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Department of Experimental and

Diagnostic Medicine
Section of General Pathology
Center of Excellence MIUR for the
Study of Inflammation (ICSI)
University of Ferrara, Ferrara, Italy

Effetti delle polveri ultrafini e delle nanoparticelle


a livello cellulare e molecolare

Effect of ultrafine particles at the


cellular and molecular level

F. Di Virgilio
Particulate air pollution increases chronic obstructive lung diseases,
congestive heart failure, myocardial infarction, and in
general hospital admissions for cardiorespiratory symptoms

• Hourly peaks in air pollution more than double stroke risk (American Heart Association, British Medical Journal)

• People with diabetes, cardiovascular diseases, COPD, rheumatoid arthritis have an increased
death risk in polluted environments (American Thoracic Society)

• Children with obesity and asthma are more affected by air pollution than other kids
(American Thoracic Society)

• Lung development is better in children who stay away from pollution


(American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine)

In October 2006 WHO said that by enforcing more restrictive


guidelines on air quality it may be possible to save as many as 300 000
lives each year around the world.
INFLAMMATION

Inflammation as a response to pathogens…….

Inflammation as the key pathogenetic mechanism in lung pathology:

obstructive (Chronic bronchitis, Emphysema, asthma, cystic fibrosis,


bronchiectasia) and restrictive (sarcoidosis, Pneumoconiosis, interstitial fibrosis,
ARDS) lung diseases.
Inflammatory changes in the lung

Chronic bronchitis with


Healthy lung inflammatory infiltrate

Emphysema
COPD/BPCO
Variazione percentuale
della mortalità aggiustata
per l’età in U.S.A.
Proporzione della frequenza del 1965
3.0
Coronaro- Infarto Altre BPCO Tutte le
2.5 patie Malattie altre cause
CV
2.0

1.5

1.0

0.5

0 -59% -64% -35% +163% -7%

1965 - 1998 1965 - 1998 1965 - 1998 1965 - 1998 1965 - 1998
But also in Cardiovascular diseases:

inflammation is crucial not only for plaque development


but also for destabilization of the plaque thus converting a chronic
vascular disease into a thrombo-embolic disorder

Coronary atherosclerosis-recent thrombus

Coronary atherosclerosis-non obstructive


Inflammation is a key disease factor in obesity or metabolic
diseases, probably due to the accumulation of visceral fat
tissue

Visceral fat in infiltrated with monocyte-like inflammatory cells

Copyright ©2005 American Society for Biochemistry and Molecular Biology Cinti, S. et al. J. Lipid Res. 2005;46:2347-2355
Inflammation as a concurrent/causative factor in age-related
deterioration (microcirculation insufficiency, muscle waste,
cognitive impairment), Alzheimer

“inflammageing”

Inflammation and cancer: back to Virchow


What is inflammation?

A homeostatic, monotonous, body response elicited by any noxious agent.

In principle is a protective mechanism, but very often it goes too far.

“Notae vero inflammationis sunt quatuor: rubor et tumor cum calore et dolore”

Cornelio Celso
TISSUE INJURY
Trauma
Ischemia
Neoplasms
Infectious agents
Foreign particles

?
VASOACTIVE MEDIATORS CHEMOTACTIC FACTORS
Histamine C5a
Serotonin PRODUCTION OF
Lipoxygenase products
Bradykinin INFLAMMATORY Formylated peptides
Anaphylotoxins MEDIATORS Chemokines
Leukotriene/prostaglandins
PAF
Nitric oxide

RECRUITMENT AND
STIMULATION OF INFLAMMATORY CELLS
VASODILATATION
INCREASED VASCULAR PERMEABILITY

ACUTE INFLAMMATION CHRONIC INFLAMMATION


PMNs Macrophages
Edema Platelets Lymphocytes
Mast cells Plasma cellls
Particulate Matter
UFPs hurt the lung as well as the heart

HOW?

• Type I Pneumocytes (Epithelial


cells)
• Type II Pneumocytes
(Surfactant cells) Cell activation
– secrete surfactant
– BIG, at corners of alveoli
• Macrophages inflammation
– within the alveolar space
(alveolar macrophages)
Alveolar macrophages and type II pneumocytes
release ROS, RNS and inflammatory cytokines

Reactive oxygen and nitrogen species Mainly local effects

airway irritation; cough; phlegm;


decreased lung function; airway
inflammation; asthma attacks; and
Protein kinase activation chronic bronchitis
Transcription factor activation

Cytokine and
Chemokine release
Interleukin-1β
Interleukin-6
Interleukin-8
TNFα Local and distal effects

Arrhythmias and changes in heart rate.


Increased risk of thrombosis and
ischemic heart disease
Particle clearance Particle effect

From Oberdoster et al., 2005 From Oberdoster et al., 2005

The Monty Python Flying Circus: and now for something completely different/and now more of the same
How do NSPs trigger inflammation?

Complement activation

Increased ICAM-1 and EGFR-ligand (amphiregulin) expression

Increased sensitivity to antigen mediated by local production of IL-5 and eotaxin

ROS/RNS

Aggregate formation, induction of granulomas

PMN recruitment

Pro-coagulant activity

Stimulation of release of pro-inflammatory cytokines (IL-1, IL-6, IL-8, TNF….)

?????????????
HOW?

Mononuclear cell activation

Endothelial cell activation

Modified from Delfino et al., 2005


The inflammasome: first line of defense to cell stress

Ogura et al., 2006, Cell 126:659-662


Pathogen detection by the IPAF Inflammasome

Particulate matter

“Sensor”

“Sensor”

Leucin Rich Repeat (LRR): -L-X-X-L-X-L- Modified from Roy and Zamboni, 2006, Nat Immunol 7:549-551
NLR make the inflammasome sensitive to danger signals

Cytoplasmic sensors of danger


or
cellular transducers of noxious signals

From Scott and Saleh, 2006, Cell Death Diff, in press


Take-home message/morale della favola

• Small is not always beautiful

• We have been exposed to very small particulate matterfor hundred thousands


of years and we have learned to detect (cellular sensors) and (possibly)
fight them

• Inflammation is our key defense mechanism

• However, sometimes it may go awry

• Thus, it would be helpful for human health to understand what goes wrong

However

“Prevenire è meglio che curare”


From Oberdoster et al., 2005
Alveolar macrophages and type II pneumocytes
release ROS, RNS and inflammatory cytokines

Reactive oxygen and nitrogen species Mainly local effects

Protein kinase activation


Transcription factor activation

Cytokine and
Chemokine release

Interleukin-1β
Interleukin-6 Local and distal effects
Interleukin-8
TNFα
Inflammation is becoming an increasing concern for physicians (and patients!)

Why?
Cytoplasmic sensors of danger
or
cellular trasnducers of noxious signals
Effetti cellulari e molecolari
indotti da particelle ultrafini

Annamaria Colacci
Eccellenza Cancerogenesi Ambientale
ARPA - ER

Polveri Ultrafini e Nanoparticelle


Ferrara, 14 Novembre 2006
Overview

ΠLe particelle ultrafini inducono tumori?

ΠQuali sono i bersagli cellulari e


molecolari della loro azione?

ΠDi quali strumenti investigativi


disponiamo?
Di quali informazioni abbiamo
bisogno per valutare i rischi per la
salute?

ΠStrumenti per valutare i rischi per la


salute
Š Epidemiologia ambientale
Š Monitoraggio ambientale
Š Risk assessment
Š Biomarcatori
Particelle ultrafini e effetti sulla salute:
che cosa sappiamo

ΠGli studi epidemiologici hanno dimostrato che il PM


nell’ambiente è associato a malattie respiratorie e patologie
cardiovascolari
Œ Un’associazione molto forte è stata descritta con i decsssi per
complicazioni respiratorie e cardiovascolari, specialmente negli
anziani
ΠLo stress ossidativo, indotto dalle particelle inalate e che
determina l’attivazione di geni del processo infiammatorio,
potrebbe essere il meccanismo alla base degli effetti osservati
ΠLe particelle ultrafini (UFP) (diametro <100 nm) sono
considerate ampiamente responsabili per questi effetti
Œ Studi sull’animale indicano che a elevati livelli di esposizione a
UFP e nanoparticelle di diossido di titanio hanno un potenziale
tossico di gran lunga superiore a quello delle particelle con
diametro 0.1–1.0 µm
Le particelle ultrafini
inducono tumore?

ΠPer le loro ridotte


dimensioni le UFP sono in
grado di penetrare la
barriera alveolare e
traslocare dal polmone a
distretti extrapolmonari
Œ
ΠIl polmone potrebbe essere
il primo e primario bersaglio
ma altri organi distali
potrebbero essere colpiti
Esposizione

Attivazione AM

Accumulo
Particelle

Infiammazione Acuta

Infiammazione Fibrosi
Crronica

Meccanismi Meccanismi
Genetici Epigenetici
CANCRO

Proliferazione
Metaplasia
Cellule Epiteliali
Qual è il ruolo delle particelle
ultrafini a livello cellulare e
d’organo?

ΠRadicali liberi persistenti


sono presenti nella
combustione generata da
PM fini e ultrafini
Š Semichinoni
Š Inducono danno al DNA
Š Il danno è eliminato da
SOD, catalasi and
desferoxantina
ΠLe specie ossigeno
reattive (ROS) sono
coinvolte nella
citotossicità indotta dalle
emissioni diesel (DEP) e Risom et al. Mutat. Res. 592: 119, 2005
da PM urbano
Evidenze sperimentali 1

ΠStandard Reference Materials


o EHC93
 Aria Urbana da Ottawa
o SRM1650
 PM raccolto da un motore diesel
 Sostituito da SRM2975, raccolto da un
impianto industriale alimentato a diesel
o SRM1649a
 PM raccolto in un periodo di 12 mesi nei centri
urbani di St. Louis e Washington
Š DEP Japanese preparation
Evidenze sperimentali 2

ΠModelli in vitro ΠRisultati


Š A549 cellule epiteliali Š Danno al DNA in tutte
di polmone le linee cellulari
Š Fibroblasti Š Non è richiesta
Š Leucociti isolati attivazione metabolica
Š HepG2 Š Effetti alle dosi più
Š Caco2 basse testate
Evidenze sperimentali 3

ΠModelli in vivo ΠRisultati


Š Studi nei roditori Š Incremento tumori del
o Esposizione a DEP polmone correlati alla
dose
Š Incremento dei livelli
di stress ossidativo
Evidenze sperimentali 4

ΠLe preparazioni standard sono


rappresentative di situazioni reali?
Š Recentemente è stato eseguito uno studio
comparativo tra SRM2975 and DEP
o Le due preparazioni sono diverse in termini di
attività mutagena e tossicità polmonare

Le miscele complesse ambientali sono


diverse tra loro perché diversi sono
l’origine e il destino ambientali
Biomonitoraggio

ΠStudio in Cotonou, ΠRisultati


Benin Š Gradienti di esposizione
Š 4 gruppi di 30 in relazione alla
soggetti concentrazione UFP
o Residenti area rurale o Motori a due tempi e
carburante di scarsa
o Residenti area
qualità
suburbana
o Residenti in strade Š Danno correlato alla
ad alto traffico dose nei linfociti (SB)
o Tassisti Š Danno anche alle dosi
Avobge et al. Carcinogenesis 26: 513, 2005
più basse

Questo approccio funziona solo ad alti livelli di


esposizione. A livelli più bassi è necessario il
monitoraggio individuale
Un problema complesso
richiede approcci complessi

ΠPM, incluso UFP, sono ΠTossicogenomica


miscele complesse Š Un approccio
associate ad altri fattori integrato per studiare
ambientali le interazioni gene-
ΠSono diverse tra loro a ambiente
seconda della sorgente, Š Fornisce una
del contesto ambientale, completa, specifica
della matrice in cui sono informazione degli
raccolte effetti indotti
Œ Gli effetti sono dall’esposizione.
strettamente correlati Š Può predire i rischi in
con la dose base alla suscettibilità
Œ La risposta può genetica
dipendere dalla
suscettibilità genetica
Ambiente Antropico Ambiente Naturale
•Trattamenti chimici •Suolo
•Inquinamento •Microclima

Componente Genetica
Alimento

Stili di Vita Esposizioni


•Fumo •Professionali
•Alcool •Ambientali

Componente Genetica
Soggetto
Tecnologie Biomiche:
Genomica Funzionale

ΠLe tecnologie biomiche:
Š Metodologie di studio
dell’era postgenomica
o Genomica
o Trascrittomica
o Proteomica
o Metabonimica
ΠLa tecnologia microarray
si basa sull’abilità di ogni
acido nucleico a singolo
filamento di accoppiarsi
alla sequenza
complementare
controllo esposto

m-RNA m-RNA

ibridazione

lavaggi

scanner
Bioinformatica e Data Mining

ΠFeature Extractor
Š Primo screening dei dati provenienti dallo scanner. Il software ha il
compito di segnalare quegli spot troppo intensi, non uniformi
ΠNormalizzazione
Š Rende confrontabili i campioni etichettati con Cy3 e Cy5 ed ibridati
congiuntamente su un singolo microarray.
Š Elimina errori sistematici dovuti a:
o diversa quantità di mRNA associata ad ogni marcatore
o diversa efficienza di incorporazione dei due marcatori
o diversa intensità di radiazione emessa dai due marcatori differentemente
misurata dal tubo fotomoltiplicatore
o differenti intensità misurate in diverse parti del microarray a causa del
posizionamento non perfettamente orizzontale del microarray rispetto al
laser dello scanner
o differenze tra gruppi di spot creati da differenti penne
Œ Controllo qualità della slide
ΠAnalisi statistica dei dati
Š Maanova di R
Š LIMMA
ΠInterpretazione biologica:
Š GoMINER High-Throughput
o Integra i risultati di molteplici microarray in una singola analisi
o Organizza la lista di geni modulati nel contesto di Gene Ontology un database
che contiene una classificazione dei geni in categorie gerarchiche basate su
processo biologico, funzione molecolare e compartimento cellulare
Tossicogenomica:
la validità dell’approccio

Œ L’espressione genica è influenzata


direttamente o indirettamente VARIAZIONE GENE
dall’esposizione ambientale
Œ L’espressione di alcuni geni è
essenziale per lo sviluppo della
malattia
Œ Le variazioni dell’espressione genica
sembrano correlare con maggiore
sensibilità e specificità FINGERPRINT
all’esposizione di altri endpoint
patologici
ΠI profili genici relativi a una
specifica esposizione) possono
essere usati come:
Š Biomarcatori di esposizione PREDIZIONE DEL RISCHIO
Š Biomarcatori di rischio
Š Biomarcatori di stadio preclinico
Profili genici in risposta
all’esposizione ad aria

ΠStudi in vitro ΠRisultati


Š alterazioni di 41
Š MCF7 cells trascritti RNA in SRM
o Pattern di espressione genica Š Aumento
 SRM1649a dell’espressione del
• Da solo citocromo P450 (CYP) in
• con benzo[a]pyrene
risposta a BP
(BP) Š Induzione additiva di
• con dibenzo[a,l]pyrene CYP1A1 e CYP1B1 con il
(DBP) co-trattamento con SRM
1649a e BP.
Š Nessuna variazione
nell’espressione di geni
di CYP1A1 and CYP1B1
nella esposizione a DBP

Mahadevan et al. Cancer Res 65: 1251, 2005


Profili genici da esposizione a
fonti diverse di inquinamento

ΠStudi in vivo ΠRisultati


Š Seoul e Ansan, Corea del Sud Š L’espressione genica era
o Microarray a c-DNA (1152 geni) significativamente diversa
 54 lavoratori addetti alla nei due gruppi (esposti/non
ispezione dei veicoli esposti)
 31 lavoratori di un impianto di Š 11 geni iperespressi e 4
incenerimento geni ipoespressi nei
 84 non esposti sani lavoratori dell’inceneritore
o Approcci addizionali Š 8 proteine iperespresse e 1
 Micronucleo proteina ipoespressa in
 Comet assay entrambe le categorie di
• Per valutare la correlazione lavoratori
tra l’espressione genica e un
biomarcatore convalidato di Š Geni e proteine dello stress
rischio genotossico ossidativo erano
 Proteomica iperespressi in entrambe le
categorie di lavoratori

Kim et al.Exp. Mol. Med.36: 396-410, 2004


Profili genici da esposizione
ad aria

ΠStudi in vivo ΠRisultati


Š Teplice area - Repubblica Ceca Š L’espressione genica era
o distretto minerario con elevati livelli significativamente diversa
di inquinamento nei due gruppi (esposti/non
o Microarray a oligonucleotidi (22K) esposti)
 23 bambini dall’area di Teplice Š Un considerevole numero di
 24 bambini di un’area rurale di geni correlava con le
Prachatice frequenze di micronuclei
o Approccio addizionale Š L’assemblaggio del
 Le espressioni geniche nucleosoma (cromatina) è
individuali sono state correlate risultato il principale
con le frequenze dei processo biologico
micronuclei nei linfociti periferici
influenzato dall’esposizione
• Per valutare la correlazione
tra l’espressione genica e un Š Questo suggerisce un
biomarcatore convalidato di effetto dell’inquinamento
rischio genotossico
dell’aria sulla unità
strutturale primaria del DNA
van Leeuwen et al.Mutat. Res. 600:12-22, 2006
Tossicogenomica, PM fini e
ultrafini e Cancro:
cosa stiamo facendo

ΠModello cellulare in vitro e tecnologia


microarray
Š Valutare gli effetti citotossici delle particelle
fini e ultrafini
Š Identificare le correlazioni dose-risposta
Š Predire l’effetto tumorale
Š Valutare il rischio cancerogeno
Š Individuare i profili genici in relazione alla
qualità dell’aria
ARPA – Eccellenza Cancerogenesi Ambientale

endpoint = formazione foci

Endpoint finale = frequenza di trasformazione


TF = numero foci/efficienza clonale
Slope factor e stima del rischio
cancerogeno

ΠLa valutazione del rischio


(Risk Assessment)
comprende procedure di
stima della probabilità che
un effetto indesiderato
possa essere generato da
una esposizione
Œ Lo “slope factor” di
potenza oncogena è
l’incremento del rischio
tumore in tutta
l’aspettativa di vita per
incremento dell’unità della
dose di esposizione
PM10 - PM2.5
ultrafini
MICROARRAY
MICROARRAY

TEST CITOTOSSICITA’ TEST TRASFORMAZIONE

1 sola dose

Effetti acuti Effetti cronici


miscela miscela

Profilo Tossicologico
della miscela
complessa
3 dosi 3 dosi
Relazioni dose-risposta

Predizione
del rischio cancerogeno
ESPOSTI CONTROLLI NON ESPOSTI

Prelievo sangue Prelievo sangue

MICROARRAY

MICRONUCLEO Marcatori Rischio


Esposizione
The MARINER Project

IN VITRO STUDY IN VIVO STUDY

BALB/c 3T3 cells


workers

Exposure to
137Cs radiation
source exposed not exposed
not exposed cells

m-RNA from m-RNA from


cytotoxicity transformation
PBMC PBMC
frequency

22K mouse oligo slide


22K human 1A oligo slide
Fingerprints

Π270 geni ΠGO:0031497


differentemente Š chromatin_assembly
espressi fra le due ΠGO:0006334
Š nucleosome_assembly
classi di esposti e non
esposti (P < 0.01)

E1 NE2 E27 Ne28


........
NE1 E2 Ne27 E28
Polveri ultrafini e nanoparticelle
Ferrara 2006

Dott.ssa Antonietta M. Gatti


Laboratorio dei Biomateriali
Università di Modena e Reggio Emilia
is the branch of learning that
deals with how the organism
reacts to the presence of
micro- and nano-particles
PM10
PM2.5
Unvoluntary nanoparticles are
already released by incineration and
power-plants, fondries and they
are disseminated in the environment
Impact of the environmental
nanopollution
Disease
Mechanisms of entrance of
nanoparticles into the human body
Respiratory system Blood circulation
Mechanisms of entrance of nanoparticles
into the human body
Digestive system Lymph circulation

Size <20μm

Polluted food
Pulmonary Mesothelioma

Asbestos fiber
Lung

Nemmar et al.: Circulation 2002, 105:411


Passage of 100nm sized particles in the blood and in the liver
Animal
Test

Ni Group :
nodules observed on both sides
(particles + bulk material) in all
animals 6 months after
implantation

Co Group :
Nodules observed on the left
side (nanoparticles IM) in all
cases 8 months after
implantation
– nothing on the right side (bulk
material implanted SC)
Nickel and Cobalt nanoparticles
induced rabdomiosarcoma after
6-month implantation in rats,
the bulk samples only fibrotic
capsules or granulomas.
RF 4
Nanoparticles of Gold
in a liver granuloma.
The patient was
treated with colloidal
gold particles for knee
arthrosis

10 μm
Bladder Carcinoma in a mine-sweeper
Gulf-War kidney

Cluster of nano Hg-Se

20 μm
Hg
Barium-sulphate
nanoparticles found
inside a thrombus

10 μm

10 μm
BLOOD
Soldier’s wife
affected by
Burning Semen
disease

Red cells
292
99 GW

10 μm
Bladder cancer with Cobalt & Tungsten

2 μm
Colon cancer
with clusters of Silver nanoparticles
Industrial Hamburger
Hay
Gas emission of a diesel car
CrFeNi

Ag
Blood clot in vivo

Ag
Cancerogenic liver tissue with nanoparticles
of Titanium inside a cell nucleous
Liver cancer

Fe
Section of a lymph node
in a civilian of Sarajevo
affected by Hodgkin
Disease (FEG-ESEM)

5 μm
Particle of Antimony- Cobalt found in a soldier’s
sperm
ESEM image of sperm with a foreign body

spermatozoon

Lead nanoparticle
20 μm
Malformed lamb born inside a
groundfire in Sardinia, 2003
Internal organs of the 291CA

malformaed foetus

Liver

Brain

Testicle
Malformed lamb fromSardinia
Pb
Kidney

Pb

Sb
Neu-Laxova syndrome
Neu-Laxova syndrome is a rare congenital
abnormality characterised by intrauterine
growth restriction, microcephaly, facial
dysmorphy, short neck, edema, scaly skin
and perinatal death. Additional features such
as spina bifida, cryptorchidism and shallow
orbital cavities have been reported.
Chromosomal analysis in reported cases has
revealed a normal karyotype and an
autosomal recessive inheritance has been
postulated.
Liver 111 MA
Polvere cittadina con Cerio Palladio Zirconio
platinoplatino
Particelle su
filtro trovate in
area urbana
Polmone

___10μ____

Ce Nd La
Cigarette from
Sarajevo
Cigarette from
Bagdhad
Anchovy’s liver from the Adriatic sea

Co Cr W Nb Nd

Cl Sb
Vongola

_____10μ____

Al Fe
Uncontaminated
bread
Pane Italia (1)

Pane Italia (2)


Factors influencing the pathogenicity of micro-
and nanoparticles

PHYSICAL
Foreign body
Size CHEMICAL
Composition BIOLOGICAL
Shape
Surface area Corrodibility Organ (cell) involved
Speciation Health condition
Concentration
Individual variability
Intake velocity
Radioactivity
What is the cell reaction to a discrete,
non continous stimulus?
Discrete stimulus

Scheme of the
cell membrane
Balb Cells with
Co nanoparticles
by
Sabbioni JRC-
Ispra
Hematite nanoparticles inside a 3T3 cell nucleus
during the mitotic phase
DIPNA
Development of an Integrated Platform for Nanoparticle
Analysis to verify their possible toxicity and the eco-toxicity
Project objectives
- In-vitro tests of interaction of engineered
nanoparticles (NP) with cells,
- Identification of the modes of NP-cell interaction
- Application of the laboratory-developed cellular
Specific challenges:
models on the field investigations -Development of :
-1 in vitro nanotoxicological tests,
and single cell-to-NP interaction
-2 new sensors to detect specific NP-
induced biological reactivities ,
STREP - 3 evaluation of NP pollution in
industrial settings
Expected impact:
- Better understanding of the possible risks related to nanopollution and
criteria to assess the risk case by case.
-Assessment of the health risk for nanotechnological operators, citizens
and end-users and identification of safety procedures
- Criteria for prevention and contribution to Standards for policy
makers
Acronym:
STREP
DIPNA
Coordinator Partners
-University of Salzburg, A
Dr. Antonietta M. Gatti -Fraunhofer Institute of Biomedical
Consorzio Nazionale Interuniversitario Engineering, DE
Sviluppo Materiali - University of -Consiglio Nazionale delle Ricerche, I
Modena and Reggio Emilia Italy -Università della Magna Graecia, I
-Grimm Aerosol, DE
-VITO n.v. NL
EU funding: 2 793 235 Euro -CSEM SA, CH
-Institut Català de Nanotecnologia, ES
Duration: 36 months -Commission of the European
Communities - Directorate General -
Start date: x Joint Research Centre Ispra –
European Center Validation
End date: x
Alternative Methods, I

Project’s website:
in progress
Memento quia pulvis es et in pulverem reverteris

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