Vortexx ES X Aspergillus Niger (Artigo)

Braz. J. Food Technol., v. 12, n. 1, p. 43-52, jan./mar.
2009
Metodologia para limpeza no local em equipamento de alta presso dinmica

Clean in place methodology in dynamic high pressure equipment
Autores | Authors
Alline Artigiani Lima TRIBST
Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP)
Faculdade de Engenharia de Alimentos
(FEA)
Departamento de Tecnologia de Alimentos
Caixa Postal: 6121
CEP: 13083-862
Campinas/SP - Brasil
e-mail: alline.lima.tribst@gmail.com
Marcelo CRISTIANINI
(UNICAMP)
(FEA)
Departamento de Tecnologia de Alimentos
e-mail: olecram@fea.unicamp.br
Pilar Rodriguez de MASSAGUER

(UNICAMP)
(FEA)
Departamento de Cincia de Alimentos
e-mail: esteril@unicamp.br
Autor Correspondente | Corresponding Author
Recebido | Received: 12/05/2008

Aprovado | Approved: 17/02/2009
Resumo
O processo de limpeza Clean in place (CIP) importante para a correta
limpeza e sanitizao de equipamentos, evitando a ocorrncia de contaminao
entre lotes e a formao de biofilme. O objetivo deste trabalho foi determinar
um mtodo para limpeza CIP de um equipamento de alta presso dinmica
contaminado com condios de Aspergillus niger. Foram realizados testes in vitro
em suspenso aquosa para determinar a mnima concentrao inibitria (MIC minimum inhibitory concentration) e teste de atividade esporicida em superfcie
para determinar a efetividade do detergente alcalino e do sanitizante base de
cido peractico contra condios de A. niger. Para avaliar a eficincia do cido
peractico, foram testadas concentraes de 0,0025%-0,2 (v/v) por 20 e 30 min
de contato para o ensaio de MIC in vitro e concentraes de 0,01-0,03% (v/v)
por 30 min para os ensaios de atividade esporicida. O detergente foi testado
em concentraes entre 1,5-2,5% (v/v) por 30 e 40 min em ambos os ensaios.
O teste piloto foi realizado no homogeneizador de alta presso dinmica aps
sua utilizao para pasteurizao de nctar de manga contendo 106 condios
de A.niger.mL1. Antes da aplicao dos agentes de limpeza e sanitizao no
teste piloto, foi realizado um enxgue inicial do equipamento, que uma prtica
comum na indstria, com gua e lcool, por 40 min. Os resultados obtidos para o
ensaio de MIC in vitro indicaram que o uso de cido peractico nas condies de
0,025% (v/v) por 20 min ou 0,01% (v/v) por 30 min de contato inativaram a carga
de 103condios.mL1. Resultado similar foi obtido para o detergente nas condies
de 1,5% (v/v) por 40 min ou 2,0%(v/v) por 30 min. No ensaio de ao esporicida
em superfcie, a concentrao de peractico requerida foi de 0,05%(v/v) por
30min e o detergente no apresentou ao contra o fungo. O teste piloto indicou
que as condies de uso dos agentes de limpeza e a sanitizao determinadas
no teste de ao esporicida foram eficientes para a sanificao do equipamento,
desde que somado a um eficiente enxgue inicial.
Palavras-chave: Alta presso dinmica; Testes de ao esporicida;
Teste de MIC; CIP; Aspergillus niger; cido peractico; Nctar de manga.
Braz. J. Food Technol., v. 12, n. 1, p. 43-52, jan./mar. 2009
Summary
Cleaning-in-place (CIP) is an important procedure for the correct cleaning
and sanitization of equipment, thus avoiding contamination amongst batches
and the formation of biofilms. The purpose of this research was to determine CIP
methodology for dynamic high pressure equipment contaminated with Aspergillus
niger conidia. In vitro tests were carried out with aqueous suspensions of conidia
to determine the minimum inhibitory concentration (MIC), and sporicidal tests of
the surface to determine the efficiency of the alkaline detergent and sanitation
agent (based on peracetic acid) against A. niger conidia. The efficiency of the
peracetic acid was tested at concentrations of 0.0025 to 0.2% (v/v) for 20 and
30min contact time in the in vitro MIC trials,, and at 0.01 to 0.03% (v/v) for 30 min
in the sporicidal trials. The detergent was tested at concentrations of 1.5 to 2.5%
(v/v) for 30 and 40 min in both trials. The pilot test was carried out in an ultra-high
pressure homogenizer after treatment with mango nectar that had been previously
contaminated with 106 A. niger conidia.mL1. Prior to application of the cleaning and
sanitation agents, the equipment was submitted to an initial rinsing with distilled
water and alcohol for 40 min, which is a common industrial procedure. The results
obtained in the in vitro MIC trials indicated that the application of peracetic acid
at 0.025% (v/v) for 20 min or 0.01% (v/v) for 30 min of contact time, inactivated
a load of 103 Aspergillus niger conidia.mL1. Similar results were obtained for the
detergent at 1.5% (v/v) for 40 min or 2.0% (v/v) for 30 min. In the sporicidal trial
of the surface, the peracetic acid was effective at 0.05% (v/v) for 30 min, but the
detergent was not effective against the fungus. The pilot test showed that the
application of the sanitizer and detergent agents at the concentrations determined
in the sporicidal test was effective in sanitizing the equipment if combined with
an efficient initial rinsing procedure.
Key words: Dynamic high pressure; Sporicidal test; MIC test; CIP;
Aspergillus niger; Peracetic acid; Mango nectar.
www.ital.sp.gov.br/bj
TRIBST, A. A. L. et al.
1 Introduo
Durante a 2 guerra mundial, o ao inox se tornou
escasso, forando a indstria de alimentos a procurar
novos materiais para seus equipamentos. O vidro passou
a ser utilizado em muitos equipamentos, exigindo o
desenvolvimento de um novo processo de limpeza (sem
desmontes) para evitar quebras. Esse processo foi
chamado de CIP e utilizado atualmente para limpeza e
sanitizao de equipamentos (SEIBERLING, 2003).
Um equipamento a ser submetido ao processo de
CIP deve ser desenhado para permitir que as solues
de limpeza circulem e atinjam todos os pontos do equipamento que tiveram contato prvio com alimentos e que
seja possvel realizar, posteriormente, a drenagem total
destas solues (STANFIELD, 2003). Parmetros como
tempo de contato, temperatura de aplicao, turbulncia,
concentrao do agente sanitizante e ciclos de enxgue
so importantes para determinar a eficincia do processo
CIP (STANFIELD, 2003).
Aspergillus niger um bolor deuteromiceto comum
em regies de clima quente e mido (PITT e HOCKING,
1985). Tem temperatura tima de 35-37 C, mas capaz
de desenvolver-se em temperaturas extremas de 6 ou
47 C e tolera ambiente com pH at 2,0 e de baixa atividade de gua (HOCKING, 2006). Essas caractersticas
tornam o A. niger um contaminante comum de frutas e de
produtos obtidos a partir desta matria-prima e, consequentemente, das indstrias processadoras. A presena
de A. niger nos produtos embalados leva deteriorao
destes, com escurecimento, amolecimento dos tecidos
e separao de fases pela ao das enzimas do microrganismo (HOCKING, 2006).
Em produtos base de frutas, o tratamento trmico
para inativao microbiolgica e enzimtica causa perdas
nutricionais e sensoriais aos produtos, pela degradao
trmica de vitaminas, compostos de cor e aroma. A alta
presso dinmica (APD) um processo de inativao a
frio e pode ser utilizada como alternativa ao tratamento
trmico, visto que capaz de inativar alguns microrganismos (CAMPOS e CRISTIANINI, 2007; FANTIN et al.,
1996) e enzimas (LACROIX et al., 2005). Para realizar este
processo, porm, preciso utilizar homogeneizadores
que possuem selos de vedao especiais, para evitar a
ocorrncia de vazamentos. Esses selos so constitudos
de materiais como ligas de cobre e alguns polmeros
que podem ser quimicamente danificados por sanitizantes. Alm disso, o homogeneizador pode ter pontos
mortos e baixa velocidade de circulao, no atingindo
a velocidade requerida para eficincia do processo CIP
(STANFIELD, 2003). Por isso, a determinao do processo
de CIP para este equipamento deve considerar as suas
limitaes e ser especfico para um microrganismo alvo,
evitando a utilizao de concentraes acima das necessrias de detergente e sanitizante.
O cido peractico um sanitizante que apresenta ao de oxidante orgnico e no degradado

pela catalase dos microrganismos (GREENSPAN e
MACKELLAR, 1951). Seu mecanismo de ao envolve
interaes com as clulas atravs de radicais livres de
oxidao, com ao sobre os grupos tiol de enzimas e
protenas, inibindo a produo de metablitos e causando
consequente morte celular (DENYER, 1998). um lquido
incolor, de odor pungente e de fcil diluio em gua.
Caractersticas como baixa toxicidade, custo baixo
e facilidade de aplicao tornam o cido peractico
um dos principais agentes sanitizantes utilizados em
processos de desinfeco de um modo geral (KOIVUNEN
e HEINONEM-TANSKI, 2005), especialmente em indstria de alimentos. A eficincia do cido peractico como
sanitizante foi avaliada por vrios autores (GREENSPAN
e MACKELLAR,1951; VIZCAINO-ALCAIDA et al., 2003;
REYNOLDS et al., 2004) sobre bactrias, bolores e
leveduras. Estudo realizado por Greenspan e MacKellar
(1950) indicou que a mnima concentrao inibitria de
cido peractico para o Aspergillus niger foi de 0,005%
(v/v) em tampo fosfato e 0,05% (v/v) em caldo nutriente
e que, a adio de 0,3% (v/v) de cido peractico na
gua de lavagem de tomates e uvas foi capaz de reduzir
metade a contaminao em tomates e a 1/5 em uvas.
Detergentes alcalinos so compostos que contm
em sua formulao lcalis e so utilizados para a remoo
de matria orgnica em equipamentos. Apresentam
propriedades emulsificantes, saponificantes e peptizantes
(CRAMER, 2006). Em altas concentraes, podem apresentar efeito bactericida (HOLAH, 2003).
Teste de MIC in vitro em suspenso aquosa, de
atividade esporicida em superfcies (carregadores) e
piloto so os trs tipos de ensaios que podem ser utilizados para determinar a concentrao de uso de um
sanitizante (REYBROUCK, 1998). A escolha do tipo de
ensaio deve considerar a contaminao presente e o tipo
de equipamento. O teste de MIC in vitro em suspenso
aquosa um teste qualitativo inicial ou aplicado em situaes em que no ocorre aderncia dos microrganismos
superfcie (KLINGEREN, 1995). Os ensaios de atividade
esporicida em superfcie so quantitativos e representam
um maior desafio aos sanitizantes (KLINGEREN, 1995).
O teste piloto utilizado para certificar que as condies
de CIP estabelecidas so suficientes para a descontaminao dos equipamentos (REYBROUCK,1998),
garantindo segurana nos processamentos de alimentos
subsequentes.
Este estudo teve por objetivo determinar as
mnimas concentraes de uso de detergente alcalino e
sanitizante base de cido peractico para a realizao
do processo de CIP de um homogeneizador a ultra-alta
presso, tendo como microrganismo alvo o Aspergillus
niger. Foram tambm avaliados os efeitos dos agentes
45
de limpeza e sanitizao sobre os selos de vedao do

equipamento, para certificar se o processo no ocasionaria danos s peas do equipamento.
2 Material e mtodos
2.1 Meios de cultura
Foram utilizados os meios gar e Caldo Extrato de
Malte (MEA e MEB, respectivamente) formulados segundo
Pitt e Hocking (1985), para a preparao da suspenso
de condios e realizao dos testes.
2.2 Microrganismo alvo e obteno da suspenso de
condios
Foi utilizada uma linhagem de A. niger isolada por
Silva (2006) por ser a linhagem mais termorresistente
de bolores obtidos em 50 amostras analisadas de 1 L
de nctar de manga processado industrialmente. Essa
linhagem sobreviveu a tratamentos de 110 C por 15 min.
A suspenso de condios foi obtida segundo metodologia
descrita por Baglioni (1998), e sua enumerao foi realizada atravs de procedimento padro de contagem de
bolores, conforme descrito por Downes (2001).
2.3 Sanitizante e detergente alcalino
O sanitizante utilizado (Vortexx ES - ECOLAB)
tem em sua formulao 12% de cido peractico, 3%
de perxido de hidrognio e baixas concentraes de
cido peroctanico. As concentraes de uso do sanitizante foram determinadas utilizando-se como base a
concentrao de cido peractico na frmula, de maneira
que fosse possvel estender os resultados obtidos para
outras formulaes. O detergente utilizado foi um detergente desincrustante alcalino (MIP FPC - ECOLAB), que
contm em sua composio 6% de tolueno sulfonato de
sdio e 1% de cloreto de dodecilmetilamnio. No foram
verificados relatos prvios de inibio de fungos por este
produto.
2.4 Equipamento para processamento
alta presso dinmica
Foi utilizado um equipamento de ultra-alta presso
tipo homogeneizador (Stansted Fluid Power Ltd., Essex,
Inglaterra), Modelo FPG7400H:350, que opera com vazo
fixa de 270 mL.min1 e pode atingir presses de trabalho
de at 300 MPa.
2.5 Teste de MIC in vitro em suspenso aquosa
frente a condios de A. niger
O ensaio foi realizado conforme procedimento
descrito por Vizcaino-Alcaide et al. (2003), utilizando uma
concentrao desafio de condios de A. niger de 103.mL1
de gua. O sanitizante foi testado em concentraes de

0,0025; 0,005; 0,0075; 0,01; 0,02; 0,025; 0,05; 0,1 e 0,2%
(v/v) de cido peractico por 20 e 30 min de contato e o
detergente em concentraes de 1,5; 2,0; e 2,5% (v/v)
por 30 e 40 min de contato. O teste foi realizado temperatura ambiente. A neutralizao do cido peractico
foi feita com soluo de tiossulfato de sdio 0,6% e do
detergente com caldo nutriente. Aps a neutralizao,
foi realizada a diluio e plaqueamento das amostras em
meio MEA formulado. As amostras foram posteriormente
incubadas a 35 C por 5 dias. Foram determinadas como
mninas concentraes inibitrias (MIC) as menores
concentraes de detergente e sanitizante nas quais
no foi possvel a recuperao de nenhuma clula aps
o tratamento.
2.6 Determinao do tipo de ao
do detergente alcalino
Foram realizados ensaios para determinao do
tipo de efeito fungisttico ou fungicida do detergente
alcalino sobre os condios de A. niger. Para tanto, foi
realizado novamente o teste de MIC in vitro utilizando
concentraes mais baixas de detergente (0,002; 0,02;
0,2; e 0,2% v/v). As demais condies do ensaio foram
mantidas.
O efeito fungicida do detergente seria determinado
pela inibio do microrganismo em todas as placas
obtidas apenas a partir da maior concentrao de detergente, e o fungisttico, caso as placas obtidas a partir
das menores diluies das concentraes mais baixas de
detergente apresentassem inibio do fungo, enquanto
que as placas obtidas a partir das maiores diluies
apresentassem crescimento positivo. Foi realizada, paralelamente, a contagem de condios de uma amostra sem
tratamento com detergente para comparar a velocidade
de crescimento das colnias.
2.7 Teste de atividade esporicida em superfcie
frente a condios de A. niger
Os ensaios foram realizados segundo adaptao
da metodologia nmero 955.17 da AOAC (1995), que
originalmente descrita para a avaliao da atividade
esporicida de desinfetantes sobre esporos bacterianos.
Foram utilizados carregadores de ao inox 316, na
forma de cilindros ocos com 10 mm de altura, 6,1 mm de
dimetro interno e 8 mm de dimetro externo. Os carregadores foram imersos em uma suspenso de condios
de A.niger de 105.mL1 por 15 min e, em seguida, foram
secos em estufa a vcuo por 24 h a 30 C. Este procedimento permitiu que ficassem retidos nos carregadores
103condios.mL1 (ou o equivalente a 0,01 mL), representando a mesma concentrao do fungo utilizada no ensaio
de MIC in vitro. Foram utilizados os mesmos tempos de
46
contato e neutralizantes do teste acima mencionado. No

ensaio, foram testadas concentraes de 0,01; 0,03; e
0,05% (v/v) de cido peractico em 30 min de contato e
2,5% (v/v) de detergente em 40 min de contato. O teste
foi realizado temperatura ambiente. A AOAC estabelece,
com 95% de certeza, que a concentrao de sanitizante
que resulta em apenas 1 tubo com crescimento positivo
entre 60 tubos inoculados apresenta ao esporicida.
Considerando-se que os condios so esporos fngicos,
possvel utilizar esta denominao de ao esporicida
do detergente e do sanitizante.
2.8 Teste da ao dos sanitizantes sobre
os selos do equipamento
Foi avaliado o efeito do detergente e do sanitizante
sobre os selos de vedao do equipamento constitudos
de material no inoxidvel (Poli-etil-etil-cetona - PEEK),
teflon, e de ligas de berlio-cobre conforme descrito
pelo fornecedor do homogeneizador. Foram testados
todos os tipos de selos do equipamento presentes nos
pistes, vlvula de entrada de amostra e vlvula de
homogeneizao, em um total de 10 amostras. Esses
selos foram previamente mensurados com paqumetro,
as suas massas determinadas em balana analtica e
seus aspectos visualizados por meio de uma lupa. Todas
as medidas foram obtidas em triplicata. Em seguida, os
selos foram imersos em solues dos agentes e mantidos
pelo tempo de contato de 30 min, sendo, posteriormente,
secos e avaliados segundo os mesmos parmetros
descritos anteriormente. O procedimento foi repetido
4 vezes para simular a realizao de 4 processos de
limpeza e sanitizao.
2.9 Teste piloto de limpeza e sanitizao
em homogeneizador
O teste piloto foi feito no equipamento de homogeneizao alta presso, no qual foi previamente
realizado um processamento de nctar de manga contaminada intencionalmente com suspenso de A. niger na
concentrao de 106 condios.mL1, de forma a simular um
processo da indstria de alimentos. Foram avaliadas as
presses de 100, 150, 200 e 300 MPa para a inativao
do microrganismo, sendo coletadas assepticamente
amostras de 50 mL aps cada processo.
Aps os processamentos, o equipamento passou
por um processo de limpeza CIP, incluindo enxgue inicial
com gua corrente e pressurizada (40 min), uso dos
agentes de limpeza e sanificao nas concentraes e
tempos determinados no ensaio de atividade esporicida
e enxgues intermedirios e finais, de 10 min cada com
gua corrente. A aplicao do sanitizante foi realizada
com o equipamento sem circulao (apenas inundado)
de forma a minimizar os possveis efeitos negativos do
cido peractico sobre os selos, especialmente sobre

os de liga de Berlio-Cobre. Aps cada procedimento do
processo CIP, amostras de 50 mL da gua de lavagem
foram assepticamente coletadas, para a verificao da
efetividade de cada etapa.
A efetividade do processamento alta presso,
bem como do processo de CIP desenvolvido, foi testada
atravs da contagem de clulas viveis em cada amostra
coletada, por diluio e plaqueamento das amostras em
profundidade em MEA formulado. As amostras foram
ento incubadas a 35 C/5 dias, quando tiveram suas
contagens determinadas (Nf). Foi tambm realizada a
contagem de clulas viveis de uma amostra sem tratamento, para ser estabelecido como contagem inicial (No).
O nmero de redues decimais (NRD) obtidos para cada
processamento e para as etapas do CIP foram expressos
segundo a Equao 1.
NRD = log (No/Nf)
(1)
Em um segundo teste piloto, o enxgue inicial foi

realizado em 40 min, revezando-se gua e lcool etlico
96%, visando mudar a solubilidade do nctar de manga,
facilitando a sua remoo do equipamento. As demais
condies foram mantidas.
2.10 Roteiro de realizao dos ensaios
A realizao dos ensaios citados no material e
mtodos seguiu uma ordem especfica de forma a estabelecer um processo de CIP para o homogeneizador
ultra-alta presso e avaliar sua eficincia sobre o
microrganismo alvo e seu efeito sobre os selos do equipamento. A Figura 1 esboa a sequncia de avaliaes
efetuadas.
3 Resultados e discusso
Os resultados obtidos para o sanitizante so
mostrados na Tabela 1.
A MIC aps 20 min de contato foi de 0,025% (v/v)
e aps 30 min, 0,01% (v/v). Foi observada uma diferena
na MIC do sanitizante quando o microrganismo foi exposto
aos diferentes tempos de contato, o que era esperado,
devido aplicao de um tempo de contato 10 min maior
(50%) em um dos ensaios. Esse resultado indica que o
sanitizante usado no perdeu atividade em at 30 min
de contato.
Com relao ao microrganismo alvo, que apresenta
uma termorresistncia incomum para sua espcie (capaz
de sobreviver a 110 C por 15 min), no foi observado
o mesmo comportamento de resistncia qumica frente
ao agente de sanitizao, visto que a MIC determinada
est prxima faixa estimada pelo fabricante (Ecolab,
2006) para inibio de bolores comuns (0,012 a 0,024%
de cido peractico).
47
Etapa 1
Teste de MIC in vitro em suspenso aquosa para

sanificante a 0,0025-0,2% por 20 e 30' de contato
Teste de MIC in vitro em suspenso aquosa para

detergente a 1,5-2,5% por 30 e 40' de contato
Determinao do efeito fungicida ou fungisttico

do detergente, utilizando concentraes de
0,002-0,2% por 40'contato
Etapa 2
Teste de atividade esporicida do sanificante

a 0,01; 0,03 e 0,05% por 30'de contato
Teste de atividade esporicida do detergente

a 2,5% por 40 min de contato
Etapa 3
Avaliao do efeito dos detergente e sanificante

nas concentraes escolhidas sobre os selos de
vedao do equipamento de alta presso dinmica
Etapa 4
Escolha das concentraes de uso de detergente

e sanificante eficientes contra o A.niger.
Realizao do teste piloto no equipamento de alta

presso dinmica previamente contaminado com o
............
A.niger , utilizando as concentraes de detergente
e sanificante determinados na Etapa 2 e enxgues
sucessivos com gua e lcool 96%
Figura 1. Diagrama dos ensaios realizados para determinao da metodologia CIP para o equipamento de alta presso dinmica.
Tabela 1. Ao do Vortexx ES
niger em suspenso.*
Concentrao de cido
peractico (%)
0,2000
0,1000
0,0500
0,0250
0,0200
0,0100
0,0075
0,0050
0,0025
sobre condios de Aspergillus

NRD**
20
>3
>3
>3
>3
2,82
2,82
1,50
1,42
0,15
30
>3
>3
>3
>3
>3
>3
2,35
1,59
0,20
* Inculo: 1,0 x 103 condios.mL1; e ** NRD = nmero de redues

decimais.
Os resultados deste experimento esto em acordo

com os obtidos previamente por Greesnpan e MacKellar
(1950), que determinaram a MIC de cido peractico para
A. niger, como 0,05% (v/v) por 10 min, em caldo nutriente.
Para o atual projeto, optou-se pelo uso do sanitizante a
0,01% (v/v) (inativao em 30 min), visando o uso da
menor concentrao possvel do cido peractico no

equipamento de APD.
Para os ensaios de MIC com detergente alcalino,
foi observado, inesperadamente, que este foi capaz de
inibir o A. niger em todas as concentraes e tempos
estudados, sendo o tratamento com 1,5% (v/v) de
detergente e 30 min de contato o nico que apresentou
sobrevivncia (1 UFC.mL 1), o que foi equivalente a
3,04redues decimais. J, com concentraes 1,5%
(v/v) durante 40 min ou 2,0% (v/v) durante 30 min de
contato, no houve crescimento, sendo ento estas
concentraes estabelecidas como MIC. Como essa
ao inibitria no era esperada, foram realizados
testes para avaliar se o efeito do detergente sobre
os condios foi fungisttico ou fungicida. Uma substncia fungisttica quando a sua presena inibe ou
retarda o desenvolvimento do fungo, sem destru-lo, e
fungicida quando o tratamento com a substncia, em
uma determinada concentrao, capaz de inativar o
microrganismo (MAGAN et al., 2003).
Em termos prticos, para o ensaio realizado, o
efeito do detergente seria fungisttico se o arraste de
48
Tabela 2. Nmero de redues decimais de Aspergillus niger obtido para diferentes concentraes de detergente e tempo de
contato de 40 min.*
NRD**
Concentrao de
Contagem nas diluies (condios.mL1)
Mdia da contagem
1
detergente (% v/v)
100
101
102
(condios.mL )
2
<1
<1
<1
<1
>3,04
1,5 (MIC)
<1
<1
<1
<1
>3,04
3
0,00
0,2
>250
118
11
1,18 x 10
0,02
>250
69
8
6,9 x 102
0,21
0,002
>250
102
7
1,02 x 103
0,03
* Inoculo: 1,1 x 103 condios.mL1; ** NRD = nmero de redues decimais.
soluo de detergente para as placas de contagens de

sobreviventes aps o procedimento de diluio tivesse
inibido o crescimento do fungo e fungicida, se a concentrao de detergente (1,5-2,5%) utilizada pelo tempo
de contato (30-40 min) tivesse sido capaz de inativar o
microrganismo. As contagens das diferentes diluies de
detergente testadas e os nmeros de redues decimais
obtidos so mostrados na Tabela 2.
Os resultados obtidos demonstram que apenas a
concentrao de 2% e de 1,5% (MIC) apresentou ao
sobre a suspenso de fungos, inibindo-os em todas as
diluies testadas. As diferenas observadas nas contagens da primeira diluio decimal de 2% do detergente
(<1 UFC.mL1) e dos plaqueamentos sem diluio de
0,2% de detergente (>250 condios.mL1) evidenciaram
que a ao do detergente no foi fungisttica, visto que,
se fosse, a inibio de crescimento destes dois plaqueamentos seria a mesma, pois ambas continham a mesma
concentrao de detergente nas placas.
Desta forma, foi possvel concluir que o detergente
apresentou ao fungicida contra o Aspergillus niger, com
MIC de 1,5%, que foi a condio de uso sugerida pelo
fabricante. Esse resultado concorda com Holaj (2003),
que indicou que detergentes alcalinos podem apresentar
efeito microbiocida.
Uma vez determinada as MICs do sanitizante
base de cido peractico e do detergente alcalino para
o Aspergilllus niger pelo ensaio de MIC em suspenso
aquosa, foram realizados os testes de atividade esporicida, para verificao da efetividade dos agentes de
limpeza e sanitizao na eliminao dos condios do
fungo em superfcie lisa.
O ensaio de atividade esporicida em superfcie
lisa representa um maior desafio aos agentes de limpeza
e sanitizao quando comparado ao teste de MIC, uma
vez que simula a desinfeco de um equipamento/
superfcie que foi exposto contaminao e seco, com
aderncia do microrganismo (REYBROUCK,1998). O
equipamento de alta presso dinmica no possui partes
expostas secagem e adeso de condios, entretanto,
apresenta alguns pontos mortos e peas constitudas de
metais e plsticos de maior rugosidade do que ao inox,

que podem ocasionar tambm a formao de biofilme.
Assim sendo, este teste foi imprescindvel para estimar
a concentrao de cido peractico necessria para o
processo de sanitizao do equipamento.
Alm disso, conforme estabelecido por Klingeren
(1995), o mtodo de MIC in vitro em suspenso aquosa,
apesar de ser bastante simples, inadequado para a
predio da eficincia de um sanitizante; especialmente
quando se refere descontaminao de superfcies,
sendo necessria a realizao de teste de carregadores
para estabelecer a sua eficincia.
Os resultados obtidos para o ensaio de atividade
esporicida do Vortexx demonstraram que as concentraes de cido peractico de 0,01 e 0,03% (v/v) foram
ineficientes na inibio do fungo e que somente a concentrao de 0,05% (v/v) com 30 min de contato resultou em
apenas 1 tubo com crescimento positivo entre 60 tubos
inoculados (requisito da AOAC para determinar atividade
esporicida). Esses resultados indicam ser necessria
a aplicao de uma concentrao 5 vezes maior para
a inibio do microrganismo alvo no ensaio e de atividade esporicida com relao ao teste de MIC in vitro
em suspenso aquosa, concordando com Reybrouck
(1998).
Para o detergente alcalino, optou-se pela realizao do teste de ao esporicida apenas com a maior
concentrao de sanitizante sugerida pelo fabricante
(2,5% (v/v), 40 min de contato). Este ensaio obteve como
resultado 14 tubos com crescimento positivo em 60 tubos
inoculados, indicando que, para se obter uma atividade
esporicida no detergente, seria necessrio aumentar
sua concentrao de uso. Como a principal funo do
detergente era a limpeza do equipamento e no a sua
desinfeco, o aumento da concentrao de detergente
foi desnecessrio e, portanto, no foi testado. A inibio
parcial observada no ensaio (46 tubos sem crescimento)
corrobora os resultados obtidos no teste de MIC in vitro,
indicando que este detergente apresenta alguma ao
fungicida, podendo ser complementar ao do sanitizante.
49
Tendo sido determinadas as concentraes de

detergente (1,5% (v/v) com 40 min de contato) estabelecidas pelo teste de MIC e considerando-se a no
necessidade de ao antifngica no detergente e
sanitizante (0,05% (v/v) por 30 min de contato) estabelecida pelo teste de atividade esporicida a serem
aplicadas no processo de CIP, foram avaliados os
efeitos desses compostos sobre os selos de vedao
do equipamento de alta presso. Os resultados obtidos
aps 4 imerses de cada um dos selos na soluo sanitizante e na de detergente no resultaram em alterao
de massa e medidas, sendo que os valores obtidos
para essas medidas ficaram dentro dos limites estabelecidos pelo coeficiente de variao de cada selo.
Isso indica que a massa e as dimenses dos selos no
foram afetadas.
Tabela 3. Nmero de redues decimais obtidos nas etapas

de processo CIP.
Etapa
Condios.mL1
*NRD
Nctar de manga
1,74E + 06
(sem enxgue)
Aps enxgue inicial
1
>6,24
(40 min)
Enxgue (10 min)
1
>6,24
aps limpeza*
Enxgue (10 min)
2,00E + 01
4,94
aps sanitizao**
No entanto, a avaliao visual dos selos indicou

que o selo composto pela liga de Be-Cu apresentou alterao aps os tratamentos com sanitizante. Foi verificada
a formao de uma superfcie brilhante, possivelmente
resultado da remoo da camada de oxidao de metal
mais externa. Esses resultados indicaram que, possivelmente, esses selos seriam afetados pelo sanitizante,
requerendo reposio mais frequente.
zante, observou-se a recuperao de condios na ordem

de 10 1 condios.mL 1 e aproximadamente 5 redues
decimais. Alm do inesperado aumento da contaminao
aps o tratamento com cido peractico, foi observado
que, aps o uso do sanitizante, apareceram partculas
de nctar de manga (grumos) misturadas na gua de
enxgue. Essas partculas haviam deixado de aparecer
ao final dos 40 min de enxgue inicial.
Como as alteraes provocadas pelo sanitizante

e pelo detergente sobre os selos foram mnimas e aceitveis, essas concentraes de detergente e sanitizante
foram utilizadas no teste piloto.
Esses resultados indicam que ainda havia polpa

de manga contaminada retida no equipamento aps
a limpeza e que, durante o tratamento com Vortexx ,
ocorreu a solubilizao e arraste desta polpa. Esse fato
pode ser atribudo forma de realizao do tratamento
com sanitizante (equipamento inundado, mas sem circulao), ou ao fato do sanitizante ter solubilizado o nctar
de manga. Como este nctar estava altamente contaminado (106 condios.mL1) as condies de sanitizao no
foram suficientes para a completa inativao do fungo,
visto que o processo de desinfeco foi desenhado para
uma contaminao mxima de 103 condios.mL1, esperada aps o enxgue inicial.
O processamento de nctar de manga inoculado

com 106 condios.mL1 foi eficiente a 300 MPa, com inativao total do fungo inoculado. O tratamento a 200MPa
foi capaz de promover aproximadamente 2 redues
decimais do fungo na amostra, e processamentos a
presses iguais ou inferiores a 150 MPa no foram
efetivas na inativao do A. niger (TRIBST et al.,2006).
A comparao dos resultados obtidos demonstrou que
o Aspergillus niger foi mais sensvel ao tratamento de
APD que o Penicillium estudado por Tahiri et al. (2006),
que necessitou de 3 passagens de suco de laranja
presso de 200 MPa para obter 2 redues decimais.
Aps o processamento do nctar de manga, foi realizado
o procedimento de CIP, utilizando as concentraes de
detergente e sanitizantes previamente determinados. Os
resultados so mostrados na Tabela 3.
Os resultados obtidos demonstraram que o
enxgue realizado com pressurizao inicial no equipamento resultou na reduo total do nmero de condios.
mL1. O tempo de enxgue longo foi necessrio para
que, aparentemente, toda a manga contida no equipamento fosse retirada. Isso era esperado, visto que o
equipamento opera com uma vazo fixa e baixa e contm
cantos mortos.
O processo de limpeza com detergente manteve a
reduo total de condios. Aps o tratamento com saniti-
* 1,5% (v/v) MIP FPC por 40 min de contato; ** 0,05% (v/v) de cido
peractico em Vortexx por 30 min de contato; e *** NRD = nmero
de redues decimais.
A partir dos resultados observados, foi includa

uma nova etapa no processo CIP, previa desinfeco,
com enxgues alternados de gua e lcool etlico 96%,
visando facilitar a remoo do nctar do equipamento
atravs da diferena de solubilidade em cada um dos
fluidos. No processo desenvolvido, o enxgue inicial com
gua (40 min) foi dividido entre enxgues com gua e
lcool e com o equipamento operando (fluxo corrente)
ou apenas inundado. Realizando-se este procedimento
inicial no foi obtido nenhum sobrevivente aps o tratamento com Vortexx, indicando que o processo de CIP
assim estabelecido foi adequado para a limpeza e sanitizao do equipamento.
A Tabela 4 sumariza os resultados obtidos em cada
etapa para o estabelecimento do processo de CIP do
equipamento de alta presso dinmica.
50
Tabela 4. Resultados sumarizados dos ensaios realizados para determinao do processo de CIP para o equipamento de alta
presso dinmica.
Etapa
Ensaio
Resultado
Teste de MIC in vitro em suspenso aquosa

para sanificante.
0,025% (v/v) por 20 min de contato ou 0,01% (v/v)

por 30 min de contato.
Teste de MIC in vitro em suspenso aquosa

para detergente.
1,5% (v/v) por 40 min de contato ou 2,0% (v/v)

Determinao do efeito fungicida ou fungisttico

do detergente.
Fungicida, em concentrao de 2%
Teste de atividade esporicida do sanificante.
0,05% (v/v) por 30 min de contato.
Teste de atividade esporicida do detergente.
Sem atividade esporicida comprovada.
Avaliao do efeito do detergente e do sanificante sobre

os selos de vedao do equipamento de alta presso
dinmica.
Sem alterao de massa e dimenses. Alterao visual

apenas nos selos de Be-Cu, com formao de superfcie
brilhante.
Teste piloto no equipamento de alta presso dinmica

contaminado com A. niger, utilizando as concentraes
de detergente e sanificante determinados na Etapa 2 e
enxgues sucessivos com gua e lcool 96%.
Processo com enxgue inicial de 40 min com gua e

lcool e etlico 96% seguido de limpeza com soluo com
2,5% de detergente por 40 min de contato e desinfeco
com 0,05% (v/v) de sanificante por 30 min de contato foi
eficiente para o CIP do equipamento.
4 Concluses
A partir dos resultados, foi possvel concluir que
o sanitizante utilizado apresentou um MIC, em base de
cido peractico, frente ao A. niger de 0,01% (v/v) por
30 min de contato, quando em suspenso aquosa, e
numa concentrao de 0,05% (v/v), quando os condios
estavam aderidos a uma superfcie seca. Tambm foi
possvel concluir que o detergente alcalino utilizado,
apesar de no apresentar relatos prvios de inibio de
fungos, foi capaz de inibir parcialmente o A. niger na
concentrao de 2,5% por 40 min.
Foi observado que, apesar de sua alta resistncia
trmica, o A. niger apresentou baixa resistncia qumica
frente ao sanitizante base de cido peractico. Alm
disso, foi possvel concluir que as concentraes determinadas do detergente e do sanitizante para aplicao
do teste piloto, no ocasionaram grandes alteraes nos
selos de vedao do equipamento.
Com relao ao processo de limpeza e sanitizao
do equipamento de alta presso dinmica, foi possvel
concluir que este um processo crtico devido s partes
sensveis do equipamento, aos seus pontos mortos e
baixa vazo de operao. Porm, possvel a desinfeco, desde que seja realizado um eficiente enxgue
inicial, com alterao da solubilidade do produto.
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Agradecimentos
DOWNES, F. P.; ITO, K. Compendium of methods for the

microbiological examination of food. 4 ed. Washington:
APHA, 2001.
Agradecemos ao CNPq e ao PRODETAB/EMBRAPA

pelo fomento da pesquisa e empresa ECOLAB pela
doao das amostras de detergente e sanitizante.
ECOLAB. (comunicao pessoal), maio 2006. (Alexrandre

Medeiros, engenheiro qumico responsvel por Pesquisa e
Desenvolvimento/ECOLAB).
51
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52

Vortexx ES X Aspergillus Niger (Artigo)

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Braz. J. Food Technol., v. 12, n. 1, p. 43-52, jan./mar.

Metodologia para limpeza no local em equipamento de alta presso dinmica

Pilar Rodriguez de MASSAGUER

Recebido | Received: 12/05/2008

Braz. J. Food Technol., v. 12, n. 1, p. 43-52, jan./mar. 2009

Braz. J. Food Technol., v. 12, n. 1, p. 43-52, jan./mar. 2009

O cido peractico um sanitizante que apresenta ao de oxidante orgnico e no degradado

de limpeza e sanitizao sobre os selos de vedao do

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de gua. O sanitizante foi testado em concentraes de

contato e neutralizantes do teste acima mencionado. No

Braz. J. Food Technol., v. 12, n. 1, p. 43-52, jan./mar. 2009

cido peractico sobre os selos, especialmente sobre

Em um segundo teste piloto, o enxgue inicial foi

Teste de MIC in vitro em suspenso aquosa para

Teste de MIC in vitro em suspenso aquosa para

Determinao do efeito fungicida ou fungisttico

Teste de atividade esporicida do sanificante

Teste de atividade esporicida do detergente

Avaliao do efeito dos detergente e sanificante

Escolha das concentraes de uso de detergente

Realizao do teste piloto no equipamento de alta

sobre condios de Aspergillus

* Inculo: 1,0 x 103 condios.mL1; e ** NRD = nmero de redues

Os resultados deste experimento esto em acordo

Braz. J. Food Technol., v. 12, n. 1, p. 43-52, jan./mar. 2009

menor concentrao possvel do cido peractico no

soluo de detergente para as placas de contagens de

Braz. J. Food Technol., v. 12, n. 1, p. 43-52, jan./mar. 2009

metais e plsticos de maior rugosidade do que ao inox,

Tendo sido determinadas as concentraes de

Tabela 3. Nmero de redues decimais obtidos nas etapas

No entanto, a avaliao visual dos selos indicou

zante, observou-se a recuperao de condios na ordem

Como as alteraes provocadas pelo sanitizante

Esses resultados indicam que ainda havia polpa

O processamento de nctar de manga inoculado

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A partir dos resultados observados, foi includa

Teste de MIC in vitro em suspenso aquosa

0,025% (v/v) por 20 min de contato ou 0,01% (v/v)

Teste de MIC in vitro em suspenso aquosa

1,5% (v/v) por 40 min de contato ou 2,0% (v/v)

Determinao do efeito fungicida ou fungisttico

Teste de atividade esporicida do sanificante.

0,05% (v/v) por 30 min de contato.

Teste de atividade esporicida do detergente.

Sem atividade esporicida comprovada.

Avaliao do efeito do detergente e do sanificante sobre

Sem alterao de massa e dimenses. Alterao visual

Teste piloto no equipamento de alta presso dinmica

Processo com enxgue inicial de 40 min com gua e

DOWNES, F. P.; ITO, K. Compendium of methods for the

Agradecemos ao CNPq e ao PRODETAB/EMBRAPA

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REYNOLDS, K. A.; BOONE, S.; BRIGHT, K.; GERBA, C. P.

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SEIBERLING, D. A. CIP Sanitary Process Design. In: VALENTAS,

HOCKING, A. D. Aspergillus and related teleomorphs. In:

Braz. J. Food Technol., v. 12, n. 1, p. 43-52, jan./mar. 2009

STANFIELD, P. Cleaning and Sanitizing a Food Plant. In: HUI,