un pH bajo; sin embargo si ste se encuentra por debajo de 4.5
(antes de que se forme una cantidad suficiente de cidos orgnicos), la solventognesis
ser disminuida e improductiva. Una forma sencilla de incrementar el crecimiento,
utilizacin de los carbohidratos as como la produccin de butanol es incrementando la
capacidad amortiguante del medio.
En la tabla siguiente se resumen las condiciones favorables para la fermentacin ABE a
partir del microorganismo Clostridium acetobutylicum ATCC 824.

La fermentacin ABE es un proceso exotrmico por lo tanto la temperatura de 37C debe

ser controlada. Lo que hace indispensable realizar un diseo del sistema de refrigeracin,
como por ejemplo una chaqueta simple, teniendo en cuenta:

Requerimiento de limpieza

Volumen del reactor

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Disminucin de costos en material

Requerimiento de energa.

Los instrumentos de control y cualquier material en contacto con los microorganismos,

susceptibles de autoclavados durante 60 minutos a 121 C.
Las condiciones de anaerobiosis se garantizan inyectando nitrgeno industrial libre de
oxgeno de bombonas de gases (Air Liquide).
Composicin tipo de un medio de cultivo
A continuacin se presenta la composicin de un medio de cultivo obtenida por la
optimizacin de un medio de cultivo industrial para la fermentacin acetobutilica (ABE)
mediante la aplicacin de diseo de experimentos. Se emple una mutante espontnea
resistente al butanol aislada de la cepa de Clostridium acetobutylicum DSM 1732 la
cual tolera una concentracin de butanol de 2.5% v/v. La mutante produce 15.5 g/L de
solventes totales que representan 30% ms que la cepa silvestre.
Melaza ( miel de caa, es un producto lquido y
espeso derivado de la caa de azcar)

130 g

Biotina (Vitamina H)

4.0 mg

PAB A(polyphosphate accumulating

microorganisms)

3.0 mg

KH2PO4

1,8 g

Extracto de levadura (Fuente de nitrogeno)

3.0 g

Solucin de minerales (FeSO4.7H2O)

4 ml

Los nutrientes se calcularon de acuerdo con la mxima cantidad de biomasa obtenida en

medio vegetativo. Con el propsito de determinar los componentes del medio de cultivo
que afectan significativamente la produccin de solventes, se diseo una matriz del
mtodo estadstico Plackell-Burman. La composicin final del medio de cultivo se
determin mediante la aplicacin del mtodo EVOP-Simplex. El pH fue de 6.1 antes de
esterilizar. Con este medio se obtuvo una concentracin de 24.6 g /I de solventes totales.
Esta concentracin represent un incremento del 58,7% comparado con la produccin de
la cepa mutante, antes de optimizar el medio de cultivo.
Cabe destacar que el hierro es un importante componente en la dieta de Clostridium, ya
que se requiere de una profusa produccin de ferredoxina en la conversin de piruvato en
acetil-Coa.
Mtodo de anlisis
10

Los solventes del proceso, acetona, butanol, etanol, cido actico y cido butrico se
determinan mediante cromatografa de gases empleando un cromatgrafo de gases.
Problemas en la produccin de butanol
Toxicidad a los microorganismos (concentraciones > a 20 g/L butanol).
Bajos rendimientos y productividad, crecimiento lento:
La produccin de butanol mediante bacterias anaerobias, como las de gnero Clostridium
que tienen como desventaja la baja velocidad de crecimiento frente a otras especies
aerobias. Por ello algunos investigadores estn trabajando en la obtencin de
butanol clonando genes relacionados con la produccin de butanol de Clostridium
acetobutylicum en Escherichia coli e incluso con levaduras modificadas de
Saccharomyces cerevisiae, debido a su potencial resistencia al butanol y por estar
genticamente bien caracterizada. Hasta el momento no se han obtenido resultados
comparables a los de Clostridium beijerinckii, pero es otra de las lneas de investigacin
abiertas y en fase de estudio.
Baja concentracin de producto y muchos sub productos
El Butanol no es un metabolito primario ni secundario, necesita que el microorganismo
esporule. Esto produce la degeneracin de las cepas y pierden capacidad de producir
butanol.
Contaminacin con bacterifagos.
Separacin de los solventes durante la fermentacin o previo a la destilacin
Tradicionalmente los procesos de fermentacin ABE se haban llevado a cabo
en procesos discontinuos, es decir, todos los reactivos se colocan en el reactor bajo las
condiciones de operacin hasta que se agotan y se obtienen los productos. Los reactores
que operan en continuo resultan ms fciles de operar y reducen los riesgos de
contaminacin, pero tambin se caracterizan por su baja productividad.
Dos de las posibles soluciones para incrementar la productividad del proceso de
produccin de butanol son la inmovilizacin de microorganismos y el desarrollo de
procesos en separacin del producto in situ.

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El arrastre de gas (gas stripping) es una tcnica muy sencilla que permite recuperar
cualquier solvente del medio de fermentacin y que no requiere grandes inversiones en
equipos. Consiste en burbujear un gas (nitrgeno o incluso los gases producidos en la
fermentacin: CO2 e H2) a travs del medio de fermentacin. Durante su paso por el
medio, el gas captura los solventes (butanol, acetona, etanol) y son arrastrados hacia la
salida, donde son condensados. El gas vuelve a ser recirculado en el fermentador para
continuar as con la captura de los productos. Esta tcnica no elimina los nutrientes del
medio y no produce daos sobre el cultivo. Los resultados obtenidos mejoran
considerablemente ya que se reduce de manera muy apreciable el problema de inhibicin
por elevadas concentraciones de azcares.
La inmovilizacin de microorganismos consiste en el establecimiento de
una interaccin (ya sea mediante fuerzas fsicas, qumicas) entre los microorganismos
productores de butanol y un soporte, que puede ser natural o sinttico. Este sistema tiene
las ventajas de facilitar la separacin de los productos, elevar la densidad celular y
mejorar la transferencia de materia. Sin embargo, presenta algunos inconvenientes como
la necesidad en algunos casos de procesos previos de hidrlisis, la prdida de
actividad celular como consecuencia de la inmovilizacin y la acumulacin de burbujas de
gas.
Otros mtodos para la separacin de los solventes son:
Adsorcin (sin membrana)
Per -extraccin (con membrana)
smosis reversa (con membrana)

Generalmente se busca: alta selectividad, velocidad de remocin, simple, no txica para

el cultivo, y de bajo costo.

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GLICEROL
El glicerol, tambin conocido como glicerina o 1, 2,3 propanotriol, es un compuesto
alcohlico con tres grupos OH (hidroxilos). La palabra glicerol, procede del griego
Glykos, que significa dulce. Posee un aspecto de lquido viscoso, no tiene color, pero si un
caracterstico olor, adems de un sabor dulzn. Adems el glicerol es un compuesto
higroscpico, lo que quiere decir que tiene la capacidad de ceder o absorber la humedad
presente en el medio ambiente que lo rodea. Adems es fcilmente soluble en agua, y se
descompone en ebullicin, en la cual entra a una temperatura de 290C. Es un compuesto
lquido si se encuentra a temperatura ambiente, (a unos 25C).
Se encuentra en todos los tipos de aceites, as como en las grasas animales o vegetales,
siempre que stas vayan asociadas a otros cidos grasos.
Adems es un subproducto del biodiesel. ste se genera en cantidades considerables en
los procesos que dan lugar a la fabricacin del biodiesel, Hoy en da, quizs la mayor
preocupacin se encuentra en intentar dar salida y utilidad a dicho subproducto, pues est
creando un cierto impacto medio ambiental, as como afectando econmicamente.
Uno de los procesos de obtencin de glicerol como sub producto del Biodiesel es:

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Acondicionamiento de la muestra: las muestras de glicerina slida se diluyen en la misma

proporcin en peso de agua destilada se hace con agitacin suave y un leve
calentamiento hasta 30 C, la razn de realizar una disolucin acuosa es que se necesita
neutralizar la muestra de glicerol que tiene cantidades importantes de hidrxido de sodio
(catalizador homogneo de la transesterificacin).
Neutralizacin: una vez diluida la muestra, se determina el pH inicial, el cual en todos los
casos fue de carcter bsico en el orden de pH: 10, lo cual era de esperar ya que la
glicerina cruda tambin tiene residuos del catalizador utilizado en la transesterificacin.
Luego, para neutralizar con la consecuente formacin y precipitacin de sales se agreg
cido sulfrico concentrado hasta alcanzar un pH ligeramente cido (pH:6). La
neutralizacin se realiz a temperatura ambiente y con agitacin, agregando gota a gota
cido y controlando con un peachmetro. Con el agregado de cido se observara que la
muestra se aclara, tornndose de aspecto lechoso en todos los ensayos, esto se debe a
la formacin de pequeo precipitado que da el aspecto de una suspensin coloidal.
Una vez alcanzado el pH 6, se contina agitando durante 15 minutos. Se dejan reposar
las muestras, hasta la formacin de 2 fases, la ms oscura en la parte superior
corresponde a la fase orgnica insoluble en agua.
Filtracin: Luego de neutralizadas las muestras de glicerol crudo son filtradas dos veces,
para ello se utiliza trampa de vaco y embudo butchner y papel de filtro.
Destilacin Simple: en esta etapa se separa toda el agua agregada en la etapa de
acondicionamiento de la muestra, las condiciones operativas son (recomendadas):
presin atmosfrica, Temperatura del bao: 130-150C, Temperatura del baln: 105C,
agitacin a altos rpm, tiempo aproximado de 1,5 h.
Con esta destilacin concentraremos la glicerina, pero sta an presentara impurezas y
restos de biodiesel por lo que es necesario realizar una destilacin al vaco para
finalmente lograr glicerina con un alto grado de pureza. En esta destilacin se lograra un
SEPARADO del GLICEROL CON EL AGUA.
Destilacin al vaco del glicerol: La destilacin a alto vaco se realiza con una bomba para
este fin, las condiciones operativas son (recomendadas) las siguientes: presin de vaco:
720 -730 mmHg, temperatura del bao: 160-180C, temperatura del baln: 130-140C,
agitacin y tiempo aproximado de 40 minutos.
Finalizada la destilacin al vaco se observaran dos fases bien definidas en el destilado, la
superior de biodiesel y la inferior de glicerina pura.
Fig: Destilado obtenido de la filtracin al
vaco realizado por el primer procedimiento
de purificacin de Glicerol.
Separacin de fases: La separacin de
fases del destilado es realizada con
14

ampolla de decantacin. La capa superior inmiscible en agua, se determina en placa

cromatogrfica que se trata de biodiesel. La capa inferior, mucho ms densa y miscible en
agua, correspondiente a glicerina.

Hay otro proceso de obtencin de glicerol donde se puede separar la biodiesel antes de
producir la destilacin simple, siendo los procesos muy similares con el siguiente cambio
de orden:

En la actualidad se est pensando introducir el glicerol en la industria de la

microbiologa, con fines de obtencin de productos de cierto valor, pues parece ser una
buena y nueva fuente de carbono, que puede ser usado en las fermentaciones para el
crecimiento bacteriano. Adems tambin se est intentando convertir el glicerol en
carbonato de glicerol mediante una ruta conocida como glicerlisis de urea, de manera
que podra ser usado en la industria.
GLICEROLISIS DE UREA.
La glicerina cruda obtenida como subproducto en la produccin de biodiesel contiene un
alto porcentaje de jabones, metanol y agua, lo cual obliga a realizar un pretratamiento a
sta para despus seguir con la produccin del carbonato de glicerol.
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La glicerina tratada se alimenta al reactor principal gas sparging junto con urea, sulfato
de zinc (catalizador) y nitrgeno. Este ltimo se adiciona continuamente con el fin de
arrastrar el amonaco en la Reaccin:

El carbonato de glicerol o carbonato de glicerina (GC) es un importante derivado

del glicerol que se caracteriza por ser un lquido incoloro y estable a temperatura
ambiente. Posee baja toxicidad, elevado punto de ebullicin, baja inflamabilidad, elevada
capacidad de hidratacin y buena biodegradabilidad. Sin embargo, como es un material
relativamente nuevo en la industria qumica, los datos disponibles sobre l estn
limitados.
Por sus propiedades, el carbonato de glicerol posee diversos usos en diferentes sectores
industriales; especialmente, es usado como disolvente polar con un elevado punto de
ebullicin as como producto qumico intermedio en la sntesis de policarbonatos y otros
materiales polimricos.
Adems, es usado como precursor en aplicaciones biomdicas, y como grupo protector
en la qumica de carbohidratos. Tambin ofrece aplicaciones tiles como componente
novedoso de las membranas de separacin de gases, en la sntesis de poliuretanos y en
la produccin de surfactantes.
Otros usos a destacar es su papel como disolvente neotrico; puede decirse que es un
potencial biodisolvente de revestimientos, cosmticos y frmacos. Su uso industrial como
disolvente verde se encuentra como diluyente no reactivo en sistemas epoxi o de
poliuretano. Es tambin usado como disolvente voltil en la industria de la pintura y como
componente de recubrimientos.

Bioetanol

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Introduccin
El bioetanol es alcohol etlico de alta pureza, anticorrosivo y oxigenante que puede ser
empleado como combustible mezclndolo con las naftas en diferentes proporciones.
Se obtiene a partir de biomasa de origen vegetal que contenga azucares simples o algn
compuesto que pueda convertirse en azucares, como el almidn o la celulosa. Las
especies vegetales a partir de las cuales se puede obtener el bioetanol son el maz, trigo,
sorgo, cebada, remolacha azucarera, caa de azcar.
Al ser una biomasa de origen vegetal, el bioetanol es considerado una energa renovable
y su empleo disminuye ampliamente la emisin de gases contaminantes a la atmosfera
debido a que durante la combustin de etanol se libera la cantidad de CO2 que fue fijada
anteriormente. Esto es un gran aporte para disminuir la contaminacin ambiental y como
consecuencia, el calentamiento global.
El bioetanol se produce mediante una fermentacin alcohlica por medio de levaduras.
Las levaduras fermentan los azucares simples, que proviene de la biomasa, dando como
resultado final, etanol y dixido de carbono.
C6H12O6 + Levaduras (Saccharomyces)

2C2H5OH

+ 2CO2

El alcohol producido en la fermentacin alcohlica es destilado. El objetivo de la

destilacin es producir alcohol de calidad y concentracin adecuada (95%v/v).
Posteriormente ese alcohol es deshidratado, la absorcin de agua se produce por medio
de tamices moleculares donde el alcohol de destilera queda con una concentracin de
99.5 % v/v. Este es el grado de pureza que se requiere para uso combustible.
Materias primas y tecnologas de produccin del bioetanol
El bioetanol se puede producir a base de cualquier biomasa que contenga cantidades
significativas de almidones o azcares. Los azcares liberados son fermentados con
levaduras, y el vino resultante sufre destilacin para la purificacin del bioetanol. Adems
del bioetanol, esos procesos implican, generalmente, diversos coproductos, que varan de
acuerdo con la biomasa utilizada.
Proceso de produccin
En general, el proceso se basa en la extraccin de los azcares (por medio de la
molienda o de la difusin), que pueden seguir directamente hacia la fermentacin. Tras la
fermentacin, se destila el vino.
Produccin a partir de la caa de azcar
Considerando la produccin a base de azcares, como en el caso de la caa y de la
remolacha, el proceso es ms sencillo e implica una etapa menos, ya que los azcares
estn disponibles en la biomasa

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La caa de azcar es una planta semiperenne con ciclo fotosinttico de tipo C4,
perteneciente al gnero Saccharum, de la familia de las gramneas, compuesta por
especies de gramas altas perennes. La parte area de la planta se compone,
esencialmente, por los tallos, en los que se concentra la sacarosa, y por las puntas y
hojas, que constituyen la paja de la caa de azcar, como se detalla en la figura. Todos
esos componentes juntos totalizan cerca de 35 toneladas de materia seca por hectrea.

Compuesto % en Peso:

Celulosa 6,48

Fructosa 0,6

Glucosa 0,9

Hemicelulosa 5,4

Sacarosa 13,5

Lignina 1,42

Protena 0,4

Agua 69,7

Grasa 0,3

Azucares no fermentables 0,35

cidos grasos 0,1

Otros compuestos 0,35

Cenizas 0,5
18

Dentro de las condiciones para un ptimo cultivo tenemos

Altura: Entre 500 y 1.500 msnm
Temperatura: 25 y 26C, aunque entre 20 a 30 C permite buenos rendimientos del cultivo.
Si los cambios de temperatura entre el da y la noche son superiores a 8 C se favorece la
formacin de la sacarosa.
Luminosidad adecuada: se encuentra entre 5 a 8 horas diarias promedio de brillo solar.
Precipitacin anual: 1.500 a 1.750 mm
Vientos: Clidos y secos aumentan la transpiracin de la planta.
Suelos: Franco arcillosos, con buen drenaje y pH entre 5,5 y 7,5.
Humedad relativa: 75 80 %
Etapas del proceso

Cosecha de la caa: El perodo de cosecha de la caa vara segn el rgimen de lluvias,

de manera de permitir las operaciones de corte y transporte y de poder alcanzar el mejor
punto de maduracin y acumulacin de azcares.
Debido a que la caa no se puede almacenar por mucho tiempo debido a las prdidas de
sacarosa, las plantas de produccin operan durante el periodo.
Extraccin
19

La extraccin del jugo se lleva a cabo en los molinos y consiste en la compresin de la

fibra de caa entre cilindros de gran tamao llamados mazas. Los molinos se colocan de
forma tal que la fibra que sale de un molino sea acarreada por un conductor intermedio y
entre a un siguiente molino, de esta manera se logra extraer la mayor cantidad de
sacarosa que contiene la fibra.
Filtracin:
El jugo extrado en la molienda contiene mucho bagazo en suspensin, conocido
generalmente como bagacillo. Para eliminar este bagacillo los jugos se pasan primero por
filtros perforados con agujeros de 1 mm de dimetro. Al pasar por el filtro el jugo se
deposita en un tanque en tanto que el bagacillo que ha sido separado se recoge por
medio de un conductor de raspador que lleva el bagacillo de nuevo a los molinos.
Clarificacin
El propsito del proceso de clarificacin es separar las impurezas presentes en el jugo
debido a que contiene una considerable cantidad de materia fina y coloidal en suspensin
que debe eliminarse para conseguir azcares de alta pureza al final del proceso. Se trata
suele tratar con lechada de cal entre 4 y 5 grados Baum para precipitar las diversas
impurezas contenidas en el jugo de caa y para incrementar el pH.
Evaporacin:
Cuando el jugo ya se encuentra limpio, a travs de evaporadores se evapota hasta que el
80% del lquido desaparece. Esto lo hace ms concentrado.
Este proceso se realiza en 3 etapas. En la primera etapa se quema bagazo para lograr
vapor en la caldera. El vapor remanente del jugo de la primera etapa ser el que caliente
al jugo en la segunda etapa. Lo mismo sucede con la tercera etapa de evaporacin.
Luego por un sistema de bombeo se transporta el lquido a los tanques fermentadores.
Fermentacin
La fermentacin puede definirse como un proceso de biotransformacin en el que se
llevan a cabo cambios qumicos en un sustrato orgnico por la accin de enzimas
sintetizadas por microorganismos conocidos como catalizadores bioqumicos o
biocatalizadores, en este caso capaces de convertir las hexosas del mosto en etanol
cuando las condiciones son anaerbicas.
La fermentacin es la etapa principal del proceso, no solo porque en ella se produce el
etanol, sino porque se reproduce la masa fundamental de microorganismos y adems por
formarse aqu los productos secundarios. Para la fermentacin adems del mosto se
requiere un biocatalizador que sea capaz de atacar enzimticamente determinados
grupos qumicos del sustrato, ya sea por hidrlisis, oxidacin, reduccin u otros medios.
Los sustratos orgnicos sobre los que actan los microorganismos tienen un doble papel:
El primero como fuente de nutrientes para dicho biocatalizador y
20

El segundo como fuente de energa.

Mediante la accin de dichos microorganismos o biocatalizadores, que pueden ser tanto
levaduras como bacterias, se transforma el azcar en alcohol. Esto se debe a que stos
bajo condiciones de crecimiento anaerbico, tienen la habilidad de utilizar la glucosa
El objetivo de la fermentacin alcohlica es la obtencin de bioetanol de mediante la
fermentacin de los azcares contenidos en los residuos orgnicos. El 96% de la
produccin de etanol la llevan a cabo diferentes especies de levaduras debido a su alta
productividad en la conversin de azcares a etanol y a que se separan mejor despus de
la fermentacin. Entre las especies ms utilizadas estn:

Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces anamensisi

Saccharomyces carlsbergensis

Candida seudotropicalis

Candida bytyrii

Kluyveromyces marxianus

Pichia stipatis

Pichia membranaefaciens

Schizosaccharomyces pombe

Los sistemas biolgicos discontinuos para la produccin de etanol se inician en

aerobiosis, para obtener la mxima biomasa posible, ya que si las condiciones anaerobias
empiezan demasiado pronto la poblacin no ser lo suficientemente grande como para
obtener una buena velocidad de conversin a etanol. Se distinguen por lo tanto dos fases:
Fase aerobia: es una fase de crecimiento en la cual la glucosa pasa a dixido de carbono.
Fase anaerobia: es la fase de produccin de etanol; la glucosa pasa a etanol y dixido de
carbono. Incluso en la fase anaerobia ser necesaria una cierta presencia de oxgeno, ya
que las levaduras lo necesitan para producir sus esteroles y sus cidos grasos
insaturados de membrana.

21

Las reacciones ocurren en tanques denominados tanques de fermentacin donde se

mezclan el Mosto y el pie de Cuba (Pre-Fermento) en una proporcin 2:1,
respectivamente.
Las etapas de un proceso de fermentacin forma continua son
Preparacin del Mosto: El mosto es una solucin de azcar cuya concentracin es
ajustada de forma que facilite la fermentacin. La concentracin del mosto es definida en
funcin de la produccin pretendida y de la capacidad de fermentacin de la levadura.
Preparacin del Fermento: La levadura recibe un tratamiento severo, que consiste en
dilucin con agua y adicin de cido sulfrico hasta, normalmente, pH = 2.5, o ms bajo
(pH = 2.0) en el caso de haber infeccin bacteriana. Esta suspensin de fermento diluido y
acidificado, conocida en la prctica como Pie de Cuba (Pre-Fermento), permanece en
agitacin por 1 o 3 horas, antes de retornar a los fermentadores.
Durante la formacin del etanol por fermentacin, se generan aproximadamente 287
kilocaloras de calor por kilogramo de etanol producido con la aplicacin del sistema
Melle-Boinot. Perodo de fermentacin de 4 a 12 horas. Para mantener baja la
temperatura (32 C), es preciso realizar el enfriamiento del vino: circulando agua ya sea
por serpentines internos o bombeando el mosto a travs de intercambiadores externos de
calor. El mosto fermentado (o vino) contiene entre 7-10 por ciento de alcohol por volumen
junto con algunos productos secundarios, tales como: alcoholes superiores, glicerol,
cidos y aldehdos.
Despus de la fermentacin, el vino es enviado a las centrfugas para l a recuperacin del
fermento. El concentrado del fermento recuperado, denominado Lechada de Levadura,
retorna a los tanques de Pre-Fermento para su tratamiento. La fase leve de la
centrifugacin o vino deslevadurado, es enviada para la Columna de Destilacin.
Destilacin:
La destilacin o mejor denominada rectificacin para el caso del etanol es una destilacin
con enriquecimiento de vapor y es el tipo ms empleado en la prctica para separar
lquidos voltiles en la industria, debido a la facilidad con que se consigue el
enriquecimiento progresivo del vapor y del lquido en los componentes respectivos.
Esta consiste en aplicar calor al vino para separar el etanol del agua. Se lleva a cabo en
columnas de destilacin que contienen dispositivos conocidos como bandejas.
En la produccin de etanol como componente para mezclar con la gasolina, una etapa
adicional es la deshidratacin hasta el 99,4% o mayor, utilizando benceno o ciclohexano
para atrapar el agua. En este caso el destilado azeotrpico se decanta con una etapa
adicional de rectificacin para la recuperacin del agente extractante. El xito del proceso
22

viene dado por la interaccin ptima de variables tales como: concentracin de azcar,
pH, concentracin de O2 y temperatura. Asimismo su progreso se controla mediante el
crecimiento celular del biocatalizador, el consumo de sustratos y la aparicin del producto
Equipos utilizados:
Extraccin:
Para la extraccin del jugo que contiene los azucares, la caa se muele en los molinos.
Cada molino est compuesto de 4 mazas, las cuales giran entre 3 y 6 rpm y tienen la
funcin de extraer el jugo del bagazo por medio de la compresin del bagazo. El proceso
de extraccin inicia con la alimentacin de la caa preparada a la tolva del primer molino a
travs de una banda transportadora. En el molino, a la caa se le extrae casi el 70% del
jugo y el resto queda en el bagazo el cual pasa al siguiente molino por medio de otra
banda. En cada uno de los molinos se repite el proceso de extraccin hasta el sexto
donde el bagazo que sale al final queda con aproximadamente un 2.5% de Brix y un 50%
de humedad.

Filtracin: Para eliminar el bagacillo, los jugos se pasan primero por filtros perforados con
agujeros de 1 mm de dimetro. Uno de los ms usados el filtro rotatorio de vaco. Estos
consisten en un tambor giratorio el cual en su interior se produce vaco. Parte del tambor
se sumerge en el fluido extrayndolo hacia su interior y posteriormente lo deposita en un
tanque en tanto que el bagacillo se recoge por medio de un conductor de raspador que lo
lleva de nuevo a los molinos.

23

Clarificacin: El proceso se lleva a cabo en clarificadores que consisten depsitos de gran

tamao por los que el jugo circula a una velocidad lo suficientemente lenta para que el
precipitado producido por la reaccin del floculante y la materia orgnica se asienten en la
parte inferior y pueda ser extrado.

Evaporacin: Se lleva a cabo en evaporadores que son intercambiadores de calor de

coraza y tubos. Las partes esenciales de un evaporador son la cmara de calefaccin y la
cmara de evaporacin. El haz de tubos corresponde a una cmara y la coraza
corresponde a la otra cmara. La coraza es un cuerpo cilndrico en cuyo interior est el
haz de tubos.
Las dos cmaras estn separadas por la superficie slida de los tubos, a travs de la cual
tiene lugar el intercambio de calor. La forma y la disposicin de estas cmaras, diseadas
para que la eficacia sea mxima, da lugar a distintos tipos de evaporadores.
Los evaporadores que se utilizan son los de tipo Roberts o de mltiple efecto de mltiple
efecto consta de un conjunto de evaporadores, donde el primer efecto es el primer
evaporador y as sucesivamente. Durante el funcionamiento, el vapor producido en el
primer efecto se utiliza como vapor calefactor del segundo y asi sucesivamente
Evaporador de alimentacin directa

Fermentacin
24

Se lleva a cabo en tanques de fermentacin o birreactores que bsicamente son

recipientes de acero inoxidable. Estos proveen un ambiente ptimo para el crecimiento
celular y la productividad asegurando el control de distintos parmetros tales como
temperatura, pH, etc. Los biorreactores que generalmente se usan en la produccin de
bioetanol son los biorreactores de tanque agitado.
El biorreactor ideal debe:
1. Mantener las clulas uniformemente distribuidas en el volumen de cultivo.
2. Mantener constante y homognea la temperatura.
3. Minimizar los gradientes de concentracin de nutrientes.
4. Mantener el cultivo puro.
5. Mantener un ambiente asptico.
6. Maximizar el rendimiento y la produccin.
7. Minimizar el gasto y los costos de produccin.
8. Reducir al mximo el tiempo del proceso.
Destilacin:
El fundamento destilacin es el contacto sucesivo del vapor ascendente, con el lquido
descendente cuya concentracin no est en equilibrio con el vapor, de forma que
paraalcanzarlo parte de los componentes menos voltiles del vapor han de condensar

sobre el lquido y a cambio, evaporarse parte de los componentes ms voltiles del lquido
que pasaran a la corriente de vapor.
La ebullicin de la mezcla en el caldern da lugar a una corriente de vapor ascendente.

25

Calderin: donde se aporta el calor necesario para la ebullicin de la mezcla, y del cual se
extrae la corriente de residuo. La ebullicin de la mezcla en el caldern da lugar a una
corriente de vapor ascendente.
Columna: donde se ponen en contacto la fase vapor generada en el caldern con el reflujo
procedente del condensador.
Condesador: situado en cabeza de la columna, condensa todo el vapor que ha ascendido
por la columna y suministra as una corriente lquida que se puede devolver ntegramente
a la columna (reflujo), o separar parcialmente como corriente de destilado.

Produccin a partir del maz

El maz (Zea mays spp.), al igual que la caa, es una planta C4 de la familia de las
gramneas, con ciclo productivo anual.

Por ser una

planta que
no tolera el
fro, en las zonas templadas el maz se cultiva en primavera, en los meses de abril y mayo
(en el caso de los Estados Unidos).
La cosecha se extiende desde los meses de septiembre hasta noviembre (otoo en los
Estados Unidos), y se realiza, generalmente, con una cosechadora mecnica.

26

La cosecha se extiende desde los meses de septiembre hasta noviembre (otoo en los
Estados Unidos), y se realiza, generalmente, con una cosechadora mecnica.
El bioetanol de maz se puede producir por medio de dos procesos, denominados
molienda seca y hmeda.
La forma hmeda en el proceso hmedo, detallado en la figura, se apartan las distintas
fracciones del grano del maz, lo que posibilita la recuperacin de diversos coproductos,
como protenas, nutrientes, dixido de carbono, almidn y aceite de maz. Aunque el
aceite de maz es el producto ms valioso, el almidn (y, consecuentemente, el bioetanol)
es el producido en mayor volumen, con rendimientos aproximados de 440 litros de
bioetanol por tonelada seca de maz.

En el caso de la molienda seca, el nico coproducto del bioetanol es un suplemento

proteico para alimentacin animal conocido como DDGS (distillers dried grains with
solubles). En ese proceso, esquematizado en la figura, se agregan agua y enzimas (alfaamilasa) al grano de maz molido, para promover la hidrlisis del almidn en cadenas
menores de azcar. En la etapa siguiente, esas cadenas son sacarificadas por la accin
de la glucoamilasa y la solucin esultante es fermentada. En algunas unidades, esas
operaciones de liquefaccin/sacarificacin sufren el reciclaje de una parte de la vinaza
fina (proceso de backsetting) con la intencin de reducir el pH y proveer nutrientes para la
fermentacin.

27

El proceso de liberacin de azcares disminuye su velocidad en poco tiempo, lo que

puede exigir tiempos de residencia en los tanques, de 48 a 72 horas, para alcanzar la
mxima sacarificacin del almidn. Con el objeto de disminuir el tiempo de residencia y el
riesgo de contaminacin, muchas unidades realizan la sacarificacin y la fermentacin de
forma simultnea. En ese caso, tambin se disminuye la conversin a glucosa. En los
procesos que utilizan el backsetting el reciclado de los azcares no convertidos
inicialmente permite su mejor aprovechamiento. Al igual que en el caso del bioetanol de
caa, durante la fermentacin, la glucosa se transforma en bioetanol gracias a la accin
de la levadura Saccharomyces cerevisiae y el vino producido sigue hacia la destilacin.
La vinaza producida en esa etapa sigue hacia un conjunto de centrfugas, en las cuales se
separa la vinaza fina, que se puede reutilizar en el proceso.
En general, la vinaza que sobra se concentra en evaporadores, produciendo un jarabe
con cerca de 50% de humedad. Ese jarabe se combina con los slidos retirados en la
centrfuga y se seca hasta el 10% de humedad, y as se origina el DDGS mencionado
antes.
Produccin a partir de otras materias prima
Cualquier materia prima con suficiente contenido de azcar o almidn puede convertirse
en bioetanol. De esa manera se utilizan cultivos como la mandioca, el trigo y la remolacha
azucarera.
La mandioca (Manihot esculenta) como ventajas principales, presenta un elevado
contenido de almidn en sus races, entre el 20% y el 30%, es fcil de cultivar, presenta
baja exigencia edafoclimtica y se puede producir a lo largo de casi todo el ao. Para la
produccin de bioetanol, las races de mandioca se deben pelar, lavar y moler,
pasndolas luego a cocederos y, sucesivamente, a los tanques para sacarificacin del
almidn, en procesos similares a los empleados en el bioetanol de maz. Con ndices de
productividad industrial semejantes a los analizados para el maz, una tonelada de
mandioca in natura, con cerca de 25% de almidn, permite producir 170 litros de
bioetanol.

28

El trigo (Triticum spp.), otro cultivo que posee almidn, tambin es utilizado en la
produccin de bioetanol mediante un proceso industrial bastante similar al utilizado para el
maz. En ese caso, la productividad agrcola y la productividad industrial tpicas son,
respectivamente, 7,5 toneladas por hectrea y 240 litros de bioetanol por tonelada de
granos procesados resultando en una produccin de 1.800 litros por hectrea cultivada.
Entre los cultivos que producen azcar, adems de la caa, la remolacha azucarera (Beta
vulgaris) ha sido utilizada para la fabricacin de bioetanol, utilizando su miel residual
(melaza) siempre disponible en la produccin industrial de sacarosa. Esa hortaliza tiene
una raz tuberosa, en la que se acumulan cantidades importantes de azcar, y presenta
una productividad entre 50 y 100 toneladas por hectrea y contenidos de sacarosa del
orden del 18%. Puede alcanzar ndices de productividad agroindustrial bastante elevados,
del orden de los 7.500 litros de bioetanol por hectrea cultivada, similares a la caa. El
procesamiento industrial de la remolacha comienza con su limpieza y fraccionamiento en
trozos finos, que siguen hacia un difusor, en el cual son lavados en agua caliente para
liberar su azcar. El lquido resultante de esa operacin contiene, aproximadamente, el
16% de slidos solubles extrados de la remolacha, y se lo procesa de forma anloga al
jugo de caa, para azcar o para bioetanol. Con una tonelada de tubrculos se producen,
normalmente, 86 litros de bioetanol y 51 kg de una torta fibrosa que se puede utilizar para
la alimentacin animal.
Conclusiones:
La produccin de bioetanol presenta las siguientes ventajas y desventajas
Ventajas
1. Prevencin del cambio climtico mediante menos emisiones de gases
invernadero. El bioetanol producido a partir de materias primas sostenibles es,
aparte del consumo de energa necesario para su produccin, completamente
neutral con respecto a la emisin de CO2.
2. Es posible ahorrar hasta un 70 % de los gases invernadero.
3. Proteccin de los recursos fsiles.
4. Tecnologa con oportunidades para zonas rurales. Se abren para la agricultura
nuevos mercados de consumo.
5. Ms eficiente que los combustibles convencionales para motores Otto. La ventaja
del bioetanol son sus propiedades qumicas favorables. Tiene un octanaje
claramente ms alto que la gasolina, prcticamente no contiene azufre y es
biodegradable.

29

Desventajas
1. La principal desventaja derivada de la produccin de bioetanol a partir de este tipo
de biomasa es el elevado coste de la materia prima, ya que dichas biomasas estn
ligadas al mercado alimentario, lo que repercute en el precio final del producto.
2. En definitiva, el bioetanol es una fuente de energa renovable prometedora, pero el
principal problema para su produccin es el uso de materia prima a la industria
alimenticia, lo que establece el dilema de si usar hectreas de tierra para cultivos
dedicados a productos alimenticios o para bioetanol.
Biodiesel a partir de Microalgas

La situacin actual debida al agotamiento de los combustibles fsiles, incremento del

precio del petrleo y dificultades ambientales, demanda urgentemente fuentes alternas de
energa siendo una opcin promisoria el biodiesel; biocombustible producido
primordialmente a partir de aceites provenientes de plantas oleaginosas.
Ventajas:
El uso de microalgas para la produccin de biodiesel es una alternativa ventajosa debido
al elevado contenido de lpidos y perfil idneo para la obtencin del biocombustible que
stas ofrecen. Otros atributos de las microalgas son su elevada eficiencia fotosinttica, su
capacidad de crecer tanto en aguas marinas, dulces, residuales y salobres, as como su
velocidad de crecimiento relativamente alta.
Desventajas:
No obstante, los sistemas de cultivo de microalgas actualmente presentan ciertas
limitantes tales como la escasez de informacin para su escalamiento, la dificultad para el
mantenimiento de monocultivos, los elevados costos de operacin para la produccin y
recoleccin de la biomasa de microalgas, entre otros.
LA FORMA MS VENTAJOSA DE LA PRODUCCIN DE BIODIESEL
Existen diversas metodologas para la produccin de biodiesel, cuatro de ellas han sido
estudiadas exhaustivamente: uso directo de aceites o mezclas de stos con dieselfsil,
microemulsiones, pirolisis y transesterificacin. La aplicacin de las tres primeras
alternativas en motores diesel es imprctica e insatisfactoria, ya que ocasiona problemas
tales como la obstruccin de los inyectores, la formacin de depsitos de carbono, la
combustin incompleta, el golpeteo en el motor, el desgaste excesivo del mismo, el dao
del lubricante, etc.
La transesterificacin o alcohlisis es la reaccin qumica ocurrida entre los aceites
(triacilglicridos) y un alcohol (comnmente metanol, etanol, propanol o butanol) para
30

producir glicerol y alquil steres de cidos grasos, los cuales son conocidos como
biodiesel.
Los principales factores que influyen en el proceso son:
* La relacin molar alcohol-glicridos.
* El tipo de catalizador (lcali, cido, lipasas).
* La temperatura.
* El tiempo de reaccin.
* El contenido de agua y cidos grasos libres en la materia prima.

Reaccin de transesterificacin.

CARACTERSTICAS GENERALES DE LAS MICROALGAS

Las microalgas son un conjunto heterogneo de microorganismos fotosintticos
unicelulares procariontes (cianobacterias) y eucariontes, que se localizan en hbitats
diversos tales como aguas marinas, dulces, salobres, residuales o en el suelo, bajo un
amplio rango de temperaturas, pH y disponibilidad de nutrientes; se les considera
responsables de la produccin del 50% del oxgeno y de la fijacin del 50% del carbono
en el planeta. Su biodiversidad es enorme, se han identificado alrededor de 40,000
especies aunque se estima que existen ms de 100,000, de las cuales con frecuencia se
desconoce su composicin bioqumica y metabolismo.
Las microalgas se clasifican de acuerdo a varios parmetros tales como pigmentacin,
ciclo de vida, morfologa y estructura celular. Las especies ms estudiadas para
aplicaciones biotecnolgicas corresponden a las algas verdes y a las diatomeas.

31

USO DE LAS MICROALGAS PARA LA OBTENCIN DE LPIDOS

En la actualidad se ha detectado el uso de lpidos microalgales para la produccin de

biodiesel, ya que es una alternativa que asegura satisfacer o reemplazar la demanda
global de petrodiesel. Esta tecnologa es prometedora dadas las ventajas que ofrece en
contraste con las plantas oleaginosas, tales como: mayor eficiencia fotosinttica; eficacia
superior en la asimilacin de nutrientes; y periodos cortos de produccin sostenida
durante todo el ao, a causa de los breves tiempos de duplicacin de las microalgas. Los
cultivos microalgales son independientes de la estacionalidad inherente a los cultivos
agrcolas y de la fertilidad del suelo, condicin que posibilita prescindir de herbicidas y
pesticidas y adems, permite emplear territorios marginales e inclusive zonas no aptas
para la agricultura, ganadera, industria y turismo.
Una ventaja adicional estriba en la posibilidad de obtener subproductos (protena,
carbohidratos, biopolmeros, pigmentos, biogs, etc.) a partir de la biomasa microalgal
residual una vez que los lpidos han sido extrados.
Finalmente, la ventaja competitiva ms importante del biodiesel de microalgas, consiste
en los rendimientos lipdicos por unidad de rea considerablemente superiores a los
obtenidos con plantas oleaginosas.
Una de las estimaciones ms conservadoras para el rendimiento anual de biodiesel
microalgal, como se indica en la tabla siguiente es una alternativa prometedora, en
comparacin con otras fuentes de materia prima (lpidos).

EL CONTENIDO LIPDICO DE LAS MICROALGAS

32

Las microalgas con elevadas productividades lipdicas son deseables para la elaboracin
de biodiesel, razn por la cual la cantidad de lpidos contenidos en la biomasa y la
velocidad de crecimiento, sumados a la eficiencia metablica y la robustez del
microorganismo, son parmetros relevantes para su seleccin
La determinacin del contenido oleaginoso de las microalgas resulta complicada a causa
de su variacin ante condiciones distintas de cultivo; el crecimiento en ambientes
desfavorables o bajo situaciones de estrs, frecuentemente conlleva al incremento de la
fraccin lipdica, aunque en detrimento de la productividad lipdica del cultivo. Los lpidos
comprendidos en las microalgas por lo general constituyen del 20 al 50% de su peso
seco, sin embargo se han reportado valores en un rango del 1 al 80%, o incluso
superiores:

ESQUEMA DEL PROCESO

La produccin de biodiesel a partir de microalgas es un proceso conformado, en trminos
generales, por las etapas elementales de produccin de biomasa rica en lpidos,
33

recuperacin o cosecha de la biomasa, extraccin de lpidos y transesterificacin, como

se indica en la siguiente figura:

SISTEMAS PARA LA PRODUCCIN DE BIOMASA

Abiertos
Los sistemas empleados con mayor frecuencia en la produccin de biomasa microalgal
son los de tipo abierto, que a pesar de sus formas y tamaos diversos, destacan por
asemejar el entorno natural de las microalgas.

Los cultivos abiertos comprenden

sistemas naturales (lagos, lagunas,
estanques), artificiales, de superficie
inclinada y estanques tipo circuito donde
estos ltimos son los de uso ms
extendido. Los estanques tipo circuito,
consisten en circuitos de 15 a 30 cm de profundidad, en los cuales una rueda de paletas
mantiene un flujo constante del cultivo; las producciones y productividades biomsicas
factibles en estos sistemas son bajas, prximas a 1 g/L y a 10-25 g/m2/d,
34

respectivamente. Las ventajas inherentes a los cultivos abiertos radican en su sencillez y

su bajo costo de inversin en contraste con sistemas cerrados, a causa de la diversidad
de materiales tiles para su construccin (concreto, tierra, plstico, etc.) y la facilidad que
ofrecen para su operacin y mantenimiento.
Cerrados
Los sistemas cerrados, en contraste con los abiertos, ofrecen numerosas ventajas tales
como prdidas mnimas de CO2, riesgo reducido de contaminacin, control y
reproducibilidad de las condiciones de cultivo, ahorro de agua y nutrientes, menores
requerimientos de superficie, flexibilidad de diseo, cortos periodos de produccin (2 a 4
semanas) y productividades considerablemente superiores (5 a 13 veces).

Los fotobioreactores cerrados, con el propsito

de colectar la mayor cuanta posible de
energa solar por unidad de superficie,
presentan configuraciones diversas, tubulares
(vertical, horizontal, helicoidal, conformacin
), pneles planos y columnas de burbujeo,
principalmente. Los reactores tubulares y de
panel plano son los de uso ms frecuente;
habitualmente estn conformados por dos
unidades, una de recoleccin de luz y otra de
transferencia de gases.

RECUPERACIN DE LA BIOMASA
Una vez que la biomasa de microalgas ha sido producida en alguno de los sistemas
descritos, se da inicio a la etapa de cosecha o recoleccin, cuyo propsito es el de
remover el agua y concentrar las clulas microalgales para su posterior procesamiento.
Esta etapa, como se ha mencionado, influye notablemente en los costos de produccin
del biodiesel, por lo que la seleccin de una tcnica de recoleccin eficiente y de bajo
costo es trascendental. La centrifugacin, sedimentacin, filtracin y floculacin, ya sea
individualmente o combinados, son los procedimientos de cosecha ms comunes, cuya
aplicacin depende de las propiedades de la especie de microalga cultivada (morfologas
particulares, presencia de vacuolas gaseosas, etc.), ya que algunas presentan
caractersticas que facilitan su recoleccin.
EXTRACCIN LIPDICA
A partir de la biomasa cosechada se extraen los aceites mediante procedimiento tales
como lixiviacin con solventes orgnicos, principalmente hexano. Sin embargo, algunos
35

inconvenientes de esta tcnica de extraccin son los costos y la energa adicionales

necesarios para la recuperacin del solvente, adems de la contaminacin de la biomasa
microalgal libre de lpidos, restringiendo as las posibilidades para el posterior
aprovechamiento de este co-producto. En esta dcada, se han propuesto variantes para
la lixiviacin con solventes orgnicos, tales como la extraccin in situ a partir de clulas
vivas de microalgas o el acoplamiento de la etapa de extraccin lipdica con la de
transesterificacin, no obstante, tanto su aplicacin a gran escala, como su factibilidad
econmica, deben ser evaluadas. Asimismo, la extraccin mediante prensado ha sido
sugerida aunque, a pesar de no implicar el uso de solventes, su eficiencia es menor a la
de la lixiviacin.
Luego de esto se procede al proceso de transesterificacin descrito anteriormente, y as
se obtiene como producto final el BIODIESEL.

Biogs
Introduccin
El biogs es un gas combustible que se genera en medios naturales o en
dispositivos especficos, por las reacciones de biodegradacin de la materia orgnica,
compuesta de compuestos orgnicos que provienen de los restos de organismos que
alguna vez estuvieron vivos, tales como plantas y animales y sus productos de residuo en
el ambiente natural, mediante la accin de microorganismos y otros factores, en ausencia
de oxgeno (esto es, en un ambiente anaerbico). Este gas se ha venido llamando gas de
los pantanos, puesto que en ellos se produce una biodegradacin de residuos vegetales
semejante a la descrita.
La produccin de biogs por descomposicin anaerbica es un modo considerado
til para tratar residuos biodegradables, ya que produce un combustible de valor adems
de generar un efluente que puede aplicarse como acondicionador de suelo
o abono genrico.
Composicin
Es una mezcla constituida por metano (CH4) en una proporcin que oscila entre un
50% y un 70 % en volumen, y dixido de carbono (CO2), conteniendo pequeas
proporciones de otros gases como hidrgeno (H2), nitrgeno (N2), oxgeno (O2) y sulfuro
de hidrgeno (H2S)
Formacin de materia orgnica
Todos los organismos vivos estn formados de compuestos orgnicos, que
contienen carbono e hidrogeno, formando enlaces carbono - carbono e hidrogeno hidrogeno. En muchos otros casos contienen tambin elementos como oxigeno,
nitrgeno, azufre, fsforo y halgenos, entre otros. Mientras estn vivos ellos secretan o
excretan materiales orgnicos tales como materia fecal que luego comienza a
descomponerse por accin de bacterias y hongos haciendo posible la formacin de
molculas grandes de materia orgnica por polimerizacin de diversas cadenas cortas
producto de materia descompuesta.
36

La materia orgnica natural puede variar mucho, dependiendo de su origen, modo

de transformacin, edad, y medio ambiente, por lo tanto sus funciones bio-fsicasqumicas presentan gran variacin dependiendo de los tipos de ambientes.
Caractersticas
El biogs tiene como promedio un poder calorfico entre 18,8 y 23,4 mega julios
por metro cbico (MJ/m). Este gas se puede utilizar para producir energa elctrica
mediante turbinas o plantas generadoras a gas, en hornos, estufas, secadores, calderas u
otros sistemas de combustin a gas, debidamente adaptados para ese uso.
Cuando el gas se procesa para obtener biogs natural concentrado y comprimido
(BNCC), puede ser utilizado para inyectarse en la red de gas natural o usarse para el
funcionamiento de vehculos a motor.
Principales factores que afectan la produccin de gas
La actividad metablica involucrada en el proceso metano gnico se ve afectada
por diversos factores. Debido a que cada grupo de bacterias intervinientes en las distintas
etapas del proceso responde en forma diferencial a esos cambios no es posible dar
valores cualitativos sobre el grado que afecta cada uno de ellos a la produccin de gas en
forma precisa. Por lo tanto nos limitaremos a dar una valoracin cualitativa y en algunos
casos se darn cifras y cuadros que deben tomarse como orientativos ya que los valores
pueden sufrir importantes variaciones.
Entre los factores ms importantes a tenerse en cuenta se desarrollarn los
siguientes: el tipo de sustrato (nutrientes disponibles); la temperatura del sustrato; la carga
volumtrica; el tiempo de retencin hidrulico; el nivel de acidez (pH); la relacin
Carbono/Nitrgeno; la concentracin del sustrato; el agregado de inoculantes; el grado de
mezclado; y la presencia de compuestos inhibidores del proceso.
Tipo de materia prima
Las materias primas fermentables incluyen dentro de un amplio espectro a los
excrementos animales y humanos, aguas residuales orgnicas de las industrias
(produccin de alcohol, procesado de frutas, verduras, lcteos, carnes, alimenticias en
general), restos de cosechas y basuras de diferentes tipos, como los efluentes de
determinadas industrias qumicas. El proceso microbiolgico no solo requiere de fuentes
de carbono y nitrgeno sino que tambin deben estar presentes en un cierto equilibrio
sales minerales (azufre, fsforo, potasio, calcio, magnesio, hierro, manganeso, molibdeno,
zinc, cobalto, selenio, tungsteno, nquel y otros menores).
Normalmente las sustancias orgnicas como los estircoles y lodos cloacales
presentan estos elementos en proporciones adecuadas. Sin embargo en la digestin de
ciertos desechos industriales puede presentarse el caso de ser necesaria la adicin de los
compuestos enumerados o bien un post tratamiento aerbico
Las sustancias con alto contenido de lignina no son directamente aprovechables y
por lo tanto deben someterse a tratamientos previos (cortado, macerado) a fin de liberar
las sustancias factibles de ser transformadas de las incrustaciones de lignina.
En lo atinente a estircoles animales la degradacin de cada uno de ellos
depender fundamentalmente del tipo de animal y la alimentacin que hayan recibido los
mismos
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ESPECIE

PESO VIVO

Kg ESTIERCOL/DIA

% CH4

Cerdos

50

4,5 - 6

65 - 70

Vacunos

400

25 - 40

65

Equinos

450

12 - 16

65

Ovinos

45

2,5

63

Aves

1,5

0,06

60

Caprinos

40

1,5

Temperatura
Para que se inicie el proceso se necesita una temperatura mnima de 4 a 5 C y
no se debe sobrepasar una mxima de alrededor de 70 C. Se realiza generalmente una
diferenciacin en tres rangos de temperatura de acuerdo al tipo de bacterias que
predominan en cada una de ellas.
TIPO DE BACTERIA

TEMPERATURA

Psiccroflicas

Menor a 20C

Mesoflicas

Entre 20 y 40C

Termoflicas

Mayor de 40C

Velocidad de carga volumtrica

Con este trmino se designa al volumen de sustrato orgnico cargado diariamente
al digestor. Este valor tiene una relacin de tipo inversa con el tiempo de retencin, dado
que a medida que se incrementa la carga volumtrica disminuye el tiempo de retencin.
Existen diferentes formas de expresar este parmetro siendo los ms usuales los
siguientes: kg de material/da; kg de materia seca/da; kg de slidos voltiles/da todos
expresados por metro cbico de digestor. Las cantidades de slidos y slidos voltiles se
extraen afectando a las cantidades en kg de material cargado con los porcentajes de
slidos o slidos voltiles que se obtiene por anlisis (porcentaje de slidos sometiendo al
sustrato a desecacin, 105C hasta peso constante y extrayendo el siguiente coeficiente:
(peso hmedo - peso seco)/peso hmedo. El porcentaje de slidos voltiles se obtiene
sometiendo la muestra seca a la mufla, 560C durante tres horas y extrayendo el siguiente
coeficiente: 1 ((peso seco - peso ceniza)/peso seco)).

38

Un factor importante a tener en cuenta en este parmetro es la dilucin utilizada,

debido a que una misma cantidad de material degradable podr ser cargado con
diferentes volmenes de agua.
Tiempo de retencin
Este parmetro slo puede ser claramente definido en los sistemas discontinuos o
Bach donde el T:R: coincide con el tiempo de permanencia del sustrato dentro del
digestor. En los digestores continuos y semi continuos el tiempo de retencin se define
como el valor en das del cociente entre el volumen del digestor y el volumen de carga
diaria.
De acuerdo al diseo del reactor, el mezclado y la forma de extraccin de los
efluentes pueden existir variables diferencias entre los tiempos de retencin de lquidos y
slidos debido a lo cual suelen determinarse ambos valores. El T.R. est ntimamente
ligado con dos factores: el tipo de sustrato y la temperatura del mismo. La seleccin de
una mayor temperatura implicar una disminucin en los tiempos de retencin requeridos
y consecuentemente sern menores los volmenes de reactor necesarios para digerir un
determinado volumen de material.
La relacin costo beneficio es el factor que finalmente determinar la optimizacin
entre la temperatura y el T.R., ya varan los volmenes, los sistemas paralelos de control,
la calefaccin y la eficiencia.
Con relacin al tipo de sustrato, generalmente los materiales con mayor proporcin
de carbono retenido en molculas resistentes como la celulosa demandar mayores
tiempos de retencin para ser totalmente digeridos.
MATERIA PRIMA

TIEMPO DE RETENCION

Estircol vacuno lquido

20 - 30 das

Estircol porcino lquido

15 - 25 das

Estircol porcino lquido

20 - 40 das

Valores de pH
Una vez estabilizado el proceso fermentativo el pH se mantiene en valores que
oscilan entre 7 y 8,5. Debido a los efectos buffer que producen los compuestos
bicarbonato-dixido de carbono (CO2 - HCO3) y Amonio -Amonaco (NH4-NH3) el
proceso en s mismo tiene capacidad de regular diferencias en el pH del material de
entrada.
Las desviaciones de los valores normales es indicativo de un fuerte deterioro del
equilibrio entre las bacterias de la faz cida y la metano gnica provocado por severas
fluctuaciones en alguno de los parmetros que gobiernan el proceso.
Contenido de slidos
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La movilidad de las bacterias metano gnicas dentro del sustrato se ve

crecientemente limitada a medida que se aumenta el contenido de slidos y por lo tanto
puede verse afectada la eficiencia y produccin de gas. Por otro lado podemos encontrar
en la literatura datos de producciones de gas importantes logradas en rellenos sanitarios
con un alto contenido de slidos. En este punto tampoco existen reglas fijas; mediciones
realizadas utilizando mezclas de estircoles animales en agua han determinado que para
digestores continuos el porcentaje de slidos ptimo oscila entre el 8% y el 12%.
Inhibidores
La presencia de metales pesados, antibiticos y detergentes en determinadas
concentraciones pueden inhibir e incluso interrumpir el proceso fermentativo.
Cuando es demasiado alta la concentracin de cidos voltiles (ms de 2.000 ppm
para la fermentacin mesoflica y de 3.600 ppm para la termoflica se inhibir la digestin.
Tambin una elevada concentracin de Nitrgeno y Amonaco destruyen las bacterias
metano gnicas.

Diseo de Experimentos
Diseo de experimento Bio-Butanol (fermentacion ABE).
En la tabla siguiente se resumen las condiciones favorables para la fermentacin ABE a
partir del microorganismo Clostridium acetobutylicum ATCC 824.

40

Para hacer el dieo de experimentos a partir de estos datos tomamos

pH
6 (+1)
4 (-1)
Concentracin de butanol (supuestos optimo concentraciones <14 g/l)
15 (+1)
13 (-1)
Concentracin de sustrato (glucosa, supuesto optimo 60-80 g/l)
55 (+1)
85 (-1)
Concentracin de solventes (supuesto optimo concentracin <20g/l)
21 (+1)
19 (-1)

A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
pH
+
+
+
+
+
+
+
Butanol +
+
+
+
+
+
+
Sustrato +
+
+
+
+
+
Solvente +
+
+
+
+
+
Matriz de Taguchi produccin de bio-butanol (fermentacin ABE)

K
+
+

L
+
-

M
+
-

N
+
-

O
+

Diseo de experimentos bioetanol.

Se pretende evaluar la influencia de los factores principales asociados a la fermentacin
de melazas por parte de la levadura Saccharomyces cerevisiae, mediante el desarrollo
de un diseo factorial 24 en el cual, mediante un anlisis estadstico, se evala la
influencia de la concentracin de melaza, la temperatura de fermentacin, el pH inicial del
medio y el microorganismo empleado (levadura de panadera aislada de procesos
fermentativos a escala piloto y Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763).
Las variables elegidas como independientes en el diseo experimental fueron:
1- La concentracin de azcares iniciales en el medio (Bx),
2- El pH inicial del medio ,

41

P
-

3- La temperatura de fermentacin (C)

4- El tipo de cepa de Saccharomyces cerevisiae.
Las variables de respuesta o variables dependientes de inters son la produccin de
etanol (ETA, g/L) y la generacin de biomasa (DCEL, cel/ml). Se seleccionan estas
variables de operacin por ser las de mayor importancia y de comn seguimiento durante
un proceso a nivel piloto e industrial. Los valores de cada uno de estos factores se
seleccionaron de acuerdo a los valores lmite, habituales en este tipo de procesos. Las
variables independientes son codificadas con valores -1 (al nivel inferior) y +1 (al nivel
superior) para factores continuos (variables A, B, C). Para factores discretos como el tipo
de cepa se emplea -1 y +1 indistintamente. En la tabla 13 se presentan los factores y el
dominio experimental, mientras que en la tabla 14 se presenta la matriz de experimentos.

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Fuentes:

http://quimica.laguia2000.com/compuestos-quimicos/glicerol

Instituto de Biotecnologa, Universidad Nacional Autnoma de Mxico.

Bioqumica de los microorganismos By Ramon Pars i Farrs, Antonio Jurez

Gimnez.
Produccin de biobutanol mediante fermentacin ABE a partir de suero lcteo.
(Efecto de suplementar el medio de fermentacin con nutrientes esenciales).
Universidad de Valladolid , alumna Rebeca Dez Antolnez
https://investigadoraenapuros.wordpress.com/2011/06/19/biobutanol-iv/
Diseo conceptual de un fermentador para la produccin de n-butanol a partir de
glucosa empleando Clostridium acetobutylicum ATCC 824 Universidad industrial
de Santander.
Microbiologa By Roger Y. Stanier, Julio R. Villanueva.

http://fciencias.ugr.es/practicasdocentes/wpcontent/uploads/guiones/RectificacionMezclasBinarias.pdf.

http://epsem.upc.edu/~intercanviadorsdecalor/castella/evaporadors.html

http://www.bdigital.unal.edu.co/2334/1/angelicamariaalzateibanez.2010.pdf

http://www.cid.unal.edu.co/files/news/051122_produccion_de_etanol_a_partir_de_y
uca.pd

http://www.inaut.unsj.edu.ar/Files/1699_04.pdf

http://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/pluginfile.php/108596/mod_resource/content/0/
Clase%206%20.pdf

http://www.azucarledesma.com.ar/Produccion.php

https://quimiart.files.wordpress.com/2012/05/evaluacic3b3n-del-proceso-deproduccic3b3n-de-etanol-carburante-a-partir-de-cac3b1a-azucarera-remolachaazucarera-y-mac3adz.pdf

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http://mic.gob.do/media/7455/Proceso%20de%20Producci%C3%B3n%20del
%20Etanol%20%28Modelo%20Dominicano%29.pdf

http://www.bioetanoldecanadeazucar.org/

http://www.gunt.de/download/CE640_flyer_spanish.pdf

http://www.agrowaste.eu/wp-content/uploads/2013/02/FERMENTACIONALCOHOLICA.pdf

http://www.bio4.com.ar/productos_etanol.php

http://argentinainvestiga.edu.ar/diario_virtual/1.0/listado/noticia.php?
titulo=bacterias:_materia_prima_de_los_biocombustibles&id=1141#.VU0Fsvmqqko

http://www.ceid.edu.ar/biblioteca/biocombustibles/alvarez_blanco_fajardo_sanchez
_thevenet_biodiesel_a_parti.pdf

http://porquebiotecnologia.com.ar/index.php?
action=cuaderno&opt=5&tipo=1&note=58

http://porquebiotecnologia.com.ar/index.php?
action=cuaderno&opt=5&tipo=1&note=58

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