OBSERVACIN DE

MICROORGANISMOS A TRAVS
DEL MICROSCOPIO

El Microscopio
El microscopio (de micro-, pequeo, y scopio,
observar) es un instrumento que permite observar
objetos que son demasiado pequeos para ser vistos
a simple vista.
El tipo ms comn y el primero que se invent es el
microscopio ptico.

UNIDAD

TIPOS DE MICROSCOPIOS

1 Clasificacin:

Segn la fuente de emisin.

Segn el nmero de lentes.
Los microscopios, segn la fuente de emisin son:
MICROSCOPIO PTICO

MICROSCOPIO ELECTRNICO

Microscopios

Estereoscpicos
o lupas

M. ptico,
corriente

Tipos de microscopios,
segn el nmero de lentes

Compuestos

M. contraste
de fases

M. de
fluorescencia

M. Electrnico

M. E. de
transmisin

M. E. de barrido

Microscopio estereoscpico
Este microscopio hace posible la visin
tridimensional de los objetos.
Ofrece ventajas para observaciones
que requieren pequeos aumentos.
El ptimo de visin estereoscpica se
encuentra entre 2 y 40X.

Microscopio ptico compuesto

Poseen dos lentes que producen una imagen ampliada, vertical
e invertida al objeto
Tiene un lmite de resolucin de cerca de 200 nm (0.2 m).
Aumenta las imgenes hasta 1000 veces.
El microscopio ptico puede ser monocular, binocular, o triocular.
Las clulas observadas bajo el microscopio ptico pueden estar
vivas o fijadas y teidas

UNIDAD

1
.

Partes del microscopio ptico

Sus principales componentes son:

Oculares. Lentes a travs de las que se

observa la preparacin ampliada.
Objetivos. Lentes que aumentan el tamao
de la imagen.
Platina. Sobre ella se coloca la
preparacin, que se sujeta con una pinza.
Iluminacin. Espejo o lmpara que ilumina la
preparacin.
Tornillos de enfoque. Mueven la platina arriba
o abajo para enfocar la imagen.

Partes

Partes
Fuente. Se trata clsicamente de una lmpara incandescente de tungsteno
sobrevoltada
Lente Ocular: lente situada cerca del ojo del observador. Capta y ampla la
imagen formada en los objetivos. Los oculares son intercambiables y sus
poderes de aumento van desde 5X hasta 20X. Existen oculares especiales de
potencias mayores a 20X y otros que poseen una escala micromtrica; estos
ltimos tienen la finalidad de medir el tamao del objeto observado
Lente Objetivo: lente situada cerca del especimen.
Objetivos secos se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna entre ellos
y la preparacin. En la cara externa llevan ndices que indican el aumento, la
abertura numrica y otros datos.
Un objetivo con estos datos: plan 40/0,65 y 160/0,17, significa que es
planacromtico, su aumento 40 y su apertura numrica 0,65, con tubo de
longitud 160 mm. Los aumentos de los objetivos secos ms frecuentemente
utilizados son: 4X, 10X, 20X, 40X y 60X.
El objetivo de inmersin est compuesto por un complicado sistema de lentes.
Para observar a travs de este objetivo es necesario colocar una gota de aceite
de cedro entre el objetivo y la preparacin, de manera que la lente frontal entre
en contacto con el aceite de cedro. Generalmente, son de 100X y se distingue
por uno o dos crculos negros en su extremo inferior.

Condensador: lente que concentra los rayos luminosos sobre la

preparacin.
Diafragma: regula la cantidad de luz que llega al condensador.
Tubo: es una cmara oscura unida al brazo mediante una
cremallera.
Revlver: Sistema que agarra los objetivos, y que rota para
utilizar un objetivo u otro.
Tornillos macro y micromtrico: Son tornillos de enfoque,
mueven la platina hacia arriba y hacia abajo. El macromtrico lo
hace de forma rpida y el micromtrico de forma lenta. Llevan
un mando de bloqueo que fija la platina a una determinada
altura.
Platina: Plataforma horizontal con un orificio central, sobre el
que se coloca la preparacin, que permite el paso de los rayos
procedentes de la fuente de iluminacin situada por debajo.
Base: Es la parte inferior del microscopio que permite el sostn

Partes

Ocular

Objetivo

Diafragma

Efecto del diafragma

Objetivo mayor menor campo, menor profundidad de
campo o de enfoque

Si cerramos el diafragma
mayor profundidad de
campo, pero menos luz

Si abrimos el diafragma
menor profundidad de
campo, pero ms luz

Objetivo menor mayor campo,

mayor profundidad de campo o
de enfoque

Dependiendo del objetivo escogido obtendremos mayor o menor campo de visin y, en

correspondencia, mayor o menor profundidad de campo

Efecto del micromtrico

Aqu, por ejemplo, logramos ver los cloroplastos de

estas clulas vegetales al mover ligeramente hacia
atrs o hacia delante el tornillo micromtrico

Moviendo el tornillo micromtrico (nunca ms de una vuelta)

alternativamente hacia delante o hacia atrs, podremos apreciar
nuevos detalles en la preparacin

Microscopio de campo claro

Ocular (

Para observar las

muestras es necesario
realizar tinciones para
aumentar la diferencia de
contraste entre los
microorganismos y el
medio.

X 10)

Objetivo ( X 20, X 40 o X 100)

( X 100 con aceite de inmersion)

Muestra

Condensador
Fuente

UNIDAD

Imgenes con el microscopio ptico

Este tipo de microscopio

permite observar clulas
vivas y los movimientos
que realizan
mantenindolas en su
medio.

Protozoos

UNIDAD

Imgenes con el microscopio ptico

Tambin permite observar tejidos en

finos cortes, pero en este caso hay
que fijar las muestras, de manera que
las clulas estn muertas.
Para ver mejor las muestras pueden
teirse con colorantes especficos que
destaquen estructuras como el ncleo
o la pared celular.
CLULAS ANIMALES

CLULAS VEGETALES

Microscopio ptico de campo oscuro

El microscopio de
campo oscuro utiliza un
haz enfocado de luz muy
intensa en forma de un
cono hueco concentrado
sobre el espcimen.
El objeto iluminado
dipersa la luz y se hace
as visible contra el
fondo oscuro que tiene
detrs, como las
partculas de polvo
iluminadas por un rayo
de sol que se cuela en
una habitacin cerrada.

Microscopio de campo oscuro

Objetivo

-Se coloca una placa opaca entre el

condensador y la muestra.
-Solo los rayos reflejados o difractados
entran al objetivo.
-Se obtiene una imagen con fondo
oscuro y la muestra iluminada.
-No es necesario fijar las muestras.

Muestra

Condensador

Placa opaca

Chlamydomonas

Esta forma de iluminacin se utiliza para analizar elementos

biolgicos transparentes y sin pigmentar, invisibles con iluminacin
normal, sin fijar la muestra, es decir, sin matarla.
Las porciones transparentes del espcimen quedan oscuras,
mientras que las superficies y partculas se ven brillantes.
Tambin es bastante utilizado en la observacin de muestras
metalogrficas para la observacin de detalles en superficies con
alta reflectancia.

Microscopio de contraste de fases

-Convierte pequeas
diferencias en indices de
refraccion en variaciones
detectables por el ojo.
- Mediante un condensador
y un objetivo especial se
controla la iluminacin de
tal manera que vaya en
diferentes rutas a travs de
las distintas partes de una
clula.
- El resultado es una
imagen con diferentes
grados de brillo y
oscuridad.
-Permite observar
estructuras sin necesidad
de fijar las muestras.

Anillo de fase
Objetivo

Muestra

Condensador

Anillo transparente
Fuente

Contraste de fase

rayos
en
fase

-1/4

anillo de fase

-1/4

Los rayos desviados se

cancelan con los no
desviados
objetivo

Se observan imgenes con el fondo claro

(rayos no desviados) y las muestras
oscuras con limites bien definidos.

Contraste de fase
Se usa principalmente para
aumentar el contraste entre
las partes claras y oscuras de
las clulas sin colorear. Es ideal
para espcimenes delgados, o
clulas aisladas
Con este mtodo, el material
denso aparece brillante,
mientras que las partes de la
clula que tienen una
densidad cercana al agua
(citoplasma) aparecen oscuras.

Microscopio de fluorescencia
Usa luz U.V. con una longitud de onda (100 y
380 nm) menor que la luz blanca (380 a 750
nm). Esta luz excita ciertas sustancias que
emiten radiaciones (mayor a 380 nm) que las
hace visibles.
Algunos materiales no requieren colorantes
pues tienen fluorescencia propia y otros
deben ser teidos con colorante fluorescente,
es estimulado por un haz de luz, emitiendo
parte de la energa absorbida como rayos
luminosos.
La imagen observada es el resultado de la
radiacin electromagntica emitida por las
molculas que han absorbido la excitacin
primaria y reemitido una luz con mayor
longitud de onda.
Para dejar pasar slo la emisin secundaria
deseada, se deben colocar filtros apropiados
debajo del condensador y encima del
objetivo
Se usa para detectar sustancias con
autofluorescencia (vitamina A).
Clulas epiteliales , triple coloracin: ncleo
(azul), microtubulos (verdes), actina (rojo).

Microscopio de fluorescencia

-Las muestras deben estar teidas

con fluoroforos
-Anticuerpos conjugados
-Hoecht (tie DNA)
-Expresion de proteinas
de fusion fluorescentes
(GFP)

-Las muestras son excitadas a una

longitud de onda y fluorescen
emitiendo a una longitud de onda
mayor.

Filtro de emision

Muestra

Condensador de campo oscuro

Lampara

Filtro de excitacion

Operacin del microscopio

Coloque el objetivo de menor aumento en posicion de empleo,
y baje la platina completamente.
Colocar la preparacion sobre la platina, y sujetela con las pinzas.
Realizar el enfoque:
Acercar al maximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el
tornillo macrometrico. Eso debe hacerse mirando directamente y no a travs
del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacion.
Mirando a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo, con el
macrometrico, y cuando se observe ntida la muestra, girar el micromtrico,
hasta obtener un enfoque fino.

Pasar al siguiente objetivo. La imagen deber estar ya casi

enfocada, y suele ser suficiente con mover un poco el
micromtrico para lograr el enfoque fino.

Mantenimiento y precuaciones
Al finalizar el trabajo, dejar puesto el objetivo de
menor aumento
Cuando no se usa mantenerlo cubierto para evitar
que se ensucien los lentes.
Nunca tocar los lentes con las manos
Despues de usar el objetivo de inmersion, limpiar el
aceite con pauelos para ptica, con una mezcla
alcphol acetona ( 7:3) o con xilol

El microscopio electrnico
En el, la luz se sustituye por un haz de
electrones que pasan por un tubo (con vaco
para mejorar el paso de los electrones).
Aumenta la imagen con lentes
magnticas.
Aumenta las imgenes hasta un milln de
veces.
Las imgenes que se producen son en
blanco y negro y muchas veces tienen
colores falsos.
Oculares. Lentes a travs de las que
se observa la preparacin ampliada
(externos).
Objetivos. Lentes que aumentan el
tamao de la imagen (internos).
Iluminacin. Can de electrones que
genera un haz que puede atravesar la
muestra o rebotar en ella (interno).

Microscopio electrnico
Los electrones chocan con la
muestra y se desvan, y estas
desviaciones son recogidas
por la pantalla.
Observamos la imagen a
travs de una pantalla que es
excitada por los electrones
que llegan a ella (mecanismo
similar a la televisin).
Las imgenes se recogen en
una placa fotogrfica que es
impresionada directamente
por los electrones.

El Microscopio Electrnico de Transmisin(MET)

Un MET mira a replicas de clulas
muertas , despus de haber sido
fijadas y teidas con ones de
metales pesados.
Los electrones son dispersados
cuando pasan a travs del
espcimen, y luego detectados y
proyectados hacia una
imagen sobre una pantalla
fluorescente.
El microscopio electrnico de
transmisin (MET) tiene un
limite de resolucin de cerca de
2 nm.

Microscopio electrnico de transmisin

UNIDAD

Imgenes en el MET

Slo permite observar clulas muertas, pero la ventaja es

que permite estudiar las estructuras internas de los
orgnulos celulares.
En este caso las muestras deben
ser muy finas para que puedan ser
atravesadas por los electrones y
tienen que estar deshidratadas.

El Microscopio Electrnico de Barrido

(MEB)
Al igual que el MET, el MEB
permite mirar a clulas
muertas, despus de haber
sido fijadas y teidas con
ones de metales pesados.
Con esta tcnica los electrones
son reflectados sobre la
superficie del espcimen.
Sirve para examinar la superficie
de los objetos y muestra la
forma real de los objetos.

Microscopio electrnico de barrido

Microscopio de
Campo Claro
Alga verde
(eucariota)

Microscopio de
Fluorescencia
Bacteria filamentosa
Teida con naranja
de acridina

Microscopio de Contraste
de Fases
Saccharomyces cerevisiae

EJERCICIO
Observa detenidamente las siguientes fotos tomadas
mediante microscopio (micrografas) y seala qu tipo de
microscopio se utiliz en cada caso. Justifica

a. Ameba, organismo
formado por una sola
clula (unicelular), que
mide cerca de 50
micrones

b. Clulas del interior de una

trompa de Falopio. Cada uno
de los pelitos que se ven
mide 10 micrones de largo y
se llaman cilios

c. Espermio
acercndose a un
vulo. El vulo
humano es una
clula que mide
poco ms de 100
micrones

d. Ncleo de una
clula animal, de
alrededor de 5
micrones de
dimetro

e. Corte transversal de una

hoja, espesor 1 mm

f. Poros de salida de
glndulas gstricas.
Por una de ellas sale
un chorro de jugo
gstrico. Diametro de
poro, 5 micras

g. Corteza cerebral
humana, que tiene un
espesor de unos pocos
milmetros

h. Glbulo blanco
deformado al atravesar
por un capilar
sanguneo. Este capilar
tiene un dimetro de
unos 10 micrones

i. Capilar sanguneo
cortado
transversalmente,
por el que asoma un
glbulo rojo, clula
que mide 7 micrones
de dimetro

TINCION
Una tincin o coloracin es una tcnica utilizada en microscopa
para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio.
Para mejor aprovechar la observacin microscpica, debe
relacionarse el comportamiento del tinte con la composicin qumica
de las partes de la anatoma bacteriana.
Los colorantes utilizados son compuestos orgnicos con grupos
cromforos y auxocromos unidos a anillos aromticos.
Cromforos son los grupos funcionales de la molcula responsables
de la absorcin. Principalmente son: dobles y triples enlaces carbonocarbono, sistemas aromticos, grupo carbonilo, imino (C=N), diazo
(N=N), nitro y enlaces C-Y (Y es un tomo con pares libres).
Auxocromos es un grupo funcional que no absorbe por si solo pero
que tiene los efectos de desplazar picos de los cromforos hacia
longitudes de onda larga adems de aumentar sus intensidades:
metilo, halgenos, hidroxi, alcoxi, amino.

Tipos de Colorantes
Cationicos: se combinan con los constituyentes celulares
cargados negativamente tales como acidos nucleicos, polisacaridos
acidos y superficies celulares. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal
violeta, Safranina.

Colorantes

Anionicos: se combinan con los constituyentes celulares

cargados positivamente, tales como numerosas proteinas. Ejemplos:
Eosina, Fucsina acida y Rojo congo.

Liposolubles: se combinan con las sustancias grasas. Ejemplos:

Sudan negro.

Tipos de tincin
Tincin in vivo (colorantes vitales) es el proceso de teir
tejidos vivos.
El propsito ms comn es revelar detalles de la
citoestructura.
Para conseguir el efecto deseado, el colorante usualmente se
utiliza en soluciones muy diluidas que van entre 1:5000 a
1:50000. A pesar de esto las tinciones son eventualmente
txicas para los organismos.
Ejem: el verde Jano y el azul de metileno.
Tincin in vitro (colorantes no vitales). Involucra el coloreo de
clulas o estructuras que han sido removidas de su contexto
biolgico.
Ejem: tincion Gram.

Colorantes histolgicos ms comunes

Azul brillante de Coomassie
Tie en forma no especfica a todas las protenas con un fuerte color azul. Se
utiliza para teir corridas de protenas en electroforesis en gel.
Azul de metileno
Se utiliza para teir clulas animales, para hacer ms visibles sus ncleos.
Azul Nilo
Tie a los ncleos de color azul. Tambin puede ser utilizado para teir
clulas vivas.
Bromuro de etidio
(BE) se intercala en el ADN y le otorga un color rojo naranja fluorescente. A
pesar de que no es capaz de teir clulas vivas ya que no atraviesa las
membranas intactas, puede ser utilizado para identificar clulas que se
encuentran en las etapas finales de la apoptosis, ya que tales clulas poseen
unas membranas mucho ms permeables.

 Carmn
Es un colorante de un intenso color rojo que puede ser
utilizado como sal de litio para teir glicgeno, mientras que las
sales de alumbre-carmn son colorantes que se adhieren al
ncleo. Las tinciones con carmn requieren del uso de un
mordiente, que usualmente es aluminio o alumbre.
Cristal violeta
El cristal violeta, al ser combinado con un mordiente adecuado,
tie las paredes celulares de color prpura.

MORDIENTES

Son sustancias capaces de formar complejos

insolubles con los colorantes y que ayudan al
proceso de coloracin: los mordientes.
Ejemplos de mordientes comnmente usados
son el Lugol, el cido tnico y algunas sales.

TCNICAS PARA REALIZAR UNA

PREPARACIN COLOREADA
a) Frotis o pelcula (extensin)
b) La fijacin
c) Coloracin.

Tinciones
Simples: uso de un solo
Positivas: se emplea el
uso de colorantes que tien al
microorganismo y no al
medio.

2 tipos de
tinciones

colorante. Sirven para

distinguir formas.

Diferenciales: uso de un
colorante inical y luego un colorante
de contraste. Sirven para diferenciar
distintos tipos de celulas (Ejemplo:
tincion Gram)

Negativas: se emplea el uso de colorantes que no tienen afinidad por

los constituyentes celulares (Ejemplo: nigrosina). Tien al medio y no a
las bacterias, sirven para ver celulas con capsulas de
mucopolisacaridos.

Observacin en fresco y coloracin vital.

Cuando se desea observar bacterias sin afectar su
viabilidad, puede realizarse una observacin en fresco
(sin colorear) o utilizar colorantes diluidos como por
ejemplo cristal violeta 1/5000. Con esta tcnica podr
observarse la morfologa y agrupacin de las
bacterias as como tambin la movilidad.

Observacin en fresco. Tcnica.

1- Sobre un portaobjetos colocar con el asa una gota
de agua y realizar una suspensin de la muestra en
estudio. No extender.
2- Colocar un cubreobjetos.
3- Observar con poca luz.

Coloracin vital.
El procedimiento es similar al de la observacin en
fresco pero en el paso 1, se coloca una gota de
solucin diluida de colorante en lugar del agua

Tincin negativa.
Se utilizan sustancias que no penetran en la clula y tie
el fondo quedando los microorganismos incoloros.
Normalmente el tamao de las bacterias observadas por
esta tcnica es mayor que el real y no debe utilizarse para
la medicin de microorganismos.
Los agentes ms utilizados son la nigrosina y la tinta
china.
Con este mtodo pueden observarse morfologa y
agrupacin as como tambin estructuras extracelulares
como la cpsula.

Tcnica.
1- Colocar sobre un portaobjetos, con la ayuda de un asa,
una gota de una solucin acuosa de nigrosina al 10 %.
2- Tomar una porcin del cultivo, suspender en la gota de
nigrosina y extender en forma de valo.
3- Dejar secar (no exponer al calor) y observar con
objetivo de inmersin.

TINCIN SIMPLE
Tincin de clulas para
la observacin microscpica

Extensin de una fina capa

de clulas sobre el porta

Adicin del colorante

lavado y secado

Secado al aire

Fijacin por flameado del porta

Se coloca una gota de aceite

de inmersin sobre el porta y
se observa con el objetivo de
100X

COLORACIONES ESPECFICAS.

Coloracin de Gram.
Esta coloracin fue ideada por el bacterilogo dans Christian Gram en el ao 1883
y ha demostrado ser de suma utilidad. Permite separar los microorganismos en
Gram (+) y Gram (-) lo cual reviste especial importancia taxonmica.
En esta tcnica, el preparado fijado por calor se trata primeramente con cristal
violeta, luego se agrega Lugol como mordiente, se decolora con alcohol-acetona y
finalmente se contracolorea con fucsina o safranina. Las bacterias Gram(+) sern
las que resulten violetas luego del procedimiento de coloracin de Gram mientras
que las Gram (-) se vern rojas.
La explicacin de las diferencias en el comportamiento tintorial entre bacterias G(+)
y G(-), debe buscarse en la estructura y composicin de la pared celular bacteriana.

TINCIN DIFERENCIAL

TINCIN DE GRAM
Tincin del frotis
Paso 1

Paso 2

Previamente fijado al calor,

con cristal violeta
Durante 1 minuto.
Todas las clulas se tien
de color azul-violeta.

Aadir Lugol,
dejar actuar 2 minutos
Todas las clulas siguen
de color azul-violeta.

Gram +

Decolorar con alcohol

Paso 3

Las clulas Gram +

siguen de color azul-violeta.
Las Gram negativas
se decoloran.

Tincin de contraste
Con safranina 2 minutos.

Paso 4

Las clulas G+
se ven azul-violeta.
Las G- rosas o rojas.

Gram -

Tincin Gram
Permite distinguir dos grandes grupos de bacterias que poseen diferencias
estructurales en la pared celular.
Peptidoglicano
Polimero de N-acetilglucosamina y N-acetilmuramico unidos por peptidos.

Tincin Gram

Tincin Gram
Protocolo
1) Preparar un extendido
A partir de cultivos en medio liquido: Se toma un poco de
cultivo con el ansa y se desparrama sobre un portaobjeto.

A partir de cultivos en medio solido: Se apoya el ansa sobre

una colonia, luego se coloca una gota de agua sobre el
portaobjeto y se desparrama el material con el ansa..

Tincin Gram
Gram +

2) Fijar el material
Una vez que el material esta seco, pasar
el portaobjeto sobre el mechero.

3) Cubrir el portaobjeto con

Cristal violeta
Se deja el colorante durante 20
segundos.

4) Lavar con agua

Gram _

Tincin Gram
Gram +

Gram _

5) Agregar el mordiente (lugol)

(Lugol: solucion de I2 y KI). Se deja actuar el
mordiente durante 20 segundos y luego se
lava con agua.

6) Agregar el decolorante
(Decolorante: solucion de acetona y EtOH).

El agregado del decolorante produce una DESHIDRATACIN de la pared de

pptido glicano que la transforma en una barrera fsica impermeable al
solvente.
Como consecuencia se impide el lavado del cristal violeta, quedando
atrapado en el interior de las bacterias Gram +.

Tincin Gram
Gram +

7) Agregar el colorante de
contraste (safranina)

8) Lavar con agua

Gram _

Tincin Gram
Rosa (Gram -)

Violeta (Gram +)

Tincin de esporas
Clasificacin en funcin de su posicin

Tincin de esporas
Protocolo:

1)

Preparacion del extendido y fijacion por

calor.
2)

Cubrir con verde de malaquita calentando

durante 3 minutos.

3)

Lavar con agua.

4)

Agregar colorante de contraste

(safranina).

5)

Lavar con agua.

Tincin de acido resistencia (Ziehl-Neelsen)

Permite distinguir bacterias del genero Mycobacterium. Estas poseen en su
pared acido micolico (hidroxilipido de cadena ramificada que se encuentra
acomplejado al peptido glicano de la pared celular.