UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD CIENCIAS QUIMICAS

MICROBIOLOGIA I

MANUAL DE LABORATORIO
MICROBIOLOGIA I
SISTEMATIZADO Y COMPENDIADO: Q.F MARIANA RENDON MARISCAL
MSc.

Docente: Q.F Marianita Rendn M MSc.

INDICE
CONTENIDO
INTRODUCCION
CONSIDERACIONES GENERALES DEL TRABAJO DE LOS ESTUDIANTES
PRACTICA No 1
BIOSEGURIDAD
PRACTICA No 2
MEDIOS DE CULTIVO
PRACTICA No 3

CONTROL DE LOS MICROORGANISMOS .- DESCONTAMINACION y

ESTERILIZACION.- MANEJO DE INOCULOS: TECNICA

PAGINA

3
6
7
31

39

PRACTICA No 4

MICROSCOPIO.- TINCION SIMPLE Y TINCION DE GRAM

46

PRACTICA No 5

TINCION DE ALCOHOL ACIDO RESISTENTES

54

PRACTICA No 6

LEVADURAS.- IDENTIFICACION MICROSCOPICA LEVADURAS.IDENTIFICACION MICROSCOPICA DE HONGOS

PRACTICA No 7
SIEMBRA Y METODOS DE SIEMBRA

57
62

PRACTICA NO 8

METODOS DE CUANTIFICACION DE LOS MICROOGANISMOS

73

INTRODUCCIN
Es aconsejable que toda persona que labore en un laboratorio de Bacteriologa o en
cualquier otra rea de la Microbiologa, no tenga riesgos innecesarios ya que el
descuido, la negligencia y las prcticas poco seguras pueden causar daos serios,
no solo en los individuos, sino tambin en los colaboradores o en los pacientes.

CADA PROFESIONAL DE LA SALUD ES RESPONSABLE POR SU

SEGURIDAD Y LA DE SUS COMPAEROS (ORGANIZACION
PANAMERICANA DE LA SALUD)
Se entiende que la bioseguridad es el conjunto de polticas destinadas a mantener la
vigilancia, para proteger el medio ambiente, la salud y la seguridad de los profesionales
de la salud que realizan actividades frente a riesgos ocupacionales procedentes de
agentes biolgicos, fsicos o qumicos. Su objetivo es implementar una serie de acciones
que garantizan una mejor calidad de vida.
Por lo cual, se han implementado una serie de normas, tendientes a disminuir el riesgo
de transmisin de microorganismos a partir de fuentes reconocidas o no reconocidas de
infeccin en Servicios de Salud, relacionadas a accidentes por exposicin a sustancias,
sangre y fluidos corporales potencialmente peligrosos.
Las siguientes consideraciones generales pueden hacer menos riesgosas las
actividades a realizar en el laboratorio:
Sugerencias generales e informacin.
1.- Cada persona que labore en el laboratorio, debe ser informado acerca de la
ubicacin y la operacin de cada uno de los equipos de seguridad y las instalaciones,
tales como extinguidores, duchas y lavaojos, los cuales deben ser fcilmente accesibles
en el laboratorio.
2.- Los equipos de proteccin personal, que incluyen entre otros; guantes y bata, debe
ser utilizados cuando sea indicado. La bata debe ser usada cerrada (abotonada) en todo
momento y es necesario quitrsela al abandonar el laboratorio.
3.- Los hbitos y el arreglo personal debe de tomarse en cuenta. El cabello largo debe
atarse, de modo que no interfiera con el trabajo. Se debe evitar la aplicacin de
cosmticos dentro del rea de trabajo. Las sandalias y zapatos abiertos estn
contraindicados ya que no protegen al pie. En lo posible, no llevarse los dedos y los
lpices a la boca.
4.- Es aconsejable no llevar lentes de contacto puestos en el laboratorio ya que
absorben solventes. Es recomendable usar lentes de seguridad cuando se trabaja con
material custico o infeccioso.
5.- Esta prohibido comer o almacenar alimentos y bebidas en el laboratorio o en el
refrigerador del laboratorio. Por tal motivo se debe designar un refrigerador especfico
para almacenar alimentos del empleado.
6.- Esta absolutamente prohibido pipetear con la boca cualquier material. Por lo que se
aconseja emplear accesorios para pipetas.
7.- Cada sesin de laboratorio deber iniciarse con una explicacin y tiempo de
instrucciones.
3

8.- No inicie a trabajar hasta que haya recibido las instrucciones.

9.- Pregunte cuando no entienda el mtodo o la finalidad de algn experimento.
10.- La buena tcnica de laboratorio depende primordialmente de que se conozca lo que
se va a hacer.
11.- Anote cuidadosamente todas las observaciones en el momento de hacerlas.

NORMAS A SEGUIR EN EL LABORATORIO.

1.- Limpie la superficie de su mesa con una solucin germicida, al principio y al final de
cada sesin de laboratorio.
2.- Mantenga la mesa libre de todo lo que no sea esencial y al final de la sesin djela
limpia y libre de material y equipo (guardar todo en su sitio)
3.- Ponga todo el material CONTAMINADO en las .canastilla para este fin
4.- Debido a que algunos de los microorganismos con que se va a trabajar son
patgenos en potencia, es necesario desarrollar tcnicas de asepsia al manejarlos y
transferirlos.
5.- Evite contacto de la boca con las manos, comer o humedecer las etiquetas con la
lengua.
6.- Informe inmediatamente al instructor de cualquier accidente tal como cortaduras,
quemaduras o derrame de cultivos.
7.- Tome todas las precauciones posibles para evitar estos a accidentes.
Precauciones sistemticas de seguridad.
Material de vidrio
1.- Desechar todo material de vidrio que est quebrado o rajado, y colocarlo en
recipientes adecuados.
2.- Recoger los vidrios rotos con escobilln y pala; no hacerlo con la mano.
3.- Los artculos de vidrio no deben ser arrojados a la pileta ni arrojarlos sueltos a un
cesto de desperdicios en el que se arrojan artculos de papel.
Muestras y derrames
1.- Las muestras se deben de recolectar en recipientes slidos, con cierres adecuados
para evitar derrames y prdidas. Todas las muestras deben ser consideradas
potencialmente peligrosas.
2.-Las cortaduras en las manos debern ser adecuadamente protegidas con tela
adhesiva. Si la actividad laborar implica en manejo de sangre, suero, plasma u otras
muestras, se debe de usar guantes desechables.
3.- Si una muestra presenta evidencia de rotura, derrame o suciedad dentro del
recipiente, ponerse guantes.
4.- Las muestras contaminadas con sangre deben ser rechazadas. Manipularlas solo
con guantes. Notificar este hecho como peligroso para la salud.
5.- Lavarse las manos minuciosamente con agua y jabn varias veces al da, en
particular despus de manipular las muestras y antes de retirarse.
6.- Inunde con solucin desinfectante cualquier rea donde haya ocurrido un derrame de
sangre o suero. Utilizando guantes, toallas de papel o gasa para absorber e lquido, y
luego realice un lavado minucioso con agua. Guarde en una bolsa todo el material
empleado contaminado, para eliminarlo como material infeccioso.

Manipulacin de desperdicios.
1.- Reserve algunas de las piletas del laboratorio para eliminar muestras de sangre y
orina. No permitir el lavado de manos en estas piletas.
2.- Eliminar en recipientes adecuados y rotulados; tubos con sangre, pipetas, puntas,
agujas.
3.- El material de vidrio o cortante debe ser eliminado en recipientes adecuados de
paredes slidas.
4.- Llevar estos recipientes al rea de desecho con la frecuencia necesaria para evitar
su acumulo.
5.- Sumerja el material de vidrio contaminado en solucin desinfectante. Enjuague
minuciosamente con agua y esterilizarlo antes de usarlo otra vez.
NOTA: Recuerde que las medidas de seguridad estn dirigidas al manejo adecuado de
productos Corrosivo, Reactivos. Explosivos, Txico, Inflamables, Biolgicos-infecciosos
(CRETIB) y Radioactivos con el fin de evitar riesgos

CONSIDERACIONES GENERALES DE TRABAJO DE LOS ESTUDIANTES

EN EL LABORATORIO
Es muy importante para su seguridad y la de sus compaeros observar siempre las
siguientes medidas mnimas de seguridad.
Es obligatorio concurrir al laboratorio con su uniforme, guantes, mascarillas, pluma y
hojas de carpeta de lnea.
Todo el material que use en el laboratorio debe considerarse como
CONTAMINADO y, por lo tanto, debe manejarse con cuidado, procurando no
dejarlos en los mesones sino eliminarlos slo en los recipientes dispuestos para ello.
En la eventualidad de cualquier accidente, por pequeo que parezca, debe
comunicarse inmediatamente al profesor a cargo de la actividad.
Respete siempre las indicaciones que se darn durante las primeras actividades
prcticas respecto al uso del mechero para la esterilizacin de asas, tubos u otros
materiales.
Est estrictamente prohibido ingerir cualquier tipo de alimento o bebida en el
laboratorio. Jams debe sacar material contaminado o cultivos bacterianos fuera del
laboratorio.
No haga bromas, ni permita que sus compaeros las hagan, con cultivos bacterianos
o material contaminado.
Al terminar su trabajo prctico debe limpiar su rea de trabajo con la solucin
desinfectante que se le proporcionar. Su microscopio debe quedar igualmente
limpio y debidamente guardado.
Al terminar el trabajo en el laboratorio lave cuidadosamente sus manos.
Se debe entregar un informe de la practica realizada antes de retirarse del laboratorio
(formato de informe en anexos)

PRACTICA N 1
TEMA: LA BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
COMPETENCIAS
CONOCER LAS NORMAS DE BIOSEGURIDAD PARA LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIA

TALLER DE BIOSEGURIDAD
1. NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD BIOLGICA EN EL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGA CLNICA
La peligrosidad de un agente est directamente relacionada con el tipo de manipulacin
a la que es sometido. Por ello es bsico:
1. Conocer los agentes, sustancias y productos peligrosos que existen en el laboratorio.
2. Conocer la metodologa de trabajo del laboratorio.
3. Conocer el equipamiento del laboratorio.
4. Conocer las medidas a tomar en caso de emergencia.
5. Conocer las leyes relacionadas con la seguridad Biolgica.
6. Respetar y hacer cumplir todo lo anterior.
Para que se produzca un accidente por agente biolgico deben concurrir bsicamente
cuatro elementos: un husped susceptible, un agente infeccioso, una concentracin
suficiente de ste y una ruta de transmisin apropiada. De todos ellos, el que mejor se
puede controlar en el laboratorio es la ruta de transmisin.
Las rutas de transmisin ms comunes en el laboratorio son la area y la inoculacin
directa, muy por encima de todas las dems, aunque la oral, la percutnea y el contacto
directo con la piel o las mucosas tambin son posibles.
Los microorganismos pueden penetrar en el organismo a travs de la boca (ingestin),
por los pulmones (inhalacin), a travs de la piel (inyeccin) y por los ojos.
Pueden ser ingeridos cuando se pipetea con la boca y pueden tambin penetrar en ella
mediante los dedos y artculos contaminados en las mesas de laboratorio, por ejemplo,
cigarrillos, comida, lpices. Dicha contaminacin ambiental puede ser consecuencia de
derramamientos y salpicaduras que no se descubren o que se desinfectan
inadecuadamente.

La inhalacin de partculas infectadas transmitidas por el aire (aerosoles), que se liberan

durante muchas manipulaciones en el laboratorio habituales, han causado
probablemente el mayor nmero de enfermedades relacionadas con el laboratorio.
La inyeccin puede ser consecuencia de heridas accidentales con agujas hipodrmicas,
pipetas Pasteur o material de vidrio infectado roto. Los grmenes pueden tambin
penetrar en el organismo a travs de cortes y abrasiones de la piel, algunas de ellas de
tamao tan pequeo como para que pasen desapercibidas para el propio investigador.
Las salpicaduras de lquidos infectados en los ojos han sido la causa de un gran nmero
de infecciones, algunas mortales.
Las vas de infeccin en las enfermedades adquiridas en el laboratorio no son
necesariamente las mismas que las de las infecciones adquiridas naturalmente.
Adems, la dosis infectante puede ser mucho mayor y, por tanto, los sntomas pueden
ser diferentes.
Siendo imposible determinar a ciencia cierta si cualquier material biolgico est
contaminado con microorganismos del grupo 2 3, ciertas muestras (respiratorias, etc.)
en las que sea posible que exista un microorganismo del grupo 3 deben manipularse
rutinariamente en las cabinas de Seguridad Biolgica (CSB).
1.1. MEDIDAS GENERALES
Son de obligado cumplimiento en cualquier rea del laboratorio.
- El acceso al laboratorio estar limitado al personal autorizado.
- No deben entrar en el mismo familiares ni amigos.
- El personal del laboratorio debe implicarse en el cumplimiento de las normas de
seguridad.
- Todas las reas estarn debidamente marcadas con la seal de riesgo biolgico y su
nivel de contencin.
- Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas para mantener la adecuada
contencin biolgica.
- Todas las superficies de trabajo se limpiarn y desinfectarn diariamente y siempre
que se produzca un derrame. Los residuos y muestras peligrosas que van a ser
incinerados fuera del laboratorio deben ser transportados en contenedores cerrados,
resistentes e impermeables siguiendo las normas especficas para cada tipo de residuo.
- El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado y no es aconsejable utilizar los
pasillos como almacn. Siempre debe quedar un espacio libre no inferior a 120 cm para
poder evacuar el laboratorio en caso de emergencia.
- El transporte de las muestras dentro o entre laboratorios se realizar de tal manera
que, en caso de cada, no se produzcan salpicaduras. Lo recomendable es hacerlo en
cajas hermticas o neveras transportables. Estas cajas o neveras debern ser rgidas y
resistentes a los golpes, contar con materiales absorbentes en su interior y de fcil
8

desinfeccin. Se etiquetarn o identificarn de forma oportuna y no podrn ser utilizadas

para otros fines. Bajo ningn concepto se pueden transportar las muestras a mano.
- La ropa protectora, fcilmente ajustable y confortable, as como guantes, gafas, etc.
debe estar disponible en todo momento. La ropa protectora de las reas con nivel de
contencin 3 (cubrebatas) nunca debe ser usada fuera del rea de trabajo y si se quita
debe de ser desechada automticamente en una bolsa de material contaminado. Jams
debe volver a ser usada.
- Todo el personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto de la piel con
materiales potencialmente infecciosos. Con este fin deben usarse guantes cuando se
manipulen muestras o cultivos que contengan posibles patgenos. Los guantes siempre
sern desechados antes de salir del rea de trabajo. Jams se saldr de la misma con
los guantes puestos, ni con ellos se coger el telfono, se tocarn los volantes, etc.
- Tras quitarse los guantes, se realizar un lavado de manos.
- Se usarn gafas protectoras y mascarillas faciales si existe riesgo de salpicaduras y/o
aerosoles.
- Se pondr extremo cuidado en minimizar el riesgo de autoinoculacin y de generacin
de aerosoles.
- Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente al Supervisor y al
Jefe del Laboratorio y hacerse constar por escrito.
- Nadie podr trabajar en el rea de tuberculosis con una prueba de Mantoux negativa.
- Est rigurosamente prohibido pipetear con la boca. Se realizar pipeteo automtico con
material adecuado y cada trabajador ser instruido para manejarlo debidamente.
- En la zona de trabajo no debe colocarse material de escritorio ni libros ya que el papel
contaminado es de muy difcil esterilizacin.
- No debern usarse lentes de contacto.
1.2. HIGIENE
- El personal con el cabello largo debe llevarlo recogido.
- Comer, beber, fumar y aplicarse cosmticos esta formalmente prohibido en el rea de
trabajo del laboratorio, as como el almacenamiento de comida o bebida.
- El personal debe lavarse las manos frecuentemente durante las actividades rutinarias,
tras acabar la jornada laboral y siempre antes de abandonar el laboratorio (almorzar). Se
usar un jabn antisptico y el secado se realizar con papel.
- Las heridas y cortes en las manos, si se han producido en el Laboratorio, sern
comunicados al responsable de la Seccin correspondiente, as como al Supervisor, que
lo registrar haciendo constar todas las circunstancias. Las heridas y cortes deben ser
convenientemente vendados y despus es imprescindible ponerse guantes.

1.3. OBJETOS PUNZANTES Y CORTANTES

- El uso de agujas hipodrmicas y jeringas debe ser limitado. Slo deben usarse las
unidades ya montadas.
- Nunca se debe volver a poner la capucha a las agujas y stas no deben ser torcidas ni
separadas de la jeringa.
- Las agujas y jeringas usadas, as como los bistures, deben ser desechados slo en
contenedores especiales diseados para este propsito.
2. NORMAS GENERALES DE UTILIZACIN DE EQUIPOS

Los equipos y aparatos nunca deben colocarse en zonas de paso, en particular

en los pasillos del laboratorio.
Todos los aparatos con toma elctrica debern cumplir las normativas de
seguridad correspondientes. Nunca deben utilizarse en zonas mal aisladas y
expuestas a la humedad.
Las fuentes de calor (calentadores, termobloques, etc.), sobre todo si se alcanzan
temperaturas elevadas, debern estar debidamente sealizadas para evitar
quemaduras accidentales.
Todos los procedimientos de utilizacin de aparatos deberan contar
obligatoriamente con apartados relativos a su utilizacin segura.

2.1. NEVERAS Y HABITACIONES FRIGORFICAS

Un adecuado mantenimiento, limpieza y desinfeccin sistemticos de los aparatos
reduce considerablemente los riesgos asociados a su utilizacin. Sin embargo, aun en
estas condiciones, hay que tener en cuenta lo siguiente:

No deben almacenarse cultivos de microorganismos patgenos por inhalacin en

recipientes que no estn convenientemente cerrados, especialmente si la cmara
tiene un sistema de circulacin de aire.
No deben almacenarse reactivos que contengan compuestos voltiles inflamables
(ter etlico, por ejemplo) en neveras que no posean un sistema de proteccin
antideflagracin. En los aparatos de tipo domstico que se utilizan en el
laboratorio debe anularse la lmpara de la luz.

2.2. CONGELADORES
La congelacin es un proceso que mantiene la viabilidad de muchos agentes
infecciosos, de ah un potencial riesgo y las siguientes recomendaciones:

Tratar de identificar en ficheros, listas, etc. el contenido de lo almacenado y sus

riesgos potenciales.
El material potencialmente infeccioso debe colocarse en tubos, recipientes, etc.
bien cerrados. No se llenarn completamente, para evitar que rebosen por efecto
del aumento de volumen tras la congelacin.
Descongelar peridicamente, limpiar y desinfectar si fuese procedente.
Utilizar guantes para manipular el contenido. Si la temperatura es baja (por
ejemplo -70C o inferior), los guantes representan una proteccin adicional.
10

2.3. ESTUFAS E INCUBADORES

La limpieza y la desinfeccin, peridicas y sistemticas, son el mtodo recomendable
para reducir los riesgos derivados de la contaminacin accidental del personal del
laboratorio.
2.4. MICROONDAS
Los microondas cada vez son ms populares en el Laboratorio de Microbiologa y
constituyen una nueva fuente de accidentes, entre los ms frecuentes las explosiones
cuando se usan para calentar medios con agar, ya que la diferencia de velocidad de
calentamiento produce burbujas que pueden estallar.

Las botellas o matraces deben tener el tapn aflojado, ya que si est cerrado
estallan fcilmente.
Estar siempre presente, con la ropa y pantalla facial adecuadas, y controlar la
intensidad del aparato, que slo puede ser la mxima con agua y la mnima si se
usa con agar.
Deber existir una tabla bien visible de los tiempos en cada posicin del
potencimetro y de las cantidades a emplear.
Los microondas interfieren con los marcapasos. No deben ser colocados a una
distancia inferior a 2 m de las personas que sean portadoras de uno de estos
dispositivos.

2.5. AUTOCLAVES
Los autoclaves deben poseer manmetro y termostato, as como vlvula de seguridad,
sistema de desconexin rpido y la purga del vapor ha de realizarse a un recipiente
estanco y con agua, jams directamente al exterior.

No deben usarse si no se conocen perfectamente todos los mandos y su

fundamento.
Usar guantes especiales para protegerse del calor.
No abrir jams si el manmetro no est a 0 y la purga no ha sido abierta.
Controlar una vez al mes su capacidad de desinfeccin mediante esporas, no
siendo suficiente el mtodo qumico. El uso de registros de presin y temperatura
de cada proceso y la instauracin de un programa de mantenimiento tambin
puede ser una alternativa vlida al control mediante esporas. El agua debe ser
cambiada regularmente.

2.6. CENTRFUGAS
Los mayores riesgos derivan, sobre todo, de la contaminacin por los aerosoles
generados durante la centrifugacin de materiales biolgicos y, en menor medida, de los
traumatismos accidentales. Se recomienda:

Cuando se centrifugue material biolgico potencialmente infeccioso deben

utilizarse tubos cerrados; la centrfuga debe disponer de rotores o cestillos de
seguridad que protejan al operador de los posibles aerosoles.
La rotura accidental de un tubo y su vertido en la cubeta representa una
incidencia importante que debe ser comunicada inmediatamente al Supervisor o
11

responsable, de forma que se proceda a la desinfeccin segura del aparato.

No se deben utilizar centrfugas antiguas que no posean sistema de cierre de
seguridad, del que disponen todos los aparatos actuales, ni manipular stas de
forma que permitan su apertura mientras estn en funcionamiento.
Si el laboratorio dispone de ultracentrfugas, el equilibrado cuidadoso del rotor es
fundamental.

2.7. MISCELNEA

Las bombas de vaco y los aspiradores debern contar con las correspondientes
trampas y filtros.
Los baos de agua (baos mara) debern contener un desinfectante adecuado,
ser limpiados una vez a la semana y desinfectados con periodicidad mensual.
En la zona de trabajo no debe colocarse directamente material de escritorio ni
libros, ya que el papel contaminado es de difcil esterilizacin o desinfeccin.

PRINCIPIOS BSICOS DE LA SEGURIDAD BIOLGICA

1.1. DEFINICIONES
Agentes biolgicos. Microorganismos, con inclusin de los genticamente modificados,
cultivos celulares y endoparsitos humanos susceptibles de originar cualquier tipo de
infeccin, alergia o toxicidad.
Microorganismo. Toda entidad microbiolgica, celular o no, capaz de reproducirse o de
transferir material gentico.
Cultivo celular. El resultado del crecimiento in vitro de clulas obtenidas de organismos
multicelulares.
Peligro. Todo aquello que puede producir un dao o un deterioro de la calidad de vida
individual o colectiva de las personas.
Dao. Es la consecuencia producida por un peligro sobre la calidad de vida individual o
colectiva de las personas.
Riesgo. Probabilidad de que ante un determinado peligro se produzca un cierto dao,
pudiendo por ello cuantificarse.
Desinfeccin. Eliminacin de agentes infecciosos que estn fuera del organismo por
medio de la exposicin directa a agentes qumicos o fsicos.
Contaminacin. Presencia de un agente infeccioso en la superficie del organismo;
tambin en vestimenta, ropa de cama, juguetes, instrumentos quirrgicos, apsitos u
otros objetos inanimados o substancias, incluyendo el agua y los alimentos.
Esterilizacin. Destruccin de todas las formas de vida por calor, radiacin, gas o
tratamiento qumico.
12

Limpieza. Eliminacin, mediante fregado y lavado con agua caliente, jabn o un

detergente adecuado, o por el empleo de una aspiradora, de agentes infecciosos y
substancias orgnicas de superficies en las cuales stos pueden encontrar condiciones
adecuadas para sobrevivir o multiplicarse.
1.2. CLASIFICACIN DE LOS AGENTES BIOLGICOS POR GRUPOS DE RIESGO
Se clasifican los agentes biolgicos en cuatro grupos en funcin del riesgo de
infeccin:
Agente biolgico del grupo 1. Aqul que resulta poco probable que cause una
enfermedad en el hombre.
Agente biolgico del grupo 2. Aqul que puede causar una enfermedad en el hombre
y puede suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco probable que se
propague a la colectividad y existiendo generalmente profilaxis o tratamiento eficaz.
Bacterias, Chlarnydias, Mycoplasmas y Rickettsias
Actinobacillus spp.
Actinomadura pelletieri
Actinomyces spp.
Bacillus cereus
Bacteroides spp.
Bordetella pertussis (V), B. parapertussis, B. bronchiseptica
Borrelia spp.
Campylobacter spp.
Chlamydia pneumoniae,Clostridium botulinum (T), C. chauvoei, C. difficile, , C. perfringens, C.
septicum , C. sordellii, C. tetani (Corynebacterium diphtheriae (, C. minutissimum, C.
pseudotuberculosis
Edwardsiella tarda
Ehrlichia spp.
Eikenella corrodens
Enterobacter spp.
Enterococcus spp.
Escherichia coli (excepto las cepas no patgenas)Flavobacterium spp.
Francisella tularensis (tipo B), F. novocida
Fusobacterium spp.
Gardnerella vaginalis
Haemophilus spp.
Helicobacter pylori
Klebsiella spp.
Legionella spp.
Leptospira interrogans
Listeria monocytogenes
Mycobacterium spp. (excepto M. tuberculosis, M. bovis (no BCG), M. africanum, M. leprae, M. microti
y M. ulcerans)
Mycoplasma spp.
Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis (V)
Nocardia asteroides, N. brasiliensis, N. farcinica
Pasteurella spp.
Peptostreptococcus spp.
Prevotella spp.
Proteus spp.
Providencia spp.
Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas spp

13

Rickettsia spp.
Salmonella paratyphi A, B, C (V), Salmonella spp. (excepto S. typhi)
Shigella boydii, S. dysenteriae (excepto tipo 1), S. flexneri, S. sonnei
Staphylococcus aureus
Streptococcus spp.
Treponema carateum, T. pallidum, T. vincentii
Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, Vibrio spp.
Yersinia enterocolitica, Y. pseudotuberculosis

Hongos
Aspergillus fumigatus
Candida albicans , Candida spp.
Cryptococcus neoformans
Microsporum spp.
Penicillium marneffei .
Virus
Hantavirus
Citomegalovirus
Virus Epstein-Barr
Herpes simplex virus tipos 1 y 2
Herpes varicella-zoster
Virus linfotrpico humano B (HBLV- HHV6)
Herpes virus humano 7Herpes virus humano 8
Virus de la influenza tipos A, B y C
Virus del papiloma humano
Virus del sarampin
Virus de las paperas
Virus de la enfermedad de Newcastle
Virus de la parainfluenza tipos 1 a 4
Virus respiratorio sincitial
Virus de la hepatitis A (enterovirus humano tipo 72)
Poliovirus
Rinovirus
Rotavirus humanos

Agente biolgico del grupo 3. Aqul que puede causar una enfermedad grave en el
hombre y presenta un serio peligro para los trabajadores, con riesgo de que se propague
a la colectividad y existiendo frente a l generalmente profilaxis o tratamiento eficaz.

Bacterias, Chlamydias y Rickettsias

Bacillus anthracis
Brucella spp.
Chlamydia psittaci (cepas aviares)
Coxiella burnetii
Escherichia coli (cepas verocitotxicas como O157:H7 u O103) (T)
Francisella tularensis tipo A Mycobacterium tuberculosis , M. bovis, M. leprae
Rickettsia akari (*), R. canada (*), R. montana (*), R. conorii, R. mooseri, R. prowazekii, R. rickettsii,
R. tsutsugamushi
Salmonella typhi [V (*)]
Shigella dysenteriae (tipo 1) [T (*)]

14

Yersinia pestis (V)

Hongos
Blastomyces dermatitidis
Cladophialophora bantiana
Coccidioides immitis
Histoplasma capsulatum
Paracoccidioides brasiliensis
Virus
Hantavirus
Virus de la hepatitis E
Virus de la encefalitis de las garrapatas de Europa Central
Virus del Dengue tipos 1-4
Virus de la hepatitis C ]
Virus de la hepatitis G
Virus de la encefalitis
Virus de la fiebre amarilla
Virus de la hepatitis
Herpesvirus simiae (virus B)
Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
Virus de las leucemias humanas de clulas T (HTLV) tipos 1 y 2

Agente biolgico del grupo 4. Aqul que causando una enfermedad grave en el
hombre supone un serio peligro para los trabajadores, con muchas probabilidades de
que se propague a la colectividad y sin que exista generalmente frente a l profilaxis o
tratamiento eficaz.
Bacterias, Chlamydias, Mycoplasmas y Rickettsias
Ninguno
Hongos
Ninguno
Virus
Complejos virales LCM-Lassa: virus de Lassa
Complejos virales Tacaribe: virus Junin, virus Machupo, virus Sabia, virus Guanarit
Nairovirus
Virus Marburg
Virus Ebola
Virus Kyasanur
Variola (major & minor) virus
Whitepox virus (variola virus)
Virus no clasificados
Morbillivirus equino

1.3. NIVELES DE CONTENCIN

La Seguridad Biolgica se fundamenta en tres elementos: 1) Las tcnicas de laboratorio,
2) El equipo de seguridad (o barreras primarias) y 3) El diseo de la instalacin (o
barreras secundarias).

Tcnicas de laboratorio. El elemento ms importante para contener los riesgos

biolgicos es el seguimiento estricto de las prcticas y tcnicas estndar
microbiolgicas. Como parte de estas prcticas est el desarrollo o adopcin por
parte de cada laboratorio de un manual de operaciones (o Manual de Seguridad
15

Biolgica) en el que se identifiquen los riesgos que pueda sufrir el personal y que
especifique los procedimientos que puedan minimizar esos riesgos.
Equipo de seguridad (barreras primarias). Se incluyen en este apartado tanto
dispositivos o aparatos que garantizan la seguridad (por ejemplo, las cabinas de
seguridad biolgica), como las prendas de proteccin personal (guantes,
mascarillas, batas, calzado).
Diseo y construccin de la instalacin (barreras secundarias). La magnitud
de las barreras secundarias depender del tipo de agente infeccioso que se
manipule en el laboratorio. Dentro de ellas se incluyen la separacin de las zonas
donde tiene acceso el pblico, la disponibilidad de sistemas de descontaminacin
(autoclaves), el filtrado del aire de salida al exterior, el flujo de aire direccional,
etc.

El trmino contencin se emplea para describir los mtodos que hacen seguro el
manejo de materiales infecciosos en el laboratorio. El propsito de la contencin es
reducir al mnimo la exposicin del personal de los laboratorios, otras personas y el
entorno a agentes potencialmente peligrosos.
Se suelen describir cuatro niveles de contencin o de seguridad biolgica, que consisten
en la combinacin, en menor o mayor grado, de los tres elementos de seguridad
biolgica descritos: tcnica microbiolgica, equipo de seguridad y diseo de la
instalacin. Cada combinacin est especficamente dirigida al tipo de operaciones que
se realizan, las vas de transmisin de los agentes infecciosos y la funcin o actividad
del laboratorio.
Nivel de contencin 1. Es el nivel de seguridad requerido para los agentes biolgicos
del grupo 1, es decir, los que no producen enfermedad en el ser humano sano y de
susceptibilidad conocida y estable a los antimicrobianos. Es el utilizado habitualmente

en los laboratorios de prcticas de universidades o centros docentes donde se emplean

cepas no patgenas (E. coli K12, Saccharomyces cerevisiae, etc.). Ejemplos tpicos son
todos los microorganismos que se utilizan en la industria de la alimentacin para la
elaboracin de quesos, cerveza, embutidos, etc.
Nivel de contencin 2. Es el obligado para agentes del grupo 2 como algunos que,
perteneciendo a la propia flora habitual del hombre, son capaces de originar patologa
infecciosa humana de gravedad moderada o limitada. Deben ser manipulados por
personal especializado (tcnicos de laboratorio, especialistas en Microbiologa) y son los
que con ms frecuencia se estudian en el Laboratorio de Microbiologa Clnica:
estafilococos, Salmonella, etc.
Nivel de contencin 3. Debe utilizarse cuando se manipulan agentes biolgicos del
grupo 3, microorganismos que cursan con patologa grave, de difcil y largo tratamiento,
que pueden curar con secuelas y ocasionalmente producir la muerte. El mayor y ms
frecuente peligro que entraan stos es la infeccin adquirida a travs de aerosoles y
por fluidos biolgicos. Por ello, las principales medidas a tomar en este caso son la
correcta manipulacin y la utilizacin de cabinas de seguridad. En los Laboratorios de
Microbiologa Clnica los ejemplos ms tpicos de este tipo de microorganismos son M.
tuberculosis, Brucella, Coxiella burneti, etc. Slo pueden ser procesados por personal
16

cualificado y en una zona con la infraestructura apropiada para el Nivel de Contencin 3,

es decir, con aire acondicionado independiente, sin recirculacin de aire, con gradiente
de presin, cabinas de bioseguridad, etc.
Nivel de contencin 4. Nivel requerido cuando se procesa con certeza o se sospecha
un agente especialmente patgeno e infectocontagioso, extico o no, que produce alta
mortalidad y para el que no existe tratamiento y/o es poco fiable. Normalmente son
microorganismos de dosis infectiva baja y alta contagiosidad. Este nivel tambin puede
utilizarse para trabajar con animales de experimentacin infectados por
microorganismos del grupo 4. Ejemplos de este nivel son los arenavirus como el que
produce la fiebre de Lassa y el virus Machupo, virus Ebola, etc. Adems, deben incluirse
en este nivel de contencin los microorganismos propios del grupo 3 que adquieran
propiedades patgenas que los eleven al grupo 4. Un ejemplo sera Mycobacterium
bovis multirresistente que puede causar fallecimiento por fracaso teraputico.
En general, la naturaleza infecciosa del material clnico es desconocida y al Laboratorio
de Microbiologa suelen remitirse muestras muy diversas. Es responsabilidad del Jefe
del Laboratorio el establecimiento de prcticas normalizadas que de forma realista
permitan su manipulacin. Excepto en casos excepcionales (por ejemplo: sospecha de
fiebres hemorrgicas), el procesamiento inicial de los especimenes clnicos y las
pruebas serolgicas pueden realizarse de forma segura en un nivel 2, que es el nivel
recomendado para trabajar con patgenos que se transmiten por va sangunea como el
virus de la hepatitis B y el VIH, a lo que habra

que aadir las precauciones universales que deben ser tomadas con todas las muestras
de sangre y otros materiales potencialmente infecciosos.
Los laboratorios que realicen trabajos que impliquen la manipulacin de agentes
biolgicos de los grupos 2, 3 4 con fines de investigacin, desarrollo, enseanza o
diagnstico debern establecer medidas de contencin que se aplicaran segn la
naturaleza de las actividades, la evaluacin del riesgo para los trabajadores y las
caractersticas del agente biolgico de que se trate.
Medidas de contencin para los distintos niveles de contencin
Observacin preliminar. Las medidas que figuran a continuacin se aplicarn segn la
naturaleza de las actividades, la evaluacin del riesgo para los trabajadores y las
caractersticas del agente biolgico de que se trate.
Las actividades que supongan la manipulacin de un agente biolgico se ejecutarn:

nicamente en zonas de trabajo que correspondan por lo menos a un nivel de

contencin 2 para un agente biolgico del grupo 2.
nicamente en zonas de trabajo que correspondan por lo menos a un nivel de
contencin 3 para un agente biolgico del grupo 3.
nicamente en zonas de trabajo que correspondan por lo menos a un nivel de
contencin 4 para un agente biolgico del grupo 4.

Los laboratorios que manipulen materiales con respecto a los cuales exista
17

incertidumbre acerca de la presencia de agentes biolgicos que puedan causar

enfermedad en el hombre, pero que no tengan como objetivo trabajar con ellos como
tales, cultivndolos o concentrndolos, debern adoptar al menos el nivel de contencin
2. Debern utilizarse los niveles 3 4 cuando proceda, siempre que se sepa o sospeche
que son necesarios, salvo cuando las lneas directrices establecidas por las autoridades
sanitarias indiquen que, en algunos casos, conviene un nivel de contencin me
Medidas de
contencin
Medidas de contencin

1. El lugar de trabajo se
encontrar separado de
toda actividad que se
desarrolle en el mismo
edificio

No

Aconsejable

2. El aire introducido y
extrado del lugar de trabajo
se filtrar mediante la
utilizacin de filtros de alta
eficacia para partculas en
el aire (HEPA) o de forma
similar

No

S, para la
salida de aire

S, para la entrada y
salida de aire

3. Solamente se permitir el
acceso
al
personal
designado

Aconsejable

S, con esclusa de
aire

4. El lugar de trabajo deber

poder
precintarse
para
permitir su desinfeccin

No

Aconsejable

5.
Procedimientos
de
desinfeccin especficos

6. El lugar de trabajo se
mantendr con una presin
negativa respecto a la
presin atmosfrica

No

Aconsejable

7. Control eficiente de
vectores,
por
ejemplo,

Aconsejable

18

roedores e insectos

8. Superficies impermeables
al agua y de fcil limpieza

S, para banco
de pruebas y
mesa
de
trabajo

S, para banco
de
pruebas,
mesa
de
trabajo y suelo

S, para banco de
pruebas, mesa de
trabajo,
suelo,
paredes y techos

9. Superficies resistentes a
cidos, lcalis, disolventes y
desinfectantes

Aconsejable

10. Almacenamiento de
seguridad para agentes
biolgicos

S, almacenamiento
seguro

11.
Se
instalar
una
ventanilla de observacin o
un dispositivo alternativo en
las zonas de manera que se
pueda ver a sus ocupantes

Aconsejable

Aconsejable

12. Laboratorio con equipo

propio

No

Aconsejable

13. El material infectado,

animales incluidos, deber
manejarse en una cabina de
seguridad biolgica o en un
aislador u otra contencin
apropiada

Cuando
proceda

Si, cuando la
infeccin
se
propague por
el aire

14.
Incinerador
para
destruccin de animales
muertos

Aconsejable

S, disponible

S, en
lugar

el

mismo

Barreras primarias: equipos o prendas de proteccin personal

Tal y como su nombre indica, las llamadas barreras primarias son la primera lnea de
defensa cuando se manipulan materiales biolgicos que puedan contener agentes
patgenos. El concepto de barrera primaria podra asimilarse a la imagen de una
burbuja protectora que resulta del encerramiento del material considerado como foco
de contaminacin.

19

Los EQUIPOS O PRENDAS DE PROTECCIN PERSONAL constituyen uno de los

componentes de las llamadas barreras primarias.
El equipo de proteccin individual o EPI se define como cualquier equipo destinado a ser
llevado o sujetado por el trabajador para que le proteja de uno o varios riesgos que
puedan amenazar su seguridad o su salud, as como cualquier complemento o
accesorio destinado a tal fin.
Entre las obligaciones generales del centro de trabajo est la de determinar los puestos
de trabajo en los que deba recurrirse a la proteccin individual, proporcionar
gratuitamente a los trabajadores los equipos de proteccin individual que deban utilizar,
velar por su correcta utilizacin, as como reponerlos cuando resulte necesario y
asegurar su mantenimiento.
Entre las obligaciones generales de los trabajadores est la obligacin de utilizar y
cuidar correctamente los equipos de proteccin individual, a colocarlos despus de su
utilizacin en el lugar indicado para ello y a informar de inmediato a su superior
jerrquico de cualquier defecto, anomala o dao apreciado en el equipo.
Equipos de proteccin individual que pueden ser necesarios, en algn momento, en un
Laboratorio de Microbiologa Clnica: los protectores de los ojos y de la cara (gafas de
seguridad, pantallas faciales), los protectores de las vas respiratorias (mascarillas,
mscaras), los protectores de manos y brazos (guantes, manguitos), los protectores de
la totalidad del cuerpo (batas) y los protectores del odo (tapones, cascos).
Es infrecuente que en este mbito laboral se precise algn tipo de calzado de seguridad,
pero s es necesario conocer que deben evitarse los modelos que no cubran por
completo al pie y, adems, que esta prenda es una fuente importante de arrastre de
contaminacin.
Consideraciones generales en torno a los EPI
a) Actualmente existen equipos que ofrecen un altsimo grado de proteccin, pero eso
no significa que el EPI sea un substituto de una buena prctica de trabajo
b) la utilizacin de un equipo equivocado crear un riesgo adicional al operario al inspirar
en ste un falso sentido de seguridad
c) el EPI se seleccionar en funcin del mximo nivel de riesgo que se espera encontrar
al desarrollar la actividad
d) la prenda ha de ser de una talla/tamao adecuada a la del usuario
e) cualquier EPI exige una limpieza y un mantenimiento adecuados
f) slo pueden emplearse equipos que lleven la marca de conformidad CE.

Proteccin de los ojos y de la cara. Las lentillas no proporcionan proteccin

alguna a los ojos, por lo que no se recomienda su utilizacin durante el trabajo en
el Laboratorio de Microbiologa. En el caso de que una persona necesitara
20

llevarlas por prescripcin facultativa, y no simplemente como correccin de la

visin, estara obligada a llevar tambin, siempre que estuviera expuesta a un
riesgo biolgico y/o qumico, unas gafas de seguridad.

Existen tambin las denominadas pantallas faciales, que ofrecen proteccin frente a
impactos y salpicaduras. Son elementos indispensables para protegerse frente a
radiaciones, como es el caso de la luz ultravioleta.
Proteccin de las manos y los brazos. Los guantes son quizs las prendas ms
empleadas, aunque no siempre se siguen correctamente las normas elementales de
uso: a) las manos han de lavarse obligatoriamente al quitarse los guantes; b) el uso de
los guantes debe quedar restringido para las operaciones frente a las que es necesario
protegerse, de manera que es inadmisible, por ejemplo, abrir puertas con los guantes
puestos, manejar volantes, coger el telfono; c) cualquier tipo de guante no protege
frente a cualquier producto qumico, lo que significa que es preciso escoger el modelo
segn el riesgo al que se est expuesto.
Los guantes tienen un amplio uso en el laboratorio pues, adems de contra riesgos
biolgicos y qumicos, tambin se emplean como proteccin frente a riesgos fsicos,
como el calor o el fro en determinadas manipulaciones.
Para la proteccin de brazos existen los manguitos, que resultan interesantes, sobre
todo, cuando la ropa que lleva el operario no es de manga larga.

21

Proteccin respiratoria. Las mascarillas en general tienen utilidad en el Laboratorio de

Microbiologa especialmente para proteccin frente a polvo (partculas), aerosoles y
gases y vapores qumicos. Las conocidas mascarillas tipo cirujano no ofrecen
proteccin alguna.

La mscara, ya sea media mscara o mscara facial, puede resultar til en caso de
proteccin frente vertidos accidentales de consideracin. Los diferentes filtros que se
pueden acoplar hay que desecharlos como material contaminado.
El vestuario como equipo de proteccin. En principio es imprescindible hacer una
clara distincin entre la ropa que es parte de un uniforme y las prendas del vestuario que
actan como elementos de proteccin individual. Adems, existen una serie de
recomendaciones generales, como son: a) no es aconsejable que el personal del
Laboratorio de Microbiologa que est en contacto con materiales contaminados emplee
su ropa de calle; b) la ropa del laboratorio no debe ser nunca lavada fuera del Hospital;
c) el usuario debe llevar la prenda de manera que se beneficie de su utilizacin pero que
no resulte un elemento peligroso que arrastre contaminacin fuera del laboratorio; d) el
vestuario que sirve como proteccin personal no debe salir nunca del lugar de uso (a la
biblioteca, a la cafetera, a la calle); e) en el ambiente de trabajo no se debe llevar ropa
de calle que aumente la superficie corporal expuesta (pantalones cortos, sandalias).

Como parte del vestuario de proteccin se incluyen las batas (que se prefieren
abrochadas a la espalda y con los puos elsticos) y los delantales. A veces, tambin
resultan tiles los cubrezapatos.
22

Proteccin auditiva. Es la menos considerada en el ambiente de un Laboratorio de

Microbiologa, siendo habitual que el personal acepte como normal un nivel de ruido,
procedente de aparatos y/o determinadas operaciones, por encima de los lmites
tolerables. Una reduccin importante de estos niveles se consigue con un buen
mantenimiento de los equipos.
BARRERAS PRIMARIAS: CABINAS DE SEGURIDAD BIOLGICA
Las cabinas de seguridad biolgica (CSB) son cmaras de circulacin forzada que,
segn sus especificaciones y diseo, proporcionan diferentes niveles de proteccin. Son
fundamentales en un Laboratorio de Microbiologa Clnica y se clasifican segn el nivel y
tipo de proteccin.
En principio es necesario distinguir entre las campanas de extraccin de gases, las
cabinas de flujo laminar y las cabinas de Seguridad Biolgica.
La campana de gases (o vitrina extractora de gases) es un recinto ventilado que
captura los humos y vapores procedentes de la manipulacin de los productos qumicos
en el laboratorio. Si bien constituye un equipo muy til en la contencin del riesgo
qumico, no ofrece proteccin alguna frente a riesgos biolgicos.
Las cabinas de flujo laminar son recintos que emplean un ventilador para forzar el
paso del aire a travs de un filtro HEPA (acrnimo del trmino anglosajn High Efficiency
Particulate Air) barriendo la superficie de trabajo.
Su funcin es la de mantener un rea libre de partculas, especialmente de posibles
contaminantes (bacterias, levaduras,) que puedan acceder al cultivo. Esto se consigue
mediante los dos sistemas descritos antes (barrera de aire y filtro) que impiden la salida
de contaminacin.

Las barreras de aire se crean permitiendo que ste fluya en una sola direccin y a una
velocidad constante dando lugar a una verdadera cortina de aire que se conoce como
flujo de aire laminar. Es, por definicin, un flujo con ausencia de turbulencias. Los filtros
tienen como finalidad atrapar las partculas contenidas en este flujo de aire y los
empleados habitualmente son los HEPA, que retienen con una eficacia del 99,97%
partculas de hasta 0,2 micras de dimetro. El flujo laminar se asegura tanto por la gran
superficie del filtro HEPA como por la velocidad constante del aire, como por la ausencia
de fuentes intensas de calor (mecheros bunsen) en el interior de las cabinas,
generadores de intensas corrientes de conveccin.
23

Las CSB tienen un dispositivo mecnico que fuerza el paso del aire a travs de un filtro
de gran superficie (filtro HEPA) situado o bien en el techo (flujo vertical) o en la pared
frontal (flujo horizontal). Por tanto, el flujo de aire puede ser vertical u horizontal y
determina el tipo de CSB.
- Las cabinas de flujo laminar horizontal son muy adecuadas para una buena
proteccin del producto, pero no son adecuadas para el trabajo con materiales
peligrosos o con algn tipo de riesgo pues el operador queda completamente expuesto.

- Las cabinas de flujo vertical, ms sofisticadas, se segura una buena proteccin del
producto, y, dependiendo de su diseo se puede asegurar una proteccin total del
operador. Son por ello ms adecuadas para el trabajo con agentes peligrosos.

24

Estas cabinas ofrecen proteccin nicamente al material que se maneja en su interior,

pero nunca al operador, por lo que no son recomendables para el trabajo en un
Laboratorio de Microbiologa Clnica. Son, sin embargo, un instrumento de trabajo
imprescindible en las denominadas zonas limpias.
Las cabinas de Seguridad Biolgica son recintos ventilados diseados para limitar al
mximo el riesgo del personal de laboratorio expuesto a agentes infecciosos. Ello es
especialmente importante si se tiene en cuenta que muchas de las operaciones
realizadas en un laboratorio implican la formacin de aerosoles. Estos equipos tienen
como objetivo principal proporcionar una zona de trabajo que minimice la probabilidad
que una partcula transportada por el aire tiene de escapar hacia el exterior de la cabina
y contaminar as al operario y a la zona que le rodea. Adems, algunas de ellas, ofrecen
proteccin al material que se manipula.
Cuando una CSB es utilizada por personal debidamente formado y consciente de las
limitaciones de sta, se convierte en un equipo de contencin muy efectivo para reducir
el posible escape de contaminacin biolgica. Sin embargo, es conveniente tener muy
en cuenta que una cabina no es nunca un substituto de una tcnica microbiolgica
adecuada.
Las CSB se dividen en tres categoras: clase I, clase II y clase III.
Cabinas de clase I. Son cmaras cerradas con una abertura al frente para permitir el
acceso de los brazos del operador. El aire penetra por este frontal, atraviesa la zona de
trabajo y todo l sale al exterior a travs de un filtro HEPA. La velocidad del flujo de aire
es de unos 0,40 m/s (75 pies/m). Son apropiadas para manipular agentes biolgicos de
los grupos 1, 2 3. La mayor desventaja que presentan es que no proporcionan
proteccin al material con el que se trabaja, no evitando por lo tanto que ste se pueda
contaminar.

Cabinas de clase II. Se diferencian principalmente de las de clase I en que, adems de

al operario y su entorno, ofrecen proteccin al producto frente a la contaminacin. La
superficie de trabajo est baada por aire limpio que ha atravesado un filtro HEPA. La
salida del aire se produce a travs de otro filtro HEPA. Son equipos vlidos para el
manejo de agentes biolgicos de los grupos 1, 2 3. Existen varios tipos de cabinas de
clase II, A, B1, B2 y B3, segn sus caractersticas de construccin, flujo de aire y
25

sistema de extraccin.

l Tipo A. En este tipo el 30 % del aire es eliminado en cada ciclo y el 70 % es

recircularizado. El aire extrado desemboque en el mismo laboratorio o fuera de ste va
una conexin de tipo canopy. El escape al medio de los agentes potencialmente
peligrosos se previene mediante una corriente de aire entrante en una rejilla frontal.
l Tipo B. Se trata de una cabina de flujo laminar para uso general, y en ella se
recirculariza slo el 30 % del aire en cada ciclo, eliminndose el 70 % del aire restante, a
travs de un conducto hermtico de salida, exclusivo para ellas, con un extractor y un
sistema de alarma apropiado. Entonces se puede emplear para manipulaciones que
impliquen pequeas cantidades de productos txicos y radionucleidos.
l Tipo 100 % exhausto. Se trata de una cabina en la que el 100 % del aire de cada ciclo
es eliminado hacia dispositivos que puedan retener los posibles agentes peligrosos. Este
tipo de cabinas se emplean fundamentalmente en laboratorios de

toxicologa en los que se requieren reas de contencin limpias y eliminacin del aire
posiblemente contaminado.
Cabinas de clase III. Constituyen el mximo nivel de seguridad. Son recintos
hermticos en presin negativa y, por ello, su interior est completamente aislado del
entorno. Se opera en ellas por medio de unos guantes, con trampa para introducir el
producto, el aire entra a travs de un filtro HEPA y se expulsa al exterior a travs de dos
filtros HEPA. Se recomiendan para el manejo de agentes de los grupos 1, 2, 3 4.

26

CSB.
Recomendaciones generales
Instalacin de la cabina:
1. Debe situarse lo ms lejos posible de las rejillas de aire acondicionado, campanas de
gases, puertas y zonas de mucho trfico de personas, que claramente interfieren en el
flujo laminar.
2. Las ventanas del laboratorio han de permanecer siempre cerradas.
3. Debe existir al menos 0,3 m entre la salida de aire de la cabina y el techo del
laboratorio.
4. Se instalar sobre una superficie slida y nunca mvil. Si es posible, en un recinto
cerrado o en una zona de acceso restringido.

Al inicial el trabajo:
1. Poner en marcha la cabina durante 5-10 minutos, a fin de purgar los filtros y lavar la
zona protegida.
2. Comprobar que el manmetro situado en la parte superior del frontal se estabiliza e
indica la presin adecuada (vara con el modelo de cabina).
3. Apagar la luz ultravioleta (si estuviera encendida) y encender la luz fluorescente.
4. Limpiar la superficie de trabajo con un producto adecuado (por ejemplo, alcohol etlico
al 70%).
5. Antes y despus de haber trabajado en una cabina deberan lavarse con cuidado
manos y brazos, prestando especial atencin a las uas
6. Se aconseja emplear batas de manga larga con bocamangas ajustadas y guantes de
ltex. Esta prctica minimiza el desplazamiento de la flora bacteriana de la piel hacia el
interior del rea de trabajo, a la vez que protege las manos y brazos del operario de toda
contaminacin
7. En determinados casos, adems es recomendable el empleo de mascarilla.

27

Durante la manipulacin:
1. Todo el material a utilizar (y nada ms) se sita en la zona de trabajo antes de
empezar. De esta forma se evita tener que estar continuamente metiendo y sacando
material durante el tiempo de operacin.
2. Es aconsejable haber descontaminado el exterior del material que se ha introducido
en la cabina.
3. Este material se coloca con un orden lgico, de manera que el material contaminado
se sita en un extremo de la superficie de trabajo y el no contaminado ocupa el extremo
opuesto de la misma.
4. Segn el tipo de manipulacin y el modelo de la cabina, la zona de mxima seguridad
dentro de la superficie de trabajo vara. En general, se recomienda trabajar a unos 5-10
cm por encima de la superficie y alejado de los bordes de la misma. Especial atencin
se prestar a no obstruir las rejillas del aire con materiales o residuos.
5. Una vez que el trabajo haya comenzado y sea imprescindible la introduccin de nuevo
material, se recomienda esperar 2-3 minutos antes de reiniciar la tarea. As se permite la
estabilizacin del flujo de aire. Es conveniente recordar que cuanto ms

material se introduzca en la cabina, la probabilidad de provocar turbulencias de aire se

incrementa.
6. Mantener al mnimo la actividad del laboratorio en el que se localiza la cabina en uso,
a fin de evitar corrientes de aire que perturben el flujo. El flujo laminar se ve fcilmente
alterado por las corrientes de aire ambientales provenientes de puertas o ventanas
abiertas, movimientos de personas, sistema de ventilacin del laboratorio
7. Evitar los movimientos bruscos dentro de la cabina. El movimiento de los brazos y
manos ser lento, para as impedir la formacin de corrientes de aire que alteren el flujo
laminar. 8. Al igual que en el resto del laboratorio, no debe utilizarse el mechero Bunsen,
cuya llama crea turbulencias en el flujo y adems puede daar el filtro HEPA.
9. Cuando deban emplearse asas de platino es aconsejable el incinerador elctrico o,
mejor an, asas desechables.
10. Si se produce un vertido accidental de material biolgico se recoger
inmediatamente, descontaminado la superficie de trabajo y todo el material que en ese
momento exista dentro de la cabina.
11. No se utilizar nunca una cabina cuando est sonando alguna de sus alarmas.
Al finalizar el trabajo:
1. Limpiar el exterior de todo el material que se haya contaminado.
2. Vaciar la cabina por completo de cualquier material.

28

3. Limpiar y descontaminar con alcohol etlico al 70% o producto similar la superficie de

trabajo.
4. Dejar en marcha la cabina durante al menos 15 minutos.
5. Conectar si fuera necesario la luz ultravioleta (UV). Conviene saber que la luz UV
tiene poco poder de penetracin por lo que su capacidad descontaminante es muy
limitada.
Limpieza y desinfeccin de la CSB
1. Se llevar a cabo una desinfeccin completa en las siguientes situaciones: a) en caso
de que se haya producido un vertido importante; b) antes de cualquier reparacin; c)
antes de iniciarse los chequeos peridicos; d) siempre que se cambie el programa de
trabajo; e) cuando se substituyan los filtros HEPA y f) al cambiarla de lugar (incluso
dentro del mismo laboratorio).

2. Se realizar con vapores de formaldehdo y siempre por personal debidamente

entrenado y con las prendas de proteccin personal adecuadas.
3. Por otro lado, debe tenerse en cuenta que una buena limpieza de la zona de trabajo
es una garanta de ausencia de polvo y otros contaminantes. La limpieza tiene por
objeto eliminar la suciedad que se halla adherida a las superficies y que sirve de soporte
a los microorganismos. Al limpiar se elimina tambin la materia orgnica, contribuyendo
de forma decisiva a la eficacia de la posterior descontaminacin.
4. Es conveniente una vez a la semana levantar la superficie de trabajo y limpiar y
descontaminar por debajo de ella.
5. Nunca se debe utilizar la cabina como almacn transitorio de equipo o material de
laboratorio. Esta mala prctica conduce a una acumulacin de polvo totalmente
innecesaria.
6. Evitar introducir en la cabina materiales que emitan partculas fcilmente como
algodn, papel, madera, cartn, lpices
Mantenimiento de la CSB
1. Semanalmente se limpiar la superficie de trabajo y el resto del interior de la cabina.
2. Semanalmente se pondr en marcha a fin de comprobar la medida que da el
manmetro.
3. Mensualmente, con un pao mojado, se limpiarn todas las superficies exteriores con
objeto de eliminar el polvo acumulado.
4. Mensualmente se revisar el estado de las vlvulas interiores con que vaya equipada.

29

5. Anualmente se certificar por una entidad cualificada.

Usos de la CSB en el Laboratorio de Microbiologa
1- Control de aerosoles infecciosos. Se generan en el procesamiento de muestras o
cultivos como:
a.- Manipulacin de microorganismos del grupo de riesgo 3.
b.- Machacamiento de tejidos.
c.- Descontaminacin de muestras para cultivo de Micobacterias.
d.- Procedimientos de identificacin de hongos.

30

PRACTICA No 2
TEMA: MEDIOS DE CULTIVO
COMPETENCIAS
Conocer que es un medio de cultivos y los distintos tipos medios de cultivos.
Preparar, envasa los medios de cultivo lquidos y slidos.
Esterilizar y almacena los medios de cultivo.

MARCO TEORICO
El cultivo de las bacterias en el laboratorio es esencial para la identificacin de estos
microorganismos. El cultivo consiste en observar el crecimiento de las bacterias en
medios especiales que contengan los nutrientes que favorezcan su desarrollo. El medio
que contiene estas sustancias alimenticias se denomina medio de cultivo y existen en
gran variedad. Para el crecimiento bacteriano adems de un medio de cultivo adecuado
es necesario mantener condiciones de temperatura, humedad y pH.
CARACTERSTICAS GENERALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Definicin.- Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y
otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismo. La diversidad de los microorganismos es enorme; por ello, la variedad
de medios de cultivos es tambin grande, no existiendo un medio de cultivo universal
adecuado para todos ellos. Daremos nicamente una idea general sobre algunos de los
constituyentes habituales de un medio de cultivo.
Constituyentes habituales de los medios de cultivos
1. Agar.- Se lo utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de
cultivos. El componente dominante en el agar bacteriolgico es un polisacrido, al
que acompaan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Un
gel de agar al 1-2 % en agua licua hacia los 1000C y se gelifica
alrededor de los 400C, dependiendo de su grado de pureza. Con la excepcin de
algunos microorganismos marinos, el agar no es empleado como nutriente.
2. Extractos.- Para su preparacin, ciertos rganos o tejidos animales o vegetales
(Ejemplo: carne, hgado, cerebro, semillas) son atrados con agua y calor y
posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Estos
preparados deshidratados son frecuentemente usados en la confeccin de
medios de cultivos. Ejemplo: extractos de carne, levaduras, malta, etc.
3. Peptonas.- son mezclas complejas de compuestos orgnicos nitrogenados y
sales minerales que se obtienen por digestin enzimtica o de protenas

animales o vegetales (soya, casena, carne, gelatina, etc.). las peptonas son muy
31

4.

5.

6.
7.

8.

ricas en pptidos y aminocidos, pero pueden ser deficientes en determinadas

vitaminas y sales.
Fluidos corporales.- sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero
sanguneo son frecuentemente aadido a los medios empleados para el cultivo
de algunos patgenos. La sangre no puede ser esterilizada y debe, por tanto, ser
obtenida en condiciones aspticas directamente de un animal sano. Los fluidos
corporales no solamente contribuyen con factores de crecimiento, sino tambin
con sustancias que neutralizan inhibidores de crecimiento de algunas bacterias.
Sistemas amortiguadores.- algunos componentes son incorporados al medio de
cultivo para mantener el pH dentro de un rango ptimo de crecimiento bacteriano.
Los microorganismos ms comunes son neutrfilos (el pH ptimo para su
crecimiento est prximo a la neutralidad), y sales como fosfatos bisdicos o
bipotsicos, o sustancias como las peptonas, previenen una desviacin del pH.
Indicadores de pH.- indicadores cidos-bases se aaden a menudo a los medios
de cultivos con objeto de detectar variaciones del Ph.
Agente reductores.- cistena, tioglicolato y otros son agentes reductores que se
aaden a los medios de cultivos para crear condiciones que permitan el desarrollo
de grmenes microaerfilos o anaerbicos.
Agentes selectivos.- la adiccin de determinadas sustancias al medio de cultivo
puede convertirlo en selectivo. Por ejemplo. Cristal violeta, sales biliares, azida
sdica, telurito potsico, antibiticos, etc., a la concentracin adecuada, actan
como agente selectivos frente a determinados microorganismos.

Medio extendido en tubo

o Agar tendido

MATERIALES
Algodn
Fsforos
Esptula
Cajas de Petri
Pipeta
Tubos de ensayos

MEDIOS
Medios de cultivo
Caldo Nutritivo
Agua de Peptona
Agar Manitol sal
Agar nutritivo
Agar Mac Conkey

EQUIPOS REACTIVO
Refrigerador Alcohol
Reverbero
Balanza
Mechero
Autoclave

32

Fiolas
vasos de
precipitacin
Agitador
agua destilada

Agar Mueller-Hinton
Agar eosina azul de
metileno

Elaborado: QF. Mariana Rendn M. MSc.

PROCEDIMIENTO
1.-Se proporciona a los alumnos diversos medios de cultivo para que primero anoten los
siguientes datos:
Nombre del medio de cultivo, tipo de medio de cultivo de acuerdo a su consistencia y
uso, para qu tipo de microorganismos se utiliza o qu pruebas
se pueden realizar, composicin y como se prepara
2.- Posteriormente que se procede a preparar algunos de los medios de cultivo que
Se necesitan para las prcticas de laboratorio siguientes
Preparacin de medios de cultivo liquido
1. Leer la instrucciones del frasco y de acuerdo a esto realizar una regla de tres para
preparar la cantidad requerida
2. Pesar la cantidad obtenida en el calculo
3. Disolver en un beaker con la cantidad de agua destilada(medida en una probeta)
de acuerdo a lo que se va a preparar
4. Disolver adecuadamente y envasar en tubos de ensayo o fiolas segn el medio
que se va a preparar
5. Llevar al autoclave y esterilizar
Preparacin de medios de cultivo solido
1. Leer la instrucciones del frasco y de acuerdo a esto realizar una regla de tres para
preparar la cantidad requerida
2. Pesar la cantidad obtenida en el calculo
3. Disolver en un beaker con la cantidad de agua destilada(medida en una probeta)
de acuerdo a lo que se va a preparar
4. Llevar al reverbero para calentar hasta que hierva, por lo menos 3 minutos.
5. Envasar en tubos de ensayo o fiolas segn el medio que se va a preparar
6. Llevar al autoclave y esterilizar
Esterilizacin de medios de cultivo:
Una vez preparado el medio, ste se debe esterilizar lo antes posible para evitar el
crecimiento de microorganismos:
- Medios slidos en placa de Petri
1) Tapar el matraz con tapn de algodn graso y cubrir con papel de aluminio para
llevar a esterilizar en el autoclave (121 C, 15-20 min).
2) Una vez estril repartir el medio en placas de Petri estriles y dejar en reposo para
su solidificacin.
- Medios slidos en tubo (agar inclinado)
1) Luego la ebullicin del medio con agar, ste se reparte en los tubos de vidrio, de
forma que queden llenos hasta aproximadamente la mitad (20ml). Los tubos se
cubren con tapn.
2) Llevar a l autoclave a 121 C por 15-20 min
33

3) Una vez esterilizado, los tubos se disponen en posicin inclinada para su

solidificacin.
- Medios lquidos
1) Una vez disueltos los componentes del medio en el matraz, repartir en su caso en
tubos a razn de 2-4 ml por tubo, cubrir con tapn y llevar a esterilizar en el
autoclave.
Alternativamente, se puede esterilizar el medio en el matraz, y posteriormente
repartirlo en tubos estriles.
- Medios semislidos
1) Se preparan con concentraciones inferiores de agente solidificante (agar agar).
2) El medio se reparte en tubos. En caso de desear proporcionar condiciones
anaerbicas, existen diversas metodologas para ello.
Los medios semislidos se utilizan para el crecimiento bacteriano a lo largo del tubo.
Los niveles de difusin de oxgeno en las distintas capas condicionar el crecimiento
de distintos tipos de microorganismos (aerobios, anaerobios).
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
1.- AGAR NUTRITIVO:
USOS.----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------FORMULA APROXIMADA POR LITRO
Ingredientes
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Cantidad
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

INSTRUCCIONES.---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------34

--------------------------------------------------------------------------------------------CALCULOS

2.- CALDO NUTRITIVO

USOS.------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------FORMULA POR LITRO
Ingredientes
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Cantidad
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

INSTRUCCIONES.------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ----------------------------------------------------35

CALCULOS

3.- AGUA MUELLER HINTON

Usos.------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------.-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------.
FORMULA POR LITRO
Ingredientes
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Cantidad
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

INSTRUCCIONES.------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------CALCULOS

36

4.- AGAR HIERRO TRIPLE AZUCAR

Usos.------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------FORMULA APROXIMADA POR LITRO
Ingredientes

Cantidad

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

INSTRUCCIONES.------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------CALCULO

37

CONCLUSIONES
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

38

PRACTICA No 3
TEMA: CONTROL DE LOS MICROORGANISMOS .- DESCONTAMINACION y ESTERILIZACION.MANEJO DE INOCULOS: TECNICA ASEPTICA
COMPETENCIAS

Conocer la tcnica asptica

Practicar las diferentes formas de manejar las muestras.
Adquirir experiencia en la toma del inculo en condiciones de asepsia, es decir,
en un ambiente libre de contaminacin microbiana.
MARCO TEORICO
INTRODUCCIN
La microbiologa es la ciencia que se encarga del estudio de los microorganismos, y su
desarrollo ha contribuido de manera fundamental en reas biolgicas, mdicas y
qumicas entre muchas otras.
El estudio en laboratorio de un microorganismo requiere que est aislado de otros; es
decir se necesita tener un cultivo puro. Para trabajar con cultivos de microorganismos y
en general en microbiologa, es de gran importancia mantener condiciones de asepsia,
es decir trabajar en ambientes libres de contaminacin microbiana, cuidando mantener
la esterilidad del material y de las soluciones. Por esta razn, todo el material a utilizar
en el laboratorio (mesones, frascos de soluciones, incluso el aire) debe estar bajo
estricto control, con el objeto de asegurarse que cuando se est cultivando una
determinada especie de microorganismo, slo se desarrolle el microorganismo de
inters y no poblaciones que se encuentran en el aire o en el ambiente general.
El trmino asptico significa sin microorganismos. La tcnica asptica se refiere a las
prcticas que reducen la posibilidad de que los microorganismos entren en el cuerpo
durante procedimientos clnicos, reduciendo as a su vez el riesgo de que los usuarios
se infecten ms tarde. Algunas de estas prcticas tambin disminuyen a posibilidad de
que los profesionales de salud tengan contacto con sangre y tejidos infecciosos durante
los procedimientos clnicos.
La tcnica asptica se realiza para:
Eliminar o matar los microorganismos que se encuentren en las manos o en otros
objetos.
Emplear instrumentos y otros objetos que se hayan esterilizado.
Reducir el contacto que tengan los usuarios con los microorganismos que no se
puedan eliminar.
El tipo de microorganismo que ser utilizado en este laboratorio sern bacterias y
levaduras. Estos microorganismos se cultivan sobre materiales conocidos como medios
de cultivo. La composicin qumica o nutricional de los medios es extremadamente
variada (Prctica Medios de Cultivo).
Los medios ms comunes son los caldos (medios lquidos), tubos con agar inclinado,
tubos con agar y cajas de Petri o placas de agar.
A menudo es necesario tomar una muestra de bacterias de un tubo y colocarlas en otro.
39

El proceso requiere cuidado y precisin, y se lleva a cabo siguiendo la tcnica

asptica para evitar que la bacteria en el tubo contamine el rea de trabajo o a la
persona que lleva a cabo a transferencia.
MATERIALES

Algodn
Lpiz graso
Fsforos
Gradilla
Tubos
Asas de
inoculacin
Guantes
Mascarillas

MEDIOS DE
CULTIVO Y CEPAS
BACTERIANAS

REACTIVOS

EQUIPOS

alcohol

Mechero
Refrigeradora
Incubadora

St. Aureus
E. coli
Agar Nutritivo
Caldo Nutritivo

Elaborado: QF. Mariana Rendn M. MSc.

PROCEDIMIENTO 1:
Control de la Esterilidad en el trabajo microbiolgico:
Desinfectar con un algodn impregnado con etanol 70% limpiar el lugar de
trabajo, manos y utensilios no esterilizados por autoclave. Procurar tener mucho
cuidado con el mechero ya que el etanol es inflamable. Trabajar con utensilios del
laboratorio cerca del mechero.
Colocar frente al mechero la muestra y todo el material que se vaya a necesitar
para realizar la siembra.
Dependiendo del tipo de siembra se utiliza el asa adecuada. Para sembrar en
caldos utilizar el asa redonda, para realizar una siembra en superficie (slant) y
TECNICA ASEPTICA
a) Importancia de las condiciones de asepsia
1. Marcar las cajas de la siguiente manera:
Caja 1: Puntas de los dedos sin guantes
Caja 2: Puntas de los dedos con guantes
Caja 2: Hablar frente a la placa.
Caja 3: Abiertas.
Caja 4: Caja control.
2. Para la caja 1, toca suavemente la superficie del agar con las puntas de los
dedos sin guantes.
3. Caja 2, toca suavemente la superficie del agar con las puntas de los dedos con
guantes
4. Destapa la caja 2 y sostenla a una distancia de 10 a 15 cm de tu boca. Repite
40

5.
6.
7.
8.
9.

tres veces el trabalenguas de tres tristes tigres tragaban trigo en un trigal en tres
tristes platos. En tres tristes platos, en un trigal, tragaban trigos tres tristes
tigres. Tapa de nuevo las cajas.
La caja 3 se dejar destapada durante toda la sesin de laboratorio.
La caja 4 se conservar sin abrir.
Una vez que las placas han sido expuestas, deben colocarse en la incubadora
en posicin invertida por 24 horas y a 37 C.
L a siguiente sesin examina las placas y registra los resultados en la tabla
Regresa las cajas a la profesora para que se desechen adecuadamente.

La toma del inculo, es decir de la muestra que hay que examinar, ya sea esta slido o
lquido, es muy sencilla, pero, se debe realizar con cuidado, para que se lleve a cabo un
trabajo exitoso.
En la toma de inculo se debe tomar en cuenta que se corre el riesgo de contaminacin
por microorganismos, como ejemplo, es por esa razn que se debe trabajar en frente de
un mechero.
La toma del inculo es muy importante para el trabajo de laboratorio, en especial
debemos tener en cuenta que debemos trabajar con precaucin
b) Transferencia tubo a tubo
Cada alumno sembrar 4 tubos practicando los diferentes tipos de transferencia (Fig. 1).
Caldo-Caldo
Caldo-Agar inclinado
Agar inclinado-Caldo
Agar inclinado-Agar inclinado
Siempre mantener los tubos con caldo en una gradilla.
Nunca acostados en la mesa de trabajo, ni en la bata.
Al acabar la prctica, coloca la gradilla con los tubos en la incubadora a 37 C por 24
horas

41

Manejo de inoculo en caja de Petri

Para traspasar un cultivo slido proveniente de una placa para realizar un frotis o aislar
un microorganismo, se toma un pequeo inculo con una asa metlica y se siembra
sobre el agar de una nueva placa, haciendo un movimiento de zigzag con el
asa cargada sobre el agar, diluyendo el inculo tres veces (ver fig. 1). Tambin es
posible traspasar cultivos slidos a medios lquidos, sacando una muestra de una
colonia con un asa e introducindola en el medio lquido, y agitando el asa en el frasco.
Del mismo modo se pueden traspasar cultivos lquidos a cultivos lquidos con micro
pipeta o con una pipeta Pasteur.
PROCEDIMIENTO
1. Colocar frente al mechero la muestra del microorganismos y el resto de material a
trabajar
2. Tome el asa de la siembra y flamee el filamento hasta que este alcance un rojo
incandescente y luego enfrelo con proximidad de la llama
3. Tome con la otra mano el recipiente que contiene los microorganismos. Si la
muestra est en un tubo, quite el tapn con los dedos meique y anular con la
mano que sostiene el asa y flamee la boca del tubo, si esta muestra est en caja
petri, coloque la caja invertida sobre la mesa de trabajo y levante la parte
4. Que contiene el medio de cultivo con los microorganismos. Llvela a la
proximidad de la llama del mechero
5. Trabajando en todo momento en la proximidad de la llama, introduzca el asa de
siembra y tome una pequea cantidad del cultivo. Si el medio es lquido, agite
ligeramente el tubo y tome una muestra que quedar adherida, por tensin
superficial, en el extremo del filamento del asa de la siembra. Si los
microorganismos se multiplican en medio slido, tome una pequea porcin de
aquellos mediante un ligero roce con el asa de siembra. Si la muestra se
encuentra en la profundidad del agar, hunda el filamento dentro del medio hasta
tomar una pequea porcin de la misma
6. Transfiera el inculo a otro medio de cultivo estril, tomando las mismas
precauciones en su manejo (flameando bocas de tubos, trabajando en la
proximidad de la llama, etc.) o bien proceda a preparar un frotis para tincin
si la transferencia se va a realizar a un caldo estril, descargue el inculo
mediante la agitacin del asa de siembra en aquel.
Si la transferencia se va a realizar a un slant, introduzca el asa con el
inculo y siempre en zigzag sobre la superficie slant.
Si la transferencia se va a realizar sobre un medio estril en una caja petri,
deposite el inculo en un rea pequea de la superficie de la placa,
prxima del borde. Extienda el inculo formando estras muy juntas sobre
la superficie de la porcin muy pequea de la placa. Tomando esta vez
como inculo el obtenido mediante el rozamiento del asa de siembra
con las estras sembradas por primera vez, realice la segunda tanda de
estras sobre una porcin virgen de la placa. Repita este proceso tres o
cuatro veces.
Una vez realizada la transferencia:
en el caso de los tubos, flamee la boca de stos antes de colocar el tapn.
Marque los tubos con la identificacin del cultivo, la fecha y el nombre.
42

Incube a temperatura adecuada durante el tiempo necesario para que se

desarrolle los microorganismos
si se realiz sobre un medio contenido en una placa de petri, tape la placa.
Esta se incubar en posicin invertida para evitar que el agua de
condensacin se deposite sobre la superficie del agar, lo cual impedir la
obtencin de colonias aisladas. Marque en la base de la placa la
identificacin del cultivo, la fecha y el nombre.
7. Antes de dejar el asa de siembra sobre la mesa, flamela de nuevo con el objeto
de esterilizarla.
RESULTADOS
Realiza la descripcin morfolgica de las colonias (si es que hay) obtenidas en las cajas
con los distintos tratamientos en relacin a la caja control.

Procedimiento
Punta de los dedos
Con guantes
Hablar frente a la placa
Caja abierta durante la practica
Caja control

RESULTADOS
Caractersticas observadas

Descripcin de las caractersticas del cultivo en caja de Petri con diferentes tratamientos
Elaborada: QF. Mariana Rendn M. MSc.

Nota: Reportar el crecimiento

1. En forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco crecimiento. (++) crecimiento
regular y (+++) crecimiento abundante.
2. Consistencia y color de la cepa cultivada( si hubiera crecimiento)
Registra la morfologa macroscpica del microorganismo sembrado en los tubos con
agar inclinado y en los caldos de acuerdo a la gua de observacin.
DISCUSIN.- CONCLUSIONES
En esta seccin se analizarn los resultados obtenidos, tratando de dar respuesta a las
siguientes preguntas (entre otras):
1. Debes tocar las cajas de agar con tus manos?
2. Puedes encontrar organismos en el aire?
3. Qu resultados soportan tus conclusiones?
4. Cundo trabajas con cultivos microbianos, puedes hablar?
5. Por qu s o por qu no?
Contestar
43

DEBER No 2
a) Cuestionario
Contesta las siguientes preguntas relacionadas con la tcnica de transferencias.
1. Por qu razn no debes compartir el mechero de Bunsen?
2. Cul es la razn para flamear los tubos antes y despus de cada transferencia?
3. Por qu debes evitar el usar el pulgar para sostener las tapas durante una
transferencia?
4. Explica por qu debes evitar que el asa llena de inculo toque la boca del tubo
fuente o del tubo a ser inoculado.
5. Cuando tomas un inculo de un tubo con agar inclinado. Por qu es necesario
tocar una parte estril del agar con el asa antes de tocar el crecimiento
bacteriano?
6. Por qu el asa debe ser flameada antes y despus de todos los procedimientos
de siembra?
7. Por qu las placas de agar deben mantenerse invertidas durante la incubacin?
c) Glosario. Define los siguientes trminos:
TERMINO

DEFINICION

Agar
Medio de cultivo
Caldo de cultivo
Incubacin
Colonia
Inoculacin
Contaminacin
Tcnica asptica
Estril
Desinfeccin
d) Haz un diagrama de flujo del procedimiento de transferencia microbiana de
tubo a tubo.
e) Completa el siguiente cuadro
Cuadro 2. Equipo y material del laboratorio.
Equipo y Material
Caja de Petri
Pipetas
Asa bacteriolgica
Balanza analtica

Para que se utiliza

Dibujo o Foto

44

Incubadora
Refrigerador
Probeta
Mechero de Bunsen

45

PRACTICA No 4
TEMA: MICROSCOPIO.- TINCION SIMPLE Y TINCION DOBLE Y DIFERENCIAL:
TECNICA DE GRAM
COMPETENCIAS:

Aprender a realizar un frotis o extendido y diferentes tipos de fijacin

Realizar una tincin simple
Diferenciar la disposicin y agrupacin de los microorganismos
Realizar la tcnica de Gram
Diferenciar los microorganismos Gram positivos de los Gram.
negativos observando las limitaciones de la tincin en cultivos en la
fase estacionaria
Adquirir destreza en el manejo del microscopio

MARCO TERICO:
La morfologa bacteriana se puede ser estudiada de dos formas distintas:
1. Por visualizacin de los microorganismos vivos sin teir, lo que nos
permite adems observar su posible movilidad
2. Por visualizacin de los microorganismos teidos mediante
colorantes, con una concentracin tal que hacen morir a la bacteria y
no permiten observar su movilidad, pero sin embargo se mejora
notablemente la visualizacin de su morfologa y otras estructuras
segn el tipo de tincin llevada a cabo.
En general las bacterias vivas son prcticamente incoloras, no presentando
suficiente contraste en el medio acuoso donde estas se presentan
suspendidas, con lo cual no pueden ser observadas con claridad. Pero si se
tien se producen una gran contraste con respecto al medio que las rodea.
Adems algunos de estos colorantes pueden tambin teir estructuras internas
de la bacteria, lo que nos sirve para su identificacin
Por todo esto las principales ventajas, de la tcnica de tincin son:
observar ms adecuadamente su morfologa
proporcionar el contraste preciso y suficiente en cada caso, lo que
permitir diferenciar distintos tipos morfolgicos
establecer una informacin complementarias sobre su estructuras
internas y/o externas que no podran ser observadas por examen en
fresco
conocer su caractersticas tintoriales orientndolos hacia un grupo
taxonmico u otro en la clasificacin bacteriana

46

BACTERIAS
Cocos (esfricas)

CARACTERISTICAS
Forma esfrica o casi
esfrica ya que sus
dimetros
(largo
y
ancho) son casi iguales

TIPOS DE AGRUPACION
Clulas agrupadas en
Pares (Diplococos)
Clulas agrupadas en
cadenas cortas y largas
(estreptococos)
Clulas agrupadas en
forma
de
racimo
(estafilococos
Bacilos
o Tienen uno de los ejes o
Sin agrupacin o
dimetro notablemente
agrupacin irregular
Bastones
mayor que el otro, de tal
Clulas aisladas en
(cilndricas)
manera que se
parejas
observan como
Clulas en cadenas
bastoncitos de diferente
Disposicin celular,
ancho y longitud.
una al lado de la otra
Helicoidales
o Generalmente
de No se tienden a agrupan
curvas (Espirales) presentacin aislada; las
clulas son muy largas
en relacin a su ancho y
se observa una torsin
alrededor de su eje
(espiras).
Elaborado por: QF. Mariana Rendn M MSc.

47

TINCION SIMPLE

MATERIALES

MEDIOS
DE REACTIVOS
CULTIVO/CEPAS

EQUIPOS

Algodn

Caldo nutritivo

Alcohol

Mechero

Fsforos

Cepas varias

Azul de
metileno
Safranina

Microscopio

Gasa
Placas
portaobjetos
Asa
de
inoculacin
Papel filtro

Violeta de
genciana
Aceite
cedro

de

Elaborado: Mariana Rendn M MSc.

PROCEDIMIENTO
FROTIS
Se saca la placa portaobjeto del recipiente en que esta almacenas y se
seca con una gasa, se rotula el nmero de muestra con el lpiz graso.
Se agrega con el asa estril 1 0 2 gotas de agua destilada o caldo
nutritivo estril. Se toma con el asa de siembra la muestra y se
extender de forma uniforme.
Si la muestra problema es lquida se tomar con el asa estril una o dos
gotas y se aadir al portaobjetos extendindola uniformemente con el
asa de siembra
FIJACION
Dejar que la muestra en el portaobjeto se seque al aire y una vez seca,
si la muestra es solida se fijar con calor, haciendo pasar por ello la
extensin de 2 a 3 veces por la llama del mechero, ayudndonos con
pinzas si fuera necesario.
Si es liquida, se debe agregar metanol y dejar secar al ambiente
TINCION
Ya realizado el frotis se pondr este en la rejilla de tinciones, que estar
sobre el lavadero. A partir de aqu se cubrir la totalidad de extensin
con el correspondiente colorante, que para la tincin simple suele ser
azul de metileno, dejndole actuar durante un minuto o azul de toloudina
durante el mismo tiempo
Transcurrido este tiempo, se verter agua abundante en la preparacin,
a fin de eliminar el resto de colorante que pudiera haber.
Dejar secar la preparacin al aire
Observar al microscopio con el objetivo de inmersin
TINCION DOBLE Y DIFERENCIAL:TECNICA DE GRAM
MARCO TERICO:
La observacin de la morfologa bacteriana se realiza utilizando colorantes
biolgicos que permiten aumentar el contraste entre la clula bacteriana y el
48

medio que las contiene. La tcnica ms utilizada para el estudio de la

morfologa bacteriana es la tincin de Gram.
Esta tcnica doble y diferencial es la ms empleada en microbiologa. Fue
desarrollada por Hans Christian Gram, en 1884. A pesar del tiempo
transcurrido, la tincin se ha modificado poco y es uno de los primeros pasos
para identificar microorganismos. Este mtodo divide las bacterias en dos
grupos: las Gram positivas y las Gram negativas.
Este distinto comportamiento en la tincin de Gram es debido a la distinta
composicin de la pared celular de las bacterias. Los microorganismos que
retienen el violeta de genciana, licor de Gram se van a observar de color violeta
y aquellos microorganismos que se decoloran van a adquirir el color de
contraste de la safranina, por lo que se observan de color rojo rosado.
En general se pueden decir, que las bacterias Gram positivas van a reaccionar
de manera diferente a las Gram negativas frente a muchos agentes fsicos y
qumicos.
En la tcnica de Gram se usan cuatro tipos de soluciones
Solucin
colorante
primario
(bsico)
mordiente

Nombre
Cristal violeta o
violeta de genciana

Funcin
Tie todas las bacterias del frotis

El licor o lugol de Es una sustancia que va a incrementar

Gram
la afinidad entre la clula microbiana y
el colorante haciendo que se formen
un complejo coloreado que fija el
colorante, por la accin del mordiente,
las clulas se tien ms intensamente.
Retira el colorante de ciertas las clula
El decolorante Alcohol al 70% o
Alcohol Cetona
teida (bacterias Gram negativas).
Algunas clulas se van a decolorar
ms fcilmente que otras. En la tincin
de Gram y en otras tinciones
diferenciales,
es
el
diferente
comportamiento en la decoloracin, lo
que sirve para diferenciar las bacterias.
Colorante de Safranina
Va a ser de un color diferente al del
contraste o
colorante primario. Su misin ser dar
secundario
color a las clulas decoloradas. Los
microorganismos que no se decoloran
fcilmente retienen el color del
colorante primario. Los que se
decoloran, toman el color de contraste.
Soluciones de la tcnica de Gram
Elaborado por: QF. Mariana Rendn M. MSc.

La Tincin de Gram es una tincin que nos permite evaluar:

49

1. Afinidad Tintorial
2. Morfologa
3. Agrupacin
MATERIALES

MEDIOS
DE REACTIVOS
CULTIVO/CEPAS

EQUIPOS

Algodn

Caldo nutritivo

Alcohol

Mechero

Fsforos

Cepas varias

Licor de Gram

Microscopio

Gasa

Safranina

Refrigeradora

Placas portaobjetos
Asa de inoculacin

Violeta
de
genciana
Aceite de cedro

Papel filtro

Alcohol Cetona

Elaborado por: Mariana Rendn M. MSc.

PROCEDIMIENTO DE LA TECNICA
Frotis
FROTIS Y FIJACION DE LA MUESTRA:

4.
5.
6.
7.
8.
9.

En un portaobjeto colocar
una gota de agua o caldo
estril y a partir de una
placa de cultivo se toma
una colonia con el asa y
posteriormente se realiza
una disolucin de las
bacterias extradas del
cultivo con el agua.
La preparacin se seca a
temperatura ambiente
Fijacin

Se pasa por la llama del

mechero (3 veces)
teniendo la precaucin de
Tincin
no exponerla demasiado
al fuego directo, ya que
Ejecute la tcnica de la forma que a continuacin se detalla
esto perjudica la
evaluacin de la forma y
tincin de las bacterias.
Una vez seca la lmina se
tie.

50

TINCION
1. Disponga la preparacin bacteriana
realizar la tincin

sobre la cubeta diseada para

2.-Cubra la lmina con Cristal violeta durante 1 minuto.

3.-Lave el exceso de colorante con agua
4.-Cubra con Lugol durante 1 minuto.
5.-Lave el exceso de lugol con agua.
6.-Decolore con solucin alcohol-acetona durante 20 segundos.
7.-Lave con abundante agua para eliminar el exceso de disolvente.
8.-Cubra la lmina con Safranina durante 30 segundos.
9.-Secar la preparacin entre 2 laminas de papel filtro y observar al
microscopio con aceite de inmersin.
NOTA: Luego de cada lavado elimine el exceso de agua para evitar la
dilucin del colorante o solucin empleada.
Disponga cada solucin durante el tiempo estrictamente estipulado.

51

1.- Visualice al microscopio la

morfologa de las bacterias (40x),
fijndose sobre todo en el color de
la preparacin para clasificarlas en
Gram + o Gram -.
Ej.: Bacilos Gram (+), Bacilos Gram
(-), Cocaceas Gram (+) o Cocaceas
Gram (-)
2.- Determine la agrupacin de las
bacterias observadas.
Ej.:
En
cadena,
agrupacin irregular, etc.

10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
COCACEAS GRAM POSITIVAS
22.AGRUPACIN EN CADENA

racimos,

BACILOS GRAM POSITIVOS

AGRUPACIN EN CADENA

RESULTADOS
TINCION SIMPLE

52

TINCION DOBLE O DIFERENCIAL

CONCLUSIONES
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

53

PRCTICA N 5
TEMA: Preparaciones teidas.- Tincin doble y diferencial
Tincin de Bacterias cido Alcohol Resistentes
(Ziehl - Neelsen)
COMPETENCIAS
Conocer la morfologa y capacidad de tincin de las bacterias cidoalcohol resistentes.
Distinguir las agrupaciones que estas presentan.
Realizar la tcnica de Ziehl-Neelsen
Diferenciar e identificar las bacterias no cido alcohol resistentes de las
alcohol cido resistentes.
MARCO TERICO
Esta tincin permite diagnosticar y estudiar enfermedades producidas por
especies alcohol cido resistente, como la tuberculosis y la lepra, que son
producidas por bacterias que son de la Familia Micobactereaceae, Gnero
Mycobacterium, Especies: Mycobacterium Tuberculosis y Mycobacterium
Leprae.
Esta tcnica diferencia las bacterias alcohol cido resistentes del resto que no
presentan esta propiedad (bacterias no alcohol cido resistentes).
Fundamento
Existe un grupo de microorganismos como las micobacterias y actinomicetos,
cuya propiedad de cido-resistencia est relacionada con un alto contenido de
lpidos y componentes creos, por lo que este tipo de bacterias presentan
grandes dificultades a la hora de teirse con los colorantes convencionales que
no pueden penetrar en el interior de las bacterias. La tincin de estas clulas
de debe realizar con colorantes que presente una gran afinidad con ellas y
ayudados con el calor y un solvente como el fenol. Una vez que han sido
teidas, son difciles de decolorar e incluso resisten las decoloraciones del
alcohol cido.
Las bacterias cido alcohol resistentes, tras la unin de la fucsina resisten el
tratamiento orgnico y se vern teidas de rosa. El resto de las bacterias
decoloran y se contrastan con azul de metileno.
La tcnica fue ideada por Robert Koch y en la actualidad este proceso se lo
conoce como la tcnica de Ziehl-Neelsen. Esta tcnica diferencia las bacterias
alcohol cido resistentes del resto que no presentan esta propiedad (bacterias
no alcohol cido resistentes).
54

Requiere de tres colorantes:

Mezcla en fucsina-fenol: capaz de teir clulas en caliente. El fenol
facilita la penetracin de la fucsina en la envoltura celular.
Decolorante: mezcla de cido y alcohol.
Colorante de contraste: azul de metileno.
MATERIALES

MEDIOS
DE REACTIVOS
CULTIVO/CEPAS

EQUIPOS

Algodn

Caldo nutritivo

Alcohol

Mechero

Fsforos

Cepas varias

Azul
de Microscopio
metileno(0.3 %)
Carbol fucsina o
fenol fucsina
cido
clorhdrico
(0.36 N) en etanol
Aceite de cedro

Gasa
Placas portaobjetos
Asa de inoculacin
Papel filtro
Elaborado por: QF. Mariana Rendn M. MSc.

PROCEDIMIENTO:
Preparar el frotis con una muestra microbiana
Fijar
Tincin
a) Cubrir toda la preparacin con Carbol fucsina o fenol fucsina. Calentar
en el mechero, sin que hierva por 5 minutos. Aadir carbol fucsina o
fenol fucsina peridicamente la placa no debe quedar seca. Lavar con
agua el exceso de colorante.
b) Decolorar con la solucin cido-alcohol hasta observar un color rosado
(30 segundos.). Lavar para detener la decoloracin.
c) Teir con azul de metileno por 1 minuto. Lavar el exceso de colorante
d) Secar la muestra
e) Leer con objetivo de inmersin, en el sentido de las manecillas del reloj
100 campos y contar los BAAR por campo.
Los bacilos aparecen como bastoncillos delgados, ligeramente curvos, teidos
de rojo, generalmente con grnulos ms coloreados en su interior, aislados, en
parejas o en grupos, sobre el azul claro de la tincin de contraste.
PASO

TCNICA

Primer
colorante
Decolorante

Fucsina fenicada
5 minutos con calor
Alcohol cido

Colorante de
contraste

Solucin
Hidro-alcohlica
Azul de metileno1 minuto

RESULTADO
AARAAR+
Se tien rojo
Se tien rojo
Se decoloran
Se tien azul

No se decoloran
Permanecen rojas
Permanecen rojas
(Mycobacterium)

55

Cuadro de SistematizacionTcnica de Ziehl-Neelsen

Elaborado por: QF. Mariana Rendn M. MSc.

REPORTE DE RESULTADOS
NEGATIVO

POSITIVO (+)

POSITIVO (++)
POSITIVO (+++) MS DE 100
POSITIVO (++++)

NEGATIVO No se encontraron bacilos

cido-alcohol resistentes en 100 campos
observados
1-9 BAAR
Informar el nmero de bacilos observados
en 100 campos
Menos de 1 bacilo por campo en
promedio, en 100 campos observados
De 1 a 10 bacilos por campo en promedio
en 50 campos observados
Ms de 10 bacilos por campo en 20
campos observados

Cuadro de reporte de resultados de la Baciloscopia

Elaborado por: QF. Mariana Rendn M. MSc.

RESULTADOS

CONCLUSIONES
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

56

PRACTICA No 6
TEMA: IDENTIFICACION MICROSCOPICA DE LAS LEVADURAS
COMPETENCIAS
Identificar microscpicamente las levaduras en preparaciones en fresco
y la tcnica de Gram
Diferenciar microscpicamente a las levaduras de las bacterias
Diferenciar la morfologa y estructura de los hongos
Identificar microscpicamente los gneros de hongos
LAS LEVADURAS
MARCO TEORICO
Las levaduras se han definido como hongos microscpicos, unicelulares. Este
grupo de microorganismos comprende alrededor de 60 gneros y unas 500
especies. Histricamente, los estudios sobre microbiologa enolgica se han
centrado en las levaduras pertenecientes al gnero Saccharomyces, que son
las responsables de la fermentacin alcohlica.
Anteriormente se crea que slo ellas participaban en el proceso de produccin
de alcohol, sin embargo, las diferentes levaduras no-Saccharomyces,
especialmente durante la fase inicial de la fermentacin, pueden influir en las
propiedades organolpticas de las bebidas alcohlicas.
El papel de las levaduras como agentes fermentadores no fue reconocido sino
hasta 1856 por Luis Pasteur. Las teoras cientficas de esa poca reconocan la
presencia de stas en la fermentacin alcohlica, pero eran consideradas como
compuestos qumicos complejos, sin vida. Esta era la teora mecanstica
liderada por los qumicos alemanes von Liebig y Whler. Luis Pasteur, propuso
la teora vitalstica y demostr que las clulas viables de levaduras causan
fermentacin en condiciones anaerobias; durante la cual el azcar presente en
el
jugo
es
convertido
principalmente
en
etanol
y
CO2.
Las levaduras son los agentes de la fermentacin y se encuentran
naturalmente en la superficie de las plantas, el suelo es su principal hbitat
encontrndose en invierno en la capa superficial de la tierra.

57

En verano, por medio de los insectos, polvo y animales, son transportados

hasta el fruto, por lo que su distribucin se produce al azar.
Existe un gran nmero de especies que se diferencan por su aspecto, sus
propiedades, sus formas de reproduccin y por la forma en la que transforman
el azcar. Las levaduras del vino pertenecen a varios gneros, cada uno
dividido en especies.

MATERIALES MEDIOS
DE REACTIVOS
CULTIVO/CEPAS COLORANTES
Algodn
Caldo nutritivo
Alcohol
Fsforos

Cepas varias

Gasa
Placas
portaobjetos
Asa
de
inoculacin
Papel filtro

Y EQUIPOS
Mechero

Algodn de Azul de Microscopio

Lacto fenol
Lugol
Kit de Gram
Aceite de cedro

Lapiz graso
Elaborado por: QF. Mariana Rendn M. MSc.

PROCEDIMIENTO
Preparacin en fresco.- Lamina y laminilla
1.
2.
3.
4.

5.

6.
7.
8.

Desinfectar la superficie de trabajo con alcohol.

Prender el mechero para dar un rea de esterilidad.
Sacar la lamina del frasco con alcohol y secarla con una gasa.
Flamear el asa al rojo vivo, tomar el tubo con el cultivo de la forma
adecuada, es decir, quitar el tapn con los dedos meique y anular,
flamear con la boca del tubo.
Tomar el inoculo (medio liquido) con el asa de cultivo, una 8 gotas y
colocarla en el centro de portaobjetos. Si la muestra est en un medio
solido, tomar primero unas 8 gotas de lugol y ponerlas en el portaobjeto
Flamear y tapar el tubo con el cultivo, llevar al rojo el asa.
Colocar la laminilla sobre la suspensin bacteriana sin formar burbujas y
presionar suavemente.
Examinar la preparacin con objetivo seco dbil primero y despus con
seco fuerte.

58

Preparacin teida.- Tcnica de Gram

Frotis
En un portaobjeto colocar una gota de agua o caldo estril y a partir de una
placa de cultivo se toma una colonia con el asa y posteriormente se realiza una
disolucin de las bacterias extradas del cultivo con el agua.
La preparacin se seca a temperatura ambiente
Fijacin
Se pasa por la llama del mechero (3 veces) teniendo la precaucin de no
exponerla demasiado al fuego directo, ya que esto perjudica la evaluacin de la
forma y tincin de las bacterias. Una vez seca la lmina se tie.
Tincin
1. Disponga la preparacin bacteriana sobre la cubeta diseada para realizar
la tincin
2.-Cubra la lmina con Cristal violeta durante 1 minuto.
3.-Lave el exceso de colorante con agua
4.-Cubra con Lugol durante 1 minuto.
5.-Lave el exceso de lugol con agua.
6.-Decolore con solucin alcohol-acetona durante 20 segundos.
7.-Lave con abundante agua para eliminar el exceso de disolvente.
8.-Cubra la lmina con Safranina durante 30 segundos.
9.-Secar la preparacin entre 2 laminas de papel filtro y observar al microscopio
con aceite de inmersin.
NOTA: Luego de cada lavado elimine el exceso de agua para evitar la dilucin
del colorante o solucin empleada.
Disponga cada solucin durante el tiempo estrictamente estipulado.

LOS HONGOS FILAMENTOSOS

MARCO TERICO
El trmino hongo viene del latn fungus, que significa hongos. Estn
ampliamente distribuidos en la naturaleza, abundante en el suelo, vegetacin,
en la materia existente en el agua y en general en cualquier medio hmedo.
Son en su mayora beneficiosos para el hombre, se encarga de destruir la
materia orgnica compleja degradndola a formas qumicas simples que pasan
59

a formas qumicas simples que pasan a formar parte del suelo, donde
finalmente son absorbidas por otras generaciones de plantas, encargndose en
gran medida de la fertilidad de la tierra.
Gracias a los hongos se pueden obtener ciertos alimentos como los quesos
yogures, pan bebidas alcohlicas (cerveza, vino) produccin de antibiticos,
vitaminas, etc.
Desde el punto de vista clnico, el grupo de hongos ms importante para el
hombre va a corresponder a aquellos que crecen como parsitos en este
produciendo infecciones, fundamentalmente de tipo superficial o cutneo,
llamados micosis superficiales y ms excepcionalmente de formas sistemticas
de micosis profundas. La ciencia que estudia los hongos se llama micologa

MATERIALES MEDIOS
DE
CULTIVO/CEPAS
Algodn
Hongos en algunos
alimentos
(arroz,
zanahoria, banano,
pan)
Fsforos
Gasa
Placas
portaobjetos
Placas
cubreobjetos
Asa
de
inoculacin
Hilo
de
inoculacin
Lapiz graso

REACTIVOS
Y EQUIPOS
COLORANTES
Alcohol
Mechero

Algodn de Azul Microscopio

de Lacto fenol
Lugol
Kit de Gram
Aceite de cedro

Papel filtro
Elaborado por: QF. Mariana Rendn M. MSc

PROCEDIMIENTOS
TECNICA DE LA LMINA Y LA LAMINILLA
Preparar la suspensin de la muestra microbiana en una laminilla, usar lugol
o algodn de azul de lactofenol como medio de suspensin.
Tomar adecuadamente la muestra, con las dos asas, desde la superficie del
alimento para observar el hongo completo.
Agregar la laminilla.
Observar con las lentes de 10X o 40X
TCNICA DE GRAM
Preparar el frotis a partir de cepas
60

 Fijar
Tincin
Observar con 100X, agregando una gota de aceite de cedro

RESULTADOS

CONCLUSIONES

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

61

PRACTICA No 7
TEMA: SIEMBRA Y METODOS DE SIEMBRA
COMPETENCIAS
Conocer y realiza diferentes formas de siembra,
Realizar la tcnica de agotamiento por estras para la obtencin de cultivos
puros
Utilizar diferentes medios de cultivo para el aislamiento de microorganismos
Practicar la transferencia de inculos
MARCO TERICO:
Introduccin
La identificacin bacteriana se realiza tras el estudio de las caractersticas de
tincin, morfolgicas y bioqumicas de los microorganismos.
Con este fin, existen en el mercado una enorme variedad de medios de cultivos
diseados no solo para permitir el crecimiento y multiplicacin de los
microorganismos, sino tambin para inhibir los de otros (medios selectivos) o
resaltar determinadas caractersticas metablicas (medios diferenciales) que
nos permitan establecer los fundamentos de algunas pruebas diferenciales.
Los ambientes microbianos solo en raras ocasiones albergan una cepa nica.
Para identificar los microorganismos de un cierto hbitat, es preciso aislar cada
especie en un cultivo puro, para lo cual es necesario realizar aislamiento en
medios especiales, selectivos y diferenciales, y poder obtener un solo tipo de
microorganismo identificndolo mediante pruebas bioqumicas o serolgicas.
El primer paso para el diagnostico de un microorganismo es sembrar las
muestra en un medio de cultivo adecuado para su desarrollo y utilizar una
tcnica de siembra para poder observar sus caractersticas macroscpicas y
microscpicas como son las morfolgicas y tintoriales
SIEMBRA
Concepto: Depositar un inoculo o semilla en n medio de cultivo adecuado para
que se desarrolle. Se necesita darle las condiciones fsicas adecuadas como
son temperatura, tiempo, oxigeno, pH, dependiendo de lo que requiere el
microorganismos que se desea cultivar
METODOS DE SIEMBRA
Se pueden distinguir dos tipos de siembra:

En superficie: Corresponde a la modalidad ms empleada.

En profundidad: Se utiliza en las pruebas de identificacin bacteriana

Las siembras se pueden realizar directamente desde una muestra clnica que
contenga un microorganismo, desde otro cultivo bacteriano o desde un inculo.
Inculo:
suspensin
de
62
bacterias en un volumen
pequeo de medio lquido que
generalmente es un caldo
nutritivo
bsico
o
agua

Forma correcta de sembrar en tubo

Estra de crecimiento

Asa

Siembra en superficie
Siembra en profundidad (picadura)
Las siembras se pueden realizar con diferentes elementos, entre ellos:
a) Siembra con asa:
Se puede realizar:
Tomando un inculo a partir de una suspensin de bacterias o para
sembrar muestras biolgicas lquidas (orinas, lquido cefalorraqudeo,
etc.)
Para formar una estra de crecimiento a partir de un inculo realizado
con hisopo.
Para realizar traspaso de bacterias de un medio a otro, tomando
directamente una porcin de una colonia.
63

b) Siembra con hisopo:

El hisopo est compuesto de algodn hidrfilo, lo que permite empapar este
material con el fluido en el que se desea estudiar una bacteria.
Generalmente para que las bacterias permanezcan viables se utilizan
medios de cultivo denominados "de transporte", en el que se sumerge el
hisopo.
La siembra se realiza depositando el hisopo sobre una seccin de la placa y
posteriormente se realiza la estra de crecimiento con asa.
c) Siembra con pipeta Pasteur:
Se realiza para sembrar bacterias en suspensin.

AISLAMIENTO
Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y de sus propiedades,
es necesario separar unos de otros y trabajar con especies aisladas,
obteniendo cultivos axnicos o puros.
Un cultivo axnico o puro es aquel que contiene un slo tipo de
microorganismo y que procede generalmente de una sola clula; el crecimiento
de sta origina, en medio slido, una masa de clulas fcilmente visible que
recibe el nombre de colonia.
Para obtener cultivos axnicos o puros a partir de una poblacin microbiana
mixta, se utilizan las denominadas tcnicas de aislamiento, que fueron
desarrolladas durante el siglo XIX. En un principio, Lister utiliz diluciones
seriadas en medio lquido con esta finalidad, pero la presencia de
contaminacin, es decir, de microorganismos no deseados dificult el
aislamiento.
64

La escuela de Robert Koch introdujo los medios slidos, complementados con

Agar, y las placas de Petri en Bacteriologa, permitiendo as la separacin fsica
de las colonias sobre la superficie del medio de cultivo o en el interior del
mismo.
El aspecto de las colonias sirve para diferenciar distintas especies microbianas.
Tambin es posible tratar el medio para eliminar otro tipo de bacterias
diferentes de las que se desean aislar, antes de sembrar en las placas.
El aislamiento de una especie microbiana a partir de mezclas microbianas,
puede a menudo ser simplificado aprovechando una caracterstica particular de
las necesidades nutricionales de los organismos, requerimientos de
temperatura, productos metablicos, etc. Regulando la temperatura y el
suministro de oxgeno, hemos establecido unas condiciones selectivas que
determinan el desarrollo de la flora. Los microorganismos que no se renen las
condiciones impuestas, no crecen.
Aadiendo ciertas sustancias qumicas a un medio base, o imponiendo algunas
otras condiciones especiales durante el crecimiento del cultivo es posible:
1. Reprimir el crecimiento de microorganismos que interfieren, permitiendo
al mismo tiempo el del cultivo deseado-seleccin por inhibicin
2. Favorecer el crecimiento del microorganismo buscado, por lo que se
desarrolla ms que sus competidores-seleccin por enriquecimiento.
En ocasiones el aislamiento a partir de un cultivo mixto puede ser favorecido
sencillamente facilitando el reconocimiento del cultivo buscado. Este mtodo,
que no requiere el empleo de un inhibidor especial o sustancias de
enriquecimiento, se denomina cultivo en medios diferenciales.
Una gran cantidad de procedimientos de aislamiento se basan en
combinaciones de varios de estos principios. Desde luego, cuanta mayor
informacin se posee de las propiedades de un microorganismo determinado,
existen ms posibilidades de conseguir un medio que impida de una manera
ms efectiva el crecimiento de los microorganismos competidores.
Para realizar la identificacin de un microorganismo ser necesario partir de
una cepa pura, para lo cual es necesario realizar aislamiento en medios
especiales, selectivos y diferenciales para poder obtener un solo tipo de
microorganismo y de esta forma realizar las pruebas de identificacin, sean
estas bioqumicas o serolgicas.
El primer pasa para el diagnostico de un microorganismo es sembrar las
muestra en un medio de cultivo adecuado para su desarrollo y utilizar una
tcnica de siembra para poder observar sus caractersticas macroscpicas y
microscpicas como son las morfolgicas y tintoriales
TCNICAS GENERALES DE AISLAMIENTO Y CULTIVO DE
MICROORGANISMOS
1. Se aconseja que la siembra de todas las muestras a los medios de
cultivos se realice bajo una cabina de flujo de aire laminar o en un
gabinete de seguridad biolgica, con los protectores de plstico o vidrio
65

2.
3.

4.
5.
6.
7.
8.

para el cuello y la cara, las muestras procesadas se las debe considerar

como potencialmente infecciosas y manipularlos adecuadamente.
Se debe contar con todos los medios de cultivos necesarios para
realizar las siembras.
Las asas deben esterilizarse antes de utilizarlas y enfriarse sobre el agar
o el material de vidrio (en zonas estriles) antes de tomar la muestra de
microorganismos, con objeto de no destruirlos por calor.
Despus de utilizarlas, las asas se vuelven a esterilizar en todo su
permetro
Las bocas de los tubos y matraces de vidrio se flamean ligeramente una
vez destapadas, antes y despus de la inoculacin.
Durante la inoculacin, los tapones se mantienen en la mano
sujetndolos por la parte que no entra en contacto con tubos y matraces.
Los tubos abiertos deben mantenerse en posicin inclinada hacia el
frente para que el riesgo de contaminacin sea mnimo.
Las tapas de las placas Petri no deben colocarse nunca sobre la mesa
de trabajo boca arriba trabajando con bacterias.

Resiembra peridica a medios nuevos

Los cultivos de bacterias se pueden mantener en tubos en los que han sido
cultivados mediante pasos peridicos a medios nuevos.
Cuando se va a utilizar este procedimiento para mantener una coleccin de
cepas controles o para un estudio posterior, se deben considerar 3 parmetros
antes de realizar la resiembra:
1. El medio de cultivo
2. Tiempo de incubacin
3. Temperatura de incubacin

MATERIALES

MEDIOS
DE REACTIVOS
CULTIVO/CEPAS

EQUIPOS

Algodn

Cepas varias

Mechero

Fsforos
Asa de inoculacin

Agar
Mac
Conkey
Agar Nutritivo

Hilo de inoculacin

Caldo Nutritivo

Alcohol

Incubadora
Refrigeradora

Lpiz graso
Hisopos estriles
Gradilla
Elaborado: QF..Mariana Rendn M. MSc.

66

PROCEDIMIENTO
1.- Prender el mechero bunsen para crear un rea estril y aplicar la tcnica
asptica
2.- Coloca las placas en posicin invertida sobre la mesa de trabajo para que
se facilite manipularlas mejor.
Tcnica de siembra por estras en placa
1.- Desinfectar el rea de trabajo, ordenar el material de trabajo
2.- Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de petri
que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se
enfre el asa y toma una colonia de la placa. Tape la caja de petri.
3.- Ahora, toma una placa con agar estril (donde vayas a sembrar) y con
cuidado de no romper el agar, inocula la muestra en un extremo de la placa y
con el asa en posicin ligeramente horizontal realiza las estras (muy juntas),
oscilando el asa de siembra sobre la superficie de una porcin pequea del
agar; mediante un balanceo sucesivo y rpido de la mueca.
4.- Esteriliza el asa de nuevo y djala enfriar. Rozar una vez con el asa de
siembra las estras sembradas la primera vez y realiza sobre una porcin
virgen del agar una segunda tanda de estras que no toque la primera.
5.- Repetir exactamente la operacin descrita en el punto anterior, pero
rozando al empezar la segunda tanda de estras, hasta completar 3 o 4.
No hagas ms presin sobre el agar que la debida al propio peso del asa y su
mango. Es importante emplear un asa de siembra en buen estado, pues una
rota o deteriorada rasgar el agar.
6.- Lleva a la incubadora y deja en posicin invertida 24 horas al trmino de las
cuales se puede observar ya el desarrollo de colonias aisladas.

Carga la muestra
Tocar estra A
1ero estra A
flamear estria B
flamear

Tocar estria B
estria C
24h 37 oC

Resultados

Sembrado por estras en tubo inclinado

67

1.- Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de petri
que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se
enfre el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera.
2.- Ahora toma el tubo de agar en pico de flauta (agar inclinado) y cerca del
mechero retira el tapn de algodn ayudndote con los dedos meique y anular
y flamea la boca del tubo.
3.- Introduce el asa con la muestra (cuidando de no tocar las paredes del tubo)
y empezando en el rea del fondo del agar realiza una estra hacia fuera hasta
terminar en la punta del agar. Retira el asa.
4.- Flamea la boca del tubo de nuevo y coloca el tapn de algodn bien firme.
Esteriliza el asa y djala enfriar.
5.- Lleva a incubar y observa el desarrollo a las 24 o 48 horas despus de la
siembra.
Inoculacin en Agar inclinado

INCUBAR 24 horas 37C

Resultados

Sembrado por agitacin en caldo

1.- Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de petri
que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se
enfre el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera.
2.- Ahora toma el tubo con el caldo estril y cerca del mechero retira el tapn
de algodn ayudndote con los dedos meique y anular, flamea la boca del
tubo.
3.- Introduce el asa con la muestra (cuidando de no tocar las paredes del tubo)
y por agitacin dentro del caldo, siembra el inculo. Retira el asa y flamea de
68

nuevo la boca del tubo y coloca el tapn de algodn firmemente. Esteriliza el

asa y djala enfriar.
4.- Lleva a incubar y observa el desarrollo a las 24 o 48 horas despus de la
siembra.

INCUBAR 24 horas 37C

Resultados

Sembrado en picadura en tubo vertical

1.- Esteriliza el filamento de la aguja de inoculacin y toma la parte de la caja
de petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera
que se enfre la aguja de inoculacin y toma una colonia de la placa. Regresa
la caja a su tapadera.
2.- Ahora toma el tubo con el medio de cultivo y cerca del mechero retira el
tapn de algodn ayudndote con los dedos meique y anular, flamea la boca
del tubo.
3.- Introduce la aguja con el inculo y sin tocar las paredes del tubo, inocula en
el centro del medio de cultivo sin llegar hasta el fondo del tubo. Retira la aguja
de inoculacin en la misma direccin de la siembra. Retira el asa y flamea de
nuevo la boca del tubo y coloca el tapn de algodn firmemente. Esteriliza el
asa y djala enfriar.

4.- Lleva a incubar y observa las caractersticas del desarrollo a las 24 o 48

horas despus de la siembra.

69

.
Siembra por dilucin en masa o por inclusin en agar

INCUBAR 24horas 37c

Resultados

CARACTERISTICAS MACROSCOPICAS

70

Descripcin del tipo de colonias obtenidas

Observar las colonias obtenidas y describirlas teniendo en cuenta las
siguientes caractersticas:

Forma: Puntiforme, Circular, Rizoide, Irregular, Filamentosa.

Tamao: Grande (ms de 3Mm.), Mediana (2-3Mm.), Pequea (1-2

Mm.)

Color: Reportar el color final despus de la incubacin

Borde: Entero, Ondulado, Lobulado, Filamentoso, Ondeado
Elevacin: Plano, Elevado, Convexo, Pulvinado, Umbonado
Superficie: Suave, Brillante, Rugosa, Plegada, Seca, Polvorienta

Procedimiento
Inhibidores

No

Aislamiento

en

medios

Selectivos

Siembre por agotamiento por estras mltiples combinada:

Agar Manitol sal
Agar Mac Conkey
Luego de realizar estas siembras (placas y suspensiones) incube en estufa a
37 C durante 24 horas, tras las cuales debe evaluar el crecimiento bacteriano.

Procedimiento N 3: Siembra de muestras biolgicas

1. Realice una toma de muestra de secrecin nasal de alguno de los
integrantes del grupo.
2. Siembre la muestra en las mitades restantes de las placas de agar sangre
y Mac Conkey e incube durante 24 horas a 37 C.
RESULTADOS
1. Observe y registre las caractersticas ms importantes de los medios de
cultivo que se presentarn.
2. Observe las caractersticas macroscpicas de las colonias bacterianas
presentes en los cultivos que se le entregarn. (Color, Forma, Hemlisis,
tamao)
3. No olvide registrar la placa, tubo y portaobjeto con el nmero de la
muestra trabajada y con una seal que identifique a su grupo.

CONCLUSIONES
71

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

72

PRACTICA NO 8
TEMA: DETERMINACIN DEL NMERO DE MICROORGANISMOS EN UNA
MUESTRA: CONTAJE DE AEROBIOS TOTALES
COMPETENCIAS:
Realizar diluciones cuantitativas
Siembrar en cajas de petri por vaciado
Cuantificar los aerobios totales presentes en una muestra
MARCO TERICO:
Prcticamente todas las fases de microbiologa requieren mtodos para medir
el nmero de microorganismos. El crecimiento microbiano puede definirse
como el incremento en el nmero de clulas, o sea al crecimiento de
poblaciones. Este viene dado como consecuencia del crecimiento de cada
clula individual y su divisin celular. El crecimiento de un microorganismo
depende de varios factores como se observa en la siguiente tabla
El microorganismo En condiciones ptimas la bacteria Escherichia Coli tiene
un ciclo de vida de 15-20 minutos, mientras que el
en s
Mycobacterium Tuberculosis lo tiene de 18 horas.
Condiciones de
La temperatura de incubacin, la concentracin de CO2
incubacin
en la atmsfera de cultivo, la agitacin, etc., son factores
importantes.
La procedencia y
caractersticas del
inculo

La curva de crecimiento variar dependiendo de que se

parta de un cultivo estacionario o de uno en crecimiento
exponencial, que se pase de un medio de cultivo crecido
en MM + Glc a MM + Gal o MR a MM + Glc.

Cuadro No Factores de que depende el crecimiento de los microorganismos

Elaborado por: QF. Mariana Rendn M. MSc.

Diluciones
Con algunos de estos mtodos mencionados, a medida de la turbidez por
ejemplo: es necesario en algunos puntos diluir la muestra. Es conveniente
adems hacer algunas diluciones, generalmente seriadas en base de 10.
As para tener una dilucin 10 veces se mezclar 1ml con 9 ml de diluyente
(medio de cultivo o agua destilada estril).
Si hacemos lo mismo con esta dilucin obtendramos una dilucin 100 veces
menor.
Si lo hacemos con esta ltima conseguiremos una dilucin 1000 veces menor y
as sucesivamente. De esta forma obtendremos valores ms exactos y ms
reales.
Mtodo cuantitativo de siembra en placa: contaje
La siembra en placa para aislar bacterias que permite ver que cada clula
bacteriana viable daba origen a cada colonia, fcilmente visible, de clulas
hijas. Debido a que una bacteria da origen a una colonia, se puede utilizar la
73

siembra en placa para determinar el nmero de bacterias que hay en una

muestra. Para realizar esto se diluye la muestra y se siembra en placa y
despus de la incubacin se cuenta el nmero de colonias que se han
desarrollado. Luego se determina el nmero original de colonias multiplicando
el nmero de colonias desarrolladas por el grado de dilucin (factor de dilucin)
de la placa en que se est haciendo el recuento, para diluir una muestra
cuantitativamente, una porcin de 1 g o 1 ml, se suele ir diluyendo en una serie
de tubos que tienen 9 ml de agua o solucin tampn estril.
MATERIALES
Algodn
Fsforos
Pipetas

MEDIOS DE
CULTIVO/CEPAS

REACTIVOS ,
MUESTRAS
Agar Nutritivo o Plate Alcohol
Count
Agua
destilada
estril
Muestra de leche

Pipeteador
Pipetas automaticas
1000 landas puntas
para pipetas para
1000 landas
100 a 1000 landas
Lpiz graso

EQUIPOS
Mechero
Incubadora
Refrigeradora
Reverbero

Tubos de 150x20mm
Cajas de Petri
Gradilla
Elaborado: QF. Mariana Rendn M. MSc.

PROCEDIMIENTO
1. Desinfectar el mesn con un algodn impregnado en alcohol
2. Prender el mechero de Bunsen para tener un rea asptica
3. Rotular 6 tubos de ensayo de 150x20 con las diluciones correspondiente
(1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000, 1/100000, 1/1000000).
4. Agregar 9 ml de agua destilada o agua de peptona estril a cada tubo
5. Se preparan las diluciones sealadas agregando 1 ml de la muestra del
primer tubo.
6. Homogenizamos la primera dilucin absorbiendo con la pipeta y
expulsando a presin alejando el tubo.
7. Se realiza la siguiente dilucin tomando 1 ml de la primera (1/10) y se
homogeniza.
8. Las siguientes diluciones se preparan tomando 1 ml de la anterior
dilucin es decir 1ml de la 1/10 para formar la 1/100, y as
sucesivamente
9. Se realiza de manera sucesiva de tal forma que se utilice una sola
pipeta.
74

10. Para la siembra se debe tomar 1 ml de cada dilucin, comenzando de la

mas diluida a la ms concentrada, agregndolos en la caja que ha sido
rotulada con la dilucin correspondiente con anticipacin
11. Se agrega a cada caja Petri aproximadamente 20 ml de Agar Nutritivo o
Plate Count, que est a temperatura aproximada de 45 oC; esto se logra
cuando podemos sostener la fiola con las manos sin quemarnos.
12. Se homogeniza con giros sobre el mesn sin derramar el contenido y
dejamos solidificar. Cada caja debe tener los datos correspondientes.
13. Se incuba por un periodo de 24 a 48 horas a 37oC.

Resultados: recuento en placa

Las colonias que se desarrollan en las placas de Agar pueden contarse de
manera eficaz usando un artificio tal como el contador de colonias Quebec,
que ofrece una fuente de luz indirecta transmitida y una lente amplificadora.
Ponga las placas invertidas sobre el contador. Marque cada colonia sobre el
vidrio utilizando una pluma o un lpiz, para volver a contarlas.
Clculos del nmero de colonias en la placa
El nmero de bacterias por ml de muestra original (el recuento de placas) se
obtiene multiplicando el nmero de bacterias que hay sobre la placa, por el
factor de dilucin. Por ejemplo si usted ha contado 150 colonias en la placa de
dilucin 1/1000. Se puede calcular as: 150 X 1000 = 150.000 U.F.C. (unidades
formadoras de colonias por ml o por g de muestra).
75

Generalmente, se aconseja preparar las placas por duplicados para cada

dilucin. Entonces se halla la medida aproximada del nmero medio.
Al obtener recuentos de 148 y 154 en la placa 1/1000.
Se promedia as: 148+154=303, se divide 302/2=151
Se multiplica por el factor de dilucin 151X1000= 151.000 U.F.C/ ml o g de
muestra.
NOTA: Solo se cuentan las cajas con las diluciones que tienen entre 30-300
colonias por considerarse representativas para el recuento bacteriana.
RESULTADOS

CONCLUSIONES
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

76

PRACTICA No 9
TEMA: PRUEBAS BIOQUIMICAS
COMPETENCIAS
Conocer el fundamento de las diferentes pruebas bioqumicas
Siembrar en los diferentes medios para las pruebas bioqumicas
Aprender a interpretar algunas pruebas bioqumicas
MARCO TERICO:
Se trata de un conjunto de reacciones basadas en el metabolismo de los
microorganismos. En otros aspectos se analiza la accin de las bacterias sobre
los hidratos de carbono, la presencia de enzima en los diferentes
microorganismos y su accin sobre los distintos compuestos qumicos
presentes en los medios de cultivos. A partir del conocimiento del metabolismo,
las pruebas bioqumicas nos permiten determinar el gnero y la especie de la
bacteria en estudio.
Casi todas las reacciones que tiene lugar en una ruta bioqumica estn
catalizadas por una enzima especfica. Los catalizadores son sustancias que
pueden acelerar una reaccin qumica sin sufrir ellas mismas alteracin,
aumentando la frecuencia de las colisiones o disminuyendo la energa
necesaria de activacin.
Las enzimas son catalizadores biolgicos. Actan siempre de forma especfica,
es decir, cada enzima afecta solamente a un sustrato especfico, debido a la
estructura especfica de cada enzima.
Esta identificacin debe hacer a partir de un cultivo puro y fresco (18-24 horas).
Hay que considerar, adems, que las caractersticas metablicas en los
microorganismos pueden variar en funcin de distintos factores de manera que
para realizar una caracterizacin confiable es necesario realizar las pruebas en
condiciones estandarizadas (en cuanto al inculo, los reactivos, las condiciones
de incubacin y el tiempo de lectura) y utilizar ms de una prueba en cada
caso.
La eleccin de las pruebas bioqumicas se har en base a la familia en estudio,
lo cual se ir determinando en el curso del aislamiento.

MATERIALES
Algodn
Fsforos
Lpiz graso
Gradilla
Tubos
Cajas de Petri
Pipetas

MEDIOS
REACTIVOS
Agua de Peptona Alcohol
Agar Urea
Kovacs
Agar Citrato
Agar hierro triple
azcar
Agar Lisina
Agar Mio

EQUIPOS
Mechero
Refrigeradora
Incubadora

77

Asa de
Inoculacin
Hilo de
Inoculacin
Elaborado por: QF. Mariana Rendn M. MSc.

PROCEDIMIENTO
Vamos a estudiar diversas enzimas que pueden tener los distintos
microorganismos, los que nos permitirn clasificarlos e identificarlos.
1. PRUEBA DEL CITRATO
nicamente las bacterias capaces de metabolizar citrato podrn multiplicarse
en este medio, al utilizar los fosfatos presentes liberan iones amonio
(bsicos) que junto con la eliminacin de citrato (cido) generar que el
medio se vuelva muy alcalino, lo que se demuestra con un cambio de color del
indicador de pH de verde a azul.
Fundamento:
Esta prueba determina la capacidad que presenta el microorganismo problema
para utilizar el citrato como nica fuente de carbono. Este medio indica la
capacidad de las bacterias de metabolizar el citrato. Contiene citrato como
nica fuente de carbono, fosfato de amonio como nica fuente de fosfato
y azul
de
bromotimol
como
como
indicador
de
pH.
Tcnica:
a. A partir de un cultivo puro y reciente del microorganismo problema se
tomar una muestra con un hilo.
b. Sembrar en picadura y estra en un tubo con citrato de Simmons.
c. Incubar a 37oC durante 18-24 horas.
Interpretacin de los resultados:
Prueba positiva. Citrato positivo (+): si aparece crecimiento en el slam y si el
medio vira de verde a azul (debido a la produccin de amoniaco que lo
alcaliniza y cambia el color del indicador), el microorganismo es citrato positivo.
Prueba negativa. Citrato negativo (-): no vira el indicador. No hay cambio del
color del medio.

2. PRUEBA DEL INDOL

78

El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido

triptfano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y
desaminar el triptfano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco.
La produccin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de
muchas especies de microorganismos. La prueba de indol est basada en la
formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo
del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo de los reactivos de
Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptfano y
puede ser suministrado por una peptona adecuada
La prctica va a consistir en observar si el microorganismo es capaz de
producir indol cuando est en presencia de agua de peptona. El indol producido
es detectado por indol de Kovacs que produce una coloracin al reaccionar con
l.
Fundamento:
Esta prueba se basa en que ciertos microorganismos poseen una enzima
llamada triptofanasa que puede degradar el triptfano a indol.
Tcnica:
a. A partir de un cultivo puro y reciente del microorganismo problema se
tomar una muestra con asa de siembra.
b. Sembrar en un tubo con agua de peptona.
c. Incubar a 37oC durante 18-24 horas.
Pasado el tiempo de incubacin se sacan los tubos de la estufa y se les aade
1 ml de reactivo de Kovacs o de Erlich y se deja reposar.
Prueba positiva. Indol positivo (+): si aparece un anillo rojo en la capa
etrea, indica que la prueba es positiva, el microorganismo produce indol.
Prueba negativa. Indol negativo (-): no hay cambio de color del medio.

3. PRUEBA DE SCREENING DE PRODUCCIN DE CIDO Y GAS

Se aplica para averiguar la capacidad degradativa de un microorganismo de un
cierto hidrato de carbono. Se puede realizar sobre distintos hidratos de
79

carbono, esta prueba orienta para posteriormente realizar otras ms selectivas,

como la de rojo o metilo o Voges Proskauer.
Fundamentos:
Se basa en el viraje de color de un indicador de pH al producirse cidos. La
formacin de gas se observa en una campana de campana de Durham
Tcnica:
a. Rotular cada tubo con el nombre del azcar correspondiente (lactosa,
glucosa, maltosa, sucrosa, etc.)
b. Agregar con una pipeta 0.5 ml de los diferentes azcares en el tubo
correspondiente.
c. Tomar la cepa bacteriana con el asa de cultivo puro del microorganismo
problema.
d. Incubar a 37oC durante 24 horas.
Interpretacin de los resultados:
La formacin de cido se ver por el viraje de incoloro a fucsia. Si se formar
gas, ste se ver en el interior de la campana de Durham.

La campana de Durham debe estar perfectamente llena de agua de peptona

con indicador de Andrade en el momento de incubar la muestra pues una sola
burbuja inducira a error.
4. PRUEBA DE HIERRO TRIPLE AZUCAR
Esta prueba se recomienda para la identificacin de patgenos entricos Gram
negativos. Se emplea para detectar la fermentacin de lactosa, sacarosa y
glucosa, con formacin de cido y gas, y tambin para detectar produccin de
cido sulfhdrico.
Procedimiento
Realice una estra en la superficie y una puncin en la profundidad del medio.
Incube a 37C. Observar a las 18-24 horas, ni menos ni ms.
Resultados
1. Profundidad cido (amarillo): Glucosa fermentada.
Superficie cido (amarillo): Lactosa y/o sacarosa fermentada.
2. Profundidad cido (amarillo): Glucosa fermentada.
Superficie alcalino (rojo): Lactosa y/o sacarosa no fermentada.
3. Profundidad alcalino (rojo)
Superficie alcalino (rojo): Ninguno de los tres glcidos es fermentado
4. La aparicin de burbujas en la profundidad del medio indica que la
fermentacin se ha efectuado con produccin de gas.
5. Un ennegrecimiento en el medio indica la produccin de cido sulfhdrico.
80

A Glucosa, lactosa y/o sacarosa fermentada

B Glucosa fermentada con produccin de cido sulfhdrico y gas
C Glucosa fermentada con produccin de cido sulfhdrico
D Ninguno de los tres azcares es fermentad
Se reporta como un quebrado
a) A/A
b) K/AG+
c) K/A+ o SH2
d) No cambio
5.- PRUEBA DE LA CATALASA
Esta prueba permite diferenciar a los Staphilococcus y Micrococcus de los
Streptococcus y Enterococcus.
Fundamento
La catalasa es una enzima que descompone el perxido de hidrgeno (H 2O2)
en agua y oxgeno (H2O2 H2O + O2). Cuando se agrega una pequea
cantidad de microorganismos se produce la catalasa a una gota de H2O2, se
produce la formacin de burbujas de oxgeno que es el producto gaseoso de la
actividad enzimtica
Tcnica
1. Realizar una suspensin en una placa portaobjeto del microorganismos
problema
2. Agregar 3 gotas de Agua oxigenada
3. La presencia de burbujas indica que la prueba es catalasa positiva, sino
se presentan las burbujas la prueba es catalasa negativa

81

Resultados
Muestra No 1
Pruebas
T.S.I
Citrato
Urea
Indol
Lactosa
Glucosa
Sucrosa
Catalasa

Caractersticas del medio

Resultados

Elaborado: QF. Marianita Rendn M. MSc.

Pruebas
T.S.I
Citrato
Urea
Indol
Lactosa

Muestra No 2
Caractersticas del medio

Resultados

Glucosa

Sucrosa
Catalasa
Elaborado: QF. Marianita Rendn M. MSc.

CONCLUSIONES
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
______________________________________________________________

82

PRACTICA No 10
TEMA: ANTIBIOSIS O SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIOTICOS.ANTIBIOGRAMA
COMPETENCIAS:
Conocer la importancia clnica y microbiolgica de las pruebas de
susceptibilidad.
Elaborar correctamente un antibiograma de acuerdo al mtodo de
difusin del disco.
Conocer los criterios que permiten la eleccin adecuada de los
discos de antibiticos a probar en un antibiograma.
Interpretar y elaborar correctamente el reporte de un antibiograma .
MARCO TEORICO
El aislamiento e identificacin de un agente infeccioso a partir de una muestra
clnica proveniente de un paciente, no es suficiente para impartir una terapia
antimicrobiana adecuada. Actualmente, numerosos microorganismos han
desarrollado mltiples mecanismos que les permiten resistir a la accin de los
ms nuevos y potentes agentes antimicrobianos.
Como no se puede predecir la susceptibilidad de las bacterias a los
antimicrobianos, en la actualidad se dispone de varios mtodos para
determinar el patrn de susceptibilidad de una bacteria a los antibiticos. Entre
los mtodos ms utilizados podemos mencionar:
1. Mtodo de difusin del disco en agar (prueba de Kirby-Bauer).
2. Antibiograma ATB Rapid (bioMrieux).
3. Mtodo de dilucin en caldo o en agar (Concentracin Inhibitoria Mnima
[CIM]).
4. Mtodo de la cinta o Epsilmetro EtestR (AB BIODISK).
Otro aspecto importante que se debe tener en cuenta en la realizacin de las
pruebas de susceptibilidad, es la eleccin correcta de los antibiticos a probar.
A continuacin se sealan algunos criterios que pueden ayudar a seleccionar
adecuadamente dichos agentes:
1. Microorganismo aislado.
2. Mecanismo de accin del antibitico.
3. Espectro de accin del antibitico.
4. Biodisponibilidad del antibitico en rganos y sistemas (localizacin de la
infeccin).
5. Origen o fuente de la infeccin (hospitalaria o extrahospitalaria).
6. Estados fisiolgicos del paciente (edad, embarazo, entre otros).
7. Estados patolgicos subyacentes (inmunosupresin, tratamiento previo
con antibiticos, insuficiencia renal o heptica, entre otros).
El reporte de los resultados de una prueba de susceptibilidad bien realizada, es
un instrumento que le permitir al clnico elaborar un plan antibacteriano eficaz
contra el patgeno, seleccionando la droga menos txica para el paciente, y
83

con las caractersticas farmacocinticas ms apropiadas segn la naturaleza y

gravedad de la infeccin
Fuentes de error ms comunes en la realizacin de un antibiograma
1. Falta del control de calidad de los medios de cultivo a utilizar, patrn de
McFarland y los discos de antibiticos.
2. Trabajar con cepas bacterianas que no estn puras.
3. Inadecuada estandarizacin de la concentracin del inculo.
4. Utilizacin de un nmero excesivo de discos de antibiticos por placa.
5. Utilizacin de medios de cultivo no aptos para las pruebas de susceptibilidad.
6. Lectura prematura o extempornea de las pruebas de susceptibilidad.
7. Medicin incorrecta de los halos de inhibicin por una iluminacin deficiente
o regla inadecuada.
8. Incubacin en atmsfera inadecuada.
9. Error en la transcripcin de los resultados en la hoja de reporte.
El antibiograma
Se define como un mtodo de estudio de susceptibilidad bacteriana.
El mtodo utilizado con mayor frecuencia para evaluar la sensibilidad de las
bacterias a los agentes antimicrobianos es el denominado prueba de difusin
del disco. Esta tcnica fue estandarizada por Kirby y Bauer en 1966, de all
que dicho mtodo tambin se le conozca con el nombre de prueba de KirbyBauer. Es un mtodo sencillo y fcil de realizar en los laboratorios de rutina
que slo brinda informacin cualitativa o semicuantitativa sobre la sensibilidad
de un microorganismo a un antibitico determinado.
Sin embargo, los resultados obtenidos son de gran valor clnico para iniciar,
mantener o modificar una antibioticoterapia.
Este mtodo, que se realiza en placa petri y en agar Mueller-Hinton, para su
realizacin necesita realizar una suspensin de la bacteria que se ha aislado e
identificado previamente, en forma homognea por el mtodo de la
escobilladura sobre toda la superficie del agar a modo de tapizar ste con el
microorganismo.
Una vez que se ha realizado esta siembra, se colocan sobre el agar discos
pequeos empapados de sustancia antibitica que difundir en el agar.
Posteriormente se incuba en condiciones adecuadas y por un tiempo
determinado. (37C; 24 horas)
"Halo de inhibicin": Comprende la zona alrededor del disco en donde no se
observa crecimiento de las bacterias. Para cada antibitico se encuentra
descrito un halo de inhibicin mnimo que define la verdadera sensibilidad de
una bacteria a un antibitico ya que existe una relacin entre la concentracin
del antibitico y su capacidad de inhibir la cepa bacteriana.
El halo de inhibicin se evala por el dimetro en mm alrededor del disco.
Por ejemplo: Tetraciclina (30g ) Sensible: 19 mm y Resistente 14
mm.

84

Halo de inhibicin

Medicin del dimetro del halo

MATERIALES

MEDIOS DE
CULTIVO/CEPAS

REACTIVOS

EQUIPOS

Algodn

Agar Mueller
Hinton
Cepas varias

Alcohol

Mechero

Fsforos
Asa de inoculacin

Caldo soya
tripticasa

Pinzas

Solucin
salina Incubadora
estril
Patrn 0.5 del
Refrigeradora
estndar de
McFarland
Discos de Antibitico

Lpiz graso
Hisopos estriles
Tablas de los
criterios estndares
Regla milimetrada
Elaborado por: QF. Mariana Rendn M. MSc.

PROCEDIMIENTO
1. Cepa bacteriana a estudiar: Debe provenir de un cultivo fresco, de un
cultivo en agar, de manera que podamos comprobar que sea una cepa pura.
2. Inculo: Se transferirn una o dos colonias del cultivo a un tubo que
contenga solucin fisiolgica estril. En el caso de bacterias exigentes (Ej:
especies de Haemophilus, especies de Streptococcus, etc.), las colonias se
transferirn a un tubo que contenga caldo Mueller Hinton. En cualquiera de los
casos, el crecimiento bacteriano se ajustar a la turbidez del patrn 0.5 del
estndar de McFarland.
3. Siembra: a) Se introducir un hisopo de algodn estril dentro del tubo que
contiene el inculo estandarizado en el paso anterior. El exceso de lquido se
eliminar haciendo rotar suavemente el hisopo contra las paredes del tubo.

85

b) Con el hisopo debidamente humedecido, se inocular en tres o cuatro

direcciones toda la superficie de una placa con agar Mueller Hinton, girando
sucesivamente dicha placa en ngulos de 90o.
Nota: El agar Mueller Hinton se suplementar con 5% de sangre de carnero en
los casos que se est estudiando la sensibilidad en especies de Streptococcus
o Corynebacterium.
En cepas de Neisseria y Haemophilus se tendrn en cuenta las
recomendaciones del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, 2007).
Nunca utilice agar sangre, agar chocolate, agar tripticasa soya, agar nutriente,
agar Luria Bertani, BHI entre otros, para la realizacin de antibiogramas
convencionales.
c) Se deja secar el inculo en la incubadora a 37oC durante 5 minutos
d) Se colocarn con una pinza estril hasta un mximo de 6 discos de
antibiticos en forma equidistantes, presionndolos suavemente contra la
superficie de agar.
e) Se colocarn las placas a 37oC, en atmsfera aerbica por 24 horas
4. Lectura: Se realizar despus de 18-24 horas de incubacin. Con una regla
milimetrada, se medir la zona clara alrededor del disco de antibitico, el cual
se corresponde con la inhibicin del crecimiento bacteriano.
Estos datos se compararn con los dimetros de zona establecidos para cada
antibitico en las tablas de interpretacin internacional.(6)
La interpretacin de los halos de inhibicin nos permitir expresar el resultado
como sensible, sensibilidad intermedia o resistente. Estas categoras indican lo
siguiente:
Sensible (S): la infeccin debida al microorganismo aislado puede ser tratada
apropiadamente con el antibitico a la dosis recomendada, de acuerdo a la
gravedad de la infeccin. Sin embargo, para la prescripcin definitiva del
medicamento, el mdico tratante tendr en cuenta algunos factores tales como
biodisponibilidad del antibitico en el tejido o sistema afectado, presentacin
del medicamento, edad del paciente, condiciones patolgicas subyacentes o
fisiolgicas, entre otras.
Intermedia (I): indica que el antibitico tiene aplicabilidad clnica en sitios
corporales donde el antibitico alcance concentraciones teraputicas
adecuadas, como es el caso de -lactmicos y quinolonas en el tracto urinario.
En otros casos, puede utilizarse el medicamento con seguridad en dosis
elevadas que no alcancen los niveles de toxicidad pero que garanticen
actividad teraputica. Sin embargo, es recomendable evitar el uso de la
categora intermedia cuando sea posible.
Resistente (R): la bacteria aislada no es inhibida por el antibitico a las
concentraciones teraputicas ideales o la bacteria ha generado mecanismos de
resistencia que evaden la actividad del antibitico, por lo tanto, la eficacia
clnica de ste no es confiable.
Es recomendable que ante el aislamiento de un microorganismo
multirresistente clnicamente significativo se ensayen otras pruebas de
susceptibilidad adicionales (CIM), tal es el caso de cepas de Staphylococcus
resistentes a la vancomicina.

86

Utilice la siguiente tabla para registrar los resultados obtenidos en el

antibiograma:

1. Segn los resultados concluya la sensibilidad y resistencia de la bacteria

que estudi de acuerdo a la informacin que proporciona la tabla adjunta.
5. El reporte de los resultados del antibiograma debe ser realizado en forma
clara y precisa y enviados en forma inmediata al mdico tratante.

Conclusiones:

87

1. Segn los resultados concluya la sensibilidad y resistencia de la bacteria que

estudi de acuerdo a la informacin que proporciona la tabla adjunta.
2. Luego de evaluado el antibiograma complete el siguiente cuadro:
Microorganismo aislado:_______________________________________
Disco de antibitico

Dimetro en Milmetros

Interpretacin

Elaborado por: QF. Mariana Rendn M. MSc.

Autoevaluacin
1. De acuerdo a los datos suministrados por el profesor y los registrados en la
tabla anterior, elabore el reporte del antibiograma:
2. Cul es la finalidad de las pruebas de susceptibilidad?
3. Qu significa sensibilidad y resistencia cuando se interpreta un
antibiograma?
4. En qu casos, las pruebas de susceptibilidad requerirn de medios de
cultivos distintos al de Mueller Hinton?

88

PRACTICA No 11
TEMA: Bacterias Gram positivas.- Identificacin de Staphilococcus
patgenos
COMPETENCIAS:
Diferenciar el tipo de coccea Gram positiva correspondiente mediante la
prueba de catalasa.
Identificar los Staphilococcus patgenos mediante la prueba de la
coagulasa
MARCO TEORICO
De acuerdo al Manual de Bergey, las cocaceas positivas de importancia clnica
para los seres humanos comprenden los gneros Streptococcus y
Staphilococcus.
Su morfologa es muy parecida, pero existen pruebas para diferenciar los dos
gneros y cada una de sus especies
Genero Staphylococcus
Dentro de este grupo destacan algunas especies de importancia clnica como
son:
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus sapropyticus
Staphylococcus hominis
En general, este gnero se caracteriza por desarrollar colonias relativamente
grandes, redondas, lisas y brillantes. Al microscopio y mediante la tincin de
Gram, los Staphylococcus se ven como cocceas Gram positivas, redondas, de
un mismo tamao, aisladas, o agrupadas en racimos o en cadenas cortas.
Poseen una pigmentacin blanca, amarilla o dorada segn la especie. Al
cultivar estas bacterias en agar sangre (incubada 18-24 h a 37oC) aparecen
como colonias redondas, blancas o amarillas, con o sin hemlisis por la
presencia de enzimas especiales para este fin. Tienen la caracterstica de
crecer en medios con elevada concentracin de sal o cloruro de sodio, lo que
les brinda una caracterstica diferencial importante.
El St. aureus es un microorganismo patgeno capaz de producir una gran
variedad de sndromes clnicos. Poseen enzimas que hidrolizan un amplio
espectro de sustratos y producen diversas toxinas: Hemolisinas, exfoliativas y
enterotoxinas. La presencia de cepas toxignicas en aguas envasadas y de
recreo puede ser causa de infecciones.
Otras caractersticas que permiten su identificacin son la produccin de
Catalasa, coagulasa y susceptibilidad a la Novobiocina.

89

Pruebas de identificacion

Catalasa
Es una caracterstica de todas las especies de Staphylococcus. La catalasa es
una enzima que desarrollan como mecanismo de defensa que les permite
neutralizar los productos txicos derivados del metabolismo del oxgeno. Los
Streptococcus no poseen catalasa, por lo que esta prueba es muy importante a
la hora de diferenciar ambos grupos.
Coagulasa
Esta prueba es til para identificar una especie de Staphylococcus en especial,
el Staphylococcus aureus. La sntesis de esta enzima permite la coagulacin
del plasma y una prueba positiva identifica con certeza a la especie
mencionada.

Susceptibilidad a la noboviocina
Esta prueba diferencia el Staphylococcus saprophyticus de otras especies
coagulasa negativo. Se pone en contacto las bacterias con el antibitico, lo que
permite evaluar si hay o no desarrollo bacteriano. La prueba positiva indica que
existe resistencia a la novobiocina, porque an cuando el antibitico est
presente, existe crecimiento.
PRUEBA
Hemlisis
Catalasa
Coagulasa
Novobiocina
MATERIALES
Algodn
Fsforos

S. aureus
+
+
+
-

S.epidermidis S.saprophyticus S.hominis

-/+
-/+
+
+
+
+
-

MEDIOS DE
REACTIVOS
CULTIVO/CEPAS
Cepa
Plasma
Staphylococcus
Agar Mueller Hinton Agua Oxigenada al 3%

Asa de
inoculacin
Pinzas

Discos de
Novobiocina

Lpiz graso

Kit de Gram

EQUIPOS
Mechero
Incubadora
Refrigeradora

Discos de Bacitracina

Placas
portaobjeto
Gasa
Elaborado por: QF. Mariana Rendn M. MSc.

90

PROTOCOLO DE PROCESAMIENTO
1. Diferenciacin de Cocaceas Gram Positivas
Frotis Tcnica de Gram
Seguir el procedimiento de la Prctica de Tincin de Gram

COCACEAS GRAM POSITIVAS

2. Diferenciacin de staphylococcus y streptococcus

Prueba de la catalasa
1.
2.
3.
4.
5.

Tome una colonia de la placa de cultivo con un asa.

Perxido de hidrgeno al 3%
Si se producen burbujas la reaccin es positiva.
Prueba positiva indica que es un Staphylococcus
Prueba negativa es un Streptococcus

Prueba de catalasa
3. Identificacin de staphilococcus patgeno
Prueba de la coagulasa
1. Tome una colonia de la placa de cultivo con un asa.
2. Sumerja el asa en un tubo con aproximadamente 1 ml de plasma.
3. Incube a 37 C en estufa de cultivo y observe peridicamente hasta 4 horas
de incubacin.
4. La formacin de un cogulo en el fondo del tubo indica una prueba
coagulasa positiva.
91

5. Si el plasma sigue liquido indica una prueba coagulasa negativa

PRUEBA DE COAGULASA

4. Diferenciacin de staphilococcus coagulasa negativos

Prueba de la Novobiocina (30 g)
1.
2.
3.
4.

Realice una siembra de la colonia en estudio en un agar sangre.

En medio de la siembra coloque un disco de novobiocina.
Incube por 24 horas aproximadamente a 37 C.
Transcurrido el tiempo de incubacin observe si existe un halo alrededor del
disco para ver si hay o no crecimiento bacteriano.
5. Si no existe crecimiento de las bacterias alrededor del disco, mida con una
regla el dimetro del halo o circulo que se observa alrededor de la
novobiocina.
6. La prueba es negativa cuando existe crecimiento alrededor del disco y se
dice que es resistente.
7. La prueba es positiva cuando se observa un halo de inhibicin alrededor del
disco de ms de 21 mm y se dice que es sensible.

92

CONCLUSIONES
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

93

PRACTICA No 12
TEMA: IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS
COMPETENCIAS
Realizar reacciones bioqumicas relacionadas con la fisiologa
bacteriana utilizadas para la identificacin de enterobacterias
Saber interpretar las pruebas bioqumicas y relacionarlas con las tablas
estndares de identificacin
MARCO TEORICO
Las enterobacterias son bacilos Gram negativos, que en general no adoptan
agrupaciones caractersticas, no forman esporas y la mayora son mviles
debido a que poseen flagelos.
Se han desarrollado una serie de medios para cultivarlas, aislarlas e
identificarlas de acuerdo a sus propiedades bioqumicas.
Todas las enterobacterias tienen la propiedad de fermentar la glucosa y de no
poseer actividad de la citocromo oxidasa. Algunas enterobacterias de
importancia clnica son:

Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Proteus mirabilis
Shigella sonnei
Salmonella typhi

La orientacin bsica hacia el estudio de las enterobacterias es la identificacin

de bacilos Gram negativos a partir de la tincin de Gram y de sus cultivos en
agar Mac Conkey (selectivo para este grupo de bacterias). Una vez realizadas
estas observaciones se realiza una batera de 5 tubos que contienen los
siguientes medios de cultivo: TSI (agar triple azcar-fierro), LIA (Agar lisinafierro), MIO (agar movilidad, indol, ornitina), agar Citrato y agar Urea.
TSI: Permite identificar bsicamente la fermentacin de azcares tales como
glucosa, lactosa y sacarosa por cambios de color en el medio. Adems permite
ver si producto de la fermentacin se produce gas y cido sulfhdrico o
hidrgeno sulfurado. El medio es de color rojo por la presencia de un indicador
de pH de este color. Producto de la fermentacin se produce una acidez que
hace que el color vire a amarillo. El gas se evidencia por la formacin de
burbujas y el cido sulfhdrico por un color negro en el medio.
LIA: Este medio evidencia si las bacterias descarboxilan la lisina o desaminan
la lisina. Tambin permite ver la formacin de gas y de cido sulfhdrico. La
descarboxilacin de la lisina se observa por un color violceo en la profundidad
del medio y la desaminacin de la lisina por un color rojo en la superficie.

94

MIO: Este medio es semislido, a diferencia de los anteriores que son slidos.
Permite el estudio de indol a partir de triptfano, por ser semislido permite ver
la movilidad de la bacteria, ya que cuando es as el medio se vuelve muy turbio,
porque la bacteria puede crecer en todo el medio. Tambin permite observar la
descarboxilacin de la ornitina que se evidencia por un color violceo en el
medio. El indol se visualiza agregando un reactivo que provocar la formacin
de un anillo color rojo.
CITRATO: Permite evidenciar la utilizacin del citrato como nica fuente de
carbono. Por medio de un indicador de pH se evidencia el viraje desde un color
verde a un color azul, cuando se utiliza el citrato.
UREA: Permite evidenciar la presencia de la enzima ureasa en la bacteria. Se
utiliza un medio de color naranja que por medio de un indicador de pH vira a
fucsia cuando existe esta enzima que hidroliza la urea presente en el medio.
La interpretacin de las pruebas se realiza en base a tablas que de acuerdo a
las propiedades entregadas por los medios de cultivo permiten identificar la
bacteria correspondiente.
Estas tablas se escogen de acuerdo a los resultados que presenten el TSI y el
LIA.
INTERPRETACIN E INFORME DE LAS PRUEBAS
TSI (Agar triple azcar-fierro)
POSIBLES
INFORME
INTERPRETACION
RESULTADOS
Amarillo/Amarillo
Fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa
A/A
Rojo/Amarillo

K/A

Rojo/Rojo

K/K

No fermentacin de Lactosa, Fermentacin de

glucosa y sacarosa
No fermentacin de glucosa, ni lactosa, ni sacarosa

LIA (Agar lisina-fierro)

POSIBLES
INFORME
INTERPRETACION
RESULTADOS
Morado/Morado
K/K
Lisina desaminasa negativa y Lisina descarboxilasa
positiva
Morado/Amarillo
K/A
Lisina desaminasa negativa y Lisina descarboxilasa
negativa
Rojo/Morado
R/A
Lisina desaminasa positiva y lisina descarboxilasa
positiva
A: Acido; K: Alcalino
Informacin adicional que entrega TSI y LIA:
95

Produccin de H2S:
Se visualiza de color negro en el medio. Indica
produccin de hidrgeno sulfurado y se informa como H2S (+) o (-)
Produccin de gas de glucosa: Se visualiza con burbujas de aire en el medio
o espacios vacos. Se informa como G (+) o (-)
MIO (Agar movilidad, indol, ornitina)
POSIBLES
RESULTADOS
Turbidez
Transparencia
Indol Positivo
Indol Negativo
Morado en profundidad
Amarillo en todo el
medio

INTERPRETACION
Movilidad positiva (+)
Movilidad Negativa (-)
Anillo rojo en superficie al agregar reactivo de Kovacs
No se forma anillo rojo al agregar el reactivo de Kovacs
Ornitina positiva (+)
Ornitina negativa (-)

CITRATO
POSIBLES
RESULTADOS

INTERPRETACION

Azul
intenso
en Citrato positivo (+): utilizacin de citrato como fuente de
superficie
carbono
Verde en superficie
Citrato negativo (-)

UREA
POSIBLES RESULTADOS

INTERPRETACION

Fucsia

Ureasa positivo(+): Tiene la enzima ureasa para

hidrolizar la Urea
Permanece el mismo color Ureasa negativo(-)
del medio ( naranjo)
METODOS DE SIEMBRA:

MEDIO
TSI
LIA
MIO
Citrato Simmons
Urea

SIEMBRA
En profundidad y en superficie ( 1 picadura)
En profundidad y en superficie ( 3 picaduras)
En profundidad
En superficie
En superficie
96

PICADURA:

Siembra en superficie

Pinchar el medio
con asa en aguja

MATERIALES
Algodn

Fsforos
Asa
inoculacin
Hilo de
Inoculacin

MEDIOS
DE REACTIVOS
CULTIVO/CEPAS

Placas de agar
Alcohol
Mac Conkey con
Enterobacterias
Agar Hierro triple Kit de Gram
azcar(TSI)
Reactivo de Kovacs
Hierro
de Agar
Lisina(LIA)

EQUIPOS
Mechero

Incubadora
Refrigeradora

Agar Citrato
Agar Urea

Lpiz graso
Agar MIO
Elaborado por: QF. Mariana Rendn M. MSc.

PROTOCOLO DE PROCESAMIENTO
1. Observe las placas entregadas, anotando las caractersticas
macroscpicas de las colonias
2. Realice la siembra de una colonia en los medios de identificacin
bacteriana segn lo indicado en cada medio
3. Incubar a 37 C por 18 a 24 hrs
4. Observar resultados
y anotar la interpretacin de las pruebas
5. Identificar la bacteria con su gnero y especie, llevando los resultados a
las tablas de interpretacin
RESULTADOS
1. Anote las observaciones de cada tubo (antes y despus de inocular),
utilizando los colores apropiados.

97

2. Anote los resultados de cada prueba usando las abreviaturas correctas. En

caso de no corresponder a la bacteria que se le dio con el resultado de sus
pruebas bioqumicas, especifique de que bacteria se trata.
PRUEBAS
TSI
LIA
MIO
motilidad
indol
ornitina
Citrato
Urea

CEPA 1

CEPA 2

OBSERVACIONES

Elaborado por: QF. Mariana Rendn M. MSc.

CONCLUSIONES
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

98

PRACTICA No 13
COPROCULTIVO.- IDENTIFICACION DE PATOGENOS: SALMONELLA,
SHIGUELA, YERSINIA
. COMPETENCIAS
Comprobar mediante coprocultivo la presencia en las heces de los
microorganismos ms frecuentes (Salmonella, Shigella y Yersinia)
que puedan ser responsables de un proceso infeccioso.
Diferenciar los microorganismos patgenos de los componentes de la
microbiota fecal normal.
Identificar
mediante
pruebas
bioqumicas
los
posibles
microorganismos patgenos
INTRODUCCION
Microorganismos como protozoos, bacterias y virus pueden ser responsables
de cuadros gastrointestinales caracterizados por diarrea, acompaada en
ocasiones de vmitos, dolor abdominal y fiebre.
Este cuadro suele ser de corta duracin y autolimitado. Ante la sospecha de
una gastroenteritis bacteriana es necesario realizar un cultivo de heces o
coprocultivo para asilar e identificar el microorganismo responsable del proceso
diarreico.
El tubo digestivo contiene una abundante microbiota intestinal (microbiota
entrica normal) que parece desempear, en condiciones fisiolgicas, una
funcin beneficiosa para el hombre. Aproximadamente el 99,9 % de la
microbiota entrica est constituida por anaerobios (Bacteroides, Clostridium,
Peptostreptococcus, Peptococcus y otros) y, en menor proporcin, bacilos
coliformes (E. coli, Klebsiella, Proteus), Enterococcus y otras especies.
Los principales agentes bacterianos infecciosos pueden afectar el tubo
digestivo invadiendo la mucosa y provocando una diarrea sanguinolenta
(mecanismo invasor).Dentro de este grupo destacan Salmonella
entrica,Shigella spp.., Yersinia enterocolitica y Y.pseudotuberculosis,
Campylobacter jejuni y Escherichia coli (serotipos enteroinvasivos).Otras
bacterias lesionan el tubo digestivo por la accin de toxinas bacterianas
(enterotoxinas) que actan sobre la mucosa intestinal (mecanismo toxignico).
El cuadro se caracteriza por la ausencia de fiebre y porque existe poco dolor
abdominal. Dentro de este grupo se pueden encontrar bacterias como
Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Vibrio cholerae (serotipo 01 y
otros), Staphylococcus aureus y Escherichia coli enterotoxigenica.
Las heces pueden recogerse en un frasco estril. Tambin puede recogerse la
muestra pasando un hisopo estril por el esfnter anal. Para su traslado al
laboratorio el hisopo se introduce en un medio de transporte adecuado, que
mantiene los microorganismos viables e impide su multiplicacin.

Las heces se procesaran lo ms rpidamente posible o, en caso contrario, se

mantendrn a 4C.

99

PROCESAMIENTO
1.-) Coprocultivo: Sembrar la muestra en las placas siguientes:
Agar sangre.
Agar MacConkey.
Agar Salmonella Shigella (S-S).
Agar entrico Hektoen (HK).
Para ello se extiende el hisopo desde un borde hasta la mitad de la placa. A
continuacin con un asa de siembra estril de punta redonda se hace un
agotamiento por estras en el resto de la placa. Por ltimo, se introduce el
hisopo en el caldo de tetrationato agitndolo ligeramente (enriquecimiento).
Incubar las placas y el caldo a 37C durante 24 horas.
2.-) Al da siguiente, realizar una resiembra del caldo de tetrationato en agar
Salmonella Shigella. Para ello, con un asa estril tomar una cantidad del caldo
y sembrar por agotamiento por estras.
3.-) Lectura de las placas: Observar las placas para detectar los
microorganismos patgenos entre la abundante microbiota fecal e identificarlos.
En el agar sangre (medio general) se puede observar la composicin de la
microbiota fecal normal aerobia. En el resto de los medios (selectivos) lo
fundamental es distinguir colonias que no fermentan la lactosa (Salmonella,
Shigella, Yersinia) de los coliformes, que habitualmente la fermentan.
El caldo de tetrationato permite la deteccin de los patgenos entricos cuando
estn presentes en bajo nmero, ya que se retrasa el desarrollo de los
microorganismos de la microbiota normal y favorece el de los patgenos
entricos.
Puede ocurrir que en las placas de cultivo no observemos colonias lactosa
negativas y, sin embargo, en la resiembra del caldo s aparezcan. En este caso
se procede a identificar a los microorganismos patgenos a partir de la
resiembra del caldo.
a.-) Observar el aspecto de las colonias en los medios selectivos:
Colonias transparentes en agar MacConkey y con un precipitado de
color negro en agar
S-S y agar HK: altamente sugestivas de
Salmonella.
Colonias grandes, planas, transparentes en los medios selectivos:
sugestivas de Shigella.
Colonias puntiformes y transparentes en los medios selectivos:
sugestivas de Yersinia.
4.-) Pruebas Bioqumicas: A partir de cualquier colonia sospechosa lactosa
negativa (seleccionada en el punto anterior), picar con un asa de siembra de
punta recta y sembrar un slant de KIA e inocular el agar urea. Incubar ambos
medios a 37C durante 24 horas.
RESULTADOS
PRUEBAS
GAS
SH2
UREA
KIA

CEPA 1

CEPA 2

OBSERVACIONES

100

CONCLUSIONES
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

101

PRACTICA No 14
DIAGNSTICO MICROBIOLGICO DE LAS INFECCIONES DEL TRACTO
URINARIO (ITU).-UROCULTIVO
COMPETENCIAS
Describir las condiciones adecuadas para la toma y transporte de la
muestra de orina.
Cuantificar la carga bacteriana.
Identificar el (los) microorganismo(s) aislado(s).
Analizar los resultados obtenidos.
Reportar los resultados siguiendo las normas de taxonoma y de
pruebas de susceptibilidad antimicrobiana.
MARCO TEORICO
El trmino ITU define la presencia de microorganismos en las vas urinarias,
siendo las patologas ms frecuentes cistitis (infeccin de la vejiga) y
pielonefritis (infeccin del rin y su pelvis).
Epidemiologa
Las ITU son de las enfermedades ms frecuentes, en particular en mujeres. Su
prevalencia es dependiente de la edad y el gnero. Casi 1% de los nios,
muchos con anomalas funcionales o anatmicas del aparato urinario, presenta
infeccin durante el perodo neonatal.
Se calcula que 20% o ms de la poblacin femenina sufre alguna forma de ITU
en su vida. La infeccin en la poblacin masculina es rara hasta el quinto
decenio de la vida, cuando el crecimiento de la prstata empieza a obstaculizar
el vaciamiento de la vejiga.
En los ancianos de ambos sexos las intervenciones quirrgicas ginecolgicas o
prostticas, la incontinencia, la instrumentacin y el sondeo uretral crnico
favorecen tasas de ITU de 30 a 40%. Un solo sondeo vesical con lleva riesgo
de infeccin del 1% y al menos 10% de los individuos con sondas a
permanencia se infecta.
Patogenia
La orina, producida en el rin y descargada a travs de la pelvis renal y los
urteres hacia la vejiga, es estril en el individuo sano.
Se desarrolla infeccin cuando las bacterias logran ingresar a ese ambiente y
pueden persistir en l, sobre todo a travs de una va ascendente de bacterias
residente de la flora perineal, provenientes de la flora del intestino grueso.

102

Entre los factores que favorecen el acceso de las bacterias el ms importante

es el coito, que desplaza bacterias de forma transitoria al interior de la vejiga y
pone en riesgo a la mujer por la corta longitud de la uretra.
Otro es la manipulacin de la uretra como el sondeo. Las bacterias tambin
pueden alcanzar las vas urinarias desde la corriente sangunea, lo cual es
menos frecuente y requiere una infeccin en otro sitio.
La persistencia se favorece por factores del hospedero que interrumpen o
retardan el flujo urinario, como instrumentacin, obstruccin o anomalas
estructurales. Los factores bacterianos incluyen la capacidad de adherirse al
uroepitelio y producir otros factores como las exotoxinas. Los miembros del
gnero Proteus, productores de ureasa, se vinculan con clculos urinarios, que
por s mismos son factores que predisponen a la infeccin.
Diagnstico
El diagnstico de laboratorio de una ITU se realiza a travs del urocultivo, el
cual consiste en el cultivo bacteriolgico de la orina para determinar la
presencia y cuantificacin de grmenes patgenos. Para la evaluacin de estos
grmenes y de su potencial importancia en un proceso infeccioso de las vas
urinarias es imperativo conocer los siguientes aspectos:
Flora habitual de los genitales externos y la uretra anterior
Estafilococos coagulasa negativa, Corinebacterias no patgenas (difteroides),
Enterobacterias: Escherichia sp., Proteus sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp.
entre otras. Micobacterias
saprofticas, especialmente Mycobacterium
smegmatis, Levaduras y Streptococcus sp. Todos estos microorganismos
pueden contaminar fcilmente las muestras de orina sin que ello signifique
infeccin, por eso se deben seguir estrictamente las normas que se explican
ms adelante, que permiten recolectar y conservar correctamente las muestras
para urocultivo.
Agentes productores de ITU
Todo microorganismo puede potencialmente producir infeccin urinaria; sin
embargo,
las ms frecuentes son: Escherichia coli (85% aproximadamente), Proteus sp.
(especialmente Proteus mirabilis), Klebsiella pneumoniae, Enterococcus sp.,
Enterobacter sp. Pseudomonas sp., Serratia y Acinetobacter generalmente en
pacientes hospitalizados con sondas permanentes o con otra patologa de
base.
Levaduras, Staphylococcus saprophyticus (generalmente en mujeres en edad
reproductiva),Haemophilus, principalmente en nios.
Del hospedero
Para interpretar correctamente el resultado del urocultivo es importante conocer
la epidemiologa, condiciones generales y la clnica del paciente, tales como:
103

enfermedades metablicas, estrechez uretral, hipertrofia prosttica, desrdenes

neurognicos.
En estos casos una buena relacin entre el mdico y el microbilogo es
determinante para un diagnstico preciso.
FASES DEL PROCESO DEL UROCULTIVO
Etapa pre-analtica
Antes de iniciar el estudio de la muestra, el microbilogo debe conocer algunos
datos concernientes al paciente: edad, gnero, factores predisponentes,
sntomas, antecedentes de ITU, tratamiento actual o previo con antibiticos.
El paciente no debe haber recibido terapia antimicrobiana durante los tres das
anteriores a la recoleccin, excepto en los casos de control de tratamiento y
pacientes gravemente enfermos.
Recomendaciones previas a la toma de muestra
Mujeres: se debe higienizar la zona genital con agua y jabn, de adelante
hacia atrs, secarse con toalla limpia y se recomienda orinar separando los
labios mayores.
Hombres: se debe retraer el prepucio e higienizar el glande y surco
balanoprepucial con agua y jabn (no usar antispticos).
Recoleccin de la muestra

Adultos que controlan esfnteres(miccin normal) Se elimina el

primer chorro de orina y luego se recolecta en un envase estril el chorro
medio miccional, entre 15 a 30 ml y luego se sigue con la miccin normal
El tiempo de retencin deseado es por lo menos 3 o 4 horas, siendo la
muestra ms representativa la primera orina de la maana.
Nios y adultos que no controlan esfnteres
Al acecho: se aplica a los lactantes y es similar al descrito para los
pacientes que controlan esfnteres. El operador deber esperar el
momento de la miccin y recoger en un envase estril lo que
seguramente ser la porcin media del chorro miccional.
Puncin suprapbica: se reserva para casos especiales por ejemplo:
pacientes cuyos urocultivos previos presentan resultados conflictivos,
neonatos graves,entre otros. Deber ser realizada por mdicos
entrenados.
Cateterizacin: Debe ser realizada por personal entrenado y se
recomienda en enfermos con vejiga neurognica, lactantes entre otros.
La muestra recolectada debe ser la porcin media del chorro de orina
que sale por la sonda.

104

Enfermos sondados: Nunca tomar la orina que fluye del extremo distal
de una sonda que no es nueva. En caso de estar recin colocada
tomarla directamente del extremo distal en un recipiente estril.
Puncin de la sonda: se realiza en aquellos pacientes con sonda
permanente. Se obtura la sonda con una pinza ad hoc, se espera unos
minutos, se desinfecta la parte externa de la sonda en la zona proximal
con alcohol yodado y se punza con una jeringa estril, colocando
posteriormente el contenido en un envase estril.

Conservacin y trasporte de la muestra: La muestra para urocultivo debe

refrigerarse a 4 8 C inmediatamente despus de recolectada. Si el traslado
al laboratorio demora ms de 15 minutos, debe colocarse el recipiente con la
orina dentro de un contenedor con hielo. Este procedimiento permitir que el
nmero de microorganismos permanezca relativamente constante por un
tiempo no mayor de 24 horas.
Etapa analtica
Procesamiento de la muestra: antes de iniciar el estudio de la muestra, el
microbilogo debe conocer algunos datos concernientes a la misma.
Muestra: tipo de recoleccin: chorro medio, puncin suprapbica, sonda
(puncin, sonda nueva). Conservacin.
Examen directo
1. Examen macroscpico: olor, color, aspecto, pH, densidad.
2. Examen microscpico: estudio del sedimento (en fresco): se centrifuga
entre 10 - 15 ml de orina a 3000 rpm durante 10 min, el sedimento
obtenido se coloca entre lmina y laminilla y se observa al microscopio
con objetivo de 40X.
Interpretacin
Presencia de 5 o ms leucocitos por campo, es signo inequvoco de piuria y
refuerza el diagnstico de infeccin.
La demostracin de cilindros leucocitarios en una muestra en la que se ha
identificado un germen con recuento significativo, sugiere posibilidades de
pielonefritis.
En infecciones vesicales agudas, adems de piuria, puede comprobarse
hematuria.
La presencia de gran cantidad de clulas epiteliales escamosas, evidencia
contaminacin y la necesidad de repetir la muestra
3. Preparacin del frotis: Se toma una gota (con pipeta Pasteur) o una
asada de orina, se coloca sobre una lmina portaobjeto y se deja secar
sin extender, luego se fija y se colorea con la tcnica de Gram. Cuando
se sospecha de tuberculosis renal, la orina se centrifuga y se toma una
gota del sedimento, se coloca sobre una lmina portaobjeto, se deja
secar sin extender, se fija y se colorea con la tcnica de Zielh Neelsen,
para la bsqueda de bacilos cidos resistentes.
105

Interpretacin
La observacin de una o ms clulas microbianas por campo de inmersin se
presenta en muestras con contajes mayores de 100.000 colonias/ml de orina,
acompaadas generalmente por al menos un leucocito cuando existe piuria.
En las muestras que contienen contajes menores de 100.000 colonias/ml de
orina, generalmente no se observan microorganismos ni clulas. La presencia
de muchas clulas epiteliales escamosas as como de una flora vaginal mixta,
evidencia contaminacin y la necesidad de repetir la muestra
4. Cultivo y recuento de colonias: Permite diferenciar la verdadera
bacteriuria de una contaminacin. Se conocen varios mtodos para
determinar la cantidad de microorganismos.
Mtodo de dilucin en tubo o mtodo de Kass: Es un mtodo poco
prctico, muy laborioso, est basado en diluciones 1:100 y luego 1:10.000
de la orina, depositadas en placas estriles a las que se les agrega el agar
fundido. Despus de varios pasos se observa el crecimiento en las
diferentes placas.
Mtodo del asa calibrada: Es un mtodo prctico, sencillo y econmico,
que consiste en sembrar la orina sin centrifugar con un asa calibrada a
0.001 ml (3mm de dimetro) o 0,01 ml (4mm de dimetro).
En la eleccin de los medios de cultivo debe considerarse la recuperacin
de la mayora de los patgenos, con el menor costo posible. Generalmente
se recomienda la utilizacin de un agar sangre (AS) y un agar CLED o un
medio selectivo diferencial como MK o EMB. En nios incluir un agar
chocolate suplementado para la recuperacin de Haemophilus.
Agar CLED (cistina-lactosa-electrolito-deficiente): utilizado como medio
diferencial para el aislamiento, contaje e identificacin de microorganismos
en orina; su contenido en cistina y lactosa y la presencia del azul de
bromotimol (como indicador de pH) facilitan diferenciar a las bacterias
fermentadoras de lactosa, que acidifican el medio, virando el indicador de
pH al color amarillo (color que toman las colonias). Por otra parte, la
deficiencia en electrolitos inhibe el carcter invasor de las colonias de
Proteus.
Nota: en caso de muestras obtenidas por puncin suprapbica, se
recomienda utilizar un medio para la recuperacin de bacterias anaerobias
Procedimiento
1. Mezclar cuidadosamente la orina restante.
2. Insertar el asa estril verticalmente en la muestra y luego diseminarla
sobre la superficie de la placa desde el centro, formando una lnea y
posteriormente hacer estras sobre la placa cruzando la lnea del inculo
varias veces.
3. Incubar las placas durante 1824 horas a 37 C en aerobiosis y el AS en
microaerofilia y en anaerobiosis si la muestra as lo exigiera. En caso de
tener cultivos negativos a las 24 horas, se deben incubar 2448 horas ms.

106

Anlisis cualitativo
La identificacin de los agentes se hace mediante el estudio de las
caractersticas microscpicas de las colonias y la utilizacin de los sustratos
del medio, ejemplo: lactosa, hemlisis y la identificacin final a travs de
pruebas fisiolgicas diferenciales, como la prueba de la oxidasa, accin
sobre azcares.
Anlisis cuantitativo
Contar el nmero de colonias y multiplicar por el factor 1000 o 100, de
acuerdo a la capacidad del asa utilizada, para determinar las unidades
formadoras de colonia por mililitro de orina (UFC/ml).
Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos
Generalmente se usa el mtodo de Kirby Bauer, tomando en cuenta para la
eleccin de los antibiticos el agente aislado y aquellos que ms se utilizan
en el tratamiento de las ITU.
Etapa post-analtica
Informe de resultados
Datos personales del paciente: Nombre y apellidos, cdula de identidad.
Nombre del mdico tratante
Fecha de recepcin de la muestra y emisin del reporte.
Tipo de muestra: Orina (especificar mtodo de recoleccin)
Examen realizado: Urocultivo o cultivo y antibiograma
Resultados del examen directo: fresco o frotis
Agente microbiano aislado (gnero y especie) y recuento de colonias:
Recuento de colonias:
Generalmente un recuento de 10.000 o menos colonias por ml de orina
indica contaminacin y un recuento de 100.000 o ms, indica infeccin.
Cuando se obtienen valores intermedios, el examen debe ser repetido, ya
que existen factores como, por ejemplo, la obstruccin uretral, diuresis,
infecciones crnicas e infecciones por cocos Gram positivos, que pueden
explicar recuentos bajos en infecciones urinarias verdaderas.

MATERIALES
Algodn
Fsforos
Gasa

MEDIOS
Agar Sangre
Agar Cled
Caldo Nutritivo

EQUIPOS
Mechero
Centrifuga
Microscopio

Lpiz graso

Agar
Hinton

Incubadora

Placa
Portaobjeto
Asa calibrada
Papel filtro
Pinzas
Hisopo Estril

REACTIVOS
Alcohol
Kit de Gram
Reactivo
de
Kovacs
Mueller- Plasma
Agua Oxigenada
Aceite de Cedro

107

PROCEDIMIENTO
Primer da
1. Llenar la planilla de registro del laboratorio con los datos personales,
epidemiolgicos y clnicos del paciente.
2. Realizar el examen macroscpico y microscpico (Sedimento y Gram) de
una muestra de orina y describir lo observado en cada caso.
3. Sembrar la muestra de orina en AS y CLED, utilizando el asa calibrada
e incubar en las condiciones ya sealadas
Segundo da
1. Observar las placas sembradas en el perodo anterior, describa las
caractersticas observadas en cada medio y realice el contaje de colonias.
2. De acuerdo a las caractersticas macroscpicas y microscpicas
observadas, sospecha de un agente en particular? Escriba el nombre.
3. Con base en la morfologa y tincin observada en el examen directo de la
muestra de orina coloreada con Gram y el estudio de las caractersticas de las
colonias y su efecto sobre el medio del agente etiolgico, seleccione y siembre
las pruebas bioqumicas que le permitirn identificar el microorganismo, as
como los antibiticos para la prueba de sensibilidad de acuerdo al agente
presuntamente identificado y los datos clnicos y epidemiolgicos.
4. Incubar a 37 C durante 24 horas.
Tercer dia
Procedimiento
1. Realizar la prueba de la oxidasa si es el caso.
2. Realizar la lectura de las pruebas fisiolgicas montadas en el perodo
anterior e
identifique el agente aislado.
3. Realizar la lectura de la prueba de susceptibilidad antimicrobiana.
4. Elaborar el informe definitivo de los resultados.
Cultivos negativos: Negativo a las 48 horas de incubacin o no se observ
desarrollo
bacteriano hasta las 48 horas de incubacin.
Cultivos positivos: Desarrollo de nmero de UFC/ml de orina de nombre del
microorganismo.
Ejemplo: Desarrollo de ms de 100.000 de UFC/ml de orina de Escherichia coli.
Autoevaluacin
1. Mencionar en orden de frecuencia las especies bacterianas productoras de
ITU.
2. Describir la tcnica ms utilizada para el diagnstico microbiolgico de una
ITU.
3. Sealar las condiciones de conservacin y transporte de una muestra de
orina para urocultivo, justificar la respuesta.
4. Mencionar los antibiticos ms utilizados para el tratamiento de una ITU.
5. Definir los siguientes trminos: disuria, poliaquiuria, piuria, cistitis,
pielonefritis.
6. Mencionar la ventaja de incorporar el medio CLED en el urocultivo.
CONCLUSIONES
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------108

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

109

PRACTICA No 15
DIAGNSTICO MICROBIOLGICO DE LAS INFECCIONES DEL TRACTO
RESPIRATORIO SUPERIOR.- EXUDADO FARINGEO
COMPETENCIAS
Describir las condiciones adecuadas para la toma y transporte de la
muestra de exudado farngeo
Identificar el (los) microorganismo(s) aislado(s) mediante pruebas
bioqumicas.
Reportar los resultados
MARCO TEORICO
El sistema respiratorio se divide en vas altas o superiores, que comprenden las
reas anteriores a la laringe, incluyendo la nasofaringe, orofaringe, laringe,
epiglotis, odo externo y medio, y los senos paranasales, y vas bajas o
inferiores que incluyen todas las estructuras posteriores a la laringe.
El tracto respiratorio habitual (la faringe) est formado por distintos
microorganismos entre los que destacan los siguientes grupos y
especies: estreptococos, estafilococos, micrococos, neisserias, Moraxella
catarrhalis, corinebacterias, Haemophilus spp, Porphyromonas, Prevotella,
Fusobacterium, Veillonela, Peptostreptococcus, Actinomyces, etc. Sin
embargo, cuando encontramos una patologa en la faringe, el agente etiolgico
ms frecuentemente aislado es el Streptococcus pyogenes, pero tambin, otros
microorganismos patgenos que podemos hallar son: Streptococcus
pneumoniae,
Streptococcus alfa-hemoltico
grupo viridans,
etc.
Para poder identificar el agente microbiano de la muestra problema, se
proceder a la siembra del mismo en diferentes medios de cultivo, y as
observar si hay o no crecimiento en cada uno de ellos. Adems se proceder a
realizar diferentes pruebas, como la tincin de Gram, la catalasa, etc.
TOMA DE MUESTRA
Se pide al paciente que se siente y coloque su
cabeza hacia atrs.
Se ilumina bien la cavidad orofarngea y con un
bajalenguas se empuja la lengua hacia abajo para
facilitar el acceso a la parte posterior de la faringe.
Con un hisopo de algodn se hace un raspado de
las reas hipermicas, purulentas o necrticas, as
como de las membranas o manchas de Koplic, si
es
que
las
presenta.

110

TRANSPORTE

Agentes virales: El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de

tapn de rosca con 1 a 2 mL de solucin salina isotnica estril. Se
rompe la varilla de madera a la altura del tapn y se tapa
hermticamente.
Agentes bacterianos: El hisopo con la muestra se introduce en un tubo
de tapn de rosca con medio de Amies o de Stuart. Se rompe la varilla
de madera a la altura del tapn y se tapa hermticamente.

MATERIALES
Algodn
Fsforos
Gasa
Lpiz graso
Placa Portaobjeto
Asa calibrada
Papel filtro
Pipetas
Guantes
Mascarilla
Hisopo Estril /medio
de transporte Stuart

MEDIOS
REACTIVOS
Agar Sangre
Alcohol
Agar
Mac Kit de Gram
Conkey
Caldo Nutritivo
Plasma
Agua Oxigenada
Aceite de Cedro

EQUIPOS
Mechero
Microscopio
Incubadora

PROTOCOLO DE PROCESAMIENTO
Una vez obtenida la muestra, exudado farngeo, se proceder a la identificacin
de los microorganismos que posiblemente estn presentes en la misma. Para
ello se realizarn las pruebas que a continuacin se describen:
En primer lugar se escogern los medios especficos para la muestra de
exudado farngeo:
- Estreptococos -hemolticos; Columbia ANC + 5% sangre de cordero
agar.
- Haemophilus; Chocolate Poly Vitex Bacitracina Agar.
- Cndida albicans, levaduras; Sabouraud Gentamicina Cloranfenicol agar.
- Pneumococos; Columbia ANC + 5% sangre de cordeno agar.
- Staphylococcus aureus; Chapman agar.

111

No se ha utilizado el medio Loeffler, puesto que en el laboratorio no se dispona

de l; no obstante, es un medio especfico para el
microorganismo Corynebacterium diphteriae el cual es muy improbable que no
se hallara en la muestra.
A continuacin se procede a sembrar cada uno de los medios por la tcnica de
los cuatro cuadrantes, y as obtener un mejor aislamiento de las colonias.

El primer da

Se incuban todos los medios en aerobiosis, excepto el de agar sangre, que se

incub dentro de una campana de anaerobiosis. Para crear dicho ambiente de
anaerobiosis, se introdujo en la campana un sobre que tiene como funcin
quelar el oxgeno disponible, tanto en el espacio interno de la campana como
en el de la placa.
Para comprobar que estas condiciones anaerbicas se han dado, se introdujo
tambin dentro de la campana una tira, la cual en un principio es de color azul,
y tras el periodo de incubacin, si efectivamente se han dado dichas
condiciones, esa coloracin cambiar a transparente. La incubacin tuvo una
duracin de 24 horas a 37C.

El segundo da

1.- Todos los medios que anteriormente fueron incubados en aerobiosis, se

incubaron en anaerobiosis como ya se explic en el prrafo anterior. Adems
se sembr otra placa de agar sangre, pero esta vez se incub en aerobiosis.
Esta segunda incubacin tuvo una duracin de 24 horas a 37C.
2.- Se realiza la visualizacin macroscpica a las placas en las que se produjo
crecimiento bacteriano, estas placas corresponden con las dos de agar sangre,
una incubada en condiciones de aerobiosis y otra en anaerobiosis. En ambas
112

placas se observ que las colonias tenan un halo de hemlisis correspondiente

a la beta hemlisis.

3.- Se realizan dos tinciones de Gram, una de cada placa, para as diferenciar
tanto la forma, agrupacin, morfologa de estos microorganismos, as como las
caractersticas de su pared bacteriana, Gram positivos o Gram negativos.

4.- Se realiza dos pruebas bioqumicas, catalasa y oxidasa a las dos placas.
- Placa agar sangre en aerobiosis: La catalasa se realiz con el fin de
diferenciar el gnero Streptococcus del gnero Staphylococcus; y, la oxidasa
se realiz para confirmar el gnero Streptococcus.
- Placa agar sangre en anaerobiosis: la catalasa y la oxidasa se realizaron
para confirmar que el microorganismo presente en esta placa es la Veillonella.

113

114

INTERPRETACIN DE RESULTADOS
Visualizando las colonias obtenidas, tanto en la muestra en condiciones
aerbicas, como la muestra en condiciones anaerbicas, podemos deducir lo
siguiente:
En el primer caso (muestra en condiciones aerbicas)
Se realiza una observacin a luz natural (sin la aplicacin de luz UV), en la que
se ven colonias muy pequeas de color blanco, con un halo de hemlisis
alrededor, pertenecientes al grupo de los ------ hemolticos.
Posteriormente, se realiza la misma operacin, pero aplicando una luz
ultravioleta; en la que se observan colonias rojizas, con su halo de hemlisis
amarillo-verdoso.
En el segundo caso (muestra en condiciones anaerbicas)
Con la luz natural se observan minsculas colonias blancas con un halo de
hemlisis de color amarillas-anaranjado. Expuesta a luz UV, se observan
colonias rojizas y el halo de hemlisis amarillo-verdoso.
Una vez hecho esto, a partir de una colonia aislada obtenida en el medio de
cultivo agar sangre, expuesta en condiciones anaerbicas; se ha realizado una
tincin de Gram, cuyo resultado ha dado cocos, streptococcus, staphilococcus
De la misma forma, se ha realizado la tincin de Gram de una colonia aislada
obtenida por crecimiento en condiciones aerbicas, en el medio agar sangre.
En este caso, los microorganismos observados al microscopio han sido cocos,
diplococos, ttradas, estreptococcus (observado de un tamao mayor, que la
muestra
anterior)
En el resto de las placas sembradas, no ha habido crecimiento microbiano, por
lo que no se ha podido realizar ningn tipo de tincin, prueba. Esto, nos ha
ayudado a descartar la presencia de algunos microorganismos.
Para poder seguir reduciendo la lista de posibles microorganismos se ha
realizado la prueba de la catalasa, dando resultados negativos en ambas
muestras;
as
como
en
la
prueba
de
la
oxidasa.
Se realizan otras pruebas bioqumicas para diferenciar la especie del
microorganismo encontrado
CONCLUSINES
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BIBLIOGRAFIA
- Granados R., Microbiologa, Ed. Paraninfo 1999
- Gamazo, C., Lpez-Coi, I. y Daz, R. Manual Prctico de Microbiologa 3
Edicin. Editorial Masson. Espaa. 2005.
-Koneman. E.W. y Col Diagnostico Microbiolgico, Ed. Editorial Medica
Panamericana 2008
-MacFaddin 2003 Pruebas Bioqumicas para la identificacin de bacterias de
importancia clnica. Edit. Mdica Interamericana. 3 Edic. Bs.As .Argentina 850
pp.
-Merck, Manual de Medios de Cultivo 2007
-Velasco Judith, et alt. Manual Prctico de Bacteriologa Clnica. Coleccin de
Textos Universitarios, Universidad de los Andes, Venezuela 2008

Internet
http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/CDS_CSR_LYO_2004_
11SP. pdf. Organizacin Mundial de la Salud, Manual de bioseguridad en el
laboratorio. Tercera edicin 2012
http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/ Sociedad Espaola
de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica, Mtodos de identificacin
bacteriana en el laboratorio de microbiologa, 2 Edicin (37), 2010Fernndez
Olmos A. y otros
http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia, Sociedad Espaola
de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica, Diagnostico
Microbiologico del tracto urinario, Edicin 14ava 2010, Andreu Domingo A. y
otros
http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia, Sociedad Espaola
de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica, Diagnstico
microbiolgico de las infecciones del tracto respiratorio superior 2 Edicin (23),
2006, Batista Daz N. y otros
http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia, Sociedad Espaola
de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica ,Recomendaciones para
la implantacin de la normativa de calidad ISO 15189 en el Laboratorio de
Microbiologa Clnica: bacteriologa y serologa 2 Edicin (32), 2009
http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia, Sociedad Espaola
de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica, Diagnstico
microbiolgico de las infecciones gastrointestinales ,2 Edicin (30), 2008

116

GLOSARIO DE TRMINOS
Agentes biolgicos: Microorganismos, con inclusin de los
genticamente modificados, cultivos celulares y endoparsitos humanos
susceptibles de originar cualquier tipo de infeccin, alergia o toxicidad
Agentes patgenos: Todo aquel microorganismo capaz de producir
enfermedad o infeccin..
Aglutinacin: Agrupamiento de un antgeno en suspensin u otra partcula
bacterial con su anticuerpo especfico que se hace visible mediante el ltex o
partculas de carbn o eritrocitos.
Anatomopatolgico: Piezas anatmicas potencialmente infectantes.
Antibitico: literalmente destructor de la vida. Trmino que comprende todas
las sustancias antimicrobianas independientemente de su origen, ya sean
derivadas de microorganismos (bacterias, hongos, etc.) de productos qumicos
sintticos
o
de
ingeniera
gentica.
Anticuerpo: sustancia defensora (protena) sintetizada por el sistema
inmunolgico como respuesta a la presencia de una protena extraa
(antgeno)
que
el
anticuerpo
neutraliza.
Anticuerpo monoclonal: anticuerpo monoclonado a partir del cultivo de un
nico tipo de clulas (un clon de hibridoma), y que contiene por tanto un slo
tipo
de
protenas
(inmunoglobulina).
Antgeno: sustancia extraa a un organismo, normalmente una protena, que
desencadena como reaccin defensiva la formacin de anticuerpos que
reaccionan especficamente con el antgeno. En general, cualquier sustancia
que
provoca
una
respuesta
inmunitaria.
Anticoagulante: Sustancia que demora o suprime la coagulacin de la sangre.
Asepsia: Mtodo de prevenir las infecciones mediante la destruccin de los
agentes infectivos.
Autoclave: Olla con la cual se realiza esterilizacin por medio de vapor
de agua a presin.
Auto inoculacin: Desarrollar algn tipo de auto infeccin o enfermedad
causada
por
malos
hbitos
Biologa Molecular: parte de la biologa que trata de los fenmenos biolgicos
a nivel molecular. En sentido restringido comprende la interpretacin de dichos
fenmenos sobre la base de la participacin de las protenas y cidos
nucleicos.
Bioseguridad: Es el conjunto de lineamientos y regulaciones para prevenir,
eliminar o reducir cualquier riesgo potencial en las personas, la comunidad y el
medio ambiente.
Biotecnologa: toda aplicacin tecnolgica que utilice sistemas biolgicos y
organismos vivos o sus derivados para la creacin o modificacin de productos
o procesos en usos especficos.
Clulas epiteliales: Clulas superficiales que protegen las cavidades internas
y la superficie externa del cuerpo.
Cepa: en microbiologa, conjunto de virus, bacterias u hongos que tienen el
mismo
patrimonio
gentico.
Cilindros urinarios: Aglomerados de protenas de estructura tubular que se
forman durante las enfermedades de los tbulos renales, pueden contener en
su matriz eritrocitos, otras clulas y depsitos de sustancias qumicas.
Coagulacin: Proceso de formacin de la sangre en una masa gelatinosa.

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Cogulo: La conversin del fibringeno en una red de molculas de fibrina

polimerizada, que transforma la sangre en una masa gelatinosa..
Concentracin: Es la relacin entre la cantidad de soluto y la cantidad de
solvente o solucin.
Contaminacin: Presencia de un agente infeccioso en la superficie del organismo;
tambin en vestimenta, ropa de cama, juguetes, instrumentos quirrgicos, apsitos
u otros objetos inanimados o substancias, incluyendo el agua y los alimentos.
Cristales urinarios: Formas geomtricas de diferentes sustancias qumicas
que se cristalizan en la orina dependiendo del pH de esta.
Cultivo celular: El resultado del crecimiento in Vitro de clulas obtenidas de
organismos
multicelulares
Dao. Es la consecuencia producida por un peligro sobre la calidad de
vida individual o colectiva de las personas.
Desinfeccin: Disminucin de microorganismos patgenos en materiales,
equipos o reas del Laboratorio de Anatoma.
Diseminacin:
Proliferacin
de
microorganismos
Enfermedad: alteracin o desviacin del estado fisiolgico en una o varias
partes del cuerpo, por causas en general conocidas, manifestada por sntomas
y signos caractersticos, y cuya evolucin es mas o menos previsible.
Ensayo: Experimento.
Enzimas: Catalizadores que modifican la velocidad de una reaccin.
Esputo: Material eyectado desde los pulmones a la boca.
Estndar: Una solucin patrn que se utiliza para comparar o para la
elaboracin de otras diluciones.
Esterilizacin: proceso fsico o qumico con el cual se logra la total eliminacin
o destruccin de todas las formas de vida microbianas
Frmaco: droga, medicamento.
Fermentacin: conversin biolgica anaerbica (sin oxgeno) de las molculas
orgnicas, generalmente hidratos de carbono, en alcohol, cido lctico y gases,
mediante la accin de ciertos enzimas que actan bien directamente o como
componentes de ciertas bacterias y levaduras. En su uso ms coloquial, el
trmino hace referencia a menudo a bioprocesos que no estn estrictamente
relacionados con la fermentacin.
Gram negativa: Caracterstica de los tejidos o bacterias que pierden la
coloracin por el mtodo de Gram (toman color rosado).
Gram positiva: Caracterstica de los tejido o bacteria que conservan la
coloracin por el mtodo de Gram (toman color azul).
Heces: Mezcla de productos de excrecin y secrecin que se eliminan por el
intestino.
Hemlisis: Destruccin de Glbulos Rojos.
Hifa: Hongo de estructura larga filamentosa en forma de tubo..
Incineracin: consiste en reducir los desechos a cenizas inodoras para evitar
la propagacin de microorganismos patgenos
Infeccin: invasin de un ser vivo por un agente patgeno que desencadena
una
enfermedad.
Inoculacin: Introduccin de microorganismos, materiales infecciosos, etc. en
un ser vivo o en cultivos potencialmente infectantes
Lquidos de precaucin universal: Son aquellos que se consideran
potencialmente infectantes, entre ellos tenemos:
Sangre
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Semen
Secrecin vaginal
Leche materna
Liquido cefalorraqudeo
Liquido pleural
Liquido amnitico
Liquido peritoneal
Liquido pericardico
Cualquier otro liquido contaminado con sangre
Material corto punzante: es todo aquel material que puede producir cortes,
pinchazos o laceraciones, como agujas, lancetas, vidriera, hojas
de bistur, entre otros.
Material de riesgo biolgico: se caracteriza por albergar microorganismos
patgenos, los cuales inciden en el proceso salud - enfermedad.
Material gentico: todo material de origen vegetal, animal, microbiano o de
otro tipo que contenga unidades funcionales de la herencia.
Micelio: Masa de hifas.
Microorganismo: organismos microscpicos pertenecientes por regla general
a virus, bacterias, algas, hongos o protozoos.Toda entidad microbiolgica,
celular o no, capaz de reproducirse o de transferir material gentico.
Morfologa bacteriana: Forma de los microorganismos
Mucosas: reas del cuerpo cubiertas con membranas sensible a agentes
patgenos, como boca, orificios nasales, ojos, odos y genitales
Organismo: entidad biolgica capaz de reproducirse o de transferir material
gentico, incluyndose dentro de este concepto a las entidades
microbiolgicas, sean o no celulares. Casi todo organismo est formado por
clulas, que pueden agruparse en rganos, y stos a su vez en sistemas, cada
uno
de
los
cuales
realizan
funciones
especficas.
Patgeno: productor
o
causante
de
enfermedad.
Plasma: Componente lquido de la sangre que se obtiene al separar una
sangre con anticoagulante del paquete globular, contiene fibringeno y
componentes de la coagulacin neutralizados.
Peligro. Todo aquello que puede producir un dao o un deterioro de la
calidad de vida individual o colectiva de las personas.
Potencialmente infectante: material orgnico o inorgnico contaminado con
agentes patgenos.
Procedimiento: Serie de pasos en forma cronolgica, por los cuales se logra
un resultado deseado.
Profilaxis: conjunto de medios que sirven para preservar de enfermedades al
individuo o a la sociedad. Sinnimo de tratamiento preventivoPseudohifas:
Hongo de tipo de levadura que presenta una extensin tubular de protoplasma
que difiere de las hifas porque continan con la clula madre..
Reaccin enzimtica: Reaccin qumica que tiene por catalizador una enzima.
Riesgo: Posibilidad o probabilidad de que ocurra un dao a la salud, puede ser
causado por accidente, enfermedades u otros, pudiendo por ello cuantificarse
Ruta hospitalaria: es la encargada de recolectar las basuras de riesgo
biolgico y llevarlos a un sistema de relleno sanitario la cual consiste en la
disposicin definitiva de los residuos slidos, bajo condiciones que aseguren su
normal descomposicin sin riesgo para la salud humana o medio ambiente.
Secrecin: Sustancia que se vierten al exterior de una clula.
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Suero: Componente lquido de la sangre que se obtiene al separar una sangre

sin anticoagulante del paquete globular
Tejido corporal: Todo tipo de material orgnico proveniente de cualquier parte
del cuerpo de un individuo
Toxina: protena responsable de la especificidad funcional de ciertas bacterias,
que es venenosa para determinados organismos. Entre las mejor conocidas,
tanto por su estructura como por los mecanismos de accin, figuran las toxinas
colrica y tetnica que interaccionan con las clulas diana a travs de
ganglisidos de membrana.
Vacuna: antgeno procedente de uno o varios organismos patgenos que se
administra para inducir la inmunidad activa protegiendo contra la infeccin de
dichos organismos. Es una aplicacin prctica de la inmunidad adquirida.
Virus: entidad acelular infecciosa que, aunque puede sobrevivir
extracelularmente, es un parsito absoluto porque solamente es capaz de
replicarse en el seno de clulas vivas especficas, pero sin generar energa ni
ninguna actividad metablica. Los componentes permanentes de los virus son
cido nucleico (ADN o ARN, de una o de dos cadenas) envuelto por una
cubierta proteica llamada cpside.
Virin: unidad estructural de los virus. Consta fundamentalmente de dos
estructuras imprescindibles: un cido nucleico (ADN o ARN) y una envoltura
proteica (cpside). A estas estructuras bsicas se aade en algunos casos una
envoltura lipdica (peplos) y/o espculas de glucoprotena.
Viroides: agente causal de ciertas enfermedades de las plantas denominado
as por su semejanza con los virus, de los que se diferencia por carecer de
cpside. Se trata de cido nucleico envuelto por una membrana procedente de
la clula en la que se replic. Por extensin se aplicaba a lo que hoy se
denomina priones.

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