CAPÍTULO
VII
‐
MECANISMOS
CELULARES
DE
REPARAÇÃO




A
PRESERVAÇÃO
DA
INFORMAÇÃO
GENÉTICA


 O
 papel
 biológico
 desempenhado
 pelas
 moléculas
 de
 DNA
 exige
 que
 elas
 possuam
 duas
 propriedades

fundamentais:
auto‐replicação
e
preservação
da
informação
genética.


 Para
que
o
conteúdo
informacional
do
DNA
seja
preservado,
e
corretamente
transmitido,
de
geração
em

geração,
 é
 indispensável
 que
 haja
 fidelidade
 na
 replicação
 semiconservativa
 e
 que
 existam
 mecanismos

capazes
de
reparar
modificações
estruturais
produzidas
no
material
genético
por
agentes
físicos
ou
químicos

do
meio
ambiente.


 Erros
na
replicação
semiconservativa
podem
ocorrer
espontaneamente,
mas,
ao
final
da
replicação,
são

bastante
raros
dada
a
existência
de
mecanismos
capazes
de
impedí‐los
ou
corrigí‐los.
Durante
a
formação
das

novas
 cadeias
 polinucleotídicas,
 além
 das
 diferenças
 de
 afinidade
 das
 bases
 nitrogenadas
 [formação

preferencial
 de
 pares
 entre
 adenina
 e
 timina
 (A:T)
 ou
 entre
 citosina
 e
 guanina
 (C:G)],
 a
 atuação
 seletiva
 da

DNA
 polimerase
 (Pol)
 e
 sua
 capacidade
 exonucleolítica
 (“editorial”)
 que,
 agindo
 no
 sentido
 3’→5’,
 elimina

nucleotídeos
 incorretamente
 inseridos,
 evita
 grande
 parte
 dos
 erros
 de
 emparelhamento.
 Em
 E.
 coli,
 a
 DNA

polimerase
III
(Pol
III),
responsável
pela
replicação
semiconservativa
é
uma
enzima
constituída
de
10
proteínas

(subunidades)
 diferentes
 e
 cada
 célula
 contém
 de
 10
 a
 20
 moléculas,
 que
 polimerizam
 de
 500
 a
 1.000

nucleotídeos
por
segundo.
A
atividade
de
“revisão
editorial”
(exonuclease
3'→5'),
encontra‐se
na
subunidade

epsilon
(ε),
codificada
pelo
gene
dnaQ
(mutD).


 Em
 células
 humanas
 a
 polimerização
 é
 mais
 lenta
 (em
 torno
 de
 50
 nucleotídeos
 por
 segundo)
 e
 o

complexo
de
replicação
é
composto
pelas
DNA
polimerases
alfa
(Polα
=
POLA),
delta
(Polδ
=
POLD1)
e
epsilon

Polε
=POLE,
sendo
que
a
atividade
de
“revisão
editorial”
encontra‐se
nas
duas
últimas.



Correção
de
erros
de
emparelhamento
em
grandes
fragmentos
(Mismatch
Repair
–
MMR)


 Outros
 mecanismos
 podem
 se
 expressar
 após
 a
 replicação,
 por
 meio
 de
 enzimas
 capazes
 de
 remover

bases
 nitrogenadas
 incorretamente
 incorporadas
 à
 cadeia
 ou
 de
 degradar
 segmentos
 nos
 quais
 tenham

ocorrido
 erros,
 ou
 ainda,
 eliminar
 bases
 alteradas
 ou
 lesadas;
 para
 tal,
 é
 indispensável
 a
 distinção
 entre
 as

hélices
neossintetizadas
e
as
preexistentes,
o
que
depende
dos
diferentes
graus
de
metilação
existentes
entre

elas.


 Em
 E.
 coli,
 na
 hélice
 neossintetizada
 a
 adenina
 das
 seqüências
 5’GATC3’
 não
 está
 metilada.
 Na
 hélice

parental
a
adenina
está
metilada
na
posição
N6
(N6MeA)
pela
DNA‐adenina
metilase
(32
kDa),
produto
do
gene

dam.

Quando
persistem
erros
de
emparelhamento,
após
a
replicação,
algumas
enzimas
entram
em
ação;
as

proteínas
 MutS
 e
 MutL
 reconhecem
 os
 erros
 de
 emparelhamento
 e
 a
 proteína
 MutH
 corta
 o
 DNA
 uma
 das

seqüências
 5’GATC3’
 não
 metiladas
 adjacentes.
 Posteriormente
 a
 DNA
 helicase
 II,
 produto
 do
 gene
 uvrD

(mutU,
 recL,
 uvrE),
 em
 conjunto
 com
 proteínas
 que
 se
 ligam
 à
 hélice
 simples
 (Ssb)
 abrem
 o
 fragmento
 e
 as

exonucleases
digerem
o
DNA.
A
PolIII
sintetiza
de
novo,
conforme
mostrado
na
figura
VII.1.


 Embora
a
eficiência
do
reparo
de
alguns
erros
dependa
da
seqüência,
em
E.
coli
o
único
erro
para
o
qual

ainda
não
foi
detectada
a
correção
é
o
par
C:C,
e
o
par
mais
facilmente
corrigido
é
o
G:T.
Além
dos
erros
de

emparelhamento
 o
 sistema
 também
 repara
 deleções
 ou
 inserções
 de
 até
 três
 nucleotídeos,
 originadas
 pelo

deslizamento
da
DNA
polimerase,
normalmente
em
seqüências
repetitivas.


 A
reparação
é
iniciada
pela
ligação
do
homodímero
de
MutS
(97
kDa)
ao
erro,
seguida
da
ligação
de
MutL

(68
kDa),
também
na
forma
de
homodímero,
dependente
da
hidrólise
de
ATP.
A
ligação
deste
complexo
leva
à

ativação
de
uma
endonuclease
GATC
latente,
associada
à
proteína
MutH
(25
kDa),
a
qual
incisa
a
ligação
5’
da

guanina
na
seqüência
GATC
não
metilada.


 O
sítio
GATC
pode
dirigir
a
correção
de
um
erro
distante
de
até
1
kb,
mas
o
sinal
é
muito
reduzido
quando

a
distância
ultrapassa
2
kb.


 A
 combinação
 MutSLH
 parece
 “sentir”
 a
 presença
 do
 erro
 e
 da
 não‐metilação,
 acreditando‐se
 que
 para

isto
se
forme
uma
estrutura
alfa
(α),
que
talvez
seja
a
ativadora
de
MutH.

 VII
 2


 A
reação
é
estritamente
exonucleolítica,
iniciando‐se
no
corte
e
prosseguindo
através
do
erro
até
cerca
de

100
 bases
 após.
 
 A
 função
 exonucleolítica
 é
 bidirecional;
 no
 sentido
 5’→3’
 é
 feita
 pela
 exonuclease
 RecJ
 ou

pela
exonuclease
VII
(produto
do
gene
xseA)
e
no
sentido
3’→5’
é
feita
pela
exonuclease
I
(produto
do
gene

sbcB).






FIGURA
VII.1
–




Como
 as
 exonucleases
 I,
 VII
 e
 RecJ
 só
 agem
 em
 hélice
 simples
 é
 provável
 que
 a
 helicase
 II
 (produto
 do

gene
uvrD),
seja
necessária
para
desenrolar
o
DNA
e
permitir
a
entrada
das
exonucleases.


 Como
 o
 duplo
 mutante
 recJ
 xseA
 não
 é
 hipermutável
 e
 diversos
 mutantes
 em
 exonuclease
 I
 fazem
 a

hidrólise
 bidirecional
 é
 possível
 que
 exista
 uma
 outra
 atividade
 exonucleásica
 3’→5’
 além
 da
 exonuclease
 I,

provavelmente
a
exonuclease
X.


 A
última
etapa
é
o
preenchimento
da
lacuna,
especificamente
pela
PolIII,
uma
vez
que
outras
polimerases

não
são
capazes
de
substituí‐la,
sugerindo
uma
ligação
entre
o
sistema
de
reparação
e
o
de
replicação
do
DNA.

A
DNA
ligase
termina
o
reparo,
unindo
o
DNA
neossintetizado
ao
preexistente.


 Cepas
 bacterianas
 contendo
 mutações
 no
 gene
 dam
 que
 produzam
 a
 enzima
 em
 quantidades
 maiores

que
o
normal
ou
não
a
produzam
são
hipermutáveis,
uma
vez
que,
neste
caso,
a
diferenciação
entre
as
hélices

pela
proteína
MutH
é
dificultada.


 Os
mutantes
deficientes
em
Dam
também
são
hipersensíveis
à
morte
pelo
agente
alquilante
N‐metil‐N’‐
nitro‐N‐nitrosoguanidina
 (MNNG).
 
 Entretanto,
 os
 mutantes
 duplos
 dam
 mutL
 e
 dam
 mutS
 não
 são
 mais

sensíveis
que
a
cepa
selvagem,
o
que
implica
MutS
e
MutL
no
aumento
de
morte
associada
à
deficiência
de

metilação.
Por
outro
lado,
a
mutagênese
é
semelhante
nas
cepas
selvagens
e
nos
mutantes
dam
e
dam
mutL,

mostrando
 uma
 separação
 entre
 efeitos
 letais
 e
 mutagênicos.
 
 Estas
 observações
 conduziram
 à
 sugestão
 de

que
 as
 lesões
 O6MeG
 produzidas
 por
 MNNG
 podem
 provocar
 a
 resposta
 do
 reparo
 por
 erros
 de

emparelhamento,
devido
à
formação
dos
pares
O6MeG:T
e
O6MeG:C.


 VII
 3


 Como
o
sistema
só
repara
erros
na
hélice
filha,
ele
não
repara
a
base
metilada
na
hélice
mãe
(lesão),
já

que,
neste
caso,
seria
um
reparo
abortivo
que
poderia
resultar
em
letalidade,
devido
à
síntese
inútil
do
DNA.

Em
 células
 humanas,
 diversos
 genes
 codificam
 para
 proteínas
 semelhantes
 a
 MutS
 e
 MutL
 e
 a
 sua
 não

funcionalidade
está
relacionada
ao
aparecimento
de
alguns
cânceres
esporádicos
e
a
praticamente
100%
dos

cânceres
de
cólon
hereditários
HPPCC
(Hereditary
Non
PolyposisColorectal
Cancer).

Aparentemente,
 em
 células
 humanas
 a
 correção
 de
 erros
 de
 emparelhamento
 funciona
 de
 maneira

semelhante
 ao
 descrito
 para
 E.
 coli.
 
 Em
 extratos
 de
 células
 humanas
 já
 foi
 verificado
 que
 a
 correção
 é

realizada

de
maneira
similar
e
também
ocorre
a
excisão
bidirecional.


 Os
 principais
 alvos
 do
 MMR
 humano
 são
 erros
 de
 emparelhamento,
 tais
 como:
 G:T,
 G:G,
 A:C
 e
 C:C,

entretanto,
 as
 proteínas
 do
 MMR
 também
 se
 ligam
 a
 lesões,
 tais
 como:
 O6MeG,
 ligada
 a
 C
 ou
 T,
 ligações

cruzadas
GpG
de
cisplatina,
fotoprodutos
da
radiação
UVC,
etc.

Em
 células
 humanas
 foram
 identificados
 genes
 que
 participam
 na
 correção
 dos
 erros
 de

emparelhamento:
MSH2
(MSH
=
MutS
Homolog),
MSH3
e
MSH6
que
codificam
proteínas
homólogas
à
MutS

bacteriana
e
MLH1(MLH
=
MutL
Homolog),
MLH3,
e
PMS2
(PMS=Post‐Meiotic
Segregation),
que
especificam

diferentes
homólogos
da
MutL
bacteriana



 As
proteínas
MSH2
e
MSH6
[GTBP
(G:T
Binding
Protein)
ou
p160]
formam
um
heterodímero
que
é
ativo

na
correção
de
erros
de
emparelhamento
e
foi
designado
MutSα.
MSH2
também
forma
complexo
com
MSH3

gerando
MutSβ.
Dependendo
do
par,
os
heterodímeros
reconhecem
diferentes
substratos.
MutSα
reconhece

erros
 de
 emparelhamento
 de
 bases
 e
 deleções/inserções
 enquanto
 MutSβ
 somente
 reconhece

deleções/inserções
e,
para
uma
ligação
eficiente
de
MutSα
ao
erro
há
necessidade
de
fosforilação.

As
proteínas
PMS2
e
MLH1
também
formam
um
heterodímero
denominado
MutLα
que
também
é
ativo

no
reparo
dos
erros
de
emparelhamento.
Admite‐se
ainda
a
existência
de
outro
complexo
(MLH1
com
MLH3)

que
atuaria
em
conjunto
com
o
complexo
MutSβ,
de
maneira
ainda
desconhecida
(Figura
VII.2).






FIGURA
VII.2
–
MMR
em
humanos


 VII
 4

Em
 células
 humanas
 o
 reconhecimento
 dos
 erros
 depende
 de
 MutSα
 e
 MutLα
 e
 a
 especificidade
 da

correção
é
similar
à
de
bactérias.
O
sistema
corrige
tanto
troca
de
bases
como
pequenas
deleções
e
inserções

de
até
quatro
nucleotídeos.

A
reação
é
dependente
de
ATP
e
é
acompanhada
por
síntese
de
reparo
partindo

da
incisão
e
atravessando
o
erro.


 Uma
 simples
 incisão
 em
 até
 1
 kb
 de
 distância
 do
 erro
 pode
 dirigir
 o
 reparo,
 entretanto,
 a
 eficiência
 vai

diminuindo
com
a
distância
entre
100
e
1000
bases
e
independe
do
corte
em
3’ou
em
5’.


 Assim
como
em
E.
coli,
a
excisão
é
bidirecional
e
as
lacunas
geradas
começam
na
incisão
e
vão
até
90
a

170
 nucleotídeos
 após
 o
 erro.
 
 Como
 a
 excisão
 é
 igual
 para
 erros
 de
 emparelhamento
 ou
 inserção
 de
 2

nucleotídeos
acredita‐se
que
o
mecanismo
seja
o
mesmo.




 A
polimerase
δ
é
a
responsável
pela
ressíntese.


 A
sinalização
para
distinguir
a
hélice
filha
não
está
clara
em
mamíferos.
Verificou‐se
que
não
é
metilação

em
seqüências
específicas
como
em
E.
coli.

O
sinal
parece
ser
a
permanência
de
proteínas
associadas
à
hélice

mãe
durante
a
replicação
ou
a
presença
de
quebras
simples
na
hélice
filha
que
ocorrem
durante
a
replicação.


 A
exonuclease
I
humana
é,
possivelmente,
a
responsável
pela
digestão
(5’→
3’)
da
fita
contendo
o
erro.

Não
se
conhece
a
exonuclease
responsável
pela
digestão
da
fita
na
direção
3’→
5’,
embora
haja
sugestões
de

que
 as
 funções
 editoriais
 das
 Polδ
 e
 Polε
 seriam
 as
 responsáveis
 por
 esta
 digestão.
 Além
 disto,
 nenhuma

helicase
foi
ainda
detectada
para
este
sistema
em
células
humanas.

O
 tratamento
 de
 células
 com
 agentes
 alquilantes
 tais
 como
 MNNG
 conduz
 à
 translocação
 de
 MSH2
 e

MSH6
 para
 o
 núcleo,
 conduzindo
 ao
 aumento
 da
 atividade
 de
 ligação
 de
 MutSα
 aos
 erros
 de

emparelhamento,
entretanto,
ainda
não
se
mostrou
inequivocamente
a
indução
do
MMR,
tanto
em
bactérias

como
em
eucariotos.

A
 primeira
 evidência
 da
 existência
 deste
 mecanismo
 em
 células
 humanas
 veio
 de
 estudos
 com
 uma

cultura
celular
hipermutável,
que
era
deficiente
na
correção
dos
erros.

Esta
cultura
foi
isolada
in
vitro
pela
sua

capacidade
 de
 sobreviver
 em
 presença
 de
 lesões
 no
 DNA,
 pela
 exposição
 a
 agentes
 alquilantes,
 que

normalmente
matariam
as
células.
A
partir
destes
experimentos
a
seleção,
in
vitro,
para
resistência
a
MNNG

ou
Metil
Nitroso
Uréia
(MNU)
conduziu
à
identificação
de
diversas
linhagens
celulares
de
mamíferos
tolerantes

a
metilação.


 Tanto
 em
 bactérias
 como
 em
 células
 humanas
 a
 resistência
 adquirida
 contra
 o
 efeito
 letal
 de
 agentes

metilantes,
a
qual
não
pode
ser
atribuída
a
um
aumento
do
reparo
das
lesões,
é
definida
como
tolerância
a

metilação.


 A
 linhagem
 melhor
 caracterizada
 é
 a
 MT1
 (MT
 =
 Methylation
 Tolerance),
 derivada
 de
 células
 humanas

linfoblastóides
TK6,
após
uma
única
etapa
de
seleção
para
resistência
a
MNNG.

Esta
linhagem,
embora
seja

centenas
de
vezes
mais
resistente
a
MNNG
que
a
parental,
em
alguns
casos
é
mais
sensível
à
mutagênese
do

MNNG.

Portanto
MT1
tolera
adutos
citotóxicos.

Células
 MT1
 também
 exibem
 um
 defeito
 de
 pontos
 de
 checagem
 (checkpoints)
 do
 ciclo
 celular
 após

tratamento
com
MNNG
e
são
hipermutáveis
em
ausência
de
MNNG.

A
mutagênese
espontânea
é
elevada
60

vezes
 nas
 células
 MT1,
 sendo
 em
 sua
 maior
 parte
 do
 tipo
 transversões,
 transições
 A
 
 G
 e
 inserções
 ou

deleções
de
um
nucleotídeo.

Baseado
 nos
 fenótipos
 de
 MT1
 e
 de
 bactérias
 deficientes
 no
 reparo
 de
 erros
 de
 emparelhamento
 foi

sugerido
que
os
defeitos
de
reparo
podem
conferir
tolerância
a
agentes
alquilantes
em
células
de
mamíferos,

assim
como
ocorre
em
bactérias.

Células
 MT1
 são
 deficientes
 em
 atividade
 MutSα
 e
 têm
 mutações
 em
 ambos
 os
 alelos
 do
 gene
 que

codifica
a
subunidade
MSH6.

MT1
exibe
um
defeito
de
checagem
no
estágio
G2
do
ciclo
celular.
Observações

similares
foram
feitas
em
células
de
camundongos
com
o
gene
MSH2
nocauteado.



 VII
 5

Correção
de
erros
de
emparelhamento
em
pequenos
fragmentos
(VSP
=
Very
Short
Patch)

Outras
 seqüências
 metiladas
 existem
 no
 DNA,
 tais
 como
 a
 (CC(A/T)GG),
 metilada
 pela
 DNA‐citosina

metilase
(Dcm),
na

segunda
citosina,
na

posição
C5.

Esta
metilação
em
E.
coli
protege
o
DNA
contra
enzimas

de
restrição
enquanto
em
células
de
mamíferos
ela
suprime
a
transcrição,
acarretando
o
bloqueio
de
alguns

genes.

Em
condições
de
baixa
de
5‐metil
citosina
(C5MeC)
há
um
aumento
da
formação
de
tumores,
sugerindo

a
localização
destas
seqüências
possivelmente
em
promotores
de
oncogenes.


 A
 desaminação
 da
 C5MeC
 acarreta
 a
 formação
 do
 par
 T:G.
 O
 sistema
 VSP
 corrige
 eficientemente
 T
 nos

erros
G:T
que
ocorrem
naquelas
seqüências.
Os
sítios
de
reconhecimento
de
Dcm
são
pontos
hipermutáveis

devido
à
desaminação
espontânea
da
C5MeC
do
par
G:
C5MeC,
um
evento
que
conduz
ao
par
G:T.


 O
 sistema
 VSP
 utiliza
 dois
 genes
 de
 reparação
 de
 erros
 de
 emparelhamento,
 mutS
 e
 mutL
 mas
 não
 os

genes
 mutH
 e
 uvrD.
 
 Adicionalmente,
 são
 necessários
 os
 produtos
 dos
 genes
 vsr
 e
 polA.
 O
 gene
 vsr
 está

localizado
antes
do
dcm
e
fazendo
parte
da
mesma
unidade
transcricional.


 Em
 heteroduplexes
 nas
 quais
 as
 seqüências
 GATC
 estão
 metiladas,
 representando
 DNA
 replicado,
 o

sistema
VSP
entra
em
ação
(Figura
VII.3);
quando
o
DNA
está
em
replicação
e
a
hélice
filha
não
está
metilada,

age
o
sistema
MutSLH.


 




FIGURA
VII.3
–
Esquema
proposto
 para
 o
 mecanismo
de
reparo
de
erros
de
emparelhamento
em
pequenos

fragmentos
(Very
Short
Patch
Repair)
em
E.
coli.



O
produto
do
gene
vsr
é
uma
proteína
de
18
kDa
constituindo
uma
endonuclease
de
correção
de
erros

hélice‐específica.
 Ela
 reconhece
 o
 par
 G:T
 no
 contexto
 CT(A/T)GG
 e
 NT(A/T)GG
 e
 faz
 incisões
 do
 lado
 5’da

timina
 produzindo
 terminais
 5’PO4
 e
 3’OH.
 Aparentemente
 a
 PolI
 (que
 é
 requerida
 para
 o
 VSP)
 remove
 a

timina
com
sua
atividade
exonucleolítica
5’→3’
e
faz
a
síntese
de
reparo
de
pequenos
fragmentos
(entre
10
e

20
nucleotídeos)
como
é
sua
característica.

 VII
 6


 MutS
 e
 MutL
 provavelmente
 agem
 estimulando
 ou
 regulando
 a
 endonuclease
 Vsr,
 já
 que
 em
 células

contendo
 plasmídeos
 multicópia
 com
 o
 gene
 vsr,
 MutS
 e
 MutL
 são
 dispensáveis
 no
 reparo
 VSP.
 Uma
 vez

terminado
o
reparo,
a
proteína
Dcm
metila
novamente
a
citosina.

Em
células
humanas,
a
reparação
de
G:T
para
G:C
foi
demonstrada
em
extratos
nucleares
de
células
HeLa.


A
 análise
 dos
 intermediários
 da
 reação
 indica
 que
 o
 reparo
 envolve
 a
 troca
 de
 um
 simples
 nucleotídeo
 e,
 a

Polβ,
é
a
responsável
pelo
fechamento
da
lacuna.

Atividades
enzimáticas
capazes
de
incisar
as
ligações
fosfodiéster
imediatamente
a
5’e
3’da
timina
errada

foram
identificadas
em
extratos
de
células
humanas.



 Uma
vez
que
a
timina
é
liberada
como
uma
base
livre,
foi
sugerido
que
uma
timina‐DNA
glicosilase
gere

um
 sítio
 intermediário
 abásico,
 que
 serve
 de
 substrato
 para
 as
 incisões.
 A
 enzima
 (55
 kDa)
 foi
 isolada
 de

células
HeLa
e
é
uma
timina‐DNA
glicosilase
específica
para
erros,
que
é
capaz
de
remover
T
do
par
G:T,
sem

atividade
 AP
 liase
 ou
 AP
 endonuclease
 associada.
 
 O
 par
 G:T
 é
 originado
 da
 desaminação
 de
 C5MeC
 nas

seqüências
CpG.

Esta
enzima
também
pode
remover
U
dos
pares
G:U
que
podem
surgir
de
desaminações
de

citosina
em
regiões
ricas
em
G:C.



Correção
de
erros
por
MutY
(metil
independente)


 O
erro
G:A
ocorre
muito
freqüentemente
durante
a
polimerização,
entretanto,
na
ausência
de
MutSLH
o

número
 de
 mutantes
 com
 este
 erro
 não
 é
 muito
 elevado,
 devido
 à
 existência
 de
 outros
 sistemas;
 assim,
 a

proteína
MutY
retira
A
do
par
G:A
e
também
participa
da
reparação
da
lesão
oxidativa
8‐oxoguanina
(8‐oxoG
=

GO),
em
conjunto
com
as
proteínas
MutT
e
MutM
como
será
visto
adiante.


 Este
sistema
libera
pequenos
fragmentos
e
é
independente
de
MutSLH,
hidrólise
de
ATP
ou
metilação.

Os

erros
G:A
são
corrigidos
para
G:C.

O
reparo
requer
a
função
do
gene
mutY
(micA)
e
da
PolI,
a
qual
libera
e,
em

seguida,
incorpora
entre
10
e
20
nucleotídeos.


A
proteína
MutY
funciona
como
uma
DNA
glicosilase
com
uma
atividade
3’AP
liase
associada,
removendo

especificamente
A
dos
pares
errados
G:A
e
C:A
com
uma
eficiência
20
vezes
maior
para
o
par
G:A.

Em
células
humanas,
recentemente
foi
purificada
uma
enzima,
que
cliva
especificamente
erros
A:G.

Ela

faz
simultaneamente
incisões
na
primeira
ligação
fosfodiéster
3’
e
5’
do
erro
no
lado
com
A
e
não
no
lado
com

G,
uma
ação
muito
similar
à
da
proteína
MutY
de
E.
coli.



Erros
de
emparelhamento
e
recombinação
genética


 Normalmente,
 a
 freqüência
 de
 recombinação
 genética
 entre
 E.
 coli
 vs
 S.
 typhimurium
 (recombinação

homeóloga)
é
da
ordem
de
10‐6
para
um
dado
caráter
(ex.,
xyl
ou
met),
comparada
com
a
recombinação
entre

E.
coli
vs
E.
coli
(recombinação
homóloga),
que
é
de
10‐1.


 Em
mutantes
mutSLH
a
freqüência
aumenta
cerca
de
1.000
vezes
quando
a
divergência
de
nucleotídeos
é

de
 cerca
 de
 20%
 (E.
 coli
 vs
 S.
 typhimurium),
 sendo
 os
 mutantes
 mutS
 e
 mutL
 os
 mais
 eficazes
 em
 deixar
 a

recombinação
ocorrer.


 A
 indução
 do
 sistema
 SOS
 estimula
 a
 recombinação
 homeóloga
 através
 da
 superprodução
 da
 proteína

RecA.

Já
que
a
proteína
RecA
é
capaz
de
deixar
mais
de
30%
de
erros
de
emparelhamento

na
recombinação,

o
efeito
cumulativo
de
deficiência
de
correção
de
erros
de
emparelhamento
e
indução
do
sistema
SOS
leva
a

taxa
de
recombinação
homeóloga
a
aproximar‐se
da
homóloga.


 Trocas
entre
seqüências
divergentes
em
somente
3%
são
dramaticamente
inibidas
por
MutS,
um
efeito

que
pode
ser
significativamente
aumentado
por
MutL.
Como
estas
proteínas
não
interferem
na
recombinação

homóloga
 o
 maior
 efeito
 é
 bloquear
 a
 migração
 dos
 cruzamentos
 das
 hélices
 de
 DNA
 durante
 as
 trocas

homeólogas,
não
deixando
a
recombinação
ocorrer,
formando
uma
verdadeira
barreira
entre
as
espécies.



 VII
 7

Barreiras
genéticas
entre
bactérias

Embora
 a
 transferência
 de
 material
 durante
 a
 conjugação
 seja
 altamente
 eficiente,
 a
 freqüência
 de

recombinação
entre
E.
coli
vs
S.
typhimurium
é
muito
baixa,
aproximadamente
105
vezes
menor
que
entre
as

mesmas
espécies.


 Durante
a
conjugação
Hfr
x
F‐,
o
DNA
entra
na
célula
receptora
como
uma
hélice
simples
com
a
fita
líder

5’.

Na
célula
F‐
a
fita
complementar
é
sintetizada,
gerando
a
dupla
hélice.


 As
pontas
da
dupla
hélice
são
substrato
para
a
enzima
RecBCD,
que
com
sua
ação
helicase
e
exonuclease

digere
 a
 dupla
 hélice
 até
 encontrar
 uma
 seqüência
 chi
 (χ)
 (5’GCTGGTGG3’).
 A
 seqüência
 χ
 altera
 a
 enzima

baixando
a
afinidade
de
RecD
com
o
heterodímero
RecBC.


 Com
 a
 perda
 de
 RecD
 o
 complexo
 RecBC
 fica
 deficiente
 em
 exonuclease
 mas
 proficiente
 em
 helicase,

produzindo
hélices
simples
de
DNA.

A
proteína
RecA
forma
um
polímero
na
hélice
simples
e
catalisa
a
procura

por
seqüências
idênticas
no
DNA
em
hélice
dupla.
A
troca
de
hélices
mediada
por
RecA
requer
um
mínimo
de

identidade
para
processamento.


 Durante
a
conjugação
interespécies
o
número
de
segmentos
com
o
mínimo
de
identidade
é
limitado
pelo

grau
de
divergência
entre
os
DNAs
dos
conjugantes,
diminuindo
a
velocidade
da
recombinação
mediada
por

RecA.
 Conseqüentemente,
 o
 complexo
 entre
 RecA
 e
 DNA
 em
 hélice
 simples
 permanece
 mais
 tempo
 no

cruzamento
interespécies
que
no
cruzamento
intraespécies,
resultando
na
ativação
da
função
coproteásica
de

RecA
e
desrepressão
do
regulon
SOS.

Como
resultado
aumenta
a
quantidade
das
proteínas
RecA
e
RuvAB
o

que
 estimula
 a
 recombinação
 entre
 as
 espécies.
 
 Assim,
 o
 SOS
 age
 como
 um
 regulador
 positivo
 indutível
 da

recombinação
interespécies.


 Entretanto,
a
indução
do
sistema
SOS
não
afeta
a
atividade
de
correção
de
erros
de
emparelhamento
em

grandes
fragmentos,
que
é
um
poderoso
inibidor
da
recombinação
entre
seqüências
divergentes
e,
a
ligação

das
 proteínas
 MutS
 e
 MutL
 bloqueia
 a
 troca
 de
 hélices
 promovida
 por
 RecA,
 reduzindo
 a
 freqüência
 de

recombinação
interespécies
(Figura
VII.4)



Reparação
de
deleções
e
inserções

As
repetições
de
dinucleotídeos
e
trinucleotídeos
que
ocorrem
freqüentemente
no
DNA
de
eucariotos
e

mais
 raramente
 em
 procariotos,
 representam
 um
 problema
 potencial
 durante
 a
 replicação,
 provocando

deslizamento
entre
as
hélices
e
conduzindo
a
deleções
e
inserções.

A
freqüência
de
deleções
e
inserções
num

fragmento
 de
 dinucleotídeos
 repetitivos
 (AC)20
 é
 aumentada
 cerca
 de
 13
 vezes
 em
 cepas
 de
 E.
 coli
 mutL
 e

mutS,
 o
 que
 não
 ocorre
 em
 mutantes
 recA.
 Este
 fato
 correlaciona‐se
 com
 a
 detecção
 de
 instabilidade
 em

repetições
de
dinucleotídeos
em
células
humanas
deficientes
no
reparo
de
erros
de
emparelhamento.


 Por
 outro
 lado,
 repetições
 de
 trinucleotídeos
 (CTG)180
 são
 mais
 estáveis
 nos
 mutantes
 mutH,
 mutL
 ou

mutS,
 sugerindo
 a
 participação
 do
 sistema
 MMR
 na
 promoção
 das
 deleções
 e
 inserções.
 Entretanto,
 a

estabilidade
 das
 repetições
 de
 trinucleotideos
 (CGG)80
 não
 é
 afetada
 pela
 reparação
 de
 erros
 de

emparelhamento
 em
 E.
 coli.
 Em
 células
 humanas
 ainda
 não
 foi
 reportada
 instabilidade
 de
 repetições
 de

trinucleotídeos
em
células
mutantes,
deficientes
na
reparação
de
erros
de
emparelhamento.

A
 atuação
 conjugada
 dos
 processos
 acima
 descritos
 faz
 com
 que
 a
 probabilidade
 de
 ocorrência
 e
 (ou)

persistência
de
um
erro
de
emparelhamento
seja
bastante
reduzida,
da
ordem
de
grandeza
de
l0‐10,
ou
seja,
de

um
nucleotídeo
indevidamente
inserido
para
cada
1010
nucleotídeos.
Na
polimerização
normal
os
erros
são
da

ordem
de
10‐4;
após
a
“revisão
editorial”
passam
para
10‐7
e
após
a
ação
das
proteínas
Mut
são
da
ordem
de

10‐10.
 Uma
 base
 nitrogenada
 incorporada
 erroneamente
 acarreta
 alteração
 do
 conteúdo
 informacional,

transmissível
às
gerações
subseqüentes,
constituindo
a
mutagênese
direta.




 VII
 8




FIGURA
 VII.4
 –
 Esquema
 do
 modelo
 proposto
 para
 a
 manutenção
 da
 barreira
 genética
 entre
 bactérias,

enfocando
o
papel
das
proteínas
MutSL.



REPARAÇÃO
DE
LESÕES
(ASPECTOS
GERAIS)
 


 Agentes
 químicos
 também
 podem
 provocar
 erros
 de
 emparelhamento,
 causando
 modificações

estruturais
nas
bases
nitrogenadas
e
alterando
sua
capacidade
de
formação
correta
de
pares.

Isto
ocorre,
por

exemplo,
 após
 tratamento
 com
 certos
 agentes
 alquilantes,
 como
 MNNG,
 capaz
 de
 inserir,
 por
 exemplo,

grupamentos
metil
no
O6
da
guanina,
de
forma
que
esta
passa
a
se
emparelhar
com
a
timina,
e
não
mais
com

a
citosina.


 Diversos
agentes
físicos
ou
químicos
do
meio
ambiente
promovem
modificações
estruturais
na
molécula

de
 DNA,
 englobadas
 sob
 a
 designação
 genérica
 de
 lesões,
 cuja
 persistência
 representa
 um
 obstáculo
 à

manutenção
dos
processos
bioquímicos
intracelulares.
Assim,
é
fácil
entender
a
importância
dos
mecanismos

enzimáticos
que
atuam
restaurando
a
integridade
do
genoma
ou
criando
vias
que
permitam
à
célula
“tolerar”

as
lesões,
isto
é,
manter
suas
funções
mesmo
sem
a
eliminação
dos
danos
provocados
no
DNA.


 A
não
funcionalidade
dos
mecanismos
de
reparação
conduz
à
inativação
celular
após
o
tratamento
com
o

agente
físico
ou
químico
ou,
eventualmente,
à
modificação
do
patrimônio
genético,
isto
é,
ao
surgimento
de

mutações.

Mas
nem
sempre
os
mecanismos
de
reparação
atuam
corretamente,
em
alguns
casos
eles
podem

 VII
 9

promover
 o
 desaparecimento
 da
 lesão,
 com
 alteração
 do
 conteúdo
 informacional,
 o
 que
 caracteriza
 a

mutagênese
indireta.
Estas
diferentes
possibilidades
encontram‐se
esquematicamente
representadas
na
figura

VII.5.




FIGURA
VII.5
–
Atuação
dos
mecanismos
de
reparação
na
eliminação
das
lesões,
na
preservação
do
conteúdo

informacional
e
na
mutagênese.




 Os
 mecanismos
 de
 reparação
 do
 DNA
 são,
 em
 geral,
 dependentes
 dos
 produtos
 de
 diversos
 genes
 e
 se

caracterizam
 por
 possuírem
 várias
 etapas,
 possibilitando
 vias
 alternativas,
 muitas
 vezes
 coexistentes
 e

competitivas.



REVERSÃO
DIRETA
DAS
LESÕES


 Alguns
 tipos
 de
 lesões
 podem
 ser
 revertidos
 diretamente,
 mediante
 a
 ação
 de
 uma
 única
 enzima,
 que

desfaz
 a
 lesão
 produzida,
 restaurando
 a
 integridade
 da
 molécula
 de
 DNA.
 
 Como
 exemplos
 de
 mecanismos

deste
tipo
de
reparação
podem
ser
citados
a
fotorreativação
e
a
remoção
de
grupamentos
alquil.


 Além
 destes
 mecanismos
 enzimáticos,
 algumas
 lesões,
 como
 os
 dímeros
 de
 pirimidinas
 podem
 ser

revertidos
diretamente
pela
radiação
ultravioleta,
como
é
o
caso
da
fotorreversão.



Fotorreativação


 Entre
os
fotoprodutos
formados
pelas
radiações
UV
germicidas
(UV‐C),
os
dímeros
de
pirimidinas
(CPD
=

Ciclobutane
Pyrimidine
Dimer)
são
os
mais
freqüentes,
sendo
os
maiores
responsáveis
pela
inativação
celular.


 A
fotorreativação
consiste
na
eliminação
de
CPDs
formados
no
DNA
pelo
UV‐C,
mediante
exposição
das

células
 às
 radiações
 UV
 de
 comprimentos
 de
 onda
 superiores
 a
 300
 nm
 ou
 à
 luz
 visível.
 
 O
 processo,

esquematicamente
representado
na
figura
VII.6,
é
mediado
pela
enzima
de
fotorreativação
ou
fotoliase,
que

tem
a
propriedade
de
combinar‐se,
mesmo
em
ausência
de
luz,
com
DNA
contendo
dímeros
de
pirimidinas.

Quando
 o
 complexo
 enzima‐substrato
 é
 iluminado,
 ele
 se
 dissocia,
 sendo
 liberados
 o
 DNA
 reparado
 e
 a

enzima,
 esta
 podendo
 atuar
 em
 outros
 sítios
 nos
 quais
 ainda
 existam
 dímeros.
 Existem
 entre
 10
 e
 20

moléculas
 por
 célula
 bacteriana
 e
 a
 fotoliase
 (49
 kDa)
 age
 rompendo
 a
 ligação
 ciclobutano
 entre
 a
 duas

pirimidinas,
numa
velocidade
de
5
dímeros
/molécula/min
e,
em
E.
coli
é
codificada
pelo
gene
phr.

Para
estas

células
os
comprimentos
de
onda
mais
eficientes
para
promover
a
fotorreativação
situam‐se
entre
340
e
390

nm.



 VII
 10




FIGURA
VII.6
‐
Esquema
do
modelo
proposto
para
a
fotorrestauração
enzimática
em

E.
coli.
A)
visão
geral;
B)

etapas
fotoquímicas.




 Recentemente
 foi
 detectado
 que
 a
 fotoliase
 de
 plantas
 também
 é
 capaz
 de
 desfazer
 a
 ligação
 do

fotoproduto
6‐4
(6‐4PP
=
6‐4
Pyrimidine
Pyrimidone).

A
 fotoliase
 contém
 dois
 cromóforos
 FADH2
 ou
 FADH‐
 (1,5‐dihidroflavina
 adenina
 dinucleotídeo)
 e
 folato

MTHF
[5,10‐metenoetiltetrahidrofolil
(poliglutamato)]
ou
deazaflavina
(8‐HDH).
O
folato
absorve
a
maioria
dos

fótons
 e
 é
 chamado
 de
 “antena”
 da
 fotoliase.
 
 O
 folato,
 ao
 receber
 um
 fóton,
 passa
 ao
 estado
 tripleto
 e

desativa‐se
 transferindo
 a
 energia
 para
 o
 FADH‐.
 
 O
 FADH‐
 excitado
 (singleto)
 transfere
 um
 elétron
 para
 o

dímero.
 Através
 de
 um
 rearranjo
 eletrônico
 há
 quebra
 do
 anel
 ciclobutano,
 gerando
 pirimidina
 e
 pirimidina

ânion
o
qual
transfere
o
elétron
para
o
FADHo,
regenerando
o
FADH2
(Figura
VII.6B).

A
 fotorreativação
 permite
 não
 somente
 o
 aumento
 da
 viabilidade
 celular
 após
 exposição
 ao
 UV‐C,

germicida,
mas
também
a
redução
da
mutagênese
fotoinduzida.


 O
 processo
 parece
 ser
 altamente
 específico
 para
 dímeros
 de
 pirimidinas,
 mas,
 a
 fotoliase
 talvez

desempenhe
outros
papéis
na
célula,
entre
os
quais
o
favorecimento
de
outros
mecanismos
de
reparação.
A

ligação
 da
 fotoliase
 aos
 dímeros
 torna
 estas
 lesões
 mais
 acessíveis
 ao
 complexo
 UvrABC,
 aumentando
 a

eficiência
da
reparação
por
excisão
de
nucleotídeos
(ver
adiante).


 Foi
mostrado
que
a
FADH2
purificada
da
fotoliase
de
E.
coli
catalisa
a
monomerização
de
dímeros
de
uracil

em
poli‐U
in
vitro,
mas
com
uma
eficiência
1.000
vezes
menor
que
a
de
dímeros
de
uracil
do
DNA.


 A
fotorreativação
já
foi
descrita
nos
mais
diversos
sistemas
biológicos:
micoplasmas,
bactérias,
leveduras,

moscas,
sapos,
diversas
plantas
e
mamíferos
não
placentários,
mas
não
em
mamíferos
superiores.

Alguns
 estudos
 sugeriram
 a
 existência
 de
 proteínas
 filogeneticamente
 correlacionadas
 à
 fotoliase
 em

células
de
mamíferos
e
outros
mostraram
perda
de
dímeros,
dependentemente
de
luz,
em
células
em
cultura

e
em
pele
humana
intacta,
entretanto,
estes
estudos
não
foram
confirmados.

 VII
 11

Muitos
estudos
falharam
na
tentativa
de
mostrar
fotorreativação
em
organismos
mais
avançados
que
os

não‐placentários
(marsupiais);
portanto,
acredita‐se
que
ela
não
exista
em
seres
humanos.


 Em
células
humans
foram
detectadas
proteínas
similares
às
fotoliases,
porém
não
relacionadas
ao
reparo

de
lesões
mas
sim
à
regulação
do
ritmo
circadiano.


 Já
foram
clonados
os
genes
CRY1
e
CRY2
em
humanos
e
em
camundongos.
CRY1
e
CRY2
são
expressos
em

diversos
 tecidos
 tais
 como:
 fígado,
 testículos,
 cérebro
 e
 retina
 e
 seus
 produtos
 agem
 como
 fotorreceptores

circadianos.


 Aparentemente
 os
 genes
 CRY1
 e
 CRY2
 têm
 papéis
 antagônicos,
 uma
 vez
 que
 o
 período
 circadiano
 é

diminuído
 em
 camundongos
 cry1‐/‐
 e
 aumentado
 em
 camundongos
 cry2‐/‐.
 
 Este
 gene
 revela
 uma

modificação
evolucionária
muito
interessante,
uma
vez
que
uma
enzima
de
reparação
de
DNA
parece
ter
se

transformado
em
uma
proteína
com
funções
completamente
diferentes.



Fotorreversão


 A
reversão
de
dímeros
de
pirimidinas
pode
também
ser
obtida
por
outros
processos,
independentes
da

fotoliase.

Ela
ocorre,
por
exemplo,
mediante
exposição
das
células,
previamente
irradiadas
com
UV
germicida,

a
 comprimentos
 de
 onda
 situados
 entre
 200
 e
 300
 nm
 (235nm
 favorece
 a
 fotomonomerização
 e
 280
 nm

favorece
 a
 dimerização),
 uma
 vez
 que
 a
 união
 de
 duas
 pirimidinas
 é
 uma
 reação
 reversível
 e
 que
 cada

comprimento
 de
 onda,
 ainda
 que
 com
 diferentes
 eficiências,
 pode
 promover
 tanto
 a
 dimerização
 como
 a

monomerização;
a
desdimerização
devida
unicamente
à
exposição
ao
UV‐C
constitui
a
fotorreversão
direta.


 Proteínas
ricas
em
triptofano,
como
a
codificada
pelo
gene
32
do
fago
T4,
e
mesmo
oligopeptídeos
ricos

neste
 aminoácido,
 podem,
 quando
 expostos
 a
 comprimentos
 de
 onda
 de
 334
 nm,
 adquirir
 a
 capacidade
 de

promover
 a
 monomerização
 de
 timinas
 dimerizadas,
 o
 que
 parece
 ser
 conseqüência
 da
 transferência
 de

elétrons
do
anel
do
triptofano
para
os
dímeros;
este
fenômeno
constitui
a
fotorreversão
sensibilizada.



Transferência
de
grupamentos
alquil


 Quando
células
são
tratadas
com
agentes
alquilantes
tais
como
MNU
ou
MNNG,
seu
DNA
é
alquilado
nas

mais
 diversas
 posições.
 
 Em
 alguns
 casos,
 estas
 lesões
 podem
 ser
 reparadas
 diretamente,
 pela
 remoção
 dos

grupamentos
alquil.


 As
metilações
que
ocorrem
no
oxigênio
exocíclico
das
bases
são
diretamente
removidas,
sendo
O6MeG
a

mais
 abundante
 (6
 a
 8%
 das
 metilações
 totais)
 e
 O4MeT
 a
 de
 menor
 importância
 (<
 0,4%).
 A
 metilação
 da

ligação
fosfotriéster
é
da
ordem
de
17%.
(Na
figura
VII.7
estão
representados
os
diferentes
sítios
de
metilação

com
as
respectivas
ocorrências)




FIGURA
VII.7
–
Principais
sítios
de
alquilação




 VII
 12

Em
 E.
 coli
 existem
 duas
 enzimas
 que
 reparam
 o
 DNA
 por
 transferência
 direta
 do
 grupamento
 alquil;
 as

proteínas
 Ada
 e
 Ogt
 (O6‐Metilguanina
 ‐
 DNA
 Metiltransferases)
 codificadas
 pelos
 genes
 ada
 e
 ogt

respectivamente.


 A
proteína
Ada
(37
kDa)
remove
grupamentos
metil
das
posições
O6
da
guanina,
O4
da
timina
e
da
ligação

fosfotriéster
enquanto
a
Ogt
só
consegue
removê‐los
das
posições
O6
da
guanina
e
O4
da
timina.

A
remoção

dos
grupamentos
alquil
das
bases
acarreta
a
inativação
das
proteínas
(enzima
“suicida”),
entretanto,
no
caso

da
remoção
do
metil
da
ligação
fosfotriéster,
a
proteína
Ada
sofre
uma
mudança
conformacional,
tornando‐se

um
ativador
de
seu
próprio
gene,
conduzindo
à
síntese
de
milhares
de
moléculas
de
Ada.


 A
 proteína
 Ogt
 (19
 kDa)
 é
 constitutiva,
 não
 tendo
 sido
 detectado
 nenhuma
 ativação
 por
 qualquer

tratamento.


 Foi
 mostrado
 que
 os
 mutantes
 ada
 e
 ogt
 são
 propensos
 a
 acumular
 mutações
 espontaneamente,

mostrando
a
existência
de
alquilações
espontâneas
provenientes
provavelmente
do
cloreto
de
metila,
que
é

abundante
na
atmosfera,
com
uma
estimativa
anual
de
emissão
de
5
x106
toneladas,
a
maior
parte
de
fontes

naturais
e
de
fontes
endógenas
como
a
S‐adenosil
metionina
e
outros
doadores
intracelulares.



 Apesar
 da
 semelhança
 quanto
 à
 sua
 atuação,
 recentemente
 foi
 verificado
 que
 aparentemente
 Ada

prefere
O6MeG
e
Ogt
prefere
O4MeT.


 Em
 células
 humanas,
 a
 O6‐Metilguanina‐DNA
 Metiltransferase
 (O6MGT),
 ainda
 conhecida
 como
 Atase,

AGT
e
AGAT,
também
é
uma
enzima
suicida
que
repara
o
DNA
transferindo
o
grupamento
metil
da
O6MeG
no

DNA
para
um
resíduo
cisteína
da
enzima
em
uma
reação
irreversível.

A
 transferência
 do
 grupamento
 alquil,
 inativa
 e
 transforma
 a
 enzima
 em
 alvo
 para
 ubiquitinação
 e

degradação
por
proteases.

Ela
repara
também
O6
 etilguanina
e
O6
butilguanina
assim
como
O4
metiltimina
com
uma
eficiência
mais

baixa.
 
 Estas
 lesões
 são
 produzidas
 por
 agentes
 alquilantes
 (MNNG,
 MNU,
 etc.,
 contidos
 em
 alimentos,

cigarros,
 etc.).
 
 Em
 condições
 fisiológicas
 o
 DNA
 é
 metilado
 por
 metilantes
 naturais
 como
 a
 S‐
adenosilmetionina.

A
O6MGT
foi
detectada
em
todas
as
espécies.

A
enzima
humana
é
uma
proteína
monomérica
de
24
kDa.

Ela
é
semelhante
à
Ogt
bacteriana
e
também
só
tem
função
de
metil
transferase
para
O6MeG
e
O4MeT,
com

uma
preferência
10.000
vezes
maior
para
O6MeG.

Ela
não
tem
a
função
de
retirar
grupos
alquil
das
ligações

fosfotriéster
e
também
não
tem
a
função
regulatória
parecida
com
a
proteína
Ada
de
bactérias,
embora
seja

induzida
por
estresse
genotóxico.


 O
gene
da
O6MGT
humana
está
localizado
no
cromossomo
10
e
tem
6
exons
e
mais
de
170
kb
e
a
proteína

tem
regiões
de
extensa
homologia
com
as
bacterianas,
entretanto,
não
há
muita
homologia
de
seqüência
e
o

cDNA
humano
não
hibridiza
com
o
DNA
genômico
de
E.
coli.


A
 proteína
 humana
 é
 uma
 enzima
 simples,
 sem
 cofator,
 com
 uma
 cisteína
 ativa
 na
 seqüência
 contexto

PCHRV
 (Pro‐Cys‐His‐Arg‐Val),
 que
 é
 conservada
 em
 todas
 as
 O6MGTs.
 
 O
 sítio
 ativo
 é
 escondido
 (latente
 =

críptico)
só
se
tornando
acessível
após
modificação
conformacional
induzida
pelo
contato
com
o
DNA.


 Os
 efeitos
 citotóxicos,
 mutagênicos
 e
 tumorigênicos
 da
 O6MeG
 são
 diminuídos
 pela
 ação
 da
 enzima

O6MGT.
Não
são
conhecidos
mutantes
humanos
para
o
gene
da
O6MGT,
entretanto
cerca
de
20%
dos
tumores

humanos
 são
 sensíveis
 a
 MNNG
 e
 não
 possuem
 atividade
 O6MGT
 detectável
 sendo
 denominados

fenotipicamente
 Mer‐
 (Methylation
 repair
 minus).
 Similarmente,
 a
 transformação
 de
 células
 humanas
 com

vírus
 tumorais
 causa
 um
 fenótipo
 deficiente
 em
 O6MGT,
 denominado
 Mex‐
 (Methylation
 excision
 minus).


Embora
não
sejam
mutadas
no
gene
O6MGT,
a
introdução
do
gene
bacteriano
ou
humano
em
células
Mer‐
ou

Mex‐
restaura
a
resistência
a
MNNG,
o
que
indica
uma
relação
de
causa
e
efeito
entre
a
falta
de
atividade
de

O6MTG
e
a
sensibilidade
a
agentes
alquilantes.


 A
 O6MGT,
 logicamente,
 tem
 um
 papel
 importante
 na
 prevenção
 do
 câncer.
 Em
 um
 grande
 número
 de

cânceres,
 a
 mutação
 oncogênica
 resultou
 de
 uma
 transição
 G:C
 para
 A:T,
 a
 qual
 pode
 ter
 resultado
 de
 uma

alquilação
 de
 G.
 Em
 verdade,
 a
 superexpressão
 de
 O6MGT
 protege
 camundongos
 transgênicos
 de
 cânceres

induzidos
por
agentes
alquilantes.
Em
um
caso,
a
expressão
de
O6MGT
humana
em
camundongos
transgênicos

protegeu‐os
contra
o
linfoma
de
timo,
induzido
por
MNU.

Em
outro
caso,
a
expressão
do
gene
ada
de
E.
coli

 VII
 13

em
 camundongos
 transgênicos
 protegeu
 os
 animais
 contra
 câncer
 de
 fígado
 induzido
 por
 dimetil
 ou

dietilnitrosamina.


 A
ocorrência
de
tumores
cerebrais
em
ratos
jovens
tratados
com
etil
nitrosuréia
é
correlacionada
com
a

persistência
da
O6
alquil
guanina
no
cérebro.

Similarmente,
o
tratamento
crônico
com
MNU
especificamente

resulta
 em
 tumores
 neurais
 em
 animais
 experimentais
 e
 é
 acompanhado
 por
 progressiva
 acumulação
 de

O6MeG
no
cérebro
sem
a
concomitante
acumulação
em
outros
tecidos.

Ainda
não
foi
detectada
doença
humana
associada
com
a
mutação
no
gene
da
O6MGT.

O
fenótipo
Mer‐

parece
ser
o
efeito
e
não
a
causa
da
transformação
maligna.



Transferência
de
grupamentos
alquil
por
AlkB


 As
metilações
podem
ocorrer
em
14
sítios
diferentes
no
DNA
(Ver
figura
VII.7),
12
dos
quais
são
reparados

por
Ada,
AlkA
e
AlkB.

As
metilações
mais
abundantes
são
N7MeG
(70%)
e
N3MeA
(10%).


 Alguns
 agentes
 alquilantes,
 tais
 como:
 CH3Cl,
 CH3I
 e
 CH3Br,
 geram
 metilações
 em
 RNA
 e
 DNA
 em
 hélice

simples
(N1MeA
e
N3MeC),
uma
vez
que
estes
sítios
estão
protegidos
na
dupla
hélice.




 AlkB
 é
 uma
 dioxigenase
 α‐cetoglutarato‐Fe(II)
 dependente,
 que
 utiliza
 um
 intermediário
 ferro‐oxo
 para

hidroxilar
N1MeA
e
N3MeC
no
DNA.

Estes
intermediários
hidroxilados
são
instáveis
e
se
decompõem,
gerando

formaldeído
e
regenerando
a
base
íntegra.
No
caso
de
N1etilAdenina
é
liberado
acetaldeído.
(Figura
VII.8)


 




FIGURA
VII.8
–
Reparo
de
alquilações
por
AlkB




In
vitro,
AlkB
repara
DNA
em
hélice
simples
assim
como
DNA
em
hélice
dupla
(preparado
por
anelamento

após
a
metilação).


 Além
disto,
AlkB
também
é
capaz
de
retirar
o
N1metil
de
dATP,
impedindo
a
incorporação
do
precursor

metilado
durante
a
síntese
de
DNA.

O
 primeiro
 gene
 humano
 descrito
 como
 homólogo
 ao
 alkB
 
 de
 E.
 coli,
 foi
 o
 ABH1.
 Entretanto,
 os

resultados
 obtidos
 não
 foram
 confirmados,
 embora
 este
 gene
 possua
 18,5%
 de
 identidade
 com
 alkB
 e

possivelmente
tenha
uma
função
relacionada.


 Posteriormente
 ABH2
 e
 ABH3
 (também
 conhecido
 como
 DEPC‐1),
 foram
 descritos
 e
 mostraram

complementar
a
mutação
alkB
de
E.
coli.



 ABH2
está
localizado
no
cromossomo
12
e
é
composto
de
4
exons
e
AHB3
está
no
cromossomo
11,
sendo

composto
de
10
exons.


 As
 proteínas
 AHB2
 e
 AHB3
 são
 do
 grupo
 da
 superfamília
 das
 dioxigenases
 cetoglutarato
 Fe(II)‐
dependentes,
contendo
a
seqüência
contexto
de
ligação
do
Fe(II).

 VII
 14


 As
duas
proteínas
retiram
metil
de
N1MeA
e
N2MeC
e
ABH2
é
mais
ativa
em
N1MeA
e
ABH3
em
N3MeC
no

DNA.


 Em
contraste
com
AlkB
as
proteínas
humanas
têm
muito
pouca
afinidade
por
N‐etilA.


 As
proteínas
AlkB
e
ABH3
preferem
DNA
em
hélice
simples
e
RNA,
enquanto
ABH2
prefere
DNA
em
hélice

simples
 e
 dupla,
 por
 isto
 AlkB
 e
 ABH3
 reparam
 eficientemente
 RNA,
 entretanto,
 a
 preferência
 das
 duas

proteínas
humanas
por
DNA
é
o
dobro
daquela
observada
para
RNA.


 Como
as
metilações
N1MeA
e
N3MeA
são
geradas
em
DNA
em
hélice
simples,
foi
sugerido
que
AlkB
e
os

homólogos
devam
funcionar
nas
forquilhas
de
replicação
e
nos
sítios
de
transcrição.

Em
verdade,
os
mutantes

alkB
de
E.
coli
são
muito
mais
sensíveis
a
agentes
alquilantes
em
fase
exponencial
do
que
na
estacionária
de

crescimento
 e
 ABH2,
 mas
 não
 ABH3,
 co‐localiza
 com
 PCNA
 (Proliferating
 Cell
 Nuclear
 Antigen)
 nos
 “foci”
 de

replicação.
 Além
 disto
 alkB
 também
 está
 associado
 com
 a
 replicação
 em
 organismos
 como
 C.
 crescentus,

aumentado
sua
expressão
durante
a
fase
S,
junto
com
outros
genes
requeridos
para
a
síntese
de
DNA.


 Ainda
 não
 se
 demonstrou
 a
 indução
 dos
 genes
 humanos
 pelos
 tratamentos
 com
 agentes
 metilantes
 de

hélices
simples
DNA.



Reparo
de
quebras
simples
pela
ligação
direta


 Na
 maior
 parte
 das
 vezes
 a
 reparação
 das
 quebras
 produzidas
 no
 DNA
 pelas
 radiações
 X
 ,
 γ
 e
 outros

agentes
 requer
 o
 sistema
 recombinacional.
 
 Além
 disto,
 os
 grupamentos
 deixados
 normalmente
 requerem

processamento
 para
 limpeza
 das
 pontas
 antes
 da
 polimerização.
 
 Em
 E.
 coli,
 e
 possivelmente
 em
 outros

organismos,
 algumas
 das
 quebras
 simples
 produzidas
 podem
 ser
 reparadas
 diretamente
 pela
 ação
 da
 DNA

ligase.
A
enzima
de
E.
coli
requer
NAD
e
Mg2+
como
co‐fatores
e,
como
todas
as
DNA
ligases,
requer
pontas

livres
no
sítio
da
quebra
e
a
presença
de
3’OH
e
5’PO4.

Assim,
uma
quebra
simples
com
estas
características,

produzida
por
agentes
lesivos,
está
sujeita
ao
reparo
pela
ligação
direta
(Figura
VII.9).




FIGURA
VII.9
–
REPARO
DE
QUEBRAS
SIMPLES
‐
Esquema
do
modelo
proposto
para
ligação
direta

de
quebras
simples
no
DNA
de
E.
coli.



REPARAÇÃO
POR
EXCISÃO

Aspectos
gerais


 O
 isolamento
 de
 mutantes
 de
 E.
 coli
 B
 denominados
 Bs‐1
 e
 Bs‐2,
 bastante
 sensíveis
 às
 radiações
 UV‐C,

levou,
há
mais
de
quatro
décadas,
à
proposição
da
existência
de
um
mecanismo
de
reparação
independente

 VII
 15

da
 iluminação
 e
 que,
 nestes
 mutantes,
 seria
 deficiente.
 
 Por
 esta
 razão,
 este
 mecanismo
 foi
 inicialmente

denominado
 de
 reparação
 no
 escuro
 (“dark
 repair”),
 sendo
 hoje
 conhecido
 como
 reparação
 por
 excisão
 ou

reparação
por
excisão‐ressíntese.


 Este
tipo
de
reparação,
provavelmente
o
mais
importante
mecanismo
de
eliminação
de
lesões
foto,
radio

ou
quimioinduzidas,
admite
várias
vias
alternativas,
que
podem
ser
agrupados
em:

a) remoção
da
base
nitrogenada
lesada,
seguida
da
inserção
de
uma
base
idêntica,
não
lesada;

b) remoção
 da
 base
 nitrogenada
 lesada,
 gerando
 um
 sítio
 apurínico
 ou
 apirimidínico,
 capaz
 de
 ser

reconhecido
por
uma
endonuclease,
que
produz
uma
quebra
na
cadeia
polinucleotídica,
seguindo‐se
a

eliminação
do
fragmento,
ressíntese
e
ligação;

c) excisão
 de
 um
 fragmento
 relativamente
 curto
 da
 cadeia
 contendo
 a
 lesão,
 seguida
 de
 ressíntese
 e

ligação.

d) excisão
 de
 um
 longo
 fragmento
 de
 cadeia,
 formado
 por
 mais
 de
 1.500
 nucleotídeos,
 seguida
 de

ressíntese
e
ligação.



REPARAÇÃO
POR
EXCISÃO
DE
BASES
(BER)


 O
 material
 genético
 é
 constantemente
 exposto
 a
 agentes
 físicos
 e
 químicos
 que
 induzem
 grande

variedade
 de
 modificações
 no
 DNA.
 
 Para
 evitar
 que
 esses
 agentes
 causem
 mutações
 ou
 morte
 celular
 os

organismos
desenvolveram
diversos
mecanismos
para
prevenir
e
reparar
as
lesões.


 Uma
grande
variedade
de
lesões
é
reparada
por
um
sistema
em
múltiplas
etapas,
denominado
reparação

por
excisão
de
bases,
composto
das
seguintes
etapas:

a) liberação
da
base
lesada
ou
mal
emparelhada
por
uma
DNA
glicosilase
específica,

b) incisão
da
cadeia
açúcar
fosfato
no
sitio
abásico
resultante,
por
uma
liase
ou
por
uma
endonuclease,

c) remoção
do
terminal
criado,

d) síntese
de
reparo
e

e) ligação
do
DNA
neossintetizado
ao
pré‐existente.



DNA
glicosilases


 Bases
nitrogenadas
lesadas
pelo
tratamento
com
agentes
físicos
ou
químicos
podem
ser
removidas
pela

atuação
de
N‐glicosilases,
capazes
de
romper
a
ligação
entre
a
base
e
a
desoxirribose.




 Muitas
DNA
glicosilases
reconhecem
somente
uma
forma
particular
da
lesão
da
base
e
a
maioria
das
DNA

glicosilases
é
altamente
específica
para
bases
com
uma
lesão
específica.


 Elas
são
proteínas
pequenas,
com
menos
de
30
kDa
e
o
aparecimento
de
bases
livres
após
tratamento
do

DNA
com
agentes
genotóxicos
é
a
maior
demonstração
da
atividade
das
DNA
glicosilases.

Isto
normalmente
é

feito
por
análise
cromatográfica
seja
da
mistura
inteira
da
incubação
do
DNA
marcado
radioativamente
seja
da

fração
contendo
oligo
ou
mononucleotídeos
solúveis
em
ácido
ou
álcool.


 O
 sistema
 de
 excisão
 de
 bases
 é
 o
 principal
 sistema
 para
 a
 reparação
 de
 bases
 modificadas,
 sítios
 com

perda
de
bases,
quebras
simples
e
pequenas
lacunas
no
DNA.



Uracil
DNA‐glicosilase
(ura‐DNA‐glicosilase)

É
 uma
 enzima
 codificada
 em
 E.
 coli
 pelo
 gene
 ung,
 constituindo‐se
 de
 um
 polipetídeo
 de
 25,6
 kDa
 que

remove
 moléculas
 de
 uracil
 incorporadas
 ao
 DNA
 pela
 DNA
 polimerase,
 que
 incorpora
 erradamente
 uma

molécula
de
uracil
para
cada
1.000
a
10.000
timinas.

 VII
 16


 O
uracil
também
pode
ser
formado
no
DNA
em
conseqüência
da
desaminação
da
citosina,
fenômeno
este

que
ocorre
com
elevada
freqüência
pela
ação
de
agentes
físicos
ou
químicos.
Portanto,
a
ura‐DNA‐glicosilase

tem
um
papel
relevante
em
evitar
a
mutagênese
espontânea
C:G

T:A.


 Algumas
 formas
 de
 vida
 usam
 o
 uracil
 no
 DNA
 (bacteriófagos
 PBS1
 e
 PBS2
 de
 Bacillus
 subtilis).
 
 Estas

cepas,
 entretanto,
 possuem
 ura‐DNA‐glicosilase.
 
 Em
 verdade,
 logo
 após
 a
 infecção
 o
 gene
 ugi
 do
 fago

(inibidor
da
ura‐DNA‐glicosilase)
é
expresso,
permitindo
a
replicação
do
vírus.


 A
 ura‐DNA‐glicosilase
 utiliza
 DNA
 em
 hélice
 dupla
 ou
 simples
 contendo
 deoxiuridina.
 A
 enzima
 retira
 o

uracil
 e
 “engloba‐o”
 no
 seu
 sítio
 ativo,
 o
 que
 limita
 as
 lesões
 reparáveis.
 
 Entretanto,
 além
 do
 uracil,
 foi

mostrado
que
ela
também
é
capaz
de
reconhecer
5‐fluoruracil,
5,6‐dihidroxiuracil
e
5‐hidroxi‐2’‐deoxiuridina.

O
gene
UNG
humano
foi
clonado
e
codifica
uma
proteína
de
34
kDa
que
é
processada
pela
clivagem
do
N‐
terminal,
gerando
um
polipeptídeo
de
26
kDa,
que
é
funcional
tanto
no
núcleo
como
nas
mitocôndrias
e
tem

preferência
 por
 DNA
 em
 hélice
 simples.
 
 Interessantemente,
 alguns
 vírus,
 incluindo
 HSV1,
 HSV2
 e
 varicela

zoster,
 codificam
 sua
 própria
 uracil‐DNA
 glicosilase,
 indicando
 a
 importância
 desta
 enzima
 para
 sua

manutenção.

Não
existe
doença
humana
conhecida
associada
com
defeito
em
UNG.





Hidroximetiluracil‐DNA
glicosilase
(somente
em
eucariotos)


 O
 hidroximetiluracil
 (HmUra)
 é
 formado
 pela
 oxidação
 do
 grupamento
 metil
 da
 timina
 ou
 pela

desaminação
da
5‐hidroximetilcitosina.
Ele
é
detectado
em
urina
de
ratos
e
de
humanos
e
é
usado
como
uma

medida
 da
 formação
 de
 lesões
 oxidativas
 no
 DNA
 nestes
 organismos.
 Esta
 lesão
 é
 removida
 por
 uma

glicosilase
 específica
 presente
 em
 todos
 os
 vertebrados,
 mas
 não
 em
 procariotos,
 provavelmente
 porque
 os

procariotos
 não
 têm
 muitos
 resíduos
 5‐metilcitosina.
 
 A
 enzima
 age
 igualmente
 em
 DNA
 em
 hélice
 simples

como
 em
 dupla,
 em
 contraste
 com
 a
 uracil‐DNA
 glicosilase,
 que
 prefere
 DNA
 em
 hélice
 simples
 e
 outras

glicosilases
que
preferem
DNA
em
hélice
dupla.




3
metil
adenina
DNA
glicosilases
(bactérias)
/
N‐metilpurina‐DNA
glicosilase
(humanos)


 Quando
do
tratamento
das
células
com
agentes
alquilantes,
diversas
posições
nas
bases
são
alquiladas
e

não
são
reconhecidas
pelas
proteínas
Ada
e
Ogt.

Entre
as
bases
alquiladas,
a
3‐metil‐adenina
é
a
lesão
mais

crítica
uma
vez
que
interfere
com
a
replicação,
conduzindo
à
letalidade.


 Em
E.
coli,
duas
proteínas
são
responsáveis
pela
eliminação
destas
bases,
as
enzimas
Tag
e
AlkA
(3‐metil‐
adenina
 DNA
 glicosilases),
 codificadas
 pelos
 genes
 tag
 e
 alkA,
 respectivamente.
 
 A
 proteína
 Tag
 (21
 kDa)
 é

capaz
 de
 reparar
 diversas
 bases
 além
 da
 N3MeA.
 Ela
 também
 catalisa
 a
 excisão
 de
 3‐metilguanina,
 3‐
etiladenina
e
3‐etiltioetiladenina.


 A
 proteína
 AlkA,
 além
 de
 remover
 N3MeA
 é
 capaz
 de
 catalisar
 a
 eliminação
 de
 pelo
 menos
 mais
 20

produtos
 de
 metilação,
 tais
 como:
 3‐metilguanina,
 7‐metilpurinas,
 7
 e
 3‐etilpurinas,
 O2‐metilpirimidinas,
 5‐
hidroximetiluracil,
N1‐carboxietiladenina,
N7‐carboxietilguanina,
etc.



 Recentemente
foi
mostrado
que
a
proteína
AlkA
também
é
capaz
de
remover
hipoxantina
(Hx,
resultante

da
 desaminação
 da
 adenina)
 e
 que
 a
 atividade
 Hx‐DNA‐glicosilase
 detectada
 anteriormente
 em
 E.
 coli
 e
 em

células
HeLa,
em
verdade
correspondia
a
uma
das
atividades
da
proteína
AlkA


 Em
células
humanas
só
foi
detectada
uma
N‐metil
purina‐DNA
glicosilase
(MPG),
que
é
uma
proteína
de

33
kDa.

A
enzima
de
mamíferos
é
funcionalmente
homóloga
à
AlkA
de
E.
coli
com
relação
à
especificidade
de

substrato,
entretanto
ela
não
tem
homologia
de
seqüência
com
Tag
nem
com
AlkA,
portanto,
o
nome
N‐metil

purina‐DNA
glicosilase
é
preferido
para
a
enzima
humana.

Entretanto,
o
nome
não
define
completamente
o

espectro
de
substratos.

A
enzima
remove
também
GO,
hipoxantina
e
1,
N6‐eteno
Adenina
da
mesma
maneira

que
N3MeA.
Os
mutantes
de
E.
coli
são
extremamente
sensíveis
aos
efeitos
mutagênicos
e
letais
dos
agentes

alquilantes,
entretanto,
em
humanos
não
foi
detectada
nenhuma
doença
associada
com
a
deficiência
de
MPG.



 VII
 17

DNA
glicosilases
com
atividade
AP
liase
associada


 Em
reações
in
vitro
foi
detectada
uma
associação
de
eliminação
das
bases
com
concomitante
quebra
das

ligações
 fosfodiéster.
 
 Foi
 mostrado
 que
 as
 incisões
 ocorrem
 por
 β‐eliminação
 no
 lado
 3’
 do
 sítio
 AP
 e
 foi

mostrado
também
que
esta
β‐eliminação
em
sítios
AP
pode
ser
facilitada
por
algumas
proteínas
básicas,
não

se
sabendo,
entretanto,
se
elas
são
verdadeiras
enzimas,
uma
vez
que,
a
quebra
por
endonucleases
envolve

uma
molécula
de
água,
ou
seja,
são
endonucleases
hidrolíticas.


 Isto
gerou
controvérsias
acerca
das
“verdadeiras”
AP
endonucleases
e
sua
distinção
entre
proteínas
que

provocam
quebras
espúrias
no
DNA.



Química
e
estrutura
dos
sítios
AP


 Os
 sítios
 AP
 existem
 no
 DNA
 como
 uma
 mistura
 de
 equilíbrio
 contendo
 cadeia
 aberta
 α,
 β‐aldeído

insaturado,
 α
 e
 β‐hemiacetal
 e
 cadeia
 aberta
 α,
 β‐hidrato
 insaturado.
 
 Os
 aldeídos
 abertos
 constituem

somente
 1%
 dos
 sítios
 AP,
 mas
 são
 os
 mais
 reativos.
 
 Os
 sítios
 AP
 podem
 reagir
 quimicamente
 levando
 à

quebra
da
cadeia
na
ausência
de
proteínas.


 β‐eliminação
 –
 Ocorre
 de
 duas
 maneiras:
 um
 próton
 é
 transferido
 do
 grupo
 CH2
 da
 desoxirribose
 α‐

para
o
grupo
carbonil
do
carbono
1
ou
uma
base
de
Schiff
é
formada
entre
uma
amina
e
o
grupo
C1

carbonil
da
cadeia
aberta
do
aldeído.
Ambas
as
reações
são
seguidas
de
β‐eliminação
que
deixa
3’
α,

β‐aldeído
 insaturado,
 4‐hidroxi‐2‐pentenal
 e
 5’PO4,
 sendo
 este
 o
 mais
 relevante
 mecanismo
 de

clivagem
nos
sítios
AP.

 δ‐eliminação
–
Em
certas
condições
o
aldeído
insaturado
3’
pode
sofrer
uma
reação
adicional
de
delta

eliminação,
 resultado
 da
 liberação
 de
 4‐hidroxi‐pent‐2,4‐dienal
 deixando
 uma
 lacuna
 de
 um

nucleotídeo
e
terminais
3’PO4
e
5’PO4.

 Rearranjo
–
Em
condições
alcalinas
o
aldeído
3’
α,
β‐
insaturado
pode
rearranjar‐se
formando
um
3’–2‐
oxociclopent‐1‐enil
terminal.




 Todas
as
DNA
glicosilases
que
podem
hidrolisar
as
ligações
fosfodiéster
no
sítio
da
perda
da
base
o
fazem

por
β‐eliminação.

Portanto,
foi
sugerido
que
estas
e
outras
proteínas
que
facilitam
a
β‐eliminação
nos
sítios

AP
devem
ser
designadas
como
AP
liases
e
não
AP
endonucleases.


 Na
figura
VII.10
estão
representadas
as
reações
descritas
acima.

MutY‐DNA‐glicosilase
(no
contexto
da
lesão
GO)
–
Sistema
GO


 A
 MutY‐DNA
 glicosilase
 é
 uma
 glicosilase
 de
 36
 kDa
 que
 catalisa
 a
 remoção
 de
 adenina,

independentemente
do
estado
de
metilação
do
DNA.
É
codificada
pelo
gene
mutY
(micA).
Células
deficientes

em
MutY
são
hipermutáveis,
gerando
transversões
G:C

T:A.


 O
 gene
 foi
 clonado
 e
 gera
 um
 polipeptídeo
 de
 39,1
 kDa
 cuja
 seqüência
 apresenta
 homologia
 com
 a

endonuclease
III,
produto
do
gene
nth
de
E.
coli
.


 A
 proteína
 MutY
 purificada
 é
 capaz
 de
 remover
 adenina
 do
 DNA
 contendo
 A:G
 ou
 A:C
 e
 tem
 associada

uma
atividade
3’AP
liase.


 A
proteína
evita
a
mutagênese
potencial
das
lesões
GO
(G:C
T:A)
que
escapam
do
reparo
da
FaPy,
já

que
esta
não
reconhece
eficientemente
GO
em
frente
a
A.


 Deve
 ser
 notado,
 entretanto,
 que
 os
 mutantes
 mutY
 somente
 conduzem
 ao
 aumento
 de
 mutações

espontâneas
G:C

T:A
presumivelmente
porque
as
MutSLH
eliminam
C:A
e
possivelmente
G:A,
tornando
o

papel
 de
 MutY
 redundante.
 A
 MutY
 é
 a
 única
 glicosilase
 que
 funciona
 na
 correção
 de
 erros
 de

emparelhamento
de
bases
normais.



 VII
 18






FIGURA
VII.10
–
Três
formas
de
incisão
de
sítios
abásicos
no
DNA.




Sistema
GO


 A
 lesão
 GO
 pode
 parear
 tanto
 com
 C
 como
 com
 A,
 de
 modo
 que
 o
 sistema
 GO
 está
 envolvido
 com
 a

atenuação
dos
efeitos
mutagênicos
desses
erros
de
emparalhamento.


 A
observação
de
que
tanto
mutantes
fpg/mutM
como
mutY
têm
aumento
da
freqüência
de
transversões

G:C
 
 T:A
 levou
 à
 conclusão
 que
 eles
 devem
 participar
 de
 um
 reparo
 comum.
 
 Em
 verdade,
 havia
 sido

mostrado
 que
 a
 proteína
 MutY
 é
 capaz
 de
 catalisar
 a
 remoção
 de
 A
 do
 par
 A:GO,
 um
 substrato
 que
 pode

aparecer
na
replicação
se
existirem
lesões
GO
no
DNA.

Além
disto,
a
proteína
MutY
permanece
ligada
ao
DNA

após
 a
 retirada
 da
 A
 do
 par
 A:GO,
 possivelmente
 protegendo
 o
 sítio
 GO
 contra
 o
 ataque
 da
 FaPy,
 evitando

quebras
duplas.


 A
 superexpressão
 do
 gene
 fpg/mutM
 corrige
 completamente
 o
 fenótipo
 mutante
 mutY.
 E
 o
 duplo

mutante
mutY
mutM
tem
uma
taxa
de
mutagênese
espontânea
que
é
20
vezes
maior
que
a
soma
das
taxas

dos
 dois
 mutantes
 isoladamente.
 
 Coletivamente
 estas
 observações
 levaram
 ao
 modelo
 de
 reparação
 das

lesões
GO
(Figura
VII.11).



 VII
 19




FIGURA
 VII.11
 –
 Esquema
 do
 modelo
 proposto
 para
 eliminação
 de
 8‐oxoG
 do
 DNA
 de
 E.
 coli:
 A)
 estrutura

química
da
base
8‐oxoG;
B)
atividade
DNA
glicosilase
de
reparo
das
enzimas
MutY
e
MutM
(Fpg)
removendo,

respectivamente,
Adeninas
incorretamente
emparelhadas
frente
a
8‐oxoG
e
8‐oxoG;
C)
atividadefosfatase
de

MutT
 removendo
 8‐oxoG
 do
 pool
 citoplasmático
 de
 nucleotídeos
 trifosfato
 e
 MutM
 e
 MutY
 corrigindo,

respectivamente,
8‐oxoG:C
e
8‐oxoG:A
durante
a
replicação
do
DNA.




 Se
 as
 lesões
 GO
 forem
 removidas
 pela
 FaPy
 antes
 da
 replicação,
 o
 reparo
 é
 efetuado
 pelo
 sistema
 de

excisão
 de
 bases
 normal.
 
 Se
 a
 lesão
 GO
 não
 é
 eliminada
 antes
 da
 replicação,
 e
 a
 replicação
 for
 acurada,

entrará
 citosina
 e
 a
 FaPy
 terá
 outra
 oportunidade
 de
 eliminar
 a
 lesão.
 
 Entretanto
 a
 replicação
 pode
 levar
 à

formação
do
par
A:GO.

A
excisão
de
A
pela
MutY
pode
iniciar
o
processo
de
excisão
da
hélice
não
lesada,
o

que
pode
conduzir
à
formação
do
par
C:GO,
que
é,
outra
vez,
sujeito
à
ação
da
FaPy
.


 Após
 a
 remoção
 da
 A
 pela
 MutY,
 o
 ataque
 a
 GO
 pela
 FaPy
 
 é
 bloqueado
 pela
 ligação
 de
 MutY
 ao
 DNA.


Resta
saber
como
o
sistema
de
excisão
de
bases
consegue
contornar
este
obstáculo
e
colocar
a
base
certa.




 Um
terceiro
elemento
no
sistema
GO
é
o
gene
mutT,
cujo
produto
não
é
uma
DNA
glicosilase.


 A
 inativação
 de
 mutT
 causa
 um
 aumento
 de
 até
 10.000
 vezes
 na
 mutagênese
 espontânea
 
 gerando

transversões
A:T

C:G.

A
proteína
codificada
por
mutT
é
pequena
(15
kDa),
tem
uma
fraca
atividade
GTPase

trifosfatase,
mas
é
cerca
de
1.000
vezes
mais
ativa
sobre
a
8‐oxo‐dGTP
(8‐oxo‐7,8‐dihidro‐2’‐dGTP),
originada

da
oxidação
de
dGTP.
Sua
ação
gera
8‐oxo‐GMP
que
não
é
incorporada
ao
DNA.


 A
inativação
de
mutT
leva
à
formação
de
A:GO
durante
a
replicação
e,
neste
caso,
a
proteína
MutY
conduz

à
 mutagênese
 A:T
 
 G:C.
 
 Em
 verdade
 foi
 verificado
 que
 o
 duplo
 mutante
 mutT
 mutY
 é
 menos
 mutável

espontaneamente
que
o
simples
mutante
mutT.


 Evidentemente
 a
 deficiência
 em
 proteínas
 MutY,
 MutT
 e
 FaPy
 acarreta
 alta
 taxa
 de
 mutagênese

espontânea,
devida
simplesmente
à
respiração
celular.


 Em
 seres
 humanos
 genes
 semelhantes
 a
 mutY,
 mutT
 e
 fpg/mutM
 já
 foram
 detectados
 e
 a
 não

funcionalidade
do
gene
fpg/mutM
humano
é
detectada
na
maioria
dos
cânceres
de
pulmão.

Em
células
humanas
o
sistema
GO
atua
de
maneira
semelhante
ao
descrito
para
E.
coli,
evitando
que
GO

(que
 pareia
 igualmente
 com
 A
 e
 C)
 conduza
 às
 transversões
 mutagênicas
 GCTA
 e
 ATCG.
 Além
 disto,
 o

sistema
GO
em
humanos
envolve
outros
sistemas
de
reparação
tais
como
BER,
MMR
e
NER,
como
pode
ser

vista
na
figura
VII.12.

 VII
 20




FIGURA
VII.12
–
Reparo
de
lesões
GO
em
mamíferos




A
proteína
MTH1
(
MTH
=
MutT
Homolog)
é
capaz
de
degradar
8‐oxo‐dGTP
assim
como
8‐oxo‐dATP
e
2

hidroxi‐dATP,
 gerando
 monofosfatos,
 que
 não
 são
 incorporados
 ao
 DNA.
 
 A
 localização
 de
 MTH1
 é
 ubíqua,

sendo
encontrada
no
núcleo,
citosol
e
mitocôndrias,
existindo
3
ou
4
variantes
(MTHa‐d)
nas
células.

Em
camundongos
mth‐/‐,
aumenta
muito
a
quantidade
de
tumores
espontâneos,
embora
as
transversões

ATCG
não
sejam
observadas
nesses
camundongos.
Entretanto
as
transversões
GCTA
aparecem
em
maior

número,
assim
como
inserções/deleções
de
1
base
em
microssatélites
de
mononucleotídeos.

A
segunda
linha
de
defesa
contra
a
lesão
GO
é
composta
de
diversas
DNA
glicosilases
que
são
capazes
de

remover
a
lesão
GO
do
DNA.

O
sistema
melhor
estudado
e
quantitativamente
dominante
é
a
OGG1
(
OGG
=

Oxo
 Guanine
 Glycolylase),
 também
 chamada
 MMH
 
 (
 MutM
 Homolog),
 que
 é
 a
 homóloga
 humana
 da


MutM/Fpg
de
E.
coli,
embora
a
homologia
ao
nível
de
aminoácidos
seja
muito
pequena.
Entretanto
é
muito

grande
com
a
de
leveduras
e
de
camundongos.

A
enzima
só
age
em
hélice
dupla
e
tem
alta
atividade
específica
para
GO
(ou
FaPyG)
emparelhados
com
C.


No
pareamento
com
A
foi
detectada
atividade
residual.

Mutações
no
gene
OGG1
assim
como
a
perda
de
heterozigose
neste
locus
foram
associadas
com
câncer

de
 pulmão,
 embora
 a
 freqüência
 dessas
 mutações
 seja
 muito
 pequena.
 
 Em
 tumores
 de
 rim
 aparecem
 mais

freqüentemente
 mutações
 em
 OGG1,
 embora
 mutações
 no
 gene
 VHL,
 um
 supressor
 localizado
 ao
 lado
 de

OGG1
sejam
muito
mais
importantes
para
o
aparecimento
destes
carcinomas.

O
 gene
 humano
 OGG1
 codifica
 duas
 isoformas
 da
 enzima
 α‐OGG1
 e
 β‐OGG1,
 resultantes
 de
 “splicing”

alternativo
 de
 mRNA
 e
 as
 duas
 isoformas
 têm
 sinalização
 mitocondrial,
 entretanto,
 somente
 α‐OGG1
 tem

sinalização
nuclear.

Recentemente
ortólogos
humanos
da
família
de
proteínas
Fpg/Nei
foram
detectados
e
designados
NEIL1‐
3
 (NEIL
 =
 da
 família
 Fpg?Nei).
 Estas
 proteínas
 mostraram‐se
 ativas
 em
 pirimidinas
 oxidadas
 como
 substrato.

Entretanto
NEIL1
mostrou
também
grande
capacidade
para
a
remoção
de
GO
do
par
GO:C
(cerca
de
10%)
de

OGG1.

 VII
 21

Em
células
humanas
ainda
não
se
detectaram
enzimas
para
a
remoção
de
GO
do
par
GO:A.
Entretanto,

em
leveduras,
a
proteína
Ogg2
(Ntg1)
tem
preferência
maior
para
GO:A
do
que
para
GO:C.

Em
células
HeLa

uma
proteína
com
as
mesmas
características
também
já
foi
identificada
e,
sua
atividade
é
diferente
de
NEIL1.


Adicionalmente
NEIL1
catalisa
β/δ‐eliminação
enquanto
OGG2
catalisa
somente
β‐eliminação.

As
células
de
mamíferos
estão
equipadas
com
uma
terceira
linha
de
defesa,
que
consiste
na
retirada
de
A

erroneamente
 incorporada
 em
 frente
 a
 GO.
 
 É
 a
 função
 de
 MYH
 (MutY
 Homolog),
 uma
 DNA
 glicosilase

específica
 para
 DNA
 em
 hélice
 dupla
 que
 retira
 A
 ou
 2‐hidroxiadenina
 (2‐OH‐A)
 erroneamente
 incorporadas

em
frente
a
G
ou
GO.

A
deficiência
de
MYH
é
associada
ao
aumento
de
mutações
somáticas
(transversões
GCTA)
em
tumores

coloretais.

MYH
 é
 regulada
 pelo
 ciclo
 celular,
 aparecendo
 em
 níveis
 máximos
 na
 fase
 S
 e
 co‐localiza
 com
 PCNA
 e

também
interage
com
RPA
(Replication
Protein
A),
sugerindo
uma
ação
imediata
após
a
ação
do
sistema
BER,

como
foi
observado
para
UNG2
e
é
também
relacionada
com
a
reparação
dependente
de
PCNA,
portanto
com

o
BER
de
longos
fragmentos
(Figura
VII.12)



Dímero
de
pirimidina‐DNA‐glicosilase
(DP‐DNA‐glicosilase)

Certos
 organismos
 possuem
 DNA
 glicosilases
 com
 atividades
 AP
 liases
 associadas
 que
 reconhecem

dímeros
de
pirimidinas
no
DNA.

A
UV‐endonuclease
de
Micrococcus
luteus
e
a
UV‐endonuclease
do
fago
T4,

codificada
pelo
gene
denV,
encontrada
em
bactérias
infectadas
são
exemplos
deste
tipo
de
enzimas.


 Estas
 enzimas
 reconhecem
 os
 dímeros
 e
 cortam
 a
 ligação
 glicosídica
 na
 posição
 5'
 do
 dímero.

Posteriormente,
cortam
a
ligação
fosfodiéster,
deixando
uma
terminação
3'PO4.
Esta
terminação
é
removida

pelas
AP
endonucleases

e
a
DNA
polimerase
I
e
DNA
ligase
completam
a
reparação.


 A
T4‐DP‐DNA‐glicosilase
(18
kDa)
é
absolutamente
específica
para
dímeros
de
pirimidina.

Em
sua
ação
AP

liase
ela
deixa
sempre
terminais
5’
(Figura
VII.13).

A
fotorreativação
libera
timina
o
que
comprova
a
ação
DNA

glicosilase.
A
de
M.
luteus
também
tem
18
kDa
e
age
da
mesma
maneira.


 É
 interessante
 salientar
 que
 estas
 endonucleases
 podem
 substituir
 deficiências
 de
 excisão
 em
 E.
 coli


assim
como
em
células
de
mamíferos,
entretanto
o
DNA
do
gene
denV
não
hibridiza
com
o
DNA
total
do
M.

luteus.




FIGURA
VII.13
–
Esquema
proposto
para
o
mecanismo
de
eliminação
de
dímeros
pela
PD‐DNA
glicosilase
do

bacteriófago
T4
(endo).

 VII
 22



DNA
endonuclease
III
(Timina
Glicol
DNA
glicosilase
ou
TG‐DNA
glicosilase)


 Esta
 enzima,
 designada
 endonuclease
 III,
 foi
 purificada
 e
 mostrou
 ser
 uma
 DNA
 glicosilase/AP
 liase
 (β‐
eliminação)
 que
 ataca
 lesões
 de
 pirimidinas,
 mas
 não
 os
 dímeros
 ou
 adutos
 6‐4.
 Ela
 recebeu
 numerosas

designações:
 timina
 glicol‐DNA
 glicosilase,
 uréia‐DNA
 glicosilase,
 endonuclease
 de
 raios
 X,
 endonuclease
 de

raios
gama,
redoxiendonuclease
e
simplesmente
endonuclease.



 Ela
é
capaz
de
reconhecer
resíduos
de
pirimidina
tais
como:
timina
glicol,
5,6‐dihidrotimina,
uréia,
ácido

beta‐ureidoisobutirico,
 5‐hidroxi‐6‐hidrotimina,
 uracil
 glicol,
 5,6‐dihidrouracil
 e
 5‐hidroxi‐6‐hidrouracil,
 5‐
hidroxi‐2‐deoxicitidina
e
5‐hidroxi‐2’‐deoxiuridina
entre
outros,
como
substrato.
Recentemente
foi
reportado

que
a
endonuclease
III
também
ataca
resíduos
de
guanina
no
DNA
lesado
por
agentes
oxidantes.


 A
enzima
é
codificada
pelo
gene
nth
(“endonuclease
three”)
e
tem
23,4
kDa.
Ela
tem
um
núcleo
Fe‐S
que

se
liga
ao
DNA,
conhecido
como
“dedo
de
zinco
primitivo”,
e
parece
ser
um
novo
domínio
que
aparentemente

também
existe
na
proteína
MutY.


 Embora
 a
 maioria
 das
 bases
 reparadas
 pela
 endonuclease
 III
 in
 vitro
 seja
 formada
 como
 resultado
 da

radiação
 ou
 oxidação,
 os
 mutantes
 nth
 não
 são
 mais
 sensíveis
 que
 as
 cepas
 selvagens
 ao
 peróxido
 de

hidrogênio
ou
à
radiação
ionizante.

Entretanto,
a
deficiência
neste
gene
em
E.
coli
leva
a
um
grande
número

de
 mutações
 espontâneas,
 mostrando
 a
 existência
 de
 lesões
 mutagênicas
 não
 reparadas
 produzidas
 por

agentes
endógenos.



Endonuclease
VIII


 A
endonuclease
VIII
foi
purificada
em
mutantes
deficientes
em
endonuclease
III
e
mostrou
uma
atividade

TG‐DNA
glicosilase
assim
como
atividade
AP
liase.

O
gene
(nei)
foi
isolado
e
codifica
uma
proteína
similar
à

endonuclease
 III,
 exceto
 que
 ela
 tem
 atividade
 β,
 δ
 liase
 em
 vez
 de
 somente
 β.
 
 Todos
 os
 substratos
 para

endonuclease
III
são
também
para
endonuclease
VIII,
embora
ela
contribua
com
menos
de
10%
da
atividade

de
reparação
e
não
é
claro
por
que
a
E.
coli
teria
esta
enzima
redundante.


 A
 endonuclease
 III
 humana
 ainda
 não
 foi
 purificada
 completamente,
 entretanto,
 duas
 enzimas,
 UV

endonuclease
 I
 de
 43
 kDa
 e
 II
 de
 28
 kDa,
 de
 ratos,
 
 foram
 purificadas
 e
 são
 homólogas
 funcionais
 da

endonuclease
III.

Estas
enzimas,
assim
como
as
humanas,
também
clivam
sítios
AP
pós
β‐eliminação.

Não
se

conhece
doença
humana
ou
modelo
animal
associado
com
a
deficiência
em
endonuclease
III.



FaPy
glicosilase/
Fpg/MutM‐DNA‐glicosilase
/8‐hidroxiguanina‐DNA
glicosilase



 A
 7‐metil‐guanina
 é
 a
 mais
 abundante
 lesão
 produzida
 por
 agentes
 metilantes.
 
 Este
 aduto
 não
 é
 letal,

mas
 a
 metilação
 pode
 levar
 à
 abertura
 do
 anel
 imidazol
 conduzindo
 à
 formação
 de
 2,6‐diamino‐4‐hidroxi‐5‐
(metil)formamidopirimidina
(FaPy),
que
inibe
a
replicação,
podendo
ser
letal.



 Em
E.
coli,
a
glicosilase
Fpg/MutM
(formamidopirimidina‐DNA‐
glicosilase
ou
FaPy
glicosilase),
codificada

pelo
 gene
 fpg/mutM
 elimina
 esta
 base
 lesada,
 sendo
 também
 capaz
 de
 eliminar
 a
 4,6‐diamino‐5‐
formamidopirimidina
gerada
pela
irradiação
com
raios
X
ou
γ

e
por
tratamentos
com
agentes
oxidantes
como

o
 peróxido
 de
 hidrogênio.
 
 Estudos
 subseqüentes
 mostraram
 que
 a
 FaPy
 e
 outra
 enzima
 (8‐hidroxiguanina

endonuclease
ou
8‐oxoG‐DNA
glicosilase),
que
reconhece
8‐hidroxiguanina
(ou
GO)
no
DNA
eram
idênticas.


 O
gene
fpg/mutM
foi
clonado
e
a
proteína
gerada
(31
kDa)
só
age
no
DNA
em
hélice
dupla.


 Os
 mutantes
 fpg/mutM,
 embora
 não
 sejam
 sensíveis
 às
 radiações
 ionizantes
 ou
 agentes
 alquilantes,

demonstram
uma
taxa
um
pouco
elevada
de
mutagênese
espontânea
(transversão
G:C

T:A).


 A
 glicosilase
 Fpg/MutM
 difere
 das
 demais,
 já
 que
 tem
 uma
 AP
 liase
 classe
 I
 associada,
 que
 faz
 β,δ‐
eliminação
 e
 uma
 atividade
 desoxirribofosfodiesterase
 (dRPase).
 Assim,
 a
 FaPy
 
 mesmo
 tendo
 muitas
 ações

não
consegue
liberar
a
base,
clivar
a
cadeia
e
processar
os
terminais
para
a
síntese
de
reparação,
já
que
deixa

um
terminal
3’PO4,
que
necessita
uma
3’–diesterase
para
sua
remoção.

A
ação
de
FaPy
forma
uma
base
de

Schiff
intermediária,
um
mecanismo
idêntico
ao
descrito
para
a
endonuclease
III.

O
significado
biológico
para

as
atividades
AP
liase
e
dRPase
associadas
a
FaPy
ainda
não
é
conhecido.

 VII
 23


 Além
 das
 lesões
 citadas,
 recentemente
 foi
 mostrado
 que
 a
 FaPy
 também
 é
 capaz
 de
 reconhecer
 5‐
hidroxicitosina,
5‐hidroxiuracil
e
anéis
imidazol
abertos
contendo
aminofluoreno
ou
aflatoxina.


 Uma
das
mais
abundantes
lesões
induzidas
no
DNA
pelas
radiações
ionizantes
e
estresses
oxidativos
é
a

7,8‐dihidro‐o‐oxoguanina
 (GO).
 
 A
 8‐oxoG‐DNA
 glicosilase
 foi
 primeiro
 identificada
 em
 E.
 coli
 como
 uma

atividade
que
liberava
formamido
pirimidinas
(geradas
como
produtos
secundários
de
purinas
alquiladas)
do

DNA.
 A
 enzima
 foi
 denominada
 FaPy
 e
 o
 gene
 fpg/mutM
 foi
 clonado.
 
 Mais
 tarde
 foi
 detectado
 que
 ela
 é
 a

enzima
responsável
pela
eliminação
de
GO
no
DNA
de
E.
coli
e
de
células
de
mamíferos.


 Esta
lesão,
a
GO,
é
uma
fonte
importante
de
mutações
espontâneas
e
a
expressão
do
gene
fpg/mutM
de

E.
 coli
 em
 células
 de
 mamíferos
 protege‐as
 contra
 a
 mutagênese
 induzida
 pelos
 raios
 X.
 
 Isto
 pode
 explicar

porque
 tanto
 em
 procariotos
 como
 em
 eucariotos
 existem
 quatro
 mecanismos
 para
 a
 eliminação
 de
 GO:
 a)

Uma
 8‐oxoGTPase
 (MTH)
 (MutT
 Homolog),
 que
 hidrolisa
 8‐oxodGTP
 do
 “pool”
 de
 nucleotídeos,
 gerando
 8‐
oxodGMP,
impedindo
sua
incorporação
no
DNA;
b)
A
8‐oxoG
DNA
glicosilase
que
remove
a
base
oxidada
do

DNA;
c)
A
metil
purina‐DNA
glicosilase
(MPG),
que
remove
GO
por
ação
glicosídica
e
d)
Uma
DNA
glicosilase,

MutY
em
E.
coli
e
MYH
em
humanos
que
remove
o
resíduo
adenina
do
par
GO:A.

A
lesão
GO
pareia
com
A
em
alta
freqüência
e
embora
o
par
GO:C
seja

um
bom
substrato
para
a
DNA

glicosilase,
o
par
GO:A
não
é.

Além
disto,
a
DNA
glicosilase
MYH
ajuda
a
reparação
da
lesão
GO
indiretamente,

iniciando
uma
reação
de
reparo
que
converte
GO:A
em
GO:C.


 A
 Fpg/MutM
 de
 E.
 coli
 é
 um
 monômero
 de
 30
 kDa
 e
 tem
 um
 “dedo
 de
 zinco”,
 responsável
 pela
 sua

afinidade
pelo
DNA.

A
enzima
libera
a
base
por
uma
ação
glicosídica
e
então
o
sítio
AP
é
clivado
por
β
e
δ‐
eliminação.

A
enzima
humana
também
libera
a
base
e
a
desoxirribose
em
uma
reação
em
duas
etapas.


 Quando
o
cDNA
do
gene
MTH
é
expresso
em
mutantes
mutT
de
E.
coli
verifica‐se
aumento
significativo
de

atividade
 8‐oxo‐dGTPase,
 e
 grande
 diminuição
 da
 mutagênese
 espontânea,
 característica
 destas
 cepas.
 A

proteína
codificada
tem
156
aminoácidos
e
homologia
com
a
proteína
MutT
de
E.
coli.


 O
gene
MYH
contém
15
introns
e
7,1
kb.

Os
16
exons
codificam
uma
proteína
(MYH)
de
535
aminoácidos

(65
kDa),
com
41%
de
identidade
com
a
proteína
MutY
de
E.
coli.
O
gene
humano
mapeia
no
cromossomo
1,

entre
p32.1
e
p34.3.


 Em
células
humanas
a
proteína
homóloga
de
FaPy
foi
denominada
OGG1,
entretanto
ela
tem
muito
pouca

homologia
com
a
proteína
bacteriana.
O
gene
OGG1
foi
localizado
no
cromossomo
3

entre
p25
e
p26,
em
uma

região
 comumente
 deletada
 em
 cânceres
 de
 pulmão.
 
 Ele
 pode,
 possivelmente,
 funcionar
 como
 um
 gene

humano
 supressor
 de
 tumores
 e
 a
 perda
 parcial
 ou
 total
 das
 proteínas
 humanas
 OGG1
 pode
 predispor
 as

células
para
a
transformação
oncogênica,
como
visto
anteriormente.



AP
ENDONUCLEASES

Os
sítios
AP
podem
aparecer
espontaneamente
pela
hidrólise
da
ligação
glicosídica
e,
diversos
estudos

estimaram
 que
 mais
 de
 25.000
 sítios
 AP
 são
 gerados
 por
 dia
 por
 célula
 humana
 em
 condições
 fisiológicas

normais.


 Um
 mecanismo
 alternativo
 para
 a
 incisão
 do
 DNA
 durante
 o
 reparo
 por
 excisão
 de
 bases
 pode
 ser
 a

hidrólise
 das
 ligações
 glicosídicas
 seguida
 da
 hidrólise
 da
 ligação
 fosfodiéster
 catalisada
 por
 uma
 5’
 AP

endonuclease
deixando
terminais
3’OH
e
5’PO4,
portanto,
as
AP
liases
in
vivo
devem
ter
um
papel
secundário

na
incisão
do
DNA
nos
sítios
AP.


 As
 AP
 endonucleases
 clivam
 as
 ligações
 fosfodiéster
 
 adjacentes
 aos
 sítios
 AP.
 
 As
 enzimas
 da
 classe
 I

clivam
 a
 ligação
 3’,
 e
 as
 de
 classe
 II
 clivam
 a
 ligação
 5’
 do
 açúcar
 abásico.
 
 Todas
 as
 enzimas
 de
 classe
 I

conhecidas
são
glicosilases
com
AP
liases
associadas.
As
de
classe
II
não
têm
AP
glicosilases
associadas
e
são
as

“verdadeiras”
AP
endonucleases.



AP
endonucleases
em
E.
coli


 VII
 24

Exonuclease
III


 A
 exonuclease
 III
 foi
 caracterizada
 como
 uma
 3’
 →
 5’
 exonuclease
 (necessita
 de
 terminal
 3’OH
 e
 dupla

hélice)
com
uma
atividade
fosfatase
associada.


 Além
 destas
 ações
 ela
 também
 degrada
 copolímeros
 mistos
 de
 ribo
 e
 deoxiribonucleotídeos,
 o
 que

corresponde
 a
 uma
 atividade
 RNaseH.
 
 A
 exonuclease
 III
 tem
 também
 uma
 atividade
 fosfodiesterase
 que

remove
resíduos
3’‐fosfoglicolato
do
DNA.

Esta
atividade
pode
também
remover
os
resíduos
aldeído
3’
α,
β

insaturados
 gerados
 após
 a
 β‐eliminação
 nos
 sítios
 AP.
 
 Isto
 pode
 ser
 mostrado
 pois
 a
 exonuclease
 III
 pode

ativar
o
DNA
incisado
pela
AP
liase
da
endonuclease
III
para
servir
de
“primer‐template”
para
a
PolI
de
E.
coli.


 Além
disto
a
enzima
também
tem
uma

atividade
5’
AP
endonuclease,
que
antes
de
ser
caracterizada
foi

denominada
de
endonuclease
II
e
também
endonuclease
VI.


 A
 exonuclease
 III,
 produto
 do
 gene
 xthA,
 é
 uma
 proteína
 de
 28
 kDa
 e
 a
 atividade
 endonuclease
 tem

necessidade
absoluta
de
Mg2+
e
é
inibida
em
presença
de
EDTA.
A
enzima
catalisa
a
hidrólise,
em
hélice
dupla,

de
sítios
AP
no
lado
5’
da
perda
da
base
deixando
terminais
3’OH
e
5’dRPO4.


 A
 presença
 de
 diversas
 funções
 catalíticas
 associadas
 a
 uma
 pequena
 proteína
 sugerem
 que
 um
 único

sitio
ativo
catalise
todas
as
reações
enzimáticas
da
exonuclease
III,
através
de
três
importantes
domínios
em

sua
estrutura.

Um
é
o
sítio
ativo
que
catalisa

a
clivagem
das
ligações
fosfodiéster
em
uma
das
hélices
do
DNA.


O
 segundo
 reconhece
 a
 estrutura
 de
 dupla
 hélice
 e
 o
 terceiro
 reconheceria
 o
 espaço
 deixado
 pela
 base

retirada,
facilitando
a
função
AP
endonuclease.


 O
 papel
 biológico
 da
 atividade
 AP
 endonuclease
 da
 exonuclease
 III
 ainda
 não
 é
 claro,
 mas
 os
 mutantes

xthA
 são
 sensíveis
 ao
 peróxido
 de
 hidrogênio
 e
 às
 radiações
 UV
 longas
 que
 produzem
 lesões
 oxidativas
 no

DNA.


 A
 natureza
 das
 lesões
 responsáveis
 por
 tal
 fenótipo
 não
 é
 conhecida,
 mas,
 os
 radicais
 livres
 produzidos

pelo
 peróxido
 de
 hidrogênio
 podem
 gerar
 quebras
 simples
 com
 terminais
 3’PO4
 e
 a
 exonuclease
 III
 é

responsável
por
mais
de
99%
da
atividade
3’‐fosfatase
em
E.
coli.

Além
disto,
a
exonuclease
III
também
ataca

DNA
contendo
produtos
de
fragmentação
de
timina
como
resíduos
de
uréia,
sugerindo
que
esta
enzima
tem

um
papel
no
reparo
de
lesões
oxidativas.


 Mutações
 no
 gene
 katF
 (rpoS),
 também
 resultam
 em
 sensibilidade
 aumentada
 à
 radiação
 UV
 longo
 e

peróxido
 de
 hidrogênio.
 Este
 gene
 codifica
 o
 fator
 sigma
 (σ
 )
 e
 a
 sua
 deficiência
 elimina
 a
 expressão
 da

exonuclease
III,
sugerindo
de
o
gene
xthA
seja
regulado
por
katF.



Endonuclease
IV

A
 endonuclease
 IV
 foi
 identificada
 como
 uma
 AP
 endonuclease
 resistente
 a
 EDTA.
 Entretanto,
 em

ausência
do
substrato
(DNA),
a
endonuclease
IV
pode
ser
inativada
por
pré‐incubação
com
agentes
quelantes

de
metais,
tais
como:
EDTA
ou
1,10‐fenantrolina,
sugerindo
que
a
enzima
contém
um
componente
metálico

essencial.


 Parecida
com
a
atividade
da
exonuclease
III,
a
endonuclease
IV
ataca
as
ligações
fosfodiéster
no
lado
5’
da

perda
 da
 base,
 deixando
 grupos
 3’OH.
 
 Adicionalmente
 ela
 também
 pode
 remover
 fosfoglicoaldeído,
 3’‐
fosfato,
desoxirribose‐5‐fosfato
e
resíduos
4‐hidroxi‐2‐pentenal
do
terminal
3’
do
DNA
dupla
fita.
Ela
também

tem
uma
ação
contra
resíduos
de
uréia.

Em
verdade,
a
única
diferença
é
que
a
exonuclease
III
tem
uma
ação

3’‐exonuclease
que
não
está
presente
na
endonuclease
IV.


 O
gene
que
codifica
a
endonuclease
IV
é
o
nfo
(“endonuclease
four”),
e
a
proteína
tem
31,6
kDa.


 Os
mutantes
deficientes
em
endonuclease
IV
são
sensíveis
a
MMS,
mitomicina
C
e
aos
agentes
oxidantes

tert‐butil
 hidroperóxido
 e
 bleomicina.
 
 Em
 mutantes
 duplos
 nfo
 xthA
 a
 sensibilidade
 a
 estes
 agentes
 e
 às

radiações
 ionizantes
 é
 aumentada.
 
 Os
 mutantes
 nfo
 são
 mais
 sensíveis
 ao
 tert‐butil
 hidroperóxido
 e
 à

bleomicina
que
os
mutantes
xthA
sugerindo
que
a
endonuclease
IV
pode
reconhecer
algumas
lesões
que
não

são
reconhecidas
pela
exonuclease
III.

Em
verdade,
recentemente,
foi
detectado
que
a
bleomicina
gera
uma

lesão
específica
no
DNA
que
requer
a
endonuclease
IV
para
um
reparo
eficiente.

 VII
 25


 Agentes
 químicos
 como
 paraquat
 e
 menadiona,
 que
 são
 reduzidos
 enzimaticamente
 in
 vivo
 via

transferência
de
um
elétron
e
então
autooxidados
gerando
radicais
superóxido,
induzem
aumento
de
10
a
20

vezes
 no
 nível
 de
 endonuclease
 IV.
 A
 endonuclease
 IV
 também
 é
 induzida
 quando
 as
 células
 deficientes
 em

superóxido
dismutase
são
cultivadas
em
presença
de
oxigênio
puro,
e
esta
indução
é
independente
do
gene

oxyR
que
controla
o
regulon
de
estresse
oxidativo
induzido
por
peróxido.


 A
 endonuclease
 IV
 está
 presente
 nas
 células
 em
 níveis
 dez
 vezes
 menores
 que
 a
 exonuclease
 III,

entretanto
chega
a
níveis
equivalentes
à
exonuclease
III
após
tratamento
das
células
com
agentes
que
geram

superóxido
ou
pelo
oxido
nítrico,
que
ativam
o
regulon
SoxRS.


 Na
 figura
 VII.14
 estão
 representadas
 as
 diferentes
 vias
 de
 cortes
 do
 DNA
 pelas
 AP
 liases
 e
 AP

endonucleases.






FIGURA
VII.14
–
Esquema
do
modelo
proposto
para
as
formas
de
corte
na
cadeia
de
DNA
nas
diferentes
vias

de
 excisão
 de
 bases:
 hidrólise
 da
 ligação
 N‐glicosídica
 pelas
 DNA
 glicosilases;
 atividade

desoxirribofosfodiesterase
das
AP‐endonucleases
e
atividade
de
β‐eliminação
das
AP‐liases.





 Recentemente
 foi
 detectado
 que
 a
 endonuclease
 IV
 também
 é
 capaz
 de
 clivar
 o
 DNA
 do
 lado
 5’
 de

algumas
 pirimidinas
 oxidadas,
 independentemente
 da
 ação
 das
 glicosilases,
 mecanismo
 denominado
 de

reparo
por
incisão
de
nucleotídeos.



AP
endonucleases
em
eucariotos


 As
 AP
 endonucleases
 clivam
 as
 ligações
 fosfodiéster
 adjacentes
 aos
 sítios
 AP.
 
 As
 enzimas
 da
 classe
 I

clivam
 a
 ligação
 3’,
 e
 as
 de
 classe
 II
 clivam
 a
 ligação
 5’
 do
 açúcar
 abásico.
 
 Todas
 as
 enzimas
 de
 classe
 I

conhecidas
são
DNA
glicosilases/AP
liases.
As
de
classe
II
não
têm
atividades
AP
glicosilases
associadas.


 Em
 E.
 coli
 existem
 duas
 AP
 endonucleases
 de
 classe
 II
 bem
 caracterizadas,
 a
 exonuclease
 III
 e
 a

endonuclease
 IV.
 
 A
 exonuclease
 III,
 como
 o
 próprio
 nome
 indica
 tem
 uma
 potente
 atividade
 3’→5’

exonuclease
 específica
 para
 DNA
 em
 hélice
 dupla.
 
 A
 endonuclease
 IV
 não
 tem
 outra
 atividade
 conhecida,

além
de
AP
endonuclease.

 VII
 26


 Em
eucariotos
há
uma
dicotomia:
em
leveduras
existem
duas
AP
endonucleases
(Apn1
e
Apn2)
que
são

estruturalmente
 e
 funcionalmente
 semelhantes
 à
 endonuclease
 IV,
 enquanto
 em
 Drosófila
 e
 em
 humanos

existe
uma
endonuclease
estrutural
e
funcionalmente
homóloga
à
exonuclease
III.


 Os
sítios
AP
bloqueiam
a
transcrição
e
a
replicação
sendo,
portanto,
citotóxicos
e
altamente
mutagênicos.


As
 AP
 endonucleases
 realizam
 duas
 funções:
 elas
 eliminam
 os
 sítios
 AP
 gerados
 pelas
 DNA
 glicosilases,
 ou

perda
espontânea
de
bases
(depurinações
que
ocorrem
com
alta
freqüência),
posteriormente,
elas
“limpam”

os
 terminais
 3’
 das
 quebras
 geradas
 por
 espécies
 ativas
 de
 oxigênio
 e
 radiações
 ionizantes.
 
 Tais
 quebras,

normalmente
deixam
3’‐fosfoglicolato
ou
3’‐fosfato.

As
AP
endonucleases
de
classe
II
eliminam
essas
espécies

gerando
um
terminal
3’‐OH
que
pode
ser
usado
pela
DNA
polimerase.


 A
AP
endonuclease
humana
(APE
=
AP
Endonuclease,
HAP1,
APEX,
REF1)
é
um
monômero
de
36
kDa,
com

um
 alto
 grau
 de
 identidade
 com
 a
 exonuclease
 III
 de
 E.
 coli
 e
 em
 adição
 à
 atividade
 5’AP
 endonuclease
 ela

também
 tem
 uma
 atividade
 3’→5’
 exonuclease
 específica
 para
 DNA
 em
 hélice
 dupla.
 
 Sua
 atividade

exonucleásica
é
menor
do
que
a
de
E.
coli.


 A
enzima
humana
tem
uma
função
adicional.

Ela
reduz
e
portanto
ativa
os
fatores
de
transcrição
FOS
e

JUN
 através
 do
 resíduo
 de
 cisteína
 na
 metade
 N‐terminal
 da
 APE,
 daí
 o
 nome
 fator
 de
 redução
 1
 (REF1).
 
 A

enzima
bacteriana
não
pode
substituir
esta
função.


 Não
se
conhece
doença
humana
associada
a
mutações
neste
gene.


 O
 gene
 HAP1
 
 (HAP
 =
 Human
 AP)
 é
 constituído
 por
 5
 exons
 e
 mapeia
 no
 cromossoma
 14q11.2‐12.
 
 A

seqüência
de
aminoácidos
da
proteína
tem
homologia
com
a
exonuclease
III
de
E.
coli,
BAP1
de
bovinos,
APEX


de
camundongos
e
RRP1
de
Drosófila.

Mutantes
duplos
dut
xth(Ts)
de
E.
coli,

inviáveis
a
420C
por
serem
incapazes
de
reparar
sítios
AP
causados

pela
excisão
de
uracil,
podem
ser
recuperados
pelo
gene
HAP1
humano.

Entretanto,
HAP1
não
complementa

nenhum
dos
fenótipos
de
mutantes
nfo.


 O
polipeptídeo
codificado
por
HAP1
mostrou
ser
o
mesmo
da
proteína
regulatória
nuclear
chamada
REF1,

um
fator
redox
que
se
acredita
regular
o
fator
de
transcrição
AP1
do
heterodímero
Fos‐Jun
através
da
redução

de
um
resíduo
de
cisteína
localizado
no
domínio
de
ligação
ao
DNA.

O
domínio
N‐terminal
de
61
aminoácidos

da
proteína
humana
que
não
é
conservado
nos
outros
organismos
e
que
também
é
dispensável
para
a
função

AP
endonuclease,
é
essencial
para
a
atividade
de
ligação
ao
DNA
da
proteína
JUN
oxidada.



EVENTOS
PÓS‐INCISÃO

DNA
desoxiribofosfodiesterase
de
E.
coli.


 Para
completar
a
excisão
o
processo
requer
a
remoção
do
resíduo
5’‐desoxirribose
fosfato.

Em
E.
coli
foi

detectada
 uma
 proteína
 designada
 DNA‐desoxirribofosfodisterase
 (dRPase)
 de
 50‐55
 kDa
 que
 cliva
 por

hidrólise
o
2‐desoxirribo‐5’‐fosfato.


 Preparações
altamente
purificadas
de
dRPase
parecem
ser
idênticas
ao
produto
do
gene
recJ
de
E.
coli,

um
gene
implicado
no
reparo
recombinacional
e
na
correção
de
erros
de
emparelhamento,
com
uma
atividade

exonuclease
5’
→
3’
para
hélice
simples.


 A
 ação
 combinada
 de
 DNA
 glicosilases,
 AP
 endonucleases
 e
 dRPase
 deve
 deixar
 uma
 lacuna
 de
 um

nucleotídeo
no
DNA
que
pode
ser
fechado
por
uma
das
DNA
polimerases.


 Em
verdade,
quando
oligonucleotídeos
contendo
um
simples
resíduo
dUMP
são
incubados
com
extratos

de
E.
coli
ou
células
humanas
o
tamanho
do
evento
de
reparo
é
de
um
nucleotídeo.


 No
caso
das
terminações
deixadas
pela
Endonuclease
III,
aparentemente
tanto
a
PolI
como
a
PolIII,
com

sua
 ação
 5’→3’
 exonuclease
 são
 capazes
 de
 realizar
 o
 término
 da
 reparação,
 e
 talvez
 por
 isso
 o
 fago
 T4

irradiado
 com
 UV
 tenha
 uma
 sobrevivência
 reduzida
 em
 hospedeiras
 deficientes
 em
 PolI
 comparada
 com
 a

obtida
na
cepa
selvagem.


 Células
 de
 mamíferos
 contêm
 N‐glicosilases
 e
 AP‐endonucleases,
 que
 parecem
 atuar
 por
 mecanismos

análogos
aos
observados
em
E.
coli;
da
mesma
forma,
uma
insertase
para
purinas
já
foi
isolada
destas
células
e

 VII
 27

uma
dRPase
também
foi
parcialmente
purificada
de
células
humanas.

Ela

tem
massa
molecular
de
47kDa
e

está
localizada
no
núcleo.



Síntese
de
reparo


DNA
polimerase
I
de
E.
coli
(PolI)



 É
uma
proteína
com
109
kDa,
produto
do
gene
polA,
que
tem
funções
catalíticas
para
polimerização
do

DNA
 na
 direção
 5’→3’,
 pirofosforólise,
 troca
 PPi,
 degradação
 exonucleolítica
 3’→5’
 e
 degradação

exonucleolítica
5’→3’.

Ela
tem
uma
propriedade
única
que
é
a
capacidade
promover
a
replicação
a
partir
de

uma
 incisão,
 sem
 necessidade
 de
 outras
 proteínas,
 e
 sua
 atividade
 exonucleolítica
 5’→3’
 pode
 excisar

fragmentos
 contendo
 mais
 de
 10
 nucleotídeos.
 Além
 disto,
 um
 ciclo
 de
 aproximadamente
 20
 etapas
 de

polimerização
ocorre
antes
que
a
enzima
se
dissocie
lentamente
da
fita
molde.


 Na
digestão
proteolítica
da
PolI
são
detectados
dois
fragmentos:
o
Klenow
(carboxi
terminal)
que
contém

a
 função
 editorial
 3’→5’
 
 e
 o
 pequeno
 fragmento
 que
 possui
 a
 atividade
 exonuclease
 5’→3’
 envolvida
 na

degradação
 da
 porção
 do
 RNA
 dos
 fragmentos
 de
 Okazaki
 e
 separação
 da
 hélice
 5’
 durante
 a
 translação
 de

quebras.


 A
abundância
relativa
de
PolI
(200‐400
moléculas/célula)
comparada
com
a
PolII
(40
moléculas/célula)
e

PolIII
(10‐20
moléculas/célula)
também
sugere
um
papel
da
PolI
I
na
síntese
de
reparo.

No
entanto,
todas
as

polimerases
 são
 capazes
 de
 funcionar
 in
 vivo
 e
 in
 vitro
 no
 DNA
 com
 lacunas
 criadas
 pelo
 sistema

endonucleolítico
UvrABC
(ver
adiante).



DNA
polimerase
II
de
E.
coli
(PolII)



 Esta
 enzima,
 produto
 do
 gene
 polB
 (90
 kDa),
 não
 tem
 atividade
 exonucleásica
 5’→3’,
 necessitando
 de

lacunas
de
perto
de
100
nucleotídeos
para
sua
ação.


 O
gene
clonado
de
polB
mostrou
ser
o
dinA,
um
dos
diversos
genes
sob
controle
do
regulon
SOS
recA/lexA

(Ver
adiante).



DNA
polimerase
III
de
E.
coli
(PolIII)



 A
DNA
polimerase
III
é
um
dímero
com
dois
complexos
multiprotéicos
com
10
subunidades
diferentes
e

tem
atividades
exonuclease
3’→5’
e
5’→3’.


 A
DNA
polimerase
III
não
consegue
degradar
dinucleotídeos
e
requer
um
substrato
em
hélice
simples
para

sua
ação
exonucleásica
5’→3’.


 Uma
forma
pequena
da
subunidade
β
da
PolIII(β*)
é
sintetizada
em
resposta
à
radiação
UV
e
este
fator

pode
 agir
 como
 uma
 unidade
 alternativa
 da
 DNA
 polimerase
 III
 durante
 a
 síntese
 com
 erros.
 
 A
 DNA

polimerase
III
é
necessária
para
o
reparo
correto
das
lesões
de
H2O2
e
MMS.



DNA
ligase
de
E.
coli


 Para
 que
 a
 reparação
 se
 complete,
 a
 DNA
 polimerase
 I
 insere
 alguns
 nucleotídeos
 (10
 a
 20)
 na
 lacuna

deixada
pelas
AP
endonucleases
e
a
DNA
ligase
completa
a
reparação.


 A
 DNA
 ligase,
 produto
 do
 gene
 ligA
 tem
 77kDa
 e
 catalisa
 aproximadamente
 25
 ligações
 por
 minuto
 de

terminais
3’OH‐
5’PO4,
e
existem
de
200
a
400
moléculas/célula.


 Na
figura
VII.15
está
representado
o
processo
geral
de
reparação
por
excisão
de
bases
em
E.
coli.

 VII
 28




FIGURA
VII.15
–
Esquema
do
modelo
proposto
para
o
reparo
por
excisão
de
bases
em
E.
coli.



O
mecanismo
BER
em
mamíferos


 Em
células
de
mamíferos
o
reconhecimento
das
lesões
é
feito
por
12
diferentes
glicosilases
caracterizadas

por
diferentes
substratos,
especificando
seus
modos
de
ação

(Tabela
VII.1)



Tabela
VII.1
–
DNA
glicosilase
em
humanos

Glicosilase

 Especificidade



MBD4

 U
e
T
na
frente
de
G


MPG

 3‐MeA,
7‐MeG,
3‐MeG
etenoA,
hipoxantina


MYH

 A
na
frente
8‐OxoG


NEIL1

 Formamidopirimidina,
pirimidinas
oxidadas
(ex.
timina
glicol)


NEIL2

 5‐hidroxiuracil:
hidroxicitosina


NEIL3

 Pirimidinas
fragmentadas
e
oxidadas


NTH1

 Pirimidinas
com
anel
saturado,
oxidadas
e
fragmentadas


OGG1

 8‐OxoG
pareada
com
C,
T
e
G


OGG2

 8‐OxoG
em
frente
de
G
e
A


SMUG1

 Uracil


TDG

 U,
T
ou
etenoC
na
frente
de
GT
na
frente
de
G,
C
e
T


UDG2

 U
na
frente
de
A


UNG

 Uracil





 VII
 29


 As
do
tipo
I
removem
a
base,
gerando
um
sítio
AP
(Ex.
MPG),
enquanto
as
do
tipo
II
removem
a
base
e

subseqüentemente
clivam
o
sítio
AP
por
uma
atividade
3’endonuclease
(AP
liase)
gerando
quebras
simples
(Ex.

OGG1).

Após
a
ação
das
glicosilases
do
tipo
I
a
incisão
no
sítio
AP
ocorre
por
AP
endonucleases
[APE1
(APEx,

REF1
ou
HAP1)],
resultando
em
5’dRPO4
e
3’OH.


 A
endonuclease
APE1
é
estimulada
por
XRCC1

(XRCC
=
X
Rays
Cross
Complementating)
e
o
resíduo
pode

ser
na
forma
de
furanose
ou
aldeído.


 Basicamente
 as
 células
 de
 mamíferos
 utilizam
 duas
 maneiras
 distintas
 de
 completar
 a
 reparação
 por

excisão
 de
 bases.
 
 No
 primeiro
 caso
 há
 a
 inserção
 de
 um
 único
 nucleotídeo,
 através
 da
 Polβ
 que,
 após
 essa

inserção,
retira
o
5’dRPO4,
já
que
ela
tem
atividade
liase
e
pode
liberar
a
forma
hemiacetal
do
5’dRPO4
por
β

eliminação.


 Entretanto,
a
Polβ
também
age
na
reparação
em
longos
fragmentos,
inserindo
o
primeiro
nucleotídeo
nos

sítios
 AP
 reduzidos.
 
 A
 remoção
 do
 5’dRPO4
 após
 a
 remoção
 do
 primeiro
 nucleotídeo
 é
 o
 ponto
 de
 decisão

entre
BER
curto
(1
nucleotídeo)
e
longo
(10‐13
nucleotídeos).


Sítios
AP
oxidados
ou
reduzidos,
aldeídos
3’‐insaturados
ou
3’
fosfatos
são
resistentes
à
β‐eliminação
pela

Polβ,
portanto,
após
a
inserção
do
primeiro
nucleotídeo
ela
se
dissocia
e
o
processamento
agora
depende
de

PCNA,
o
que
ocorre
com
aproximadamente
25%
das
lesões.

A
 síntese,
 após
 a
 dissociação
 de
 Polβ
 é
 processada
 por
 Polε
 e
 Polδ
 junto
 com
 PCNA
 e
 RFC
 (Replication

Factor
 C),
 resultando
 na
 incorporação
 de
 mais
 de
 10
 nucleotídeos.
 A
 remoção
 da
 estrutura
 resultante
 (5’‐
dRPflap)
é
realizada
pela
FEN1
(FEN=
Flap
ENndonuclease)
estimulada
por
PCNA.



A
ligação,
neste
caso
é
feita
pela
DNA
ligase
I,
que
interage
com
Polβ
e
PCNA.

No
caso
anterior,
em
que
somente
1
nucleotídeo
é
incorporado,
a
ligação
é
feita
pela
DNA
ligase
III,
que

interage
com
a
Polβ
,
XRCC1
e
PARP
[poli(ADP‐ribose)polimerase‐1].

É
interessante
salientar
que
a
proteína
p53
estimula
BER
“in
vitro”
pela
interação
direta
com
APE
e
Polβ,

estabilizando
a
ligação
de
Pol
β
aos
sítios
AP.

Na
 figura
 VII.16
 estão
 representados
 os
 modelos
 propostos
 para
 a
 reparação
 de
 bases
 em
 células
 de

mamíferos.



REPARAÇÃO
POR
EXCISÃO
DE
NUCLEOTÍDEOS
(NER)

A
reparação
por
excisão
de
nucleotídeos
consiste
em
uma
série
de
reações
enzimáticas
requeridas
para

remover
virtualmente
qualquer
lesão
do
DNA,
incluindo
a
maioria,
senão
todas,
as
removíveis
pela
reparação

por
 excisão
 de
 bases.
 
 Os
 nucleotídeos
 lesados
 são
 excisados
 como
 fragmentos
 de
 tamanho
 fixo,

independentemente
da
natureza
da
lesão.

O
mecanismo
é
constituído
de
5
etapas
gerais:
reconhecimento
da

lesão,
incisão,
excisão,
síntese
de
reparo
e
ligação.

O
 sistema
 é
 constituído
 de
 dois
 mecanismos,
 denominados:
 reparo
 genômico
 global
 (GGR)
 e
 reparo

acoplado
à
transcrição
(TCR).
O
GGR
é
independente
da
transcrição
e
remove
lesões
de
partes
do
genoma
que

não
 estão
 sendo
 transcritas
 e
 da
 fita
 que
 não
 é
 transcrita.
 O
 TCR
 promove
 a
 remoção
 de
 danos
 nos
 genes

ativamente
transcritos.

No
reparo
global
em
E.
coli,
as
duas
primeiras
etapas
deste
processo
são
feitas
por
um
conjunto
de
três

proteínas,
UvrA,
UvrB
e
UvrC
codificadas
pelos
genes
uvrA,
uvrB
e
uvrC,
em
uma
série
de
reações
dependentes

da
 hidrólise
 de
 ATP.
 O
 sistema
 UvrABC
 possui
 um
 amplo
 espectro
 de
 especificidade
 de
 substratos
 e
 foi

proposto
 que
 ele
 reconheça
 modificações
 da
 conformação
 do
 DNA
 e
 não
 necessariamente
 as
 bases

modificadas.

Em
estudos
realizados
na
década
de
60
sobre
a
reparação
de
dímeros
de
pirimidinas,
formados
no
DNA

pelas
radiações
ultravioleta
germicidas,
utilizando
cepas
resistentes
(E.
coli
B/r
e
K‐12)
e
os
mutantes
sensíveis

Bs‐1
e
AB1886
(uvrA),
foi
mostrado
que
os
dímeros
eram
removidos,
em
ausência
de
luz,
nas
cepas
resistentes

(uvr+)
 mas
 não
 nos
 mutantes
 sensíveis
 (uvr‐),
 sendo
 o
 processo
 designado
 de
 reparo
 por
 excisão,
 já
 que,

 VII
 30

diferentemente
 da
 fotorreativação,
 em
 que
 não
 se
 verificavam
 incisões,
 neste
 caso
 as
 incisões
 eram

detectadas
após
a
irradiação
com
UV‐C.






Figura
VII.16
–
Reparo
por
excisão
de
base
em
mamíferos




Posteriormente
 foi
 verificado
 que
 nenhum
 dos
 mutantes
 uvrA,
 uvrB
 ou
 uvrC
 eram
 capazes
 de
 remover

dímeros
 de
 pirimidinas
 do
 seu
 DNA
 e
 que
 estes
 mutantes
 eram
 também
 sensíveis
 a
 outros
 agentes
 como:

alquilantes
bifuncionais,
ácido
nitroso,
mitomicina
C,
etc.


 O
 sistema
 UvrABC
 também
 atua
 na
 reparação
 de
 lesões
 produzidas
 no
 DNA
 de
 fagos
 que
 infectem
 a

célula
bacteriana.

Assim,
a
capacidade
infecciosa
de
fagos
como
o
T1,
T3,
T7
e
λ,
se
previamente
lesados
pela

radiação
UV,
é
bem
maior
em
células
que
possuem
reparação
por
excisão
que
nos
mutantes
nela
deficientes,

fenômeno
 que
 constitui
 a
 reativação
 pela
 célula
 hospedeira
 (host
 cell
 reactivation
 ‐
 hcr).
 
 Este
 tipo
 de

reparação
 não
 ocorre
 em
 mutantes
 uvrA,
 B
 ou
 C,
 e
 é
 bloqueado
 por
 determinados
 compostos
 que
 atuam

sobre
o
sistema
UvrABC
de
E.
coli,
como
a
acriflavina
ou
a
cafeína.



 Mediante
 o
 emprego
 de
 técnicas
 de
 seqüenciamento
 de
 bases
 nitrogenadas
 do
 DNA,
 acopladas
 à

digestão
 enzimática
 de
 fragmentos
 contendo
 extremidades
 marcadas
 com
 um
 precursor
 radioativo,
 foi

mostrado
que
o
sistema
UvrABC
é
capaz
de
produzir
duas
roturas
na
cadeia
polinucleotídica.
Quando
a
lesão
é

um
dímero
de
pirimidina,
o
sistema
promove
quebras
na
oitava
ligação
fosfodiéster
do
lado
5'
do
dímero
e
na

quarta
ligação
no
lado
3'
(no
caso
do
aduto
6‐4PP,
o
corte
é
na
quita
ligação),
deixando,
como
extremidades

livres,
3'OH
e
5'PO4.



O
gene
uvrA,
localizado
no
minuto
92
do
mapa
de
E.
coli,
tem
um
sítio
de
ligação
para
o
repressor
LexA
no

seu
promotor
e
codifica
uma
proteína
de
103
kDa
que
contém
dois
sítios
de
ligação
de
ATP
e
dois
dedos
de

zinco.

 VII
 31

O
gene
uvrB,
localizado
no
minuto
17,
tem
um
sítio
de
ligação
para
o
repressor
LexA
no
seu
promotor
P2

e
codifica
uma
proteína
de
76,6
kDa,
contendo
um
sítio
de
ligação
a
nucleotídeos.

O
 gene
 uvrC,
 localizado
 no
 minuto
 4l,5,
 não
 tem
 sítio
 de
 ligação
 para
 o
 repressor
 LexA.
 Codifica
 uma

proteína
de
66
kDa.

A
proteína
UvrA
é
uma
ATPase
modulada
por
DNA
e
mutações
localizadas
no
domínio
C‐terminal,
onde

existe
um
dedo
de
zinco,
conferem
extrema
sensibilidade
ao
UV,
devido
à
sua
incapacidade
de
ligação
ao
DNA.

A
proteína
UvrB
purificada
não
apresenta
atividade
ATPase,
a
qual
só
é
observada
quando
UvrB
interage

com
UvrA
em
presença
de
DNA
lesado
ou
não
e
UvrB
só
se
liga
ao
DNA
em
presença
de
UvrA.

A
 proteína
 UvrC
 tem
 um
 domínio
 C‐terminal
 com
 um
 alto
 grau
 de
 homologia
 com
 o
 C‐terminal
 da

proteína
ERCC1
(ERCC
=
Excision
Repair
Cross
Complementing)
humana.
Ela
é
uma
proteína
que
se
liga
a
hélice

simples
com
grande
afinidade
e
também
se
associa
com
o
complexo
UvrB‐DNA.



Mecanismo
molecular
da
incisão
dupla

A
 ligação
 de
 ATP
 à
 proteína
 UvrA
 conduz
 à
 sua
 dimerização,
 formando
 UvrA2.
 O
 dímero
 liga‐se
 ao
 DNA

lesado.

UvrB
 então
 se
 liga
 a
 UvrA2
 e
 o
 complexo
 desloca‐se
 para
 o
 local
 da
 lesão
 e,
 nesta
 situação,
 a
 proteína

UvrA
 “sente”
 a
 presença
 da
 lesão,
 reconhecendo
 o
 sítio
 lesado.
 A
 proteína
 UvrB
 liga‐se
 à
 lesão
 e
 o
 dímero

UvrA2
é
liberado.

A
proteína
UvrC
liga‐se
ao
complexo
UvrB‐DNA
e
a
incisão
dupla
é
catalisada
por
UvrB
no
lado
3’
e
UvrC

no
 lado
 5’
 da
 lesão.
 Recentemente
 foi
 mostrado
 que,
 in
 vitro,
 a
 proteína
 UvrC
 pode
 realizar
 os
 dois
 cortes,

entretanto,
isto
ainda
não
foi
verificado
in
vivo.

A
 proteína
 UvrD
 (helicase
 II)
 retira
 UvrC
 e
 um
 oligonucleotídeo
 de
 12
 ou
 13
 bases
 contendo
 a
 lesão,

entretanto,
UvrB
permanece
ligada
ao
DNA,
provavelmente
para
proteger
a
hélice
simples
formada.



A
PolI
desloca
UvrB
e
polimeriza
a
lacuna
que
é
selada
pela
DNA
ligase.

O
 sistema
 UvrABC
 não
 reconhece
 um
 grupo
 químico
 específico
 ou
 estrutura
 no
 nucleotídeo
 lesado.
 Ela

reconhece
 uma
 deformidade
 especifica
 na
 hélice
 dupla,
 causada
 por
 uma
 variedade
 de
 diferentes
 agentes

genotóxicos.
 
 Ela
 reconhece
 desde
 grandes
 lesões
 
 tais
 como
 dímeros
 de
 pirimidinas,
 adutos
 de
 pirimidinas,

adutos
 de
 2‐aminofluoreno,
 adutos
 de
 aflatoxina
 B1,
 monoadutos
 e
 ligações
 cruzadas
 de
 psoraleina
 até

pequenas
lesões
como
O6MeG,
glicol
de
timina
e
sítios
AP.

A
excisão
de
dímeros
de
pirimidinas
é
precedida
pela
dupla
incisão.
A
ligação
de
UvrC
ao
complexo
UvrB‐
DNA
 resulta
 na
 incisão
 nos
 dois
 lados
 adjacentes
 à
 lesão.
 A
 localização
 precisa
 das
 incisões
 é
 afetada
 pela

seqüência.
 Os
 cortes
 são
 feitos
 no
 lado
 3’aparentemente
 influenciados
 pela
 proteína
 UvrB
 e
 esta
 incisão

precede
o
corte
em
5’
pela
proteína
UvrC.

As
radiações
UV‐C
praticamente
não
produzem
quebras
na
cadeia
polinucleotídica;
entretanto,
se
após
a

irradiação,
as
células
forem
incubadas
em
meio
nutritivo
estas
quebras
começam
a
aparecer,
como
mostrado

na
figura
VII.17;
nestas
condições,
o
número
de
quebras
aumenta
até
atingir
um
máximo,
começando
depois
a

diminuir,
uma
vez
que
a
ocorrência
das
outras
etapas
do
processo
leva
à
sua
progressiva
eliminação.

A
liberação
do
fragmento
lesado
é
dependente
da
reação
coordenada
excisão‐ressíntese
por
UvrD
e
DNA

polimerase
na
presença
de
nucleotídeos.

O
fragmento
removido
pode
ter
12
ou
13
nucleotídeos.

UvrD
afeta

a
liberação
do
fragmento
e
de
UvrC,
entretanto
UvrB
só
é
liberada
após
a
entrada
da
PolI
e
dos
nucleotídeos.

Em
 células
 humanas
 são
 necessárias
 pelo
 menos
 16
 proteínas
 para
 realizar
 a
 mesma
 dupla
 incisão
 (ver

adiante).



 VII
 32




FIGURA
VII.17
–
Cinética
de
produção,
pela
endonuclease,
de
quebras
na
cadeia
polinucleotídica,
após

irradiação
 com
 UV
 germicida.
 Uma
 cultura
 bacteriana
 foi
 exposta
 ao
 UV
 germicida,
 uma
 alíquota
 sendo

removida
 para
 análise
 por
 ultracentrifugação
 em
 gradiente
 alcalino
 de
 sacarose;
 o
 restante
 foi
 incubado
 a

37oC,
em
meio
nutritivo,
sendo
retiradas
alíquotas
para
análise
por
centrifugação
em
diferentes
momentos.
A)

perfis
de
sedimentação;
B)
representação
do
número
de
roturas
observadas
durante
a
pós‐irradiação.




 Uma
vez
removido
o
segmento
do
DNA
que
contém
a
lesão,
novos
nucleotídeos
devem
ser
inseridos,
o

que
 é
 feito
 mediante
 complementação
 da
 seqüência
 de
 bases
 existentes
 na
 hélice
 oposta,
 pela
 atuação
 de

uma
polimerase.

Em
E.
coli

foram

isoladas

e

caracterizadas
três
polimerases,

todas
dotadas
também
de

atividade
 exonucleolítica,
 designadas
 como
 PolI,
 PolII
 e
 PolIII,
 codificadas
 respectivamente
 pelos
 genes
 polA,

polB
e
polC.

Estas
enzimas
podem
degradar
o
DNA
no
sentido
oposto
ao
de
polimerização,
o
que
lhes
permite

atuar
também
na
eliminação
de
nucleotídeos
inseridos
incorretamente
durante
a
replicação
semiconservativa,

desempenhando,
portanto,
um
papel
de
"revisão
editorial",
já
referido
anteriormente.


 A
PolI
I
atua
especificamente
sobre
DNA
em
dupla
hélice,
desde
que
este
contenha
uma
terminação
3'OH

e,
no
passado,
foi
considerada
como
a
enzima
responsável
pela
replicação
semiconservativa
do
DNA
de
E.
coli.


Posteriormente,
o
isolamento
de
cepas
deficientes
nesta
enzima,
levou
à
reavaliação
de
seu
papel,
admitindo‐
se
 que
 sua
 ação
 seja
 a
 de
 preenchimento
 das
 lacunas
 geradas
 pela
 atuação
 da
 endonuclease
 UvrABC
 e
 de

outras
enzimas
tais
como
as
AP
endonucleases.


 A
 PolII
 tem
 atividade
 bastante
 limitada
 em
 relação
 à
 PolI
 na
 reparação
 de
 lesões,
 parecendo
 atuar

somente
 quando
 as
 células
 são
 deficientes
 nesta
 última
 enzima.
 
 A
 PolIII
 é
 a
 principal
 responsável
 pela

replicação
 semiconservativa,
 mas
 também
 pode
 substituir
 a
 PolI,
 embora
 com
 eficiência
 reduzida,
 nos

processos
de
reparação
na
ausência
de
PolI.


 A
verificação
experimental
da
neossíntese
de
fragmentos
da
cadeia
polinucleotídica
foi
tornada
possível

mediante
 a
 utilização
 de
 técnicas
 análogas
 às
 empregadas
 por
 Meselson
 e
 Stahl
 para
 demonstrar
 que
 a

replicação
 do
 DNA
 é
 semiconservativa.
 
 Tais
 técnicas
 fundamentam‐se
 em
 que
 cadeias
 polinucleotídicas

sintetizadas
em
presença
de
5‐bromouracil
(ou
do
isótopo
 15N,
como
foi
feito
nos
experimentos
originais
para

o
 estudo
 da
 replicação)
 são
 mais
 densas
 que
 as
 sintetizadas
 em
 sua
 ausência
 e,
 desta
 forma,
 podem
 ser

separadas
por
ultracentrifugação
em
gradientes
de
cloreto
de
césio.

Se
o
DNA
estiver
previamente
marcado

com
 14C‐timina
e,
após
a
irradiação,
for
adicionado
5‐bromouracil
contendo
 3H
ao
meio
de
cultura,
a
análise

das
 densidades
 e
 da
 distribuição
 de
 radioatividade
 permite
 verificar
 ter
 ocorrido
 síntese
 de
 fragmentos
 da

cadeia
 polinucleotídica,
 uma
 vez
 que
 há
 incorporação
 no
 DNA
 do
 precursor
 marcado
 com
 3H,
 mas
 as

dimensões
dos
fragmentos
são
bastante
reduzidas,
já
que
não
alteram
a
posição
de
sedimentação
da
cadeia

polinucleotídica
(ou
seja,
não
modificam
sua
densidade
de
forma
perceptível
pela
técnica
empregada).


 Esquemas
experimentais
desta
natureza
permitiram
verificar
que
os
segmentos
neossintetizados
são,
em

geral,
 de
 dimensões
 reduzidas,
 inferiores
 a
 20
 nucleotídeos,
 o
 que
 está
 de
 acordo
 com
 o
 descrito

anteriormente
 e
 mostrado
 na
 figura
 VII.18.
 
 Em
 mutantes
 
 polA,
 entretanto,
 pode
 ocorrer
 neossíntese
 de

 VII
 33

fragmentos
 bastante
 maiores,
 contendo
 entre
 1.500
 e
 9.000
 nucleotídeos,
 processo
 designado
 como

reparação
por
excisão
de
longos
fragmentos
(long‐patch
repair)
e
também
observável,
embora
raramente,
em

células
selvagens
irradiadas
com
UV‐C
(somente
cerca
de
1%
dos
sítios
nos
quais
tenham
surgido
lesões
são

por
 ele
 reparados,
 sendo
 os
 99%
 restantes
 corrigidos
 pela
 inserção
 de
 curtos
 fragmentos).
 
 Várias

características
desta
forma
de
reparação,
inclusive
a
necessidade
de
síntese
de
proteínas,
a
dependência
do

gene
recA
e
a
cinética
do
fenômeno
permitem
incluí‐la
entre
os
processos
indutivos,
que
serão
vistos
adiante.


Aliás,
 recentemente
 foi
 mostrado
 que
 a
 PolII
 é
 uma
 das
 enzimas
 induzidas
 quando
 o
 sistema
 SOS
 é

desreprimido.


 




FIGURA
VII.18
–
Esquema
do
modelo
proposto
para
o
mecanismo
de
excisão
de
nucleotídeos
UvrABC
em
E.

coli.



A
 última
 etapa
 do
 processo
 de
 reparação
 por
 excisão
 é
 a
 união
 do
 fragmento
 neossintetizado
 à

extremidade
 livre
 da
 cadeia
 pré‐existente,
 mediante
 o
 estabelecimento
 de
 uma
 ligação
 fosfodiéster
 entre
 o

radical
3'OH
daquele
e
o
grupamento
fosfato
da
posição
5'
desta
última.

Em
E.
coli
esta
etapa
é
mediada
por

uma
 polinucleotídeo
 ligase,
 codificada
 pelo
 gene
 ligA,
 cuja
 atividade
 é
 dependente
 da
 presença
 de

nicotinamida‐adenina
dinucleotídeo
(NAD);
células
deficientes
neste
gene
são
bastante
sensíveis
às
radiações

e
a
outros
agentes
que
provocam
lesões
no
DNA.


 Em
células
humanas
pode‐se
detectar
o
processo
de
excisão
através
da
medida
de
síntese
de
DNA
fora
da

fase
 S
 (síntese
 não
 programada).
 
 O
 sistema
 é
 semelhante,
 entretanto,
 o
 número
 de
 bases
 eliminadas
 no

fragmento
removido
é
maior
(27
‐
30
nucleotídeos
–
ver
adiante).


 O
reparo
por
excisão
de
nucleotídeos
é
o
único
sistema
de
reparação
para
grandes
adutos
de
DNA
como

acetilaminofluoreno‐guanina,
 cisplatina‐guanina,
 psoraleina‐timina.
 Adicionalmente,
 todas
 as
 lesões
 que
 são

reparadas
primariamente
pelo
reparo
direto
e
pelo
reparo
por
excisão
de
bases
também
podem
ser
excisadas

 VII
 34

por
este
sistema
de
reparo.

Não
há
modificação
covalente
de
base
conhecida
que
não
seja
substrato
para
o

sistema
de
excisão
de
nucleotídeos

A
estratégia
básica
do
reparo
global
é
similar
em
pro
e
eucariotos.

Em
ambos
os
sistemas,
um
complexo

reconhece
o
sítio
da
lesão,
uma
nuclease
dependente
de
ATP,
constituída
de
subunidades,
faz
duplas
incisões,

uma
de
cada
lado
da
lesão
e
uma
helicase
excisa
o
oligonucleotídeo
contendo
a
lesão.

Tanto
o
sistema
UvrABC
de
E.
coli
como
o
sistema
humano
incisam
a
quinta
ligação
fosfodiéster
do
lado

3’da
 lesão.
 
 No
 lado
 5’
 o
 sistema
 UvrABC
 de
 E.
 coli
 incisa
 a
 oitava
 e
 a
 de
 humanos
 incisa
 a
 vigésima
 quarta

ligação
 fosfodiéster,
 para
 dímeros
 de
 pirimidinas.
 
 Existe
 variabilidade
 nos
 locais
 exatos
 das
 incisões

dependendo
da
lesão
e
da
seqüência,
entretanto,
normalmente,
a
enzima
de
E.
coli
excisa
oligonucleotídeos

de
10‐13
bases
contendo
a
lesão
e
a
excinuclease
humana
remove
oligonucleotídeos
de
27‐29
bases,
também

contendo
a
lesão.

Em
E.
coli
três
subunidades
são
necessárias
e
suficientes
para
fazer
as
duas
incisões.
Em
humanos,
mais

de
 16
 polipeptídios,
 nenhum
 dos
 quais
 tem
 qualquer
 homologia
 com
 as
 subunidades
 UvrABC
 de
 E.
 coli,
 são

requeridos
para
fazer
a
dupla
incisão.

O
oligonucleotídeo
excisado
é
então
substituído
pela
síntese
de
reparo

pelas
DNA
polimerases
e
fatores
acessórios.
Recentemente
foi
detectado
que
UvrB
e
XPD
(proteína
humana

constituinte
do
fator
de
transcrição
TFIIH,
com
atividade
helicase)
possuem
identidade
estrutural.



Reconhecimento
da
lesão
em
eucariotos


 Os
complexos
XPC‐HR23B
(XP
=
Xeroderma
Pigmentosum;
HR
=
Homolog
of
RAD)
e
RPA‐XPA
identificam

as
lesões
no
DNA.
O
primeiro
reconhece
6‐4PPs
induzidos
por
UV,
com
alta
especificidade,
mas
não
reconhece

CPDs,
GO
ou
O6MeG.
Por
outro
lado
o
complexo
RPA‐XPA
reconhece
os
6‐4PPs
e
adutos
de
cisplatina.


 Alguns
 autores
 acreditam
 que
 o
 complexo
 XPC‐HR23B
 liga‐se
 primeiro
 à
 distorção
 da
 hélice,
 enquanto

outros
sugerem
que
RPA‐XPA
reconhece
primeiro.


 Outro
fator
envolvido
no
reconhecimento
das
lesões
do
UV
é
o
DDB
(Damaged
DNA
Binding
protein),
um

hetrodímero
 de
 DDB1
 (p127)
 e
 DDB2
 (p48),
 que
 pertencem
 ao
 grupo
 de
 complementação
 XPE.
 O

heterodímero
parece
estar
envolvido
no
reconhecimento
e
estimulação
da
excisão
de
CPDs
in
vitro
com
alta

eficiência,
 enquanto
 os
 6‐4PPs
 quase
 não
 são
 reconhecidos.
 Além
 disto
 as
 células
 mutadas
 em
 DDB
 são

deficientes
em
reparo
global
(GGR),
entretanto
são
normais
para
o
reparo
acoplado
à
transcrição
(TCR).


 Como
DDB
tem
uma
afinidade
500.000
vezes
maior
para
DNA
lesado
com
UV
em
relação
ao
não
lesado,

foi
 proposto
 que
 DDB
 se
 ligue
 à
 lesão
 e
 recrute
 XPC‐HR23B
 para
 a
 lesão
 no
 mecanismo
 GGR.
 Entretanto,

também
foi
sugerido
que
DDB
recrute
RPA‐XPA
para
o
sítio
da
lesão.


 Uma
 observação
 importante
 é
 que
 fibroblastos
 primários
 deficientes
 em
 p53
 apresentam
 defeito
 no

reparo
de
CPDs
e
eficiência
reduzida
na
GGR,
sugerindo
uma
atenuação
da
indução
de
XPC
e
DDB2,
que
são

induzidos
em
fibroblastos
humanos
após
UV‐C,
através
da
p53.

Em
verdade,
na
síndrome
de
Li‐Fraumeni,
que

se
caracteriza
por
deficiência
na
indução
de
DDB2
por
p53,
há
deficiência
no
reparo
de
CPDs.



Abertura
do
DNA


 Após
a
o
reconhecimento
da
lesão,
o
fator
de
transcrição
TFIIH
(TF
–
Transcription
Factor),
constituído
de

sete
 proteínas
 diferentes
 [XPB,
 XPD,
 GTF2H1,
 GTF2H2,
 GTF2H3,
 GTF2H4,
 CAK
 (CDK7,
 CCNH
 e
 MNAT1)]
 é

recrutado
por
XPC‐HR23B,
para
o
sítio
da
lesão.
Este
fator
tem
atividade
helicase,
presente
nas
subunidades

XPB
e
XPD,
sendo
o
responsável
pelo
desenrolamento
do
DNA
em
torno
da
lesão.
Interessantemente
o
TFIIH
é

um
dos
diversos
componentes
da
RNA
polimerase
II,
requerida
para
a
iniciação
do
processo
de
transcrição.



Incisão
e
Excisão
das
lesões


 Após
a
abertura
da
hélice
do
DNA,
a
excisão
da
lesão
é
feita
por
duas
incisões
em
posições
definidas
nos

lados
da
lesão.

A
incisão
no
lado
3’
é
feita
por
XPG
e
em
5’
pelo
complexo
XPF‐ERCC1.

 VII
 35


 A
incisão
dupla
é
absolutamente
dependente
da
hidrólise
de
ATP.

Diferentemente
da
incisão
em
E.
coli,

na
 qual
 a
 3’
 precede
 a
 5’,
 em
 humanos
 ela
 é
 randômica.
 
 Não
 há
 evidência
 da
 existência
 de
 um
 complexo

reparossoma.

Após
a
incisão
dupla
algumas
subunidades
permanecem
no
complexo
pós‐incisão,
assim
como
a

UvrB
em

E.
coli,
de
tal
maneira
que
uma
lacuna
em
hélice
simples
nunca
existe
como
intermediário.


 O
fragmento
eliminado
contém
27‐30
nucleotídeos
e
a
polimerização
é
também
de
27‐30
nucleotídeos.



Síntese
de
reparo
e
ligação


 O
complexo
pós‐excisão
é
dissociado
pelas
proteínas
de
replicação
de
reparo.

A
síntese
de
reparo
requer

PCNA
e,
desde
que,
entre
as
polimerases
humanas,
somente
a
Polδ

e
Pol
ε
requerem
PCNA,
é
sugerido
que
a

síntese
 de
 reparo
 seja
 processada
 por
 estas
 enzimas.
 
 Estudos
 de
 inibição
 por
 anticorpos
 com
 extratos

celulares
 livres
 de
 células
 sugerem
 que
 a
 Polδ
 seja
 a
 enzima
 que
 faz
 a
 síntese
 de
 reparo.
 
 Em
 sistemas

definidos,
Polδ,
Polε
e
mesmo
a
PolI
de
E.
coli
podem
fazer
a
síntese
de
reparo,
mas
não
a
Polβ.

Na
replicação

do
 DNA
 o
 fator
 RFC
 age
 como
 um
 casamenteiro
 para
 PCNA,
 para
 conduzí‐lo
 ao
 DNA
 e
 então
 conferindo

processividade
para
Polδ
e
Polε.

Na
síntese
de
reparo
RFC/PCNA
parecem
ter
duas
funções:
a
dissociação
do

complexo
 pós‐incisão
 e
 a
 formação
 de
 um
 local
 de
 entrada
 para
 a
 síntese
 de
 reparo,
 possivelmente
 de

maneira
análoga
à
replicação.

A
lacuna
é
fechada
de
maneira
precisa,
sem
aumento
para
os
lados
3’ou
5’
e

então
o
tamanho
do
reparo
é
exatamente
igual
à
lacuna
da
excisão
(27‐30
bases).

O
reparo
é
terminado
por

uma
das
4
DNA
ligases
humanas,
possivelmente
pela
DNA
ligase
I.


 Na
 figura
 VII‐19A
 está
 representado
 o
 mecanismo
 proposta
 para
 a
 excisão
 de
 nucleotídeos
 (GGR)
 em

células
humanas.




Figura
VII.19
–
Reparo
por
Excisão
de
Nucleotídeos
em
mamíferos



REPARAÇÃO
ACOPLADA
À
TRANSCRIÇÃO
(TCR)


 O
DNA
transcrito
é
reparado
mais
rapidamente
que
o
não
transcrito
tanto
em
células
humanas
como
em

E.
coli.
Além
disto
este
reparo
preferencial
é
feito
na
fita
líder
e
em
humanos
somente
nos
genes
transcritos

pela
RNA
polimerase
II.
O
fator
que
modula
o
reparo
parece
ser
a
interação
da
RNA
polimerase
com
a
lesão.



 VII
 36



Reparação
acoplada
à
transcrição




 Em
E.
coli
o
aumento
da
reparação
na
hélice
transcrita
é
mediado
por
TRCF
(Trancription‐Repair
Coupling

Factor),
 codificado
 pelo
 gene
 mfd
 (mutation
 frequency
 decline).
 
 O
 TRCF
 é
 uma
 proteína
 de
 130
 kDa
 com

estruturas
de
helicase
mas
sem
atividade
helicase
até
agora
demonstrada
in
vitro.


 O
mecanismo
deste
reparo
consiste
no
reconhecimento
pelo
TRCF
da
RNA
polimerase
parada
na
lesão.

O

TRCF
libera
a
RNA
polimerase
e
o
transcrito
truncado
e
ao
mesmo
tempo
recruta
o
complexo
protéico
UvrA2B

do
sistema
de
excisão
de
nucleotídeos
ligando
especificamente
UvrA.

Os
sítios
de
ligação
de
TRCF
e
UvrB
à

proteína
UvrA
são
parcialmente
superponíveis,
assim,
após
recrutar
o
complexo
UvrA2B
para
o
sítio
da
lesão
o

TRCF
ajuda
a
dissociação
de
UvrA
facilitando
a
formação
do
complexo
pré‐incisão
UvrB‐DNA.


 Neste
caso
a
reparação
na
hélice
transcrita
é
cerca
de
dez
vezes
mais
rápida
que
na
hélice
não
transcrita.

Aparentemente
 a
 ligação
 da
 RNA
 polimerase
 na
 dupla
 hélice,
 na
 lesão,
 cria
 a
 distorção
 necessária
 para
 a

translocação
do
complexo
UvrA2B
e
pré‐determina
onde
a
incisão
deve
ocorrer.



 Os
 mutantes
 mfd
 são
 moderadamente
 sensíveis
 às
 radiações
 UV
 e
 a
 mutagênese
 espontânea
 é
 apenas

três
vezes
maior
que
nas
células
selvagens.


 Em
 humanos
 o
 mecanismo
 é
 similar
 ao
 de
 E.
 coli,
 somente
 mais
 complexo.
 
 Duas
 proteínas
 são

necessárias
para
fazer
a
ligação
transcrição‐reparo,
CSA
(CS
=
Cockayne
Syndrome)
e
CSB.
Deficiências
em
TCR

são
diretamente
relacionadas
com
a
síndrome
de
Cockayne,
que
é
caracterizada
pela
falta
de
reparo
acoplado

à
transcrição.

Os
genes
correspondentes
de
células
de
Hamster
Chinês
(CHO)
são
o
ERCC8
e
ERCC6.
As
células

CS
 apresentam
 sensibilidade
 aumentada
 à
 radiação
 UV
 e
 deficiência
 em
 TCR.
 
 Entretanto,
 apresentam
 GGR

normal.


 Nos
 pacientes
 CS
 a
 incidência
 de
 tumores
 não
 é
 elevada,
 o
 que
 pode
 ser
 explicado
 pela
 eficiente

eliminação
das
células
lesadas
através
de
apoptose.





 O
reparo
acoplado
à
transcrição
ocorre
somente
em
genes
transcritos
pela
RNA
PolII,
é
observado
com

qualquer
lesão
que
bloqueie
a
transcrição
(em
geral
lesões
grandes
que
necessitam
o
sistema
de
excisão
de

nucleotídeos),
ocorre
mais
rapidamente
na
fita
transcrita
e
mutações
em
cinco
genes
causam
a
síndrome
de

Cockayne
[CSA/ERCC8,
CSB/ERCC6,
XPB
e
XPD
(como
parte
de
TFIIH)
e
XPG].


 A
proteína
CSB,
mas
não
a
CSA,
interage
diretamente
com
RNA
PolII.
Quando
RNA
PolII
é
bloqueada
no

sítio
 da
 lesão,
 CSA
 e
 CSB
 ativam
 o
 TCR.
 
 Estudos
 recentes
 sugerem
 que
 CSB
 usa
 a
 sua
 atividade
 translocase

para
 remover
 o
 complexo
 RNA
 PolII
 da
 lesão.
 Em
 verdade,
 a
 exposição
 das
 células
 a
 agentes
 lesivos
 como

cisplatina
e
radiação
UV‐C
induzem
a
ubiquitinação
de
RNA
PolII
dependente
de
CSA
e
CSB
nas
forquilhas
de

transcrição
facilitando
sua
liberação,
degradação
e
proteólise
quando
a
lesão
não
pode
ser
reparada.

Quando
 a
 reparação
 é
 possível
 o
 TFIIS
 provoca
 o
 deslocamento
 da
 RNA
 PolII
 por
 aproximadamente
 20

nucleotídeos,
permitindo
a
reparação
do
DNA
e
que
a
RNA
PolII
alongue
o
transcrito
truncado.


 A
 maior
 diferença
 entre
 este
 modelo
 e
 o
 de
 procariotos
 é
 que
 em
 E.
 coli
 o
 transcrito
 truncado
 é

descartado
e
em
células
humanas
ele
é
reusado.

Outra
síndrome
envolvida
na
reparação
acoplada
à
transcrição
de
CPDs
é
a
síndrome
de
sensibilidade
ao

UV
(UVSS),
que
não
pertence
ao
grupo
de
complementação
CS.
Isto
sugere
que
o
TCR
é
muito
mais
complexo

que
inicialmente
pensado,
o
que
não
acontece
com
o
GGR
que
está
melhor
estabelecido,
como
já
descrito.


 Na
 figura
 VII.19B
 está
 representado
 o
 modelo
 proposto
 para
 a
 reparação
 acoplada
 à
 transcrição
 em

células
de
mamíferos.


 

REPARAÇÃO
PÓS‐REPLICATIVA



 A
 existência,
 na
 célula
 bacteriana,
 de
 duas
 ou
 mais
 cópias
 de
 determinada
 seqüência
 de
 DNA
 pode

favorecer
 a
 manutenção
 da
 viabilidade
 após
 tratamentos
 físicos
 ou
 químicos,
 pela
 recombinação
 de

fragmentos
não
lesados
entre
si.

 VII
 37


 As
 primeiras
 evidências
 sobre
 a
 existência
 deste
 fenômeno
 foram
 obtidas
 com
 bacteriófagos,
 com
 base

em
vários
tipos
de
estudos,
quais
sejam:


 a)
 a
 reativação
 por
 multiplicidade,
 que
 consiste
 em
 um
 aumento
 do
 número
 de
 centros
 infecciosos

produzidos
quando
cada
bactéria
é
infectada
por
dois
ou
mais
fagos
irradiados;
o
fenômeno
é
conseqüência

da
recombinação
entre
genomas
lesados,
cada
um
deles
incapaz,
isoladamente,
de
se
replicar,
mas
podendo

fazê‐lo
se
existirem
vários
exemplares
no
interior
da
célula;


 b)
 a
 reativação
 cruzada,
 análoga
 à
 anterior,
 observável
 quando
 ocorre
 infecção
 da
 célula
 por
 dois
 tipos

distintos
 de
 fagos,
 relacionados
 geneticamente,
 um
 dos
 quais
 inativado
 pela
 radiação;
 alguns
 "marcadores"

genéticos
 deste
 último
 são
 encontrados
 entre
 os
 fagos
 produzidos
 após
 a
 lise
 bacteriana,
 o
 que
 evidencia
 a

ocorrência
de
recombinação;


 c)
 a
 reativação
 pelo
 profago,
 verificada,
 por
 exemplo,
 quando
 uma
 bactéria
 lisogênica,
 portadora
 do

profago
 λ,
 é
 infectada
 por
 um
 mutante
 virulento
 (λ
 vir),
 previamente
 irradiado;
 nestas
 condições,
 a

probabilidade
de
multiplicação
do
fago
é
maior
que
a
observável
se
a
bactéria
infectada
não
fosse
lisogênica,
o

que
costuma
ser
interpretado
como
conseqüência
de
recombinação
entre
o
DNA
infectante
e
o
profago,
que

apresentam
quase
100%
de
homologia.


 A
 conjugação
 bacteriana
 constitui
 outro
 fenômeno
 importante
 para
 a
 compreensão
 da
 reparação
 pós‐
replicativa,
consistindo
na
incorporação,
ao
genoma
bacteriano,
de
segmentos
de
DNA
exógeno,
incorporação

esta
dependente
da
proteína
RecA,
codificada
pelo
gene
recA.

Neste
caso
particular,
uma
bactéria
("macho"),

transfere
uma
cópia
de
seu
cromossoma
para
outra
("fêmea"),
do
que
resulta
a
incorporação
ao
patrimônio

genético
da
receptora
de
um
ou
mais
genes
da
doadora,
como
visto
anteriormente.

O
fenômeno
só
ocorre
em

cepas
fêmeas
portadoras
do
alelo
selvagem
do
gene
recA
e
a
verificação
de
que
as
células
deficientes
neste

gene
são
bastante
sensíveis
às
radiações
e
a
diversos
agentes
químicos
levou
à
formulação
da
hipótese
de
que

a
recombinação
genética
estaria
ligada
a
alguma
forma
de
reparação.


 Cepas
 deficientes,
 simultaneamente,
 em
 reparo
 por
 excisão
 (uvrA,
 por
 exemplo)
 e
 em
 recombinação

(recA)
 são
 muito
 mais
 fotossensíveis
 que
 as
 células
 deficientes
 em
 somente
 um
 destes
 mecanismos,
 o
 que

permite
afirmar
tratarem‐se
de
duas
vias
independentes
de
reparo.

Por
outro
lado,
esta
constatação
justifica

a
 utilização
 de
 mutantes
 desprovidos
 de
 excisão
 nos
 estudos
 visando
 avaliar
 a
 eficiência
 da
 reparação
 pela

recombinação
genética.


 O
duplo
mutante
uvrA
recA
é
inativado
por
um
único
dímero
de
pirimidina
formado
no
DNA,
enquanto

células
deficientes
somente
em
excisão
serão
inativadas
quando
sofrerem,
em
média,
30
lesões
e
as
selvagens,

proficientes
nos
mecanismos
de
reparação,
cerca
de
700
lesões.


 Os
resultados
experimentais
assim
obtidos
indicam
que:


 a)
a
irradiação
das
células,
assim
como

tratamentos
com
diversos
agentes
químicos,
provocam
o
bloqueio

da
replicação
semiconservativa
do
DNA,
que,
em
muitos
casos,
não
é
permanente;


 b)
 a
 replicação
 que
 então
 ocorre
 é
 descontínua,
 correspondendo
 às
 dimensões
 médias
 dos
 segmentos

neossintetizados
às
distâncias
entre
as
lesões,
dependentes
da
dose
de
radiação
aplicada;


 c)
à
medida
que
aumenta
o
tempo
transcorrido
desde
a
irradiação,
crescem
as
dimensões
dos
fragmentos

neossintetizados,
o
que
sugere
sua
progressiva
associação;


 d)
as
lesões
provocadas
pelo
tratamento
físico
ou
químico
não
desaparecem
completamente
(ao
menos

em
mutantes
desprovidos
de
excisão),
diluindo‐se
ao
longo
das
divisões
celulares,
podendo
ser
detectados
por

três
ou
quatro
gerações
após
a
irradiação;


 e)
em
mutantes
recA
o
fenômeno
não
é
observável.


 Com
base
nestes
argumentos
experimentais
foram
apresentados
diversos
modelos
para
a
reparação
pela

recombinação.


 As
 trocas
 de
 material
 genético
 entre
 as
 moléculas
 de
 DNA,
 aspecto
 central
 no
 qual
 fundamenta‐se
 o

modelo
 apresentado
 na
 figura
 VII.20,
 foram
 verificados
 por
 meio
 de
 experimentos
 nos
 quais
 as
 hélices

parentais
foram
marcadas
com
isótopos
"pesados"
de
nitrogênio
ou
de
carbono,
sendo
a
análise
realizada
por

ultracentrifugação
 em
 gradientes
 de
 cloreto
 de
 césio.
 
 Outro
 método
 fundamenta‐se
 na
 incorporação
 de

bromodeoxiuridina
na
hélice
parental,
sendo
os
segmentos
que
contenham
este
análogo
de
timina
detectados

 VII
 38

nas
hélices
filhas
por
fotólise.

Outro
argumento
experimental
decorre
da
observação
da
presença
de
dímeros

de
 pirimidinas
 nas
 hélices
 filhas,
 indicando
 a
 existência
 de
 recombinação
 genética,
 fato
 este
 observado
 não

somente
em
procariotos,
mas
também
em
células
de
mamíferos.






FIGURA
VII.20
–
Modelo
proposto
para
o
mecanismo
de
recombinação
homóloga
pós‐replicativa
em
E.
coli.





 A
 estabilização
 da
 ligação
 da
 proteína
 RecA,
 no
 sítio
 da
 recombinação
 parece
 ser
 devida
 à
 ação
 do

produto
do
gene
ssb,
uma
proteína
capaz
de
se
ligar
a
zonas
do
DNA
em
hélice
simples
("single
strand
binding

protein").
 Nesta
 situação
 a
 proteína
 RecA
 forma
 longos
 filamentos
 que
 envolvem
 as
 hélices
 do
 DNA

promovendo
a
troca
de
hélices.

Uma
vez
realizada
a
recombinação,
as
proteínas
RuvA
e
RuvB
promovem
a

migração
 das
 hélices
 interligadas.
 Este
 sistema
 gera
 as
 chamadas
 "figuras
 de
 Holliday"
 
 que
 são
 "resolvidas"

através
 de
 cortes
 promovidos
 pela
 proteína
 RuvC,
 sendo
 o
 complexo
 de
 proteínas
 Ruv
 denominado

“resolvase”.
É
interessante
salientar
que
os
genes
ruvA
e
ruvB
fazem
parte
daqueles
controlados
pelo
sistema

SOS.
Em
mutantes
ruvA
ou
ruvB
o
processo
ainda
pode
ser
realizado
já
que
a
proteína
RecG
pode
substituir
as

proteínas
RuvA
e
RuvB.



 Evidentemente,
 a
 reparação
 recombinacional,
 dada
 sua
 complexidade,
 exige
 a
 atuação
 de
 várias

proteínas
 intracelulares,
 além
 do
 produto
 do
 gene
 recA;
 vias
 competitivas
 também
 parecem
 existir,

dependentes
de
diversas
outras
proteínas.

Assim,
por
exemplo,
em
células
proficientes
em
excisão,
este
tipo

de
reparação
exige
a
presença
dos
alelos
selvagens
dos
genes
recB,
recC
e
recD,
que
codificam
para
a
síntese

da
 exonuclease
 V,
 que
 funciona
 também
 como
 uma
 helicase
 "desenrolase";
 já
 em
 células
 deficientes
 em

excisão,
o
reparo
recombinacional
exige
o
produto
do
gene
recF,
provavelmente
uma
outra
nuclease.


 O
fechamento
das
lacunas
formadas
durante
o
processo
de
reparo
recombinacional
é
realizado
por
PolI
e

PolIII.

A
etapa
final
do
processo
é
promovida,
à
semelhança
do
que
ocorre
na
reparação
por
excisão,
pela
DNA

ligase.

O
processo
de
recombinação
para
fechar
as
lacunas
em
frente
aos
dímeros
foi
a
primeira
sugestão
de
um

mecanismo
de
tolerância
de
lesões
em
E.
coli
.

A
existência
deste
mecanismo
em
células
humanas
não
está

definitivamente
provada.

Algumas
evidências
da
transferência
de
dímeros
de
pirimidinas
para
as
hélices
filhas

já
 foram
 obtidas.
 
 Em
 células
 irradiadas
 na
 fase
 G1,
 de
 1
 a
 3%
 dos
 dímeros
 produzidos
 na
 hélice
 parental

 VII
 39

podem
ser
detectados
na
hélice
filha,
assim
como
a
detecção
de
quebras
duplas
na
fase
S
após
a
irradiação

com
 UV
 (em
 células
 deficientes
 em
 excisão)
 é
 consistente
 com
 tal
 modelo.
 
 Os
 detalhes
 bioquímicos
 das

reações
de
recombinação
em
células
humanas
ainda
é
desconhecido.



Reparação
de
quebras
duplas


 Em
adição
ao
reparo
de
quebras
simples,
as
células
de
E.
coli
têm
a
capacidade
de
reparar
quebras
duplas

no
 seu
 DNA.
 
 Estas
 quebras
 podem
 ser
 produzidas
 pela
 radiação
 ionizante
 assim
 como
 pelo
 processamento

das
lesões
produzidas
pela
radiação
UV
(que
não
produzem
quebras
duplas
diretamente).

As
quebras
duplas

podem
ocorrer
em
células
selvagens
irradiadas
com
elevadas
doses
de
radiação
UV,
nas
quais
a
proximidade

dos
dímeros
pode
 acarretar,
no
processo
de
excisão,
a
quebra
dupla.


Em
células
deficientes
em
excisão
 as

quebras
podem
ocorrer
no
DNA
parental
opostas
a
uma
quebra
não
reparada
na
hélice
filha,
possivelmente

através
de
um
ataque
de
uma
endonuclease
específica
para
DNA
em
hélice
simples.


 O
reparo
de
quebras
duplas
é
induzido
e
faz
parte
das
funções
SOS,
e
logicamente
requer
a
presença
de

outra
 molécula
 de
 DNA
 em
 dupla
 hélice,
 contendo
 a
 mesma
 seqüência
 de
 bases
 da
 hélice
 quebrada,
 o
 que

ocorre
 freqüentemente
 quando
 as
 bactérias
 são
 cultivadas
 em
 meio
 rico.
 
 Este
 fato
 correlaciona‐se
 com
 a

observação
de
que
células
de
E.
coli

contendo
múltiplos
genomas
são
muito
resistentes
aos
raios
X.


 O
modelo
aceito
para
este
tipo
de
reparação
pode
ser
visto
na
figura
VII.21.

De
acordo
com
o
modelo,
a

quebra
é
processada
por
ação
exonucleolítica
de
modo
a
gerar
terminais
3’OH
que
invadem
o
DNA
homólogo

intacto
 e
 para
 a
 síntese
 de
 reparo,
 iniciada
 nos
 terminais
 invasores.
 
 Dependendo
 de
 como
 as
 junções
 de

Holiday
são
resolvidas,
as
moléculas
resultantes
podem
ser
recombinantes
ou
não.






FIGURA
VII.21
–
Esquema
do
modelo
proposto
para
o
reparo
de
quebras
duplas
no
DNA
de
E.
coli.




 O
 reparo
 requer
 o
 gene
 recA+
 funcional.
 
 A
 proteína
 RecA
 catalisa
 a
 invasão
 pela
 hélice
 3’.
 
 Em
 células

selvagens
 o
 reparo
 de
 quebras
 duplas
 também
 depende
 de
 recB+
 e
 recC+
 funcionais.
 
 O
 mecanismo
 para
 a

geração
 dos
 terminais
 3’OH
 envolve
 a
 entrada
 do
 complexo
 RecBCD
 na
 quebra
 dupla.
 Este
 complexo

 VII
 40

exonucleolítico
 ao
 encontrar
 uma
 seqüência
 χ
 (chi)
 produz
 uma
 seqüência
 invasiva
 3’OH
 de
 alguns

nucleotídeos,
que
a
proteína
RecA
insere
na
hélice
dupla.


 O
requerimento
para
RecBCD
em
células
selvagens
é
absoluto
uma
vez
que
uma
simples
quebra
dupla
é

letal
em
ausência
de
RecA
ou
RecBCD,
mas
não
impede
o
crescimento
celular
na
célula
selvagem.


 O
 reparo
 de
 quebras
 duplas
 é
 um
 processo
 complexo
 e
 diversos
 genes
 além
 de
 recA
 e
 recBCD
 estão

implicados
neste
reparo
(recN,
recF,
recJ,
radA,
e
uvrD).

O
gene
recN
é
de
particular
interesse,
desde
que
sua

expressão
é
regulada
pela
resposta
SOS
e
o
seu
produto
é
requerido
para
o
reparo
de
quebras
duplas
mas
não

para
o
reparo
de
quebras
simples.



 A
 recombinação
 homóloga
 não
 é
 favorecida
 em
 células
 humanas
 e
 portanto
 a
 maioria
 dos
 eventos
 de

integração
são
resultado
de
recombinações
ilegítimas,
envolvendo
homologias
em
trechos
muito
pequenos
de

DNA.


 Estas
 recombinações
 ilegítimas
 estão
 envolvidas
 no
 reparo
 de
 quebras
 duplas.
 Terminações
 abruptas

assim
 como
 pequenas
 protuberâncias,
 complementares
 ou
 não,
 podem
 ser
 reunidas
 com
 eficiências

diferentes.




 As
 quebras
 duplas
 são
 potentes
 indutoras
 de
 efeitos
 genotóxicos
 (quebras
 cromossomiais,
 rearrajos,

trocas)
e
morte
celular.


 Em
 humanos
 uma
 única
 quebra
 dupla
 não
 reparada,
 inativando
 um
 gene
especifico
 pode
 ser
 suficiente

para
induzir
a
morte
celular
por
apoptose.


 A
 reparação
 das
 quebras
 duplas
 pode
 ocorrer
 pela
 recombinação
 homóloga
 (HR
 =
 Homologous

Recombination)
 (que
 é
 livre
 de
 erros)
 ou
 pela
 recombinação
 não
 homóloga
 (NHEJ
 =
 Non‐Homologous
 End‐
Joining)
que
é
caracteristicamente
sujeita
a
erros.

Em
leveduras
predomina
a
HR
enquanto
em
mamíferos
a

predominância
 é
 da
 NHEJ,
 porém
 isto
 depende
 do
 ciclo
 celular,
 sendo
 que
 NHEJ
 ocorre
 mais
 em
 G0/G1

enquanto
HR
ocorre
preferencialmente
em
S
e
G2,
quando
a
cromátide
irmã
já
foi
sintetizada.



NHEJ

Este
tipo
de
recombinação
liga
as
pontas
sem
requerer
homologia
entre
a
terminações.

A
primeira
etapa

é
a
ligação
do
heterodímero
KU70
e
KU80
(XRCC5),
o
que
protege
o
DNA
da
digestão
exonucleolítica.


 Após
 a
 ligação
 ao
 DNA
 o
 heterodímero
 KU70‐KU80
 associa‐se
 à
 DNA‐PK
 (XRCC7
 ou
 DNA‐PKcs)
 (PK
 =

Protein
 Kinase
 :
 cs
 =
 catalytic
 subunit)
 formando
 
 a
 DNA‐PK
 holoenzima
 ativa.
 A
 DNA‐PKcs
 á
 ativada
 pela

interação
com
a
hélice
simples
no
sítio
da
quebra
dupla,
o
que
aciona
a
atividade
cinase
Ser‐Thr.


 Um
 dos
 alvos
 da
 DNA‐PKcs
 é
 o
 XRCC4,
 o
 qual
 forma
 um
 complexo
 estável
 com
 a
 DNA
 ligase
 IV.
 
 O

complexo
 DNA
 ligase
 IV‐XRCC4
 liga‐se
 aos
 terminais
 e
 junta
 os
 terminais
 duplos
 com
 os
 terminais

complementares
mas
não
ligáveis.
Como
o
complexo
não
pode
ligar
a
maioria
das
quebras
duplas
produzidas

por
muitos
agentes,
estas
devem
ser
processadas
primeiro.


 O
 processamento
 dos
 terminais
 das
 quebras
 duplas
 é
 realizado
 pelo
 complexo
 MRN
 (MRE11‐RAD50‐
NBS1)
 (MRE
 =
 Meiotic
 REcombination,
 RAD
 =
 RADiation,
 NBS
 =
 Nijmegen
 Breakage
 Syndrome)
 que
 contém

atividades
exonuclease,
endonuclease
e
helicase,
e
remove
o
excesso
de
DNA
nos
“flaps”
3’.

Nos
“flaps”
5’
a

FEN1
é
a
responsável
pela
remoção
e
sua
deficiência,
bem
como
a
de
DNA
ligase
IV,
causam
redução
no
uso
da

via
do
NHEJ.


 Outra
enzima
envolvida
no
processo
de
geração
de
saliências
durante
o
NHEJ
é
a
proteína
Artemis,
que

age
em
um
complexo
de
DNA‐PK.
Artemis
tem
uma
exonuclease
específica,
que
após
sua
ligação
na
DNA‐PK
e

sendo
fosforilada
pela
DNA‐PKcs
adquire
atividade
endonuclease,
degradando
DNA
em
hélice
simples
saliente

e
“grampos”,
o
que
parece
ser
necessário
para
o
processamento
de
saliências
5’
e
3’
durante
o
NHEJ.


 Na
figura
VII.22A
está
representado
um
modelo
proposto
para
este
tipo
de
reparação.



 VII
 41




Figura
VII.22
–
Reparo
de
quebras
duplas
em
mamíferos



Recombinação
homóloga
(HR)

Na
 recombinação
 homóloga
 o
 cromossomo
 lesado
 entra
 em
 contacto
 físico
 com
 o
 não
 lesado,
 na

homologia
de
seqüência,
que
é
usada
como
iniciador
para
o
reparo.


 O
 processo
 é
 iniciado
 pelo
 complexo
 MRN,
 que
 age
 promovendo
 a
 digestão
 na
 direção
 5’→
 3’.
 O

resultado
 é
 um
 DNA
 em
 hélice
 simples
 com
 final
 3’
 saliente,
 no
 qual
 se
 liga
 um
 anel
 complexo
 de
 proteínas

RAD52,
que
o
protegem
da
digestão
nucleolítica.


 RAD52
compete
com
Ku
o
que
determina
o
caminho
do
reparo
via
NHEJ
ou
HR.


 RAD52
interage
com
RAD51,
estimulando
a
troca
de
hélices
promovida
pela
RAD51
(que
é
homóloga
da

RecA
de

E.
coli)
.
RAD51
forma
nucleofilamentos,
liga
DNA
de
hélice
simples
e
DNA
de
fita
dupla
e
promove

interações
entre
regiões
homólogas
lesadas
e
não
lesadas,
dependendo
de
ATP
e
estimulação
por
RPA.


 RAD54,
uma
ATPase
DNA
dependente
que
interage
com
RAD51
é
capaz
de
induzir
o
superenrolamento
do

DNA
 e
 pode
 estimular
 indiretamente
 a
 recombinação
 por
 afastar
 as
 histonas
 ou
 outras
 proteínas
 ligadas
 ao

DNA.

Este
processo
também
requer
BRCA2,
que
pode
estar
envolvida
na
tanslocação
de
BRCA1
e
RAD51
para

a
lesão.
 

RAD51
catalisa
a
troca
de
hélices
da
hélice
complementar
quando
a
hélice
lesada
invade
o
DNA
em
hélice

dupla
não
lesado.


 A
junção
do
filamento
da
proteína
RAD51
é
facilitada
por
5
parálogos
de
RAD51
(RAD51B,
C
e
D
e
XRCC2
e

XRCC3)
que
têm
um
papel
importante
durante
a
pré‐sinapse.


 Outra
 interação
 de
 RAD51
 é
 com
 RPA.
 Há
 sugestões
 de
 que
 RPA
 estabilize
 o
 pareamento
 de
 DNA
 feito

pela
RAD51,
ligando‐se
à
hélice
deslocada.

Após
a
ação
das
proteínas
RAD,
as
estruturas
são
resolvidas
pelas

resolvases.




 Na
figura
VII.22B
está
representado
um
modelo
proposto
para
este
tipo
de
reparação.




 VII
 42

REPARO
DE
LIGAÇÕES
CRUZADAS
(Interstrand
cross‐links
=
ICLs)


 Estas
 lesões
 são
 muito
 tóxicas,
 sendo
 que
 uma
 única
 lesão
 é
 capaz
 de
 matar
 células
 bacterianas
 e
 de

leveduras
 deficientes
 em
 reparação
 e
 cerca
 de
 40
 ICLs
 podem
 inativar
 células
 de
 mamíferos
 deficientes
 em

reparação.


 Diversas
substâncias
encontradas
no
meio
ambiente
são
capazes
de
provocar
ligações
cruzadas
tais
como

furocumarinas,
 que
 estão
 presentes
 em
 muitas
 plantas
 e
 cosméticos.
 
 Além
 disto
 muitas
 substâncias
 são

utilizadas
como
quimioterápicos
no
tratamento
do
câncer,
devido
à
sua
propriedade
de
fazer
ligações
cruzadas

no
DNA,
o
que
acarreta
a
parada
da
replicação
e,
conseqüentemente,
a
morte
celular.
Entre
estas
substâncias

podemos
 citar:
 mitomicina
 C,
 cisplatina,
 mostradas
 nitrogenadas,
 nitrosouréias,
 etc.
 
 Entretanto,
 a
 estrutura

tridimensional
das
ICLs
são
variáveis,
o
que
pode
influenciar
o
seu
reconhecimento
e
sua
reparação.


 Uma
 classe
 especial
 de
 substâncias
 capazes
 de
 fazer
 ICLs
 são
 os
 psoralenos,
 os
 quais
 se
 intercalam
 nas

moléculas
 de
 DNA
 e,
 quando
 as
 células
 são
 iluminadas
 com
 radiação
 UVA,
 formam
 ligações
 com
 a
 timina,

como
visto
anteriormente.
Estas
substâncias
são
muito
utilizadas
no
tratamento
de
psoriasis,
vitiligo
e
micosis

fungóides,
um
tratamento
dermatológico
conhecido
como
PUVA
(psoraleno
+
UVA).


 Em
E.
coli
proficientes
em
recombinação
genética,
o
reparo
de
ligações
cruzadas
é
realizado
em
diversas


etapas.
Ocorre
a

incisão
dupla
em
uma
das
hélices,
pelo
sistema
UvrABC,
na
nona
ligação
fosfodiéster
a
5’
da

ICL
e
na
terceira
ligação
no
lado
3’,
como
demonstrado
in
vitro.
Posteriormente,
a
atividade
exonucleolítica
5’

da
PolI
digere
o
DNA
formando
uma
lacuna
no
terminal
3’.
Isto
gera
a
estrutura
necessária
para
que
ocorra
a

recombinação
genética
com
outra
hélice
de
DNA.
Após
a
recombinação,
o
sistema
UvrABC
pode
agir
no
outro

lado
da
hélice,
liberando
a
lesão.
A
própria
PolI
faz
a
polimerização
da
lacuna
gerada
e
a
DNA
ligase
completa
a

reparação.



 Em
 bactérias
 deficientes
 em
 recombinação
 genética
 ou
 na
 falta
 de
 uma
 cópia
 do
 DNA,
 a
 reparação
 das

ICLs
 é
 dependente
 de
 NER
 e
 da
 PolII.
 
 Na
 falta
 de
 recombinação
 genética,
 após
 a
 dupla
 incisão
 feita
 pelo

sistema
 UvrABC
 a
 PolII
 sintetiza
 o
 DNA
 através
 do
 oligonucleotídeo
 contendo
 a
 ligação.
 Posteriormente
 o

sistema
UvrABC
faz
a
segunda
incisão
dupla
e
a
DNA
polimerase
I
e
DNA
ligase
completam
a
reparação,
como

pode
ser
visto
na
figura
VII.23.






Figura
VII.23
–
Reparo
de
ligações
cruzadas
(“crosslink”
ou
“ICL”)
em
bactéria

 VII
 43





 In
 vivo
 outras
 proteínas
 estão
 envolvidas
 neste
 reparo,
 já
 que
 mutantes
 RecB,
 C,
 D,
 F,
 G,
 O
 e
 R
 são

sensíveis
a
agentes
que
causam
ICLs.
RecFOR
promove
a
ligação
de
RecA
ao
DNA
em
hélice
simples,
facilitando

o
emparelhamento
homólogo,
principalmente
em
ausência
de
quebras
duplas.

RecBCD
é
necessária
quando

uma
quebra
dupla
é
formada
durante
o
reparo
do
ICL.
A
quebra
dupla
pode
ser
formada
pela
ação
direta
de

nucleases
 ou
 quando
 uma
 quebra
 é
 feita
 perto
 do
 ICL
 e
 a
 forquilha
 de
 replicação
 chega
 à
 lesão.
 RecG
 ou

RuvABC,
são
responsáveis
pela
resolução
dos
intermediários
da
recombinação.



 Os
processos
de
reparação
de
ICLs
foram
conservados
em
eucariotos,
desde
leveduras
até
o
homem.
Nas

células
humanas
o
processo
necessita
de
NER,
recombinação
homóloga
e
reparação
translesão.
Diversos
genes

idênticos
aos
de
leveduras
estão
envolvidos
no
reparo
destas
lesões
em
humanos,
tais
como:
RAD6,
RAD18,
,

SNM1,
REV3
e
REV7.
Entretanto,
na
reparação
das
quebras
duplas
que
ocorrem
durante
o
processamento
das

lesões,
as
leveduras
normalmente
usam
a
recombinação
homóloga,
enquanto
a
maioria
das
células
humanas

usa
a
NHEJ.
Além
disto,
em
humanos
o
processo
é
mais
complexo,
envolvendo
muito
mais
proteínas
que
em

leveduras.

Um
exemplo
do
processo
de
reparação
de
quebras
duplas
em
leveduras
pode
ser
visto
na
figura

VII.24.




Figura
VII.24
–
Reparo
de
ligações
cruzadas
(“crosslink”
ou
“ICL”)
em
levedura




Naturalmente,
 todos
 os
 mutantes
 deficientes
 em
 reparo
 e,
 particularmente
 RAD10,
 RAD1,
 ERCC1
 e

ERCC4(XPF),
são
extremamente
sensíveis
a
agentes
que
fazem
ligações
cruzadas.

Adicionalmente,
linhagens

celulares
 da
 Anemia
 de
 Fanconi
 são
 sensíveis
 a
 agentes
 que
 fazem
 ligações
 cruzadas,
 mas
 não
 são

particularmente
sensíveis
a
outras
lesões
que
são
reparadas
por
NER.


 Algumas
 proteínas
 sem
 homologia
 com
 as
 de
 leveduras
 tais
 como
 BRCA
 
 (BReast
 CAncer)
 e
 FANC

(Fanconi)
 têm
 participação
 na
 reparação
 de
 ICLs
 em
 mamíferos.
 
 Uma
 grande
 diferença
 entre
 mamíferos
 e

leveduras
 é
 que
 somente
 ERCC1
 e
 XPF
 (NER)
 participam
 do
 reparo
 em
 mamíferos,
 enquanto
 muitas
 outras

proteínas
 do
 NER
 participam
 do
 reparo
 em
 leveduras.
 
 Em
 verdade
 as
 proteínas
 responsáveis
 pelo

reconhecimento
 dos
 ICLs
 em
 mamíferos
 não
 são
 conhecidas.
 
 Além
 disto,
 aparentemente
 ERCC1
 e
 XPF,
 em

mamíferos,
participam
principalmente
da
resolução
de
intermediários
da
recombinação.

 VII
 44


 Em
 leveduras
 a
 RAD52
 é
 mais
 importante
 que
 a
 RAD51
 na
 maioria
 dos
 eventos
 recombinacionais,

enquanto
em
mamíferos
RAD51
é
a
mais
importante.

Os
mamíferos
dependem
mais
dos
parálogos
de
RAD
51

para
a
sua
ativação
na
estimulação
de
troca
de
hélices
do
que
para
RAD52.


 As
 proteínas
 SNM1,
 FANC
 e
 BRCA
 podem
 funcionar
 na
 regulação
 das
 respostas
 celulares
 aos
 ICLs.
 Por

exemplo,
 as
 proteínas
 BRCA
 estão
 envolvidas
 na
 indução
 de
 pontos
 de
 checagem
 via
 ATM
 (Ataxia

Telangiectasia
Mutated),
na
HR
e
BRCA1
está
associada
à
transcrição.
Além
disto
a
ligação
de
FANC2
e
BRCA1
é

consistente
com
um
papel
regulatório
das
proteínas
FANC.



ATM
e
ATR
–
Controle
da
sinalização
e
pontos
de
checagem

O
reconhecimento
e
a
sinalização
das
lesões
do
DNA
são
requisitos
para
a
indução
de
respostas
celulares

tais
como:
aumento
de
reparo,
parada
do
ciclo
celular
e
apoptose.

O
 reconhecimento
 é
 feito
 por
 um
 grupo
 de
 fosfotidilinositol‐3‐cinases
 ATM,
 ATR
 (Ataxia
 Telangiectasia

Related)
 e
 pela
 subunidade
 catalítica
 da
 DNA‐PK
 (DNA‐PKcs),
 cujo
 alvo
 para
 fosforilação
 é
 a
 seqüência

consenso
Ser‐Thr‐Gln‐Glu.

ATM
e
ATR
podem
ligar‐se
às
terminações
do
DNA
lesado,
o
que
resulta
na
ativação
da
função
cinase,
ou

possivelmente
 a
 ativação
 da
 ligação
 nas
 modificações
 da
 estrutura
 da
 cromatina
 induzida
 pelas
 radiações

ionizantes.
 
 Estas
 modificações
 poderiam
 induzir
 a
 autofosforilação
 da
 ATM,
 conduzindo
 à
 dissociação
 dos

dímeros
ATM
nos
monômeros
ativos.

Diversas
proteínas
de
reparo
[BRCA1,
MSH2,
MSH6,
MLH1,
ATM,
BLM
e
o
complexo
MRN]
co‐precipitam

imunologicamente
no
complexo
BRCA1
de
vigilância
associada,
denominado
BASC.

MLH1
 e
 MSH2
 então
 diretamente
 envolvidas
 na
 ativação
 de
 ATM.
 
 Após
 irradiação
 com
 radiações

ionizantes
 MLH1
 liga‐se
 a
 ATM
 e
 MSH2
 liga‐se
 a
 CHK2
 ,
 o
 que
 permite
 especular
 que
 o
 MMR
 reconhece
 as

lesões
induzidas
pelas
radiações
ionizantes,
formando
uma
configuração
que
permite
a
ATM
fosforilar
CHK2
e

ativar
o
ponto
de
checagem
da
fase
S.

ATM
 fosforila
 CHK2
 enquanto
 ATR
 fosforila
 CHK1.
 
 Ambas,
 CHK1
 e
 CHK2
 são
 capazes
 de
 fosforilar
 p53,

levando
 à
 estabilização
 de
 p53,
 isto
 é,
 impedindo
 a
 sua
 ubiquitinização
 e
 degradação.
 
 ATM
 e
 ATR
 também

podem
fosforilar
diretamente
p53,
aumentando
sua
atividade
de
transativação.

A
estabilização
e
o
aumento

da
atividade
de
transativação
leva
à
indução
de
p21,
que
inibe
o
complexo
CDK2‐ciclina
E‐PCNA,
resultando
no

bloqueio
G1/S.

CHK1
ativada
por
ATR
pode
fosforilar
CDC25a,
levando
à
ubiquitinização
e
degradação
da
proteína,
que

não
 pode
 mais
 ativar
 o
 complexo
 CDK2‐ciclina
 E
 pela
 desfosforilação
 de
 CDK2,
 resultando
 na
 parada
 G1/S

independente
de
p53.

CHK1
ativada
por
ATR
também
fosforila
CDC25c,
induzindo
a
ligação
de
CDC25c
à
proteína
14‐3‐3σ.

Este

complexo
é
levado
para
fora
do
núcleo
e
torna‐se
incapaz
de
desfosforilar
(ativar)
CDK1‐Ciclina
B,
conduzindo

à
parada
G2/M.

Além
do
papel
de
controle
dos
pontos
de
checagem,
ATM
e
ATR
também
regulam
o
reparo
do
DNA.
ATM

fosforila
 diversas
 proteínas
 associadas
 ao
 reparo,
 tais
 como:
 NBS1,
 BRCA1,
 RAD9
 e
 c‐ABLl,
 o
 que
 resulta
 na

fosforilação
de
RAD51.
Além
disto,
ATM
também
fosforila
a
histona
H2AX,
responsável
pela
criação
dos
“foci”

na
cromatina,
no
sítio
da
quebra,
para
onde
RAD50,
RAD51
e
BRCA1
serão
recrutadas.

A
 fosforilação
 de
 NBS1
 por
 ATM,
 em
 resposta
 à
 radiação
 ionizante,
 é
 necessária
 para
 a
 formação
 dos

“foci”
 nucleares
 MRN
 no
 sítio
 da
 lesão
 do
 DNA.
 O
 complexo
 MRN
 é
 um
 sensor
 que
 recruta
 ATM
 para
 as

quebras
duplas
e
promove
sua
fosforilação.
A
ativação
de
NF‐κB
(NF
=
Necrosis
Factor)
em
resposta
às
quebras

duplas
é
mediada
pela
fosforilação
de
IκB
cinase
dependente
de
ATM.

ATR
também
fosforila
proteínas
de
reparação
ou
fatores
associados,
como:
RAD17
e
BRCA1.

Em
adição,

após
 lesões
 no
 DNA
 ATM
 e
 DNA‐PKcs
 medeiam
 a
 fosforilação
 de
 c‐ABL.
 Isto
 atinge
 p53
 e
 p73,
 que
 exercem

atividade
pro‐apoptótica.

De
um
modo
geral
a
fosforilação
mediada
por
ATM/ATR,
principalmente
de
CHK1,
CHK2
e
p53,
é
crucial

para
gerar
os
sinais
de
parada
do
ciclo
celular
em
G1/S
e
G2/M,
apoptose
e
aumentar
o
reparo
de
DNA.

 VII
 45

Convém
 salientar
 que
 a
 deficiência
 em
 ATM
 causa
 ataxia
 telangiectasia,
 cuja
 característica
 é
 grande

sensibilidade
às
radiações
ionizantes.

Um
esquema
mostrando
a
ação
de
ATM/ATR
está
representado
na
figura
VII.25.








Figura
VII.25
–
Lesão
de
DNA.
Sinalização
via
ATM/ATR




Papel
de
PARP
no
reparo
de
DNA


 Um
 papel
 importante
 na
 regulação
 do
 reparo
 do
 DNA
 é
 realizado
 pelos
 membros
 da
 família
 PARP

[poli(ADP‐ribose)
polimerases].

Estas
enzimas
associadas
à
cromatina
modificam
diversas
proteínas
através
da

poli(ADP‐ribosilação).

PARP1,
 além
 de
 regular
 o
 reparo
 de
 DNA
 também
 está
 implicada
 na
 longevidade
 dos
 mamíferos
 e
 é

considerada
a
proteína
chave
entre
necrose
e
apoptose.

Ela
é
uma
proteína
de
113kDa,
com
dois
dedos
de

zinco
no
N‐terminal
e
com
o
sinal
de
localização
nuclear
no
C‐terminal.


 Em
 resposta
 às
 lesões
 induzidas
 pela
 radiação
 ionizante
 ou
 agentes
 alquilantes,
 PARP1
 liga‐se

especificamente
a
SSBs.
Após
a
ligação
ao
DNA
ela
se
autorribosila,
o
que
permite
sua
interação
não
covalente

com
outras
proteínas.


 Aparentemente,
PARP1
(e
possivelmente
PARP2)
está
envolvida
com
o
reparo
do
DNA
de
três
maneiras

diferentes:

(a) Pela
interação
direta
com
XRCC1
e
Polβ,
ambas
proteínas
chaves
para
o
mecanismo
BER.
PARP2
interage

com
XRCC1,
Polβ
e
DNA
ligaseIII.

In
vitro,
PARP1
estimula,
junto
com
FEN1
o
deslocamento
da
hélice
e
a

síntese
 de
 reparação
 por
 Polβ,
 estimulando
 o
 BER
 em
 longos
 fragmentos.
 
 Deve
 ser
 salientado
 que

camundongos
 deficientes
 em
 PARP1
 são
 hipersensíveis
 a
 metil
 nitroso
 uréia
 (MNU)
 e
 as
 células

germinativas
 desses
 animais
 são
 hipersensíveis
 a
 MMS,
 mostrando
 redução
 do
 reparo
 de
 quebras
 e

aumento
de
apoptose.

 VII
 46

(b) Pela
remodelação
da
estrutura
da
cromatina
após
a
indução
de
lesões
no
DNA,
foi
mostrado
que
PARP1

automodificada
interage
com
o
proteossoma
20s,
via
polímeros
ADP
ribose.
A
poli(ADP‐ribosilação)
do

proteossoma
 20s
 resulta
 no
 aumento
 da
 atividade
 proteolítica
 do
 proteossoma,
 que
 é
 o
 responsável

pela
degradação
de
histonas
oxidadas.

A
degradação
das
histonas
leva
à
remodelação
da
estrutura
da

cromatina
dando
acesso
às
enzimas
de
reparação
do
DNA.

(c) Uma
seqüência
consenso
de
ligação
de
poli(ADP‐
ribose)
foi
detectada
em
diversas
proteínas
de
reparo

e
de
controle
de
pontos
de
checagem,
tais
como:
p53,
p21,
XPA,
MSH6,
DNA
ligase
III,
XRCC1,
DNA‐PKcs,

KU70,
 NF‐κB,
 sintetase
 induzida
 por
 ácido
 nítrico,
 caspase
 ativada
 por
 DNAase
 e
 telomerase.
 
 Pela

interação
 com
 estes
 “motivos”,
 PARP1
 pode,
 potencialmente,
 interferir
 com
 diversas
 funções
 destas

proteínas,
envolvidas
em
reparação
do
DNA,
regulação
do
ciclo
celular,
apoptose,
etc.

Na
figura
VII.26
está
representado
um
modelo
proposto
para
a
atuação
de
PARP.






Figura
VII.26
–
Papel
de
PARP
na
repação
de
DNA



PARADA
DA
REPLICAÇÃO
E
SÍNTESE
TRANSLESÃO


 Em
E.
coli
foram
isoladas
cinco
polimerases.
A
PolI
é
requerida
para
a
maturação
da
hélice
descontínua
e
é

a
responsável
pela
complementação
dos
diferentes
sistemas
de
reparação.
A
Pol
III
é
a
polimerase
replicativa.


Após
exposição
a
agentes
que
lesam
o
DNA,
as
células
de
E.
coli
respondem
através
do
sistema
SOS,
induzindo

mais
 de
 30
 genes
 envolvidos
 na
 reparação
 do
 DNA.
 
 Entre
 os
 genes
 induzidos
 três
 codificam
 para
 
 DNA

polimerases
não
essenciais:
PolII,
PolIV
e
PolV.


 A
PolII
é
requerida
para
reiniciar
a
replicação
livre
de
erros
nas
lesões
induzidas
por
UV.

A
replicação
pára

quando
 PolIII
 encontra
 uma
 lesão
 bloqueadora.
 A
 forquilha
 retrocede
 e
 a
 hélice
 filha
 neossintetizada
 serve

como
molde
para
a
síntese
posterior
por
PolII.
O
tamanho
sintetizado
depende
do
que
foi
sintetizado
na
hélice

não
lesada.
A
forquilha
é
restabelecida
por
migração
reversa
das
hélices,
atravessando
a
lesão
sem
repará‐la.


A
lesão
poderá
ser
reparada
mais
tarde
por
outros
mecanismos.

 VII
 47


 In
 vitro,
 PolII
 pode
 sintetizar
 através
 de
 sítios
 AP
 e
 alguns
 adutos
 por
 um
 mecanismo
 denominado

desalinhamento
de
“primers”,
que
ocorre
em
seqüências
repetidas.
Neste
caso
o
deslizamento
de
“primer”
e

“template”
provoca
“loops”
e
a
polimerização
leva
a
mutações
“frameshift”.


 A
PolIV
é
o
produto
do
gene
dinB
(isolado
há
mais
de
20
anos)
mas
somente
recentemente
caracterizado

como
codificador
de
uma
DNA
polimerase.


 Esta
 polimerase
 existe
 normalmente
 nas
 células,
 mas
 é
 induzida
 cerca
 de
 10
 vezes
 na
 resposta
 SOS.
 
 A

PolIV
não
é
capaz
de
atravessar
dímeros
de
pirimidinas
mas
algumas
lesões
parecidas
são
atravessadas
e
ela

também
 é
 capaz
 de
 estender
 “primers”
 desalinhados.
 Além
 disto
 ela
 também
 pode
 atuar
 nas
 forquilhas

paradas
nas
lesões,
estendendo
terminais
aberrantes.

Os
mutantes
dinB
não
são
deficientes
em
reparação
do

DNA
 mas
 têm
 deficiência
 em
 mutagênese
 não
 dirigida,
 portanto,
 muito
 mais
 mutações
 são
 observadas
 na

progênie
 de
 fagos
 lambda
 propagados
 em
 células
 irradiadas
 que
 nas
 não
 irradiadas.
 
 PolIV
 também
 é

responsável
pela
maioria
das
mutações
“frameshift”
adaptativas
do
gene
lacZ(‐1)


 A
PolV
é
o
produto
dos
genes
umuDC.
Ela
é
capaz
de
atravessar
dímeros
de
pirimidinas
e
sítios
AP
in
vitro.

Além
disto,
a
mutagênese
observada
em
células
irradiadas
com
UV,
transições
T→C
nos
dímeros
de
timina
são

correlacionadas
com
a
capacidade
da
PolV
atravessar
os
dímeros.

A
expressão
desta
polimerase
é
altamente

regulada
 tanto
 ao
 nível
 de
 transcrição
 como
 postranscricionalmente
 possivelmente
 para
 evitar
 grande

quantidade
 de
 mutações
 no
 DNA.
 UmuC
 é
 a
 mutapolimerase
 e
 UmuD,
 após
 processamento
 por
 RecA
 co‐
protease
auxilia
UmuC.


 Na
figura
VII.27
está
representado
um
modelo
proposto
para
a
atuação
dessas
polimerases.




Figura
VII.27
–
Replicação
translesões





 Até
 o
 momento
 foram
 detectadas
 16
 polimerases
 em
 eucariotos.
 Três
 destas;
 Polα,
 Polδ
 e
 Polε
 são

requeridas
para
replicação
do
cromossomo
e
outra,
a
Polγ
é
requerida
para
replicação
do
DNA
mitocondrial
e

para
reparação.

As
outras
12
parecem
ter
funções
especializadas
no
reparo
e
na
estabilidade
cromossômica.


As
 proteínas
 de
 reparo
 associadas
 com
 a
 recuperação
 e
 a
 ultrapassagem
 do
 bloqueio
 da
 replicação
 são

denominadas
polimerases
sujeitas
a
erros
ou
mutapolimerases.
 

Grandes
 lesões
 bloqueiam
 a
 replicação
 do
 DNA
 diretamente,
 o
 que
 leva
 ao
 recrutamento
 de
 diversas

proteínas
 de
 reparo
 para
 o
 local
 da
 lesão,
 isto
 é,
 para
 a
 forquilha
 de
 replicação
 parada.
 Como
 este

recrutamento
 é
 feito
 ainda
 não
 se
 sabe.
 
 Durante
 a
 replicação
 normal,
 PCNA
 forma
 um
 anel
 deslizante
 e

estimula
a
replicação
pelas
DNA
polimerases.
O
transportador
de
PCNA
é
feito
pelo
chamado
transportador
de

anéis,
 que
 é
 idêntico
 ao
 fator
 de
 replicação
 C
 (RFC).
 
 No
 reparo
 do
 DNA
 a
 função
 de
 PCNA
 é
 terminada
 por

 VII
 48

outro
transportador
específico
das
lesões
(complexo
RAD9‐1‐1),
formado
pelas
proteínas
RAD9,
HUS1
e
RAD1,

que
pode
servir
a
diversas
proteínas
de
reparo.
(Após
irradiação
com
radiações
ionizantes
HUS1
desloca‐se
do

citosol
para
o
núcleo,
onde
se
associa
com
PCNA
e
RAD9).


 Após
 a
 irradiação,
 outra
 proteína,
 a
 RAD17
 é
 fosforilada
 por
 ATR
 e
 então
 recruta
 o
 complexo
 RAD9‐1‐1

para
 a
 cromatina.
 Há
 indicações
 de
 que
 RAD17
 substitui
 RFC1,
 a
 maior
 subunidade
 do
 complexo
 RFC,

formando
um
novo
complexo
com
as
outras
unidades
do
RFC,
designado
RAD17‐RFC,
que
é
o
transportador
de

anéis
para
RAD9‐1‐1.

Em
leveduras
já
foi
mostrado
que
a
mutapolimerase
DINB
interage
com
HUS1/RAD1,
e

sua
associação
com
a
cromatina
é
dependente
de
RAD17.




 A
síntese
de
DNA
translesão
é
feita
pelas
polimerases
eta,
kappa,
iota,
mu
e
zeta.


 A
 polimerase
 eta
 (Polη
 =
 POLH,
 RAD30,
 XPV)
 é
 uma
 enzima
 de
 baixa
 fidelidade
 pois
 não
 tem
 a
 função

editorial
 (atividade
 exonuclease
 3’→5’),
 portanto
 erra
 muito
 (10‐2
 a
 10‐3).
 
 A
 Polη
 está
 implicada
 na
 forma

variante
de
xeroderma
pigmentosum
(XPV)
e
reduz
a
sensibilidade
ao
UV
nas
células
XP.
Em
verdade
a
Polη

tem
 a
 capacidade
 de
 inserir
 AA
 em
 frente
 a
 dímeros
 de
 timina.
 No
 XPV
 ela
 está
 mutada
 e
 sua
 função
 é

substituída
por
Polι,
que
erra
muito
mais
e
introduz
mutações,
levando
ao
câncer.


 A
polimerase
kappa
humana
(Polκ
=
POLK,
DINB)
é
homóloga
à
DNA
polimerase
IV
codificada
pelo
gene

dinB
de

E.
coli.
Polκ
também
exibe
alta
taxa
de
erros,
mas
em
contraste
com
as
outras
mutapolimerases
tem

moderada
processividade
e
pode
sintetizar
mais
de
25
nucleotídeos
durante
a
síntese
translesão.


 A
polimerase
iota
(Polι
=
POLI,
RAD30B)
é
o
homólogo
de
RAD30
de
S.
cerevisiae,
e
tem
uma
taxa
de
erros

de
1x10‐2,
errando
mais
em
frente
a
timina
e
menos
em
frente
a
adenina.


 A
 polimerase
 humana
 mu
 (Polµ
 =
 POLM)
 tem
 grande
 analogia
 com
 a
 deoxinucleotidil
 transferase

terminal.


 A
polimerase
zeta
(Polζ
=
POLG,
REV3L)
é
constituída
por
duas
sub‐unidades
(REV3
e
REV7)
que
cooperam

com
REV1.


 Algumas
 mutapolimerases,
 além
 de
 fazer
 a
 síntese
 translesão
 parecem
 também
 estar
 envolvidas

diretamente
na
remoção
de
lesões.

A
polimerase
lambda
humana
(Polλ
=
POLL)
tem
homologia
de
32%
com

Polβ
=
POLB,
e
tem
atividade
desoxirribose
fosfato
liase
(dRPase),
inserindo
nucleotídeos
em
pequenas
lacunas

contendo
5’‐fosfato,
sendo
portanto
associada
a
BER.


 Polι
parece
atuar
em
BER
de
pares
G:U
e
A:U,
devido
à
sua
atividade
5’‐deoxiribose
fosfato
(dRP)
liase


 Pouco
 se
 sabe
 acerca
 das
 DNA
 polimerases
 humanas
 sigma
 [Polσ
 =
 POLS,
 TRF4
 (DNA
 Topoisomerase

Related
Function)],
assim
como
da
DNA
polimerase
theta
(Polθ
=
POLQ),
que
é
homóloga
do
produto
do
gene

mus308
 de
 D.
 melanogaster,
 que
 codifica
 uma
 DNA
 polimerase‐helicase
 talvez
 envolvida
 na
 reparação
 de

ligações
cruzadas.


 Interessantemente
 Polµ
 está
 envolvida
 na
 hipermutação
 dos
 genes
 da
 imunoglobulina
 e
 participa
 no

fechamento
dos
terminais,
durante
a
recombinação
V(D)J

e
no
NHEJ.


 As
 mutapolimerases
 são
 as
 maiores
 responsáveis
 pela
 mutagênese
 induzida
 por
 agentes
 que
 causam

lesões
no
DNA
capazes
de
parar
a
forquilha
de
replicação.

Elas
talvez
representem
o
elo
entre
as
funções
SOS

mutagênicas

de

E.
coli
(controladas
por
RecA
e
UmuDC)
e
as
funções
SOS
em
mamíferos.


 Na
tabela
VII.2
estão
relacionadas
as
mutapolimerases
humanas
e
suas
respectivas
famílias.


 Devido
a
grandes
confusões
relacionas
aos
nomes
das
polimerases
humanas
em
diferentes
trabalhos,
foi

proposta
uma
nova
nomenclatura

HUGO
(HUman
Genome
Organization),
que
também
consta
da
tabela.


 

 VII
 49

TABELA
 VII.2
 –
 Famílias
 de
 DNA
 polimerases
 de
 eucariotos.
 Nomenclatura
 HUGO
 (Human
 Genome

Organization).
NI
‐
ainda
não
identificado

FAMÍLIA

 DESIGNAÇÃO
GREGA

 S.
cerevisiae

 NOME
HUGO



A

 gamma
(Pol
γ)

 MIP1

 POLG



A

 theta
(Polθ)

 NI

 POLQ


B

 alpha
(Polα)

 POL1

 POLA


B

 delta
(Polδ)

 POL3

 POLD1


B

 epsilon
(Polε)

 POL2

 POLE


B

 zeta
(Polζ)

 REV3/REV7

 POLG


B

 phi
(Polπ)

 POL5

 NI


X

 beta
(Polβ)

 NI

 POLB


X

 lambda
(Polλ)

 POL4

 POLL


X

 Terminal
Transferase

 NI

 TDT


X

 mu
(Polμ)

 NI

 POLM


X

 sigma
(Polσ)

 TRF4/TRF5

 POLS


Y

 Rev1

 REV1

 REV1


Y

 eta
(Polη)

 RAD30

 POLH


Y

 iota
(Polι)

 NI

 POLI


Y

 kappa
(Polκ)

 NI

 POLK





REPARAÇÕES
INDUTIVAS


 Agentes
físicos
ou
químicos
podem
provocar
respostas
celulares
articuladas,
mediadas
por
determinados

sinais
e
expressadas,
fenotipicamente,
pela
desrepressão
de
um
ou
mais
genes,
que
são
transcritos
em
RNA

mensageiro
e
traduzidos
em
proteínas.





Respostas
adaptativas


 Quando
 células
 procarióticas
 ou
 eucarióticas
 são
 incubadas
 com
 concentrações
 reduzidas
 (subletais)
 de

determinados
 agentes
 químicos,
 elas
 podem
 tornar‐se
 mais
 resistentes
 a
 tratamentos
 posteriores
 com

concentrações
elevadas
(letais)
do
mesmo
agente,
como
pode
ser
visto
na
figura
VII.28A.


 Este
fenômeno,
conhecido
como
reparação
adaptativa,
é
explicado
pelo
acúmulo
intracelular
de
uma
ou

mais
enzimas
capazes
de
eliminar
lesões
provocadas,
no
DNA,
pelo
tratamento,
reduzindo
assim
seus
efeitos

letais
ou
mutagênicos;
para
que
ela
se
expresse,
é
indispensável
que
a
célula
possa
sintetizar
proteínas
após
o

primeiro
tratamento
"indutor".

a)
agentes
alquilantes


 Em
 E.
 coli
 e
 em
 algumas
 outras
 espécies
 bacterianas,
 pelo
 menos
 duas
 enzimas
 acumulam‐se
 após
 o

tratamento
 indutor,
 ambas
 capazes
 de
 promover
 a
 eliminação
 de
 lesões
 provocadas
 no
 DNA
 por
 agentes

alquilantes
 e,
 portanto,
 de
 reduzir
 a
 inativação
 celular
 e
 a
 mutagênese
 produzidas
 por
 estes
 agentes,
 como

pode
ser
visto
na
figura
VII.28B.


 



 VII
 50




FIGURA
VII.28
–
Sobrevivência
e
mutagênese
de
culturas
bacterianas,
adaptadas
ou
não,
tratadas
com
agentes

alquilantes.




 A
O6Metilguanina‐DNA
Metiltransferase,
produto
do
gene
ada
remove
grupamentos
alquil
inseridos
nas

posições
O6
da
guanina,
O4
da
timina
e
da
ligação
fosfotriéster,
transferindo‐os
para
uma
cisteína
constituinte

da
 proteína,
 o
 que
 justifica
 a
 sua
 inativação
 durante
 o
 processo.
 Uma
 vez
 que
 a
 metilação
 da
 guanina
 na

posição
O6
conduz,
durante
a
replicação
semiconservativa
do
DNA,
a
erros
de
emparelhamento,
torna‐se
fácil

entender
os
efeitos
mutagênicos
deste
tipo
de
lesão
e
a
importância
da
reparação
adaptativa
na
redução
da

mutagênese.
 
 Em
 células
 de
 E.
 coli
 não
 adaptadas
 existem
 entre
 20
 e
 60
 moléculas
 desta
 enzima,
 cuja

concentração
pode
ser
multiplicada
por
100
ou
200
em
conseqüência
do
tratamento
indutor.

Quando
a
transferência
é
feita
da
O6‐metil
guanina
ou
da
O4‐metil
timina
o
metil
é
capturado
pela
cisteína

321
 do
 sítio
 ativo
 C
 terminal
 (VIPCHRVI)
 e
 a
 enzima
 é
 inativada,
 entretanto
 quando
 o
 metil
 é
 retirado
 do

fosfotriéster
 ele
 é
 capturado
 pela
 cisteína
 38
 (do
 N
 terminal)
 e
 não
 pela
 69
 como
 sugerido
 previamente,
 a

enzima
transforma‐se
em
um
ativador
do
seu
próprio
gene,
conduzindo
à
síntese
de
milhares
de
moléculas
da

proteína
Ada.


 Quando
 da
 metilação
 de
 cys
 38,
 que
 é
 irreversível,
 Ada
 transforma‐se
 na
 ativadora
 da
 transcrição
 dos

genes
da
resposta
adaptativa,
ada‐alkB,
alkA
e
aidB,
uma
vez
que,
neste
caso,
a
mudança
conformacional
de

Ada
aumenta
a
capacidade
de
ligação
aos
promotores
destes
genes,
facilitando
a
ligação
da
RNA
polimerase.




 A
transformação
da
proteína
Ada
conduz
à
desrepressão
de
outro
gene,
o
alkA,
que
codifica
a
síntese
da

3‐metil
 adenina
 DNA
 glicosilase
 II
 (AlkA)
 
 que
 remove
 bases
 metiladas
 em
 diferentes
 posições
 (N3
 e
 N7
 da

guanina,
O2
da
citosina,
N3
e
N7
da
adenina
e
O2
da
timina,
entre
outras).


 Na
 figura
 VII.29
 está
 representado
 esquematicamente
 o
 processo
 da
 resposta
 adaptativa
 para
 agentes

alquilantes.



 VII
 51




FIGURA
 VII.29
 –
 Regulação
 da
 resposta
 adaptativa
 pela
 proteína
 Ada
 e
 expressão
 dos
 principais
 genes

envolvidos
em
E.
coli.




 Em
 células
 não
 adaptadas
 a
 proteína
 AlkA
 atua
 juntamente
 com
 a
 Tag,
 mas
 a
 quantidade
 desta
 não
 se

altera
durante
a
adaptação;
em
células
adaptadas,
a
quantidade
de
AlkA
é
multiplicada
por
20,
e
esta
enzima

passa
a
ter
um
papel
importante
na
eliminação
de
bases
alteradas.



 A
proteína
Ada
também
regula
outros
genes
tais
como
o
alkB
e
o
aidB.



 O
 papel
 da
 proteína
 AlkB
 é
 o
 reparo
 de
 N1MeA
 e
 N3MeC
 em
 DNA
 em
 hélice
 simples,
 já
 descrito

anteriormente.
Por
outro
lado,
o
papel
da
proteína
AidB
ainda
não
está
bem
estabelecido.
Aparentemente
ela

inativa
agentes
alquilantes
antes
que
eles
causem
as
lesões,
não
participando
do
reparo
das
lesões.


 Em
células
humanas
o
gene
da
O6MGT
foi
o
primeiro
que
mostrou
ser
indutível
por
estresses
genotóxicos

e
por
glicocorticóides,
conduzindo
à
resposta
adaptativa
das
células
aos
efeitos
citotóxicos
e
mutagênicos
de

agentes
alquilantes
simples.


 A
 expressão
 de
 O6MGT
 é
 regulada
 pela
 metilação
 do
 gene
 e
 do
 promotor.
 A
 metilação
 do
 promotor

provoca
a
inibição
e
a
metilação
do
gene
resulta
no
aumento
da
expressão
da
proteína.
A
metilação
também

está
envolvida
na
resistência
adquirida
por
células
de
melanoma
contra
drogas
anticâncer
contendo
cloroetila.


 Em
células
eucarióticas
ainda
não
se
detectou
a
reparação
das
metilações
nas
ligações
fosfotriéster.



b)
agentes
oxidantes


 A
 resposta
 adaptativa
 tem
 sido
 descrita
 após
 tratamento
 com
 diversos
 agentes
 químicos,
 inclusive
 com

peróxido
 de
 hidrogênio,
 substância
 que
 atua
 tendo
 como
 intermediários
 radicais
 livres,
 especialmente
 o

radical
 hidroxil.
 Existem
 evidências
 de
 que
 células
 pré‐tratadas
 com
 peróxido
 de
 hidrogênio
 tornam‐se
 mais

resistentes
ao
UV
longo,
reforçando
a
idéia
deste
tipo
de
radiação
atuar
por
meio
de
EAO.


 O
 gene
 oxyR
 codifica
 a
 proteína
 OxyR,
 responsável
 pelo
 aumento
 da
 resistência
 celular
 ao
 peróxido
 de

hidrogênio.
 O
 produto
 do
 gene
 oxyR
 é
 um
 regulador
 positivo
 de
 pelo
 menos
 9
 genes.
 Pelo
 tratamento
 com

peróxido
de
hidrogênio
a
proteína
OxyR
é
oxidada
em
dois
de
seus
resíduos
cisteína
acarretando
sua
ativação.


Uma
 vez
 ativada,
 OxyR
 ativa
 a
 transcrição
 de
 diversos
 genes
 tais
 como:
 katG
 (catalase
 hidroperoxidase
 I),

ahpCF
(alquilhidroperóxido‐NADPH
oxido‐redutase),
grxA,
(glutaredoxina),
gor
(glutationa
redutase),
dps
(uma

 VII
 52

proteína
 que
 protege
 o
 DNA
 das
 lesões
 de
 peróxidos)
 e
 fur
 (um
 controlador
 do
 transporte
 de
 ferro
 para
 a

célula).
Os
outros
genes
ativados
ainda
não
foram
detectados.


 Além
disto,
OxyR
ativa
a
síntese
de
oxyS,
que
codifica
um
mRNA
não
transcrito
que
parece
regular
mais
de

20
genes
adicionais,
possivelmente
por
um
mecanismo
antissense.


 Recentemente
 foi
 detectado
 mais
 um
 gene
 que
 requer
 OxyR
 para
 a
 sua
 indução;
 henF,
 cujo
 produto
 é

requerido
 para
 a
 ativação
 de
 hidroperoxidase
 I
 e
 hidroperoxidase
 II.
 E
 por
 técnicas
 de
 “microarray”
 foram

detectados
 diversos
 genes
 ativados
 por
 OxyR:
 henH,
 cujo
 produto
 atua
 na
 síntese
 do
 heme,
 seis
 genes
 do

operon
 suf
 que
 parecem
 participar
 na
 reparação,
 no
 “cluster”
 de
 Fe‐S,
 e
 mais
 quatro
 genes
 de
 função

desconhecida


 Além
do
gene
oxyR
as
células
tratadas
com
peróxido
de
hidrogênio
induzem
um
conjunto
de
21
proteínas,

três
das
quais
são
também
induzidas
pelo
choque
térmico.

O
mecanismo
molecular
da
indução,
pelo
peróxido

de
hidrogênio,
dos
genes
independentes
de
oxyR
ainda
não
é
conhecido.


 Da
mesma
forma
que
para
o
peróxido
de
hidrogênio,
o
tratamento
com
substâncias
que
geram
radicais

superóxido,
 tais
 como:
 paraquat
 e
 menadiona,
 torna
 as
 células
 resistentes
 
 a
 altas
 doses
 desses
 agentes,
 na

dependência
da
integridade
do
locus
soxRS.


 Este
 sistema
 regulatório
 age
 em
 duas
 etapas,
 sendo
 SoxR
 uma
 proteína
 sensora
 e
 ativadora.
 
 Quando

ativada
 pela
 oxidação
 dos
 clusters
 2Fe‐2S,
 SoxR
 induz
 a
 transcrição
 de
 soxS,
 um
 regulador
 positivo
 que

estimula
 a
 transcrição
 de
 mais
 de
 16
 outros
 genes
 responsáveis
 pela
 resposta
 a
 superóxido.
 
 Normalmente

este
 sistema
 não
 é
 ativado
 por
 peróxido
 de
 hidrogênio,
 entretanto
 foi
 demonstrado
 recentemente
 que,
 em

condições
muito
especiais
tanto
o
H2O2
como
o
oxigênio
singleto,
podem
ativar
SoxRS.


 Os
produtos
do
regulon
soxRS
induzido
incluem:
Mn‐superóxido
dismutase
(sodA),
endonuclease
IV
(nfo),

glicose‐6‐fosfato
 desidrogenase
 (zwf),
 aconitase
 (acnA),
 fumarase
 estável
 (fumC),
 ferridoxina
 redutase
 (fpr),

bomba
 de
 efluxo
 de
 toxinas
 e
 antibióticos
 (acrAB),
 mRNA
 antissense
 para
 a
 porina
 OmpF
 (micF)
 e
 o

controlador
de
transporte
de
ferro
para
a
célula
(fur)
e
outros
ainda
não
conhecidos.
 

Os
radicais
superóxido
 induzem
 proteínas
que
são
diferentes
das
induzidas
pelo
produto
do
 gene
 oxyR.

Uma
 destas
 proteínas
 é
 a
 endonuclease
 IV
 (produto
 do
 gene
 nfo),
 que
 é
 a
 única
 enzima
 de
 reparação

conhecida
induzida
por
esta
via
de
estresse
oxidativo.



 Em
 células
 de
 mamíferos
 ainda
 não
 foi
 detectada
 uma
 resposta
 articulada
 induzida
 pelo
 estresse

oxidativo.



c)
termotolerância


 Quando
células
são
expostas
a
altas
temperaturas
(não
letais)
uma
série
de
proteínas
de
choque
térmico

(HSPS)
são
induzidas
e,
neste
caso,
as
células
ficam
protegidas
contra
o
efeito
de
temperaturas

mais
elevadas

(letais).
 
 Em
 E.
 coli
 o
 aumento
 da
 temperatura
 de
 37°C
 para
 42°C
 induz
 estas
 proteínas
 e
 as
 células
 ficam

protegidas
contra
os
efeitos
letais
de
subseqüente
aquecimento
a
52°C.


 Em
E.
coli
o
aumento
da
temperatura
ativa
e
estabiliza
o
fator
de
transcrição
das
HSPS
(σ32),
produto
do

gene
rpoH
(htpR),
impedindo
sua
ligação
com
duas
das
proteínas
induzidas,
DnaK
e
DnaJ.


 Algumas
 destas
 proteínas
 são
 induzidas
 por
 outros
 agentes
 tais
 como
 análogos
 de
 aminoácidos,

deprivação
 de
 fontes
 de
 carbono,
 infecção
 por
 fagos,
 tratamento
 com
 etanol,
 etc,
 sugerindo
 que
 as
 HSPS

podem
proteger
as
células
contra
uma
variedade
de
estresses
ambientais.


 Durante
o
choque
térmico
são
induzidas
pelo
menos
20
proteínas
em
E.
coli
e
quase
todas
são
homólogas

às
induzidas
em
células
eucarióticas.


 A
 maioria
 destas
 proteínas,
 incluindo
 DnaK,
 DnaJ,
 GrpE,
 GroEL,
 etc,
 são
 denominadas
 chaperonas
 ou

chaperoninas
 ("protetores"),
 uma
 vez
 que,
 quando
 superproduzidas
 podem
 proteger
 várias
 outras
 proteínas

da
inativação
pelo
calor.

Algumas
delas
(DnaK,
DnaJ
e
GrpE)
conseguem
reativar
proteínas
desnaturadas
tais

como
a
RNA
polimerase
e
proteínas
ribossomais.

 VII
 53


 Por
outro
lado,
pelo
menos
três
(Lon,
Clp
e
DegP)
são
proteases
que
estão
envolvidas
na
degradação
de

proteínas
desnaturadas
não
"reparáveis",
que
se
acumulam
durante
o
crescimento
normal
ou
em
condições

de
estresse.


 Em
 células
 humanas
 as
 proteínas
 induzidas
 pelo
 choque
 térmico
 são
 homólogas
 às
 induzidas
 nas

bactérias.



FUNÇÕES
SOS


 Em
 termos
 de
 reparo,
 particular
 importância
 tem
 sido
 dada
 a
 um
 conjunto
 de
 funções
 celulares

desreprimidas
 quando
 surgem
 lesões
 no
 DNA,
 as
 chamadas
 funções
 SOS,
 cuja
 expressão
 é
 dependente
 da

existência
 de
 alelos
 selvagens
 de
 dois
 genes,
 recA
 e
 lexA.
 
 Em
 E.
 coli,
 pelo
 menos
 40
 genes
 já
 foram

identificados
 como
 capazes
 de
 se
 desreprimir
 nestas
 condições,
 o
 que
 caracteriza
 a
 pleiotropia
 da
 unidade

genética
 constituída
 por
 recA
 e
 
 lexA.
 
 Em
 muitos
 casos,
 estas
 respostas
 só
 se
 expressam
 em
 condições
 de

máxima
eficiência
quando
a
biossíntese
protéica
encontra‐se
plenamente
funcionante.



a)
controle
molecular
das
funções
SOS


 O
sistema
de
controle
de
expressão
das
funções
SOS
é
relativamente
complexo,
envolvendo
as
proteínas

RecA
 e
 LexA.
 
 O
 modelo
 hoje
 admitido
 fundamenta‐se
 nos
 seguintes
 princípios,
 todos
 já
 verificados

experimentalmente,
ao
menos
em
E.
coli,
e
mostrados
esquematicamente
na
figura
VII.30.






FIGURA
VII.30
–
Esquema
do
modelo
proposto
para
a
regulação
da
expressão
gênica
das
funções
SOS
em
E.

coli.
(Miroslav
Radman,
1973)




a) o
produto
do
gene
lexA
(proteína
LexA)
é
o
repressor
de
diversos
genes,
entre
os
quais
encontram‐se

o
 próprio
 gene
 lexA,
 o
 gene
 recA,
 genes
 ligados
 a
 processos
 de
 reparação,
 
 genes
 ligados
 a
 outras

funções
celulares
como
a
filamentação,
etc.;

b) a
proteína
RecA
é
uma
enzima
multifuncional,
desempenhando
diversos
papéis
na
célula
(controle
da

recombinação
genética
e
da
reparação
pós‐replicativa,
por
exemplo);
quando
ocorre
o
sinal
indutor,

algumas
 moléculas
 desta
 proteína
 passam
 ao
 estado
 co‐proteolítico
 (co‐protease
 RecA),
 cuja

 VII
 54

interação
 com
 a
 proteína
 LexA
 promove
 a
 auto‐clivagem
 desta
 última;
 como
 esta
 é
 o
 repressor
 de

diversos
 genes,
 estes
 se
 desreprimem,
 inclusive
 o
 próprio
 gene
 recA,
 do
 que
 resulta
 o
 aumento
 da

quantidade
intra‐celular
das
proteínas
RecA,
LexA
e
outras
que
estavam
reprimidas
por
LexA;

c) após
a
eliminação
das
lesões
(e
conseqüentemente
do
sinal
indutor),
o
nível
de
co‐protease
RecA
se

reduz
e
a
proteína
LexA,
neste
momento
acumulada
na
célula,
volta
a
reprimir
os
genes
indutíveis;

d) mesmo
 seqüências
 informacionais
 que
 não
 sejam
 reprimidas
 pela
 proteína
 LexA
 poderão
 ser

liberadas
 do
 controle
 se
 seus
 repressores
 possuírem
 estrutura
 relativamente
 semelhante
 à
 da

proteína
LexA,
pois
a
protease
RecA
será
também
capaz
de
clivá‐los,
o
que
ocorre,
por
exemplo,
com

o
repressor
do
profagoλ.


 Além
dos
danos
produzidos
no
DNA
por
agentes
físicos
ou
químicos,
outros
fenômenos
podem
provocar
o

aparecimento
 do
 sinal
 indutor,
tais
como
o
bloqueio
da
replicação
semiconservativa
do
DNA
ou,
no
 caso
 de

certos
mutantes
bacterianos
termossensíveis,
a
incubação
das
células
em
temperaturas
não
permissíveis.



b)
papel
dos
genes
recA
e
lexA


 Grande
 parte
 dos
 conhecimentos
 que
 tornaram
 possível
 a
 proposição
 dos
 modelos
 SOS
 foi
 obtida

mediante
 o
 isolamento
 e
 caracterização
 de
 diversos
 mutantes
 de
 E.
 coli,
 possuidores
 de
 alterações
 nas

seqüências
 informacionais
 dos
 genes
 recA
 e
 lexA.
 
 A
 análise
 do
 papel
 destes
 genes
 foi
 também
 bastante

facilitada,
nos
últimos
anos,
pelo
emprego
de
técnicas
de
DNA
recombinante.


 As
principais
mutações
isoladas
no
gene
recA
são:

 recA
 (Def),
 que
 acarreta
 bloqueio
 de
 todas
 as
 funções
 das
 quais
 participa
 a
 proteína
 RecA,

incluindo
a
inexistência
de
recombinação
genética,
de
reparo
pós
replicativo
e
a
impossibilidade

de
expressão
das
funções
SOS,
uma
vez
que
não
há
produção
de
co‐protease
RecA;

 recA
441,
que
faz
ser
a
proteína
RecA
ativável
para
o
estado
proteolítico,
mesmo
na
ausência
de

lesões
 no
 DNA
 ou
 de
 bloqueio
 da
 replicação
 semiconservativa,
 por
 simples
 aumento
 de

temperatura
(37°C
para
42°C);

 recA
 430,
 que
 bloqueia
 a
 função
 de
 co‐protease
 da
 proteína
 RecA,
 mantendo
 intacta
 a
 função

recombinacional;

 recA
142,
que
bloqueia
a
função
recombinacional
da
proteína
RecA,
mantendo
intacta
a
função

de
co‐protease.

As
principais
mutações
isoladas
no
gene
lexA
são:

 lexA
 (Ind‐),
 que
 acarreta
 a
 síntese
 de
 uma
 proteína
 LexA
 resistente
 à
 clivagem;
 desta
 forma,
 os

genes
não
podem
ser
desreprimidos
e
as
funções
SOS
não
se
expressam;

 lexA
(Ts),
que
leva
à
síntese
de
uma
proteína
LexA
termossensível,
de
tal
forma
que,
mesmo
em

ausência
de
lesões
no
DNA,
as
funções
SOS
se
expressam
a
42°C;

 lexA
(Def),
que,
pela
deficiência
em
proteína
LexA,
leva
à
expressão
permanente
(constitutiva)
das

funções
SOS.


 Muitos
 dos
 atuais
 conhecimentos
 sobre
 o
 controle
 exercido
 pela
 unidade
 genética
 recA‐lexA
 foram

obtidos
 por
 meio
 de
 experimentos
 realizados
 com
 o
 emprego
 do
 bacteriófago
 Mu,
 cujo
 DNA,
 após
 infectar

uma
 célula
 bacteriana,
 pode
 incorporar‐se
 aleatoriamente
 no
 DNA
 celular,
 ou
 seja,
 pode
 inserir‐se
 nos
 mais

diversos
sítios
do
cromossomo.

Por
meio
de
técnicas
de
DNA
recombinante
foi
construído
um
fago
Mu
com
as

seguintes
características:
(i)
operador
não
funcionante,
o
que
torna
a
expressão
de
seus
genes
dependente
do

operador
do
cromossomo
da
bactéria;
(ii)
inserção,
no
conteúdo
informacional
do
DNA
do
fago,
do
gene
lacZ,

gene
estrutural
que
codifica
para
a
síntese
da
β‐galactosidase;
(iii)
sítios
normais
e
funcionais
para
integração

no
 cromossomo
 bacteriano.
 
 Quando
 este
 DNA
 viral
 insere‐se
 no
 gene
 estrutural
 de
 uma
 determinada

proteína
bacteriana,
esta
não
é
mais
sintetizada,
mas
o
operador
deste
gene
passa
a
controlar
a
formação
de
β
‐galactosidase.
 
 Se
 a
 inserção
 ocorre
 em
 um
 operon
 que
 se
 expresse
 constitutivamente,
 a
 enzima
 será

permanentemente
 sintetizada
 em
 níveis
 correspondentes
 à
 proteína
 constitutiva
 controlada
 pelo
 operon;

quando
a
inserção
se
processa
em
um
gene
indutível,
a
síntese
de
β‐galactosidase
obedecerá
ao
comando
do

 VII
 55

operador,
 isto
 é
 ocorrerá
 em
 nível
 basal
 nas
 células
 não
 induzidas
 e
 aumentará
 em
 presença
 do
 agente

indutor.

Nos
experimentos
visando
ao
estudo
das
funções

SOS,
a
bactéria
a
ser
infectada
era,
adicionalmente,

portadora
de
uma
deleção
no
gene
lacZ,
de
tal
forma
que
todas
as
moléculas
desta
enzima
formadas
podem

ser
 atribuídas
 à
 transcrição
 do
 gene
 contido
 no
 DNA
 viral.
 
 Assim,
 para
 acompanhar
 a
 desrepressão
 de
 uma

determinada
 região
 do
 cromossomo
 bacteriano,
 basta
 dosar,
 quimicamente,
 a
 β‐galactosidase.
 
 Nestas

condições,
 em
 mutantes
 lexA
 (Ind‐)
 a
 síntese
 de
 β‐galactosidase
 será
 basal
 em
 qualquer
 situação
 e
 nos

mutantes
lexA
(Def)
será
constitutivamente
alta
quando
a
inserção
do
fago
se
der
em
um
gene
indutível
pelo

sistema
SOS.


 Com
base
neste
tipo
de
procedimento,
e
em
outros
análogos,
foram
determinadas
as
posições,
no
mapa

cromossômico
de
E.
coli,
de
diversos
genes
desreprimidos
pelo
sinal
indutor
das
funções
SOS,
alguns
dos
quais

estão
relacionados
na
tabela
VII.3,
juntamente
com
as
funções
que
provavelmente
desempenham
na
célula.


Adicionalmente
 alguns
 genes
 contidos
 em
 plasmídeos
 podem
 também
 se
 expressar
 nestas
 condições,
 como

ocorre
 com
 os
 genes
 mucA
 e
 mucB,
 participantes
 do
 controle
 de
 processos
 incorretos
 de
 reparação
 e
 da

mutagênese
e
que
provavelmente,
são
alelos
dos
genes
bacterianos
umuC
e
umuD.
Alguns
genes
responsáveis

pela
síntese
de
colicinas,
também
contidos
em
plasmídeos,
desreprimem‐se
quando
ocorrem
lesões
no
DNA.


 A
 natureza
 do
 sinal
 indutor
 ainda
 é
 bastante
 controvertida,
 embora
 dele
 participem,
 provavelmente,

regiões
 do
 DNA
 em
 hélice
 simples
 (pelas
 lesões
 ou
 pela
 inibição
 da
 replicação)
 e
 o
 trifosfato
 de
 adenosina

(ATP).
 
 Nestas
 condições,
 como
 mostrado
 na
 figura
 VII.30.
 algumas
 moléculas
 da
 proteína
 RecA
 passam
 ao

estado
co‐proteolítico
e,
desta
forma,
adquirem
a
capacidade
de
promover
a
auto‐clivagem
da
proteína
LexA
e

outros
repressores,
cuja
estrutura
primária
tenha
algumas
afinidades
com
aquela,
o
que
ocorre,
por
exemplo,

com
o
repressor
do
profago
λ.


 A
análise
da
seqüência
de
bases
nitrogenadas
nos
operadores
de
vários
genes
que
se
expressam
quando

as
funções
SOS
são
induzidas
permitiu
verificar
a
existência
de
significativas
homologias
entre
elas,
provável

razão
de
serem
reprimidos
pela
mesma
proteína
(LexA).



TABELA
VII.3
–
Alguns
genes
reprimidos
pela
proteína
LexA
em
E.
coli


Gene

 Localização
(min)

 Função



recA

 58

 Recombinação
genética,
co‐protease



lexA

 91

 Repressor
SOS


uvrA

 92

 Reparação
por
excisão


uvrB

 17

 Reparação
por
excisão


umuDC

 25

 Reparação
mutagênica


sulA(sfiA)

 22

 Inibidor
da
divisão
celular


ruvAB

 41

 Recombinação
genética


polB

 2

 Replicação
do
DNA





c)
principais
funções
SOS


 Embora
 todas
 as
 funções
 SOS
 sejam,
 provavelmente,
 induzidas
 por
 um
 mecanismo
 comum,
 isto
 não

significa
 que
 elas
 se
 desreprimam
 simultaneamente.
 
 As
 diferenças
 de
 cinética
 já
 observadas
 para
 a

desrepressão
 das
 diversas
 funções
 talvez
 possam
 ser
 explicadas
 por
 diferentes
 graus
 de
 afinidade
 entre
 a

proteína
 LexA
 e
 o
 operador
 ao
 qual
 ela
 se
 fixa.
 
 Algumas
 destas
 funções
 serão
 resumidamente
 abordadas
 a

seguir.



Reativação
e
mutagênese
induzidas
de
fagos


 Quando
 um
 fago,
 lesado
 pela
 radiação
 ou
 por
 um
 agente
 químico,
 infecta
 uma
 bactéria,
 os
 sistemas

enzimáticos
desta
podem,
em
muitos
casos,
reparar,
total
ou
parcialmente,
as
lesões
formadas
no
DNA
viral,
o

que
 constitui
 o
 fenômeno
 da
 reativação
 pela
 célula
 hospedeira.
 
 Quando,
 entretanto,
 a
 bactéria
 foi

 VII
 56

previamente
 também
 irradiada,
 verifica‐se
 um
 significativo
 aumento
 da
 capacidade
 de
 multiplicação
 viral,
 o

que
 constitui
 a
 reativação
 induzida
 do
 fago,
 também
 denominada
 Weigle‐reativação.
 
 Esta
 reativação
 é

acompanhada
 de
 elevada
 mutagênese
 entre
 os
 fagos
 produzidos,
 fenômeno
 designado
 como
 mutagênese

induzida
 do
 fago
 ou
 Weigle‐mutagênese.
 
 A
 Weigle‐reativação
 e
 a
 Weigle‐mutagênese
 encontram‐se

esquematicamente
representadas
na
figura
VII.31.


 




FIGURA
 VII.31
 –
 Weigle‐reativação
 e
 Weigle‐mutagênese.
 A)
 Esquema
 experimental
 para
 observação
 dos

fenômenos;
B)
Aumento
da
sobrevivência
de
fagos
irradiados,
quando
utilizados
para
infectar
células
também

lesadas;
C)
aumento
da
mutagênese,
nas
mesmas
condições.



Uma
vez
que
a
expressão
dos
dois
fenômenos,
depende
de
mecanismos
bioquímicos
que
se
processam

no
 interior
 da
 célula,
 é
 fácil
 prever
 que
 eles
 alcancem
 suas
 máximas
 amplitudes
 algum
 tempo
 após
 a

irradiação,
 tempo
 este
 que,
 em
 E.
 coli,
 corresponde
 a
 cerca
 de
 30
 minutos;
 assim,
 sua
 visualização
 torna‐se

mais
fácil
se
os
fagos
irradiados
infectarem
as
bactérias
meia
hora
após
a
exposição
destas
à
radiação,
ficando

as
células,
durante
este
tempo,
em
condições
que
assegurem
síntese
protéica.


 Embora
 existam
 significativas
 analogias
 entre
 a
 Weigle‐reativação
 e
 a
 Weigle‐mutagênese,
 os
 dois

fenômenos
 não
 podem
 ser
 considerados
 como
 expressão
 de
 um
 único
 mecanismo.
 
 O
 aumento
 de

sobrevivência
 depende
 da
 funcionalidade
 dos
 genes
 uvrA,
 uvrB,
 uvrC,
 umuC
 e
 umuD,
 mas
 pode
 ocorrer
 em

duplos
mutantes
recA(Def)
lexA(Def),
nos
quais
a
mutagênese
não
é
observada.

Assim,
é
possível
admitir
que

a
 reativação
 exija
 somente
 a
 desrepressão
 dos
 genes
 implicados
 nas
 funções
 SOS,
 requisito
 atendido
 nos

referidos
 mutantes,
 dada
 a
 alteração
 da
 proteína
 LexA,
 mas
 mutações
 no
 fago
 parecem
 exigir,
 além
 da

desrepressão
destes
genes,
a
funcionalidade
da
proteína
RecA.



Mutagênese
bacteriana

 VII
 57


 Como
 já
 foi
 referido,
 mutações
 podem
 ocorrer
 por
 erros
 de
 emparelhamento
 durante
 a
 replicação

semiconservativa
 do
 DNA,
 como
 ocorre
 em
 células
 tratadas
 com
 certos
 agentes
 alquilantes
 (EMS,
 MMS,

nitrosoguanidina,
 etc.),
 constituindo
 a
 mutagênese
 direta.
 Adicionalmente
 também
 ocorre
 a
 chamada

mutagênese
 espontânea,
 que
 engloba
 todas
 as
 mutações
 para
 as
 quais
 os
 conhecimentos
 atuais
 não

permitem
 identificar
 um
 agente
 causal
 (as
 EAO
 e
 os
 sítios
 AP,
 talvez
 possam
 justificar
 algumas
 ou
 muitas

destas
mutações).


 Mas
estas
formas
de
alteração
do
conteúdo
informacional
representam
somente
uma
pequena
fração
do

total
de
mutações
produzidas
nas
células.

A
maior
parte
é
conseqüência
de
processos
incorretos
de
reparação

das
lesões
provocadas
no
material
genético
o
que
constitui
a
mutagênese
indireta.


 As
mutações
gênicas
consistem
em
modificações
da
seqüência
de
nucleotídeos
de
um
determinado
gene,

do
que
resulta
a
perda
da
atividade
do
produto
por
ele
codificado,
ou
sua
alteração;
no
nível
molecular,
este

tipo
de
mutação
pode
ser
provocado
por
dois
mecanismos
básicos,
quais
sejam:

a) a
substituição
de
uma
base
nitrogenada
por
outra,
fenômeno
que
inclui
as
transições
(substituição
de

uma
purina
por
outra
purina
ou
de
uma
pirimidina
por
outra
pirimidina)
e
as
transversões
(situação

na
 qual
 uma
 base
 purínica
 é
 substituída
 por
 uma
 pirimidínica,
 ou
 vice
 versa),
 mostradas
 na
 figura

VII.32.

b) o
deslocamento
do
referencial
de
leitura
do
código
genético
("frameshift"),
conseqüente
à
inserção,

ou
à
deleção,
de
um
ou
mais
nucleotídeos
do
DNA,
como
pode
ser
visto
na
figura
VII.33.


 




FIGURA
 VII.32
 –
 Mecanismos
 de
 mutagênese
 por
 substituição
 de
 bases
 nitrogenadas.
 A)
 transição;
 B)

transversão.




 VII
 58




FIGURA
VII.33
–
Mecanismos
de
mutagênese
por
defasagem
do
referencial
de
leitura.
A)
inserção
de
um
par

de
bases
nitrogenadas;
B)
deleção
de
um
par
de
bases
nitrogenadas;
C)
inserção
de
um
par
de
bases
e
deleção

de
outro,
em
sítios
próximos.



A
 ocorrência
 de
 uma
 mutação
 gênica
 em
 uma
 célula
 pode
 ser
 detectada
 mediante
 a
 verificação
 da

alteração
fenotípica
dela
dependente,
tal
como
a
impossibilidade
de
sintetizar
uma
certa
enzima.

Em
muitos

casos,
é
possível
verificar
que
esta
enzima
não
está
presente
nas
células
mutadas,
ao
contrário
do
que
ocorre

nas
células
originais,
ditas
do
tipo
selvagem
em
relação
ao
caráter
genético
considerado;
em
outras
situações,

a
 enzima
 ainda
 é
 sintetizada,
 mas
 em
 quantidades
 reduzidas,
 ou
 com
 atividade
 diminuída.
 
 Uma
 vez
 que
 a

seqüência
 de
 nucleotídeos
 de
 um
 gene
 pode
 ser
 determinada,
 torna‐se
 relativamente
 fácil,
 analisar
 a

mutação.


 A
expressão
fenotípica
de
uma
mutação
gênica
pode
ser
alterada
pela
introdução,
no
patrimônio
genético

da
célula,
de
outra
mutação,
capaz
de
atuar
como
supressora
da
primeira.
A
mutação
supressora
pode
ocorrer

no
próprio
gene
mutado
(isto
é,
ser
intragênica,
como
ocorre
pela
inserção
ou
deleção,
de
um
nucleotídeo
em

uma
 seqüência
 na
 qual
 tenha
 ocorrido
 defasagem
 do
 referencial
 de
 leitura),
 ou
 processar‐se
 em
 um
 gene

distinto
 (supressão
 intergênica,
 que
 se
 expressa
 mediante
 modificação,
 por
 exemplo,
 da
 tradução
 do
 RNA

mensageiro
correspondente
ao
gene
mutado,
acarretando
a
síntese
de
uma
proteína
ativa).


 À
luz
dos
conhecimentos
atuais,
deixando
de
lado
alguns
mecanismos
que
ainda
não
estão
esclarecidos,
a

mutagênese
indireta
parece
ser
uma
forma
de
expressão
das
funções
SOS.

Uma
evidência
de
sua
existência

foi
obtida
por
meio
de
experimentos
nos
quais
o
DNA
do
fago
ΦX174,
após
irradiação
com
UV,
foi
adicionado

a
 extratos
 celulares
 obtidos
 de
 culturas
 de
 E.
 coli,
 irradiadas
 ou
 não.
 
 Nesta
 última
 situação,
 a
 síntese

semiconservativa
 é
 interrompida
 quando
 a
 polimerase
 encontra
 uma
 lesão,
 enquanto
 na
 primeira
 ela

ultrapassa
 as
 fotolesões,
 o
 que
 sugere
 a
 existência,
 nos
 extratos
 acelulares
 de
 bactérias
 irradiadas,
 de
 uma

polimerase
que
consegue
replicar
o
DNA
mesmo
ultrapassando
lesões
e,
conseqüentemente,
não
obedecendo

rigorosamente
 às
 informações
 contidas
 na
 outra
 hélice,
 o
 que
 representa
 um
 requisito
 para
 o
 reparo

mutagênico.


 A
 mutagênese
 indireta
 não
 é
 observada
 em
 mutantes
 recA
 (Def)
 ou
 lexA
 (Ind‐),
 nem
 em
 ausência
 de

biossíntese
 protéica,
 o
 que
 permite
 incluí‐la
 entre
 as
 funções
 SOS.
 
 Adicionalmente,
 em
 células
 de
 E.
 coli

portadoras
 de
 mutações
 nos
 genes
 umuC
 e
 umuD
 não
 ocorre
 mutagênese
 indireta,
 o
 que
 permite
 supor

tenham
 estes
 genes
 papéis
 fundamentais
 no
 processo;
 
 admite‐se,
 assim,
 que
 eles
 sejam
 responsáveis
 pelo

surgimento,
na
célula,
de
uma
polimerase
incorreta,
a
mutapolimerase
(em
verdade
a
PolV,
já
descrita).



 VII
 59

Esta
 enzima
 talvez
 também
 possa
 provocar
 erros
 de
 emparelhamento
 durante
 a
 replicação

semiconservativa
de
moléculas
de
DNA
não
lesadas,
o
que
justificaria
o
aumento
de
mutagênese
observado

quando
fagos
não
irradiados
infectam
células
previamente
expostas
a
agentes
físicos
ou
químicos.
A
PolIV
foi

recentemente
implicada
neste
processo.


 A
 proteína
 RecA,
 além
 de
 desreprimir
 os
 genes
 umuC
 e
 umuD,
 quando
 se
 transforma
 em
 co‐protease,

deve
 também
 desempenhar
 outro
 papel
 na
 mutagênese
 indireta,
 uma
 vez
 que
 o
 fenômeno
 não
 ocorre
 em

duplos
mutantes
recA
(Def)
lexA
(Def),
nos
quais
os
genes
umuC
e
umuD
estão
desreprimidos.


 Recentemente
 foi
 detectado
 que
 a
 co‐protease
 RecA
 também
 está
 envolvida
 na
 clivagem
 da
 proteína

UmuD,
gerando
UmuD’.

UmuD’
na
forma
de
dímero
e
em
conjunto
com
UmuC
constituem
a
mutapolimerase

DNA
polimerase
V,
a
maior
geradora
de
mutagênese
em
E.
coli.




Indução
lisogênica


 Já
 foi
 visto
 que
 um
 fago
 temperado
 pode
 incorporar‐se
 ao
 cromossomo
 bacteriano,
 sob
 a
 forma
 de

profago,
mantendo‐se
em
uma
espécie
de
equilíbrio,
graças
à
atuação
de
um
repressor,
de
natureza
protéica,

codificado
 pelo
 profago.
 
 A
 inativação
 deste
 repressor
 leva
 ao
 rompimento
 do
 equilíbrio,
 permitindo
 a

chamada
 indução
 lisogênica.
 
 A
 destruição
 do
 repressor
 (ou
 mais
 precisamente
 a
 sua
 clivagem)
 pode
 ser

desencadeada
 por
 diversos
 tratamentos
 físicos
 (como
 irradiações)
 ou
 com
 certos
 agentes
 químicos

(compostos
mutagênicos
e
cancerígenos,
por
exemplo).


 Em
culturas
bacterianas,
já
foi
possível,
após
o
tratamento
indutor,
acompanhar
o
acúmulo
de
proteína

RecA,
 sua
 parcial
 transformação
 em
 co‐protease
 RecA
 e
 a
 clivagem
 do
 repressor,
 o
 que
 também
 foi
 visto
 in

vitro,
empregando
repressor
purificado,
proteína
RecA
e
um
meio
adequado,
contendo
oligonucleotídeos.

A

cinética
 de
 clivagem
 de
 repressor
 do
 fago
 pela
 co‐protease
 RecA
 é
 bem
 mais
 lenta
 que
 a
 da
 proteína
 LexA,

apesar
das
analogias
estruturais
existentes
entre
elas.


 Na
figura
VII.34
pode
ser
vista
a
cinética
de
indução
de
uma
cultura
lisogênica
de
E.
coli,
evidenciando‐se

a
 produção
 de
 fagos
 após
 a
 exposição
 a
 um
 agente
 que
 lesa
 o
 DNA,
 no
 caso
 a
 radiação
 UV.
 
 É
 interessante

ressaltar
 que
 esta
 indução
 não
 ocorre
 em
 cepas
 recA
 (Def),
 mas
 pode
 ser
 detectada
 em
 células
 lexA
 (Ind‐),

embora
seja
mais
lenta
e
conduza
a
uma
menor
produção
de
fagos;
como,
nestas
condições,
não
deve
ocorrer

desrepressão
 dos
 genes
 sob
 o
 controle
 da
 proteína
 LexA,
 é
 possível
 que
 as
 quantidades
 basais
 da
 proteína

RecA
 possam
 redundar
 na
 formação
 de
 co‐protease
 RecA
 em
 quantidades
 suficientes
 para
 a
 clivagem
 do

repressor.
 
 Aliás,
 indução
 lisogênica
 em
 cepas
 selvagens
 foi
 observada
 em
 condições
 de
 bloqueio
 da

biossíntese
protéica
por
um
antibiótico,
a
rifampicina,
que
inibe
a
transcrição
do
DNA.






FIGURA
VII.34
‐
Cinética
de
indução
de
uma
cultura
lisogênica
de
E.
coli,
após
irradiação
com
UV.
A
produção

de
fagos
está
expressa
pelo
número
de
unidades
formadoras
de
placas
de
lise
(ufp)
por
mililitro
de
cultura.

 VII
 60

Filamentação


 Quando
 uma
 célula
 bacteriana
 sofre
 lesões
 produzidas
 por
 agentes
 físicos
 ou
 químicos,
 pode‐se

evidenciar
 o
 fenômeno
 da
 filamentação,
 que
 consiste
 no
 progressivo
 aumento
 das
 dimensões
 celulares,

especialmente
do
comprimento,
sem
que
ocorra
a
septação.

Se
o
fenômeno
atingir
uma
amplitude
excessiva,

ele
 será
 irreversível
 e
 conduzirá
 à
 inativação;
 em
 caso
 contrário,
 o
 filamento
 pode
 sofrer
 septação,
 dando

origem
 a
 duas
 ou
 mais
 células
 viáveis,
 isto
 é,
 capazes
 de
 formar
 colônias
 em
 meio
 de
 cultura
 gelosado.
 
 A

filamentação
pode
ser
provocada
pela
expressão
fenotípica
de
algumas
mutações
em
genes
que
controlam
a

replicação
 do
 DNA,
 assim
 como
 pela
 indução
 das
 funções
 SOS.
 
 Em
 E.
 coli,
 a
 formação
 de
 filamentos
 após

tratamento
 com
 agentes
 físicos
 ou
 químicos
 é
 dependente
 do
 produto
 de
 dois
 genes,
 sulA
 e
 sulB,

anteriormente
designados
como
sfiA
e
sfiB,
ambos
sendo
reprimidos
pela
proteína
LexA,
o
que
explica
possam

ser
transcritos
quando
a
célula
acumula
co‐protease
RecA.

É
bastante
provável
que
a
filamentação,
desde
que

não
 excessiva,
 propicie
 melhores
 condições
 para
 a
 manutenção
 da
 viabilidade
 celular
 após
 a
 produção
 de

lesões
no
DNA.

Um
dos
modelos
aceitos
para
explicar
o
fenômeno
consiste
em
admitir
que
a
desrepressão

dos
genes
da
filamentação
levaria
à
biossíntese
de
um
ou
mais
fatores
protéicos,
capazes
de
inibir
a
septação

celular
 e,
 conseqüentemente,
 a
 divisão;
 corrigidas
 as
 lesões
 do
 DNA,
 a
 síntese
 deste
 fator
 cessaria
 e
 o

filamento
se
dividiria
em
duas
ou
mais
células.



Outras
funções
SOS


 Como
 já
 foi
 mencionado
 na
 tabela
 VII.3,
 diversas
 outras
 funções
 SOS
 foram
 caracterizadas,
 todas

dependentes
da
funcionalidade
dos
produtos
dos
genes
recA
e
lexA,
cujos
mecanismos
moleculares
só
agora

começam
 a
 ser
 esclarecidos.
 
 Entre
 elas,
 merecem
 especial
 menção
 o
 bloqueio
 da
 respiração
 celular,
 a

degradação
do
DNA
pós‐irradiação
e
a
radiorresistência
induzida.


 O
bloqueio
da
respiração
celular
pós‐irradiação
constitui
uma
função
SOS
cuja
natureza
molecular
ainda

não
está
esclarecida,
não
ocorrendo
em
mutantes
recA
(Def)
ou
lexA
(Ind‐),
nem
em
ausência
de
biossíntese

de
proteínas.

É
possível
que
este
bloqueio
da
respiração
forneça
melhores
condições
à
célula
para
sobreviver

após
exposição
à
radiação.


 A
degradação
do
DNA
pós‐irradiação
é,
em
grande
parte,
mediada
pela
exonuclease
V,
produto
dos
genes

recB,
recC
e
recD,
cuja
ação
é
controlada
pela
proteína
RecA.

Assim,
torna‐se
fácil
entender
que
em
mutantes

recA
 (Def)
 esta
 degradação
 seja
 intensa
 e
 possa,
 em
 muitos
 casos,
 conduzir
 à
 inativação
 celular.
 
 Logo,
 à

semelhança
 do
 que
 foi
 visto
 para
 a
 filamentação,
 um
 certo
 nível
 de
 degradação
 do
 DNA
 parece
 favorecer
 a

manutenção
da
viabilidade
celular,
mas,
se
exagerada,
ela
deve
conduzir
ao
resultado
oposto.


 A
radiorresistência
induzida
consiste
no
fato
de
que
células
previamente
expostas
a
doses
relativamente

reduzidas
 de
 UV
 ou
 de
 radiações
 ionizantes
 tornam‐se
 mais
 resistentes
 a
 uma
 nova
 irradiação
 com
 estas

últimas;
 uma
 vez
 que
 este
 fenômeno
 depende
 dos
 mesmos
 requisitos
 que
 as
 funções
 SOS,
 ele
 costuma
 ser

incluído
 entre
 as
 respostas
 celulares
 induzidas
 pela
 presença
 de
 lesões
 no
 DNA.
 
 Como
 algumas
 enzimas

ligadas
ao
reparo
são
acumuladas
intracelularmente
após
a
exposição
à
radiação
ou
a
agentes
químicos,
torna‐
se
lógico
supor
que
este
acúmulo
crie
melhores
condições
para
a
sobrevivência
a
uma
segunda
irradiação.



Funções
SOS
em
eucariotos
?


 A
existência,
em
células
de
mamíferos,
de
funções
análogas
às
que
acabam
de
ser
descritas
em
bactérias

constitui
 um
 dos
 pontos
 mais
 polêmicos
 entre
 os
 foto
 e
 radiobiologistas.
 
 Diversos
 fenômenos
 foram

observados
e
interpretados
como
uma
forma
de
expressão
de
mecanismos
induzidos
de
reparação
do
DNA
em

eucariotos,
mas,
em
muitos
casos,
outras
interpretações
são
igualmente
possíveis.


 Entre
os
mecanismos
descritos,
o
aumento
de
sobrevivência
de
vírus
irradiados,
quando
infectam
células

de
 diversas
 linhagens
 também
 lesadas
 por
 tratamentos
 físicos
 ou
 químicos,
 parece
 constituir
 a
 menos

controvertida
 forma
 de
 expressão
 de
 funções
 análogas
 às
 SOS.
 
 Este
 fenômeno
 foi
 observado,
 por
 exemplo,

com
fibroblastos
humanos,
células
de
rim
de
macaco,
células
HeLa
e
células
de
xeroderma
pigmentosum,
após

exposição
 ao
 UV
 ou
 aos
 raios
 X.
 
 Mas
 a
 parcial
 sincronização
 da
 divisão
 celular
 promovida
 por
 estes

tratamentos
 talvez
 possa
 justificar
 o
 aumento
 de
 sobrevivência,
 independentemente
 de
 alguma
 forma
 de

desrepressão
gênica.

 VII
 61


 A
hipótese
da
existência
de
um
mecanismo
geral
do
controle
de
diversos
genes
em
eucariotos
é
bastante

atraente,
 pois,
 se
 verificada
 experimentalmente,
 ela
 poderia
 justificar
 inúmeros
 fenômenos
 da
 maior

relevância,
entre
os
quais
a
própria
transformação
neoplásica.




 Genes
e
proteínas
induzidas
por
lesões
no
DNA


 Existem
 cerca
 de
 20
 genes
 GADD
 (Growth
 Arrest
 by
 DNA
 Damage),
 definidos
 por
 um
 aumento
 de
 seus

transcritos
após
o
aparecimento
das
lesões.


 Entre
as
proteínas
de
reparação
a
indução
de
Polβ
por
agentes
alquilantes
é
bem
documentada
e
existem

evidências
 que
 O6MGT
 é
 induzida
 por
 MNNG
 e
 outros
 agentes,
 incluindo
 UV,
 por
 mecanismos
 ainda

desconhecidos.
Uma
proteína
que
se
liga
a
lesões
do
DNA
(DDB)
é
induzida
por
UV
e
cisplatina.

Ela
se
liga
ao

fotoproduto
6‐4
mas
não
ao
dímero
ou
adutos
de
cisplatina
e
está
ausente
em
alguns
pacientes
XPE,
mas
não

em
outros.


 A
heme
oxigenase,
que
faz
o
heme
ser
convertido
em
bilirrubina
(aceptor
de
EAO)
é
altamente
induzida

por
 UV
 longo
 e
 H2O2
 e
 existem
 algumas
 evidências
 de
 que
 ela
 tenha
 um
 papel
 na
 defesa
 celular
 como

antioxidante.




 Reativação
de
vírus


 Como
 descrito
 para
 E.
 coli
 ,
 uma
 das
 respostas
 SOS
 é
 o
 aumento
 da
 sobrevivência
 e
 mutagênese
 de

bacteriófagos
em
células
irradiadas
(W‐reativação
e
W‐mutagênese).

Experimentos
similares
foram
realizados

em
 células
 humanas
 usando
 uma
 grande
 variedade
 de
 tratamentos
 e
 vários
 tipos
 de
 vírus
 (herpes
 simplex,

citomegalovírus,
etc).


 Os
 pré‐tratamentos
 das
 células
 foram
 feitos
 com
 UV,
 raios
 X,
 agentes
 alquilantes,
 cafeína,
 hidroxiuréia,

etc.,
e
os
vírus
foram
submetidos
aos
mesmos
tratamentos
ou
com
outros
agentes
lesivos.


 Na
 maioria
 dos
 casos
 os
 resultados
 foram
 negativos
 e,
 quando
 positivos,
 foram
 altamente
 variáveis
 e

muito
menores
do
que
os
observados
para
a
W‐reativação
em
E.
coli.




 A
 reativação
 foi
 observada
 em
 células
 XP
 e
 vírus
 herpes
 simplex,
 mostrando
 que
 o
 fenômeno
 seria

independente
 da
 reparação
 por
 excisão
 de
 nucleotídeos,
 entretanto,
 muitos
 estudos
 foram
 realizados

posteriormente
 e
 os
 resultados
 não
 foram
 confirmados,
 e
 principalmente,
 nunca
 foi
 detectado
 aumento
 de

mutagênese
em
vírus
herpes
tratados
com
radiação
UV.



ALTERAÇÕES
GENÉTICAS
E
REPARO
DO
DNA
NA
CARCINOGÊNESE
HUMANA

Alterações
genéticas

Dados
 experimentais
 e
 epidemiológicos
 suportam
 uma
 associação
 causal
 entre
 alterações
 genéticas
 e

câncer.
A
inativação
mutacional
de
genes
supressores
de
tumor
e
a
ativação
de
oncogenes
estão
associadas
à

maioria
 dos
 cânceres,
 sendo
 que
 a
 maioria
 das
 substâncias
 mutagênicas
 é
 cancerígena.
 
 Além
 disto,
 a

deficiência
em
reparação
do
DNA
é
associada
ao
risco
de
cancerização,
já
que
a
deficiência
em
reparação
pode

conduzir
à
mutagênese.


 É
postulado
que
a
mutagênese
tem
um
papel
tanto
na
iniciação
como
na
progressão
da
carcinogênese,
já

que
o
processo
celular
que
suprime
a
mutagênese
está
comprometido.


 A
 associação
 entre
 alterações
 genéticas
 e
 câncer
 foi
 observada
 há
 muitos
 anos.
 
 Por
 exemplo,
 a

translocação
 cromossômica
 denominada
 Philadelphia
 é
 encontrada
 na
 maioria
 dos
 glóbulos
 brancos
 de

pacientes
 com
 leucemia.
 Adicionalmente
 as
 células
 tumorais
 apresentam
 instabilidade
 genética,
 aberrações,

rearranjos,
aneuploidia,
etc.


 O
 início
 do
 entendimento
 das
 alterações
 genéticas
 veio
 dos
 estudos
 de
 vírus
 oncogênicos.
 Vírus

oncogênicos
 a
 RNA
 expressam
 oncogenes
 c‐ras
 e
 c‐myc,
 que
 permitem
 a
 transformação
 pelos
 vírus
 e
 têm

homologia
 com
 proto‐oncogenes
 humanos
 RAS
 e
 MYC.
 
 Posteriormente
 foi
 detectado
 que
 RAS
 e
 MYC
 são

superexpressos
em
células
cancerosas
através
de
potentes
promotores
heterólogos.

 VII
 62


 O
estudo
do
retinoblastoma
humano
levou
à
detecção
do
gene
supressor
de
tumor
RB
(RetionoBlatoma),

cuja
perda
de
função
leva
à
formação
de
tumores
na
retina
de
crianças.


 Outro
 supressor
 de
 tumores
 é
 a
 proteína
 p53,
 que
 inicialmente
 foi
 identificada
 como
 o
 alvo
 do
 vírus

tumoral
SV40
e
mais
tarde
foi
mostrado
estar
inativada
em
uma
série
de
células
tumorais.


 Mutações
 puntiformes
 e
 deleções
 são
 encontradas
 em
 RB
 e
 TP53
 e,
 a
 perda
 do
 segundo
 alelo
 em

cânceres
 hereditários
 ocorre
 com
 freqüência
 aumentada.
 
 Diversos
 genes
 supressores
 são
 conhecidos

atualmente.


 Foi
postulado
que
o
mínimo
de
mutações
requeridas
para
a
transformação
oncogênica
em
humanos
inclui

inativação
 de
 TP53
 e
 RB,
 ativação
 de
 RAS
 (ou
 outros
 membros
 desta
 via)
 e
 expressão
 constitutiva
 de
 TERT,

genes
 que
 controlam
 a
 proliferação
 celular.
 
 As
 mutações
 mais
 prevalentes
 nos
 cânceres
 humanos
 são
 nos

genes
repressores
TP53
e
RB,
e
são
representadas
tanto
por
troca
de
bases
como
por
deleções/inserções.


 A
 proteína
 RB
 é
 o
 regulador
 chave
 do
 ciclo
 celular
 e
 a
 perda
 desta
 função
 leva
 à
 proliferação
 celular
 e

falência
da
diferenciação
terminal,
isto
é,
um
aumento
do
“nascimento
celular”.

A
proteína
p53
é
importante

na
resposta
celular
ao
estresse,
controlando
o
reparo
do
DNA
o
ciclo
celular
e
a
apoptose,
por
isso
a
perda
de

função
 da
 p53
 pode
 levar
 à
 diminuição
 da
 apoptose,
 isto
 é,
 um
 decréscimo
 da
 “morte
 celular”,
 por
 isto,
 a

inativação
destes
genes
leva
a
um
aumento
do
número
de
células,
isto
é,
à
proliferação
celular.


 O
 desenvolvimento
 do
 câncer
 pode
 ser
 também
 promovido
 por
 mutações
 que
 ativam
 a
 expressão
 de

proto‐oncogenes
 que
 regulam
 a
 proliferação
 celular,
 através
 da
 secreção
 de
 fatores
 de
 crescimento
 (PDGF),

receptores
de
tirosina
cinase
de
superfície
(EGFR,
HER),
sinais
de
tradução
de
proteínas
G
(RAS)
e
fatores
de

transcrição
nuclear
(MYC).


 Mutações
“missense”
em
RAS
são
encontradas
em
cerca
de
20%
dos
cânceres
estudados.
O
gene
MYC
é

normalmente
 ativado
 por
 rearranjos
 que
 colocam
 o
 gene
 sob
 o
 comando
 de
 promotores
 fortes,
 levando
 ao

aumento
 do
 número
 de
 cópias
 de
 mRNA.
 Estes
 fatores
 conduzem
 à
 estimulação
 da
 proliferação
 celular,

levando
à
expansão
da
população
celular,
acumulando‐se
com
os
efeitos
da
perda
da
função
da
supressão
de

tumores.


 Um
 requerimento
 adicional
 peara
 o
 desenvolvimento
 do
 câncer
 é
 a
 “imortalização”
 celular.
 Células

normais
têm
um
número
finito
de
divisões
e
morrem.
Isto
é
atribuído
ao
encurtamento
gradual
das
seqüências

repetidas
 teloméricas
 no
 final
 dos
 cromossomos,
 que
 os
 protegem
 contra
 a
 degradação
 e
 junção
 dos
 seus

terminais.
 
 A
 ausência
 de
 telômeros
 leva
 à
 instabilidade
 genética
 e
 morte
 celular
 por
 apoptose.
 
 As
 células

tumorais
 conseguem
 se
 “perpetuar”
 ligando
 o
 gene
 da
 telomerase
 (TERT),
 que
 codifica
 uma
 enzima
 que

mantém
o
comprimento
do
telômero.


 Na
figura
VII.35
pode
ser
visto
um
esquema
das
alterações
genéticas
no
processo
de
cancerização.



Reparo
do
DNA
e
vias
de
pontos
de
checagem


 As
 células
 elaboraram
 mecanismos
 para
 salvaguardar
 a
 integridade
 informacional
 do
 genoma
 pela

supressão
de
mutações.

Estes
mecanismos
incluem:
(a)
pontos
de
checagem
no
ciclo
celular
para
assegurar

alta
 fidelidade
 na
 replicação
 (1
 erro
 em
 106
 nucleotídeos
 incorporados);
 (b)
 vias
 que
 suprimem
 o
 estresse

oxidativo,
 impedindo
 as
 lesões
 oxidativas;
 (c)
 vias
 que
 regulam
 a
 progressão
 do
 ciclo
 celular
 e
 (d)
 vias
 de

reparo
de
DNA
que
corrigem
todos
os
tipos
de
lesões
endógenas
e
exógenas.

Mais
de
130
genes
de
reparação

do
DNA
já
foram
detectados
em
células
humanas.


 Uma
 das
 primeiras
 doenças
 hereditárias
 estudadas
 e
 associadas
 com
 o
 risco
 de
 câncer
 foi
 o
 xeroderma

pigmentosum,
caracterizado
como
um
dramático
aumento
do
risco
de
câncer
induzido
pela
exposição
ao
sol,

devido
 à
 deficiência
 de
 reparação
 por
 excisão
 de
 nucleotídeos,
 um
 processo
 que
 nos
 seres
 humanos
 requer

mais
de
30
proteínas.





 VII
 63




Figura
VII.35
–
Alterações
genéticas
no
câncer





 XPA
a
XPG
são
requeridos
para
o
reparo
genômico
global
(GGR)
enquanto
o
reparo
ligado
à
transcrição

requer
 os
 genes
 da
 síndrome
 de
 Cockayne
 (CSA
 e
 CSB)
 assim
 como
 algumas
 proteínas
 XP,
 cuja
 deficiência

causa
os
riscos
de
câncer.


 A
alta
fidelidade
da
replicação
é
normalmente
atribuída
à
Polδ
pela
sua
função
editorial.
Por
outro
lado
o

aumento
 da
 atividade
 da
 Polβ,
 menos
 acurada
 na
 reparação,
 pode
 aumentar
 a
 mutagênese
 e
 o
 risco
 de

aparecimento
de
câncer.


 Outras
 DNA
 polimerases
 menos
 acuradas
 também
 podem
 contribuir
 para
 o
 aparecimento
 de
 câncer,

como
é
o
caso
da
Polη,
que
em
frente
aos
dímeros
TT
coloca
as
bases
certas
AA.

Na
sua
falta
(caso
do
XPV)
ela

é
substituída
pela
Polι
que
é
muito
menos
acurada,
causando
mutações
que
levarão
ao
alto
risco
de
câncer.


 Outro
sistema
de
reparação
associado
ao
câncer
é
o
MMR,
cujo
defeito
conduz
ao
alto
risco
de
câncer
de

cólon
(HNPCC).

As
mutações
nos
genes
MMR,
também
estão
associadas
à
instabilidade
de
microssatélites
e
a

um
grande
aumento
de
mutações
somáticas,
como
visto
anteriormente.



 Outros
 genes
 associados
 a
 risco
 de
 câncer
 são
 os
 envolvidos
 com
 a
 sinalização
 de
 lesões,
 pontos
 de

checagem
 no
 ciclo
 celular
 e
 reparo
 de
 quebras
 duplas
 do
 DNA
 Quando
 a
 progressão
 das
 forquilhas
 de

replicação
 é
 bloqueada
 por
 lesões
 no
 DNA,
 alguns
 mecanismos
 de
 reparação
 são
 induzidos,
 entre
 os
 quais

helicases
tipo
RECQ,
tais
como
BLM
e
WRN.

Estas
paradas
da
forquilha
também
podem
causar
quebras
duplas

que
necessitam
do
complexo
MRN
(MRE11,RAD50
e
NSB)
para
seu
reparo,
assim
como
BRCA1
e
BRCA2.
Por

outro
lado
os
genes
FANC
são
necessários
para
a
reparação
de
ligações
cruzadas.


 As
 células
 humanas
 também
 têm
 diversos
 mecanismos
 regulatórios
 denominados
 de
 pontos
 de

checagem,
 que
 entram
 em
 ação
 bloqueando
 a
 progressão
 do
 ciclo
 celular
 para
 permitir
 a
 reparação
 das

lesões.
Por
exemplo,
a
proteína
cinase
codificada
pelo
gene
ATM,
o
qual
está
mutado
em
pacientes
com
ataxia

telangiectasia
(AT)
é
um
dos
mais
importantes
reguladores.
Esta
cinase
é
ativada
em
resposta
a
vários
tipos
de

lesão
 e
 então
 passa
 a
 ativar
 proteínas
 regulatórias
 do
 ciclo
 celular
 como
 p53
 e
 de
 reparação
 (NBS1),
 como

visto
anteriormente.
A
perda
destas
funções
resulta
em
instabilidade
genômica
e
risco
de
câncer.

 VII
 64


 Uma
vez
que
a
reparação
do
DNA
é
essencial
para
o
não
aparecimento
de
mutações
e
câncer,
substâncias

de
bloqueiem
a
reparação
podem
agir
como
co‐carcinogênicos.

Um
exemplo
é
o
arsênico.

Esta
substância,

por
 si,
 não
 é
 mutagênica
 nem
 cancerígena,
 entretanto,
 por
 ser
 capaz
 de
 bloquear
 os
 mecanismos
 de

reparação,
 principalmente
 aqueles
 envolvidos
 na
 reparação
 das
 lesões
 da
 radiação
 UV,
 é
 considerada
 um

potente
co‐carcinogênico.

Portanto,
é
possível
que
outros
agentes
possam
aumentar
o
risco
de
câncer
pelos

mesmos
mecanismos.



Mutadores,
proliferação
e
desenvolvimento
de
câncer


 Foi
 estimado
 que
 muitas
 células
 tumorais
 têm
 milhares
 de
 mutações.
 Entretanto,
 não
 está
 claro
 se
 a

instabilidade
genética
é
a
causa
ou
a
conseqüência
do
fenótipo
do
câncer.

Diversos
argumentos
sugerem
que

o
 fenótipo
 mutador
 seja
 a
 causa
 do
 câncer.
 Por
 esta
 hipótese
 é
 assumido
 que
 pelo
 menos
 5
 eventos

(mutações)
são
requeridos
para
o
desenvolvimento
do
câncer



 Assumindo
 que
 as
 mutações
 somáticas
 são
 em
 torno
 de
 10‐6
 por
 divisão
 celular,
 a
 probabilidade
 de
 5

eventos
independentes
ocorrerem
em
uma
célula
seria
de
10‐30
por
divisão.

Mesmo
considerando
que
temos

1014
células
no
corpo
e
em
torno
de
50
divisões
durante
a
vida,
isto
leva
a
um
risco
calculado
de
10‐15.

Desde

que
o
câncer
é
muito
mais
prevalente
que
isto,
é
sugerido
que
um
aumento
da
freqüência
de
mutações
seja

necessário
para
o
desenvolvimento
do
câncer.


 Embora
seja
claro
que
um
aumento
da
mutagênese
possa
promover
o
desenvolvimento
do
câncer,
pode

ser
 questionado
 que
 em
 tecidos
 altamente
 proliferativos
 a
 indução
 do
 fenótipo
 mutador
 não
 seja
 um
 pré‐
requisito
 para
 o
 desenvolvimento
 do
 câncer.
 Neste
 caso,
 podem
 ocorrer
 divisões
 suficientes
 de
 células

promovendo
acumulação
de
mutações
que
promovem
vantagem
seletiva
e
expansão
clonal.


 Se
o
primeiro
evento
provoca
uma
vantagem
no
crescimento
da
célula,
ela
irá
proliferar,
aumentando
a

probabilidade
 do
 segundo
 evento
 dentro
 da
 população
 expandida.
 Isto
 está
 de
 acordo
 com
 o
 aumento
 de

câncer
 com
 a
 idade.
 Tempo
 maior
 e
 maior
 número
 de
 divisões
 aumentam
 a
 probabilidade
 de
 geração
 do

estado
mutador
ou
mais
mutagênese
e
expansão
clonal.


 É
 bem
 conhecido
 que
 a
 estimulação
 da
 proliferação
 celular
 tanto
 por
 injuria
 como
 por
 promotores
 de

tumor
 ou
 hormônios
 podem
 aumentar
 os
 efeitos
 mutagênicos
 de
 agentes
 genotóxicos.
 Por
 exemplo,
 o

promotor
 de
 tumor
 TPA
 (forbol
 12‐miristato
 13
 acetato)
 aumenta
 a
 freqüência
 de
 mutações
 induzidas
 pelo

benzo[a]pireno,
 em
 camundongos,
 devido
 ao
 aumento
 da
 proliferação
 das
 células
 lesadas.
 
 Isto
 é
 também

observado
 com
 N‐etil‐N‐nitrosoureia,
 cuja
 mutagenicidade
 é
 dramaticamente
 aumentada
 em
 fígado
 com

hepatectomia
parcial
(que
aumenta
a
proliferação
celular).


 É
possível
que
a
proliferação
celular
induzida
por
hormônios
como
estrogênio
ou
hiperplasia
por
agentes

externos
 como
 arsênico
 possam
 aumentar
 a
 mutagênese.
 Tais
 agentes
 estimulam
 a
 expansão
 da
 população

mutante,
 que
 adquiriu
 vantagem
 seletiva
 e
 ambos
 os
 efeitos
 contribuem
 para
 a
 ligação
 entre
 proliferação

celular
e
aumento
do
risco
de
câncer.



Mecanismos
epigenéticos


 Alterações
na
expressão
de
genes
ligados
ao
câncer
podem
ocorrer
por
mecanismos
epigenéticos.

O
mais

conhecido
 mecanismo
 epigenético
 envolve
 e
 metilação
 do
 DNA
 e
 a
 acetilação,
 metilação
 e
 fosforilação
 de

histonas.
A
desmetilação
de
regiões
promotoras
nas
seqüências
GpC
podem
levar
à
superexpressão
de
proto‐
oncogenes
e
o
silenciamento
da
expressão
gênica
pode
ocorrer
como
resultado
da
hipermetilação,
podendo

conduzir
à
condensação
cromossômica.


 Parece
haver
uma
relação
entre
a
metilação
do
DNA
e
modificações
nas
histonas.
Algumas
desacetilações

e
metilações
de
histonas
estão
associadas
com
a
metilação
do
DNA
e
silenciamento
de
genes.

Estas
mudanças

epigenéticas
também
podem
tornar
os
genes
mais
suscetíveis
a
lesões,
alterando
a
sensibilidade
de
algumas

seqüências
à
mutação.





 VII
 65

DOENÇAS
HUMANAS
ASSOCIADAS
A
DEFICIÊNCIAS
EM
REPARO
DE
DNA


 O
 mecanismo
 melhor
 conhecido
 é
 o
 que
 correlaciona
 a
 deficiência
 na
 correção
 de
 erros
 de

emparelhamento
e
o
aparecimento
de
câncer
de
cólon
(HNPCC).


 No
 homem
 existem,
 pelo
 menos,
 três
 doenças
 caracterizadas,
 em
 parte,
 por
 uma
 deficiência
 do

mecanismo
 de
 Reparo
 por
 Excisão
 de
 Nucleotídeos:
 xeroderma
 pigmentosum
 (XP),
 tricotiodistrofia
 (TTD)
 e

síndrome
de
Cockayne
(CS).
Somente
os
pacientes
XP
são
caracterizados
por
uma
forte
incidência
de
cânceres

cutâneos
 localizados
 nas
 zonas
 expostas
 ao
 sol.
 Essas
 três
 doenças
 raras
 são
 hereditárias
 e
 transmitidas
 de

modo
 autossômico
 e
 recessivo;
 além
 disso,
 várias
 outras
 patologias
 humanas
 decorrem
 do
 mau

funcionamento
de
outros
mecanismos
de
reparação
de
lesões
de
DNA.
Entre
elas
podemos
citar
a
Anemia
de

Fanconi,
Ataxia
Telangiectasia,
Síndrome
de
Nigmegen,
Síndrome
de
Werner,
Síndrome
de
Bloom,
Síndrome

de
Rapadilino
e
Síndrome
de
Rothmund
Thomson.



 De
 maneira
 geral,
 a
 vinculação
 entre
 essas
 patologias
 e
 os
 sistemas
 de
 reparação
 de
 lesões
 de
 DNA

resulta
do
fenótipo
de
hipersensibilidade
das
células
provenientes
desses
pacientes
aos
mais
diversos
agentes

genotóxicos
(radiação
UV,
radiação
ionizante,
agentes
promotores
de
ligações
cruzadas,
etc)
e
do
fenótipo
de

predisposição
 ao
 desenvolvimento
 de
 neoplasias.
 Isto
 porque,
 os
 genes
 que
 participam
 dos
 diferentes

mecanismos
 de
 reparação
 de
 lesões
 de
 DNA
 pertencem
 à
 categoria
 dos
 assim
 chamados
 “guardiões”.
 A

inativação
desses
genes
gera
instabilidade
no
genoma,
abrindo
caminho,
desta
forma,
para
o
estabelecimento

de
uma
neoplasia.




Deficiência
de
correção
de
erros
de
emparelhamento
(HNPCC)

A
Síndrome
de
Lynch
é
uma
das
principais
síndromes
que
causam
predisposição
para
câncer
e
que
afeta
1

em
 cada
 200
 indivíduos
 da
 população
 mundial.
 
 Células
 de
 alguns
 cânceres
 esporádicos
 e
 virtualmente
 de

todos
os
tumores
associados
com
o
câncer
coloretal
hereditário,
não‐polipose
(HNPCC
=
Síndrome
de
Lynch)

são
 altamente
 mutáveis.
 Assim
 como
 as
 bactérias
 deficientes
 na
 correção
 de
 erros
 de
 emparelhamento,

linhagens
celulares
derivadas
destes
tumores
acumulam
mutações
em
números
que
podem
ser
mais
de
cem

vezes
 maiores
 que
 nas
 células
 normais
 e
 a
 análise
 bioquímica
 demonstra
 que
 na
 maioria
 das
 linhagens
 há

deficiência
no
reparo
de
erros
de
emparelhamento.


 A
Síndrome
(HNPCC)
é
herdada
de
maneira
autossômica
dominante,
com
células
normais
de
indivíduos

afetados
 contendo
 uma
 cópia
 funcional
 e
 uma
 deficiente
 do
 gene
 de
 reparo
 em
 questão.
 
 Portanto,
 células

normais
de
pacientes
HNPCC
são
pouco
mutáveis
já
que
têm
uma
cópia
selvagem
do
gene.

Células
tumorais,

por
outro
lado,
são
deficientes
nas
duas
cópias
do
gene
afetado
devido
à
inativação
do
gene
selvagem
como

resultado
de
uma
mutação
somática.


 Associada
 à
 demonstração
 do
 defeito
 de
 reparo
 nas
 células
 cancerosas,
 esta
 observação‐chave
 implica

que
o
evento
inicial
dos
tumores
HNPCC
é
a
perda
funcional
de
uma
atividade
crítica
de
correção
de
erros
de

emparelhamento,
 com
 a
 resultante
 desestabilização
 genética
 presumivelmente
 conduzindo
 a
 mutações
 que

modificam
os
sistemas
regulatórios
que
controlam
a
proliferação
celular.


 Famílias
 HNPCC
 são
 definidas
 comumente
 como
 aquelas
 nas
 quais
 pelo
 menos
 três
 parentes
 em
 duas

gerações
tiveram
câncer
coloretal,
com
um
dos
parentes
tendo
sido
diagnosticado
com
menos
de
50
anos
de

idade.


 Foi
 observada
 instabilidade
 genética,
 tumor‐específica,
 em
 HNPCC
 e
 em
 alguns
 cânceres
 esporádicos.


Famílias
 Lynch
 I
 são
 precocemente
susceptíveis
ao
câncer
coloretal,
enquanto
 famílias
Lynch
II
têm
 também

um
risco
para
tumores
epiteliais
extracólon,
do
endométrio,
ovário,
estômago,
intestino
delgado,
rim
e
ureter.

Em
adição
aos
cânceres
extracólon,
característica
de
Lynch
II,
famílias
Muir‐Torre
compreendem
uma
terceira

e
rara
classe
de
pacientes
HNPCC
também
sujeitos
a
tumores
de
glândulas
sebáceas.

A
primeira
evidência
de
aumento
de
mutabilidade
e
câncer
veio
do
fato
de
que
alguns
tumores
de
cólon
e

a
maioria
dos
tumores
que
ocorrem
em
pacientes
HNPCC
contêm
mutações
freqüentes
em
seqüências
simples

repetidas
 (A)n,
 (GGC)n
 ou
 (CA)n.
 Mutações
 nestas
 seqüências
 repetidas
 (microssatélite)
 são,
 tipicamente,

tumor‐
 específicas,
 indicativas
 de
 origem
 somática
 e,
 sua
 incidência
 é
 dramática.
 As
 células
 tumorais

acumulam
milhares
de
mutações
em
microssatélites.

 VII
 66

Foi
 descrita
 instabilidade
 de
 microssatélites
 para
 muitos
 tumores
 incluindo
 o
 coloretal
 (12‐28%),

endometrial
 (17‐23%),
 de
 estômago
 (18‐39%),
 ovariano
 (16%),
 cervical
 (15%),
 pancreático
 (67%),
 adenoma

esofágico
(22%),
de
células
escamosas
da
pele
(50%)
e
próstata
(20‐38%).


 A
presença
de
numerosas
mutações
em

microssatélites
de
tumores
foi
postulada
ser
o
reflexo
da
quebra

da
 fidelidade
 da
 replicação
 do
 DNA
 ou
 do
 seu
 reparo,
 e
 o
 fenótipo
 MIN+
 (Microsatellite
 INstability)
 é
 usado

para
designar
tumores
que
têm
instabilidade
de
microssatélites.

O
estabelecimento
do
fenótipo
hipermutável

é
 um
 evento
 primário
 na
 tumorigênese
 coloretal
 MIN+,
 e
 a
 instabilidade
 genética
 permanece
 após
 a

transformação.

Existem
diversas
categorias
de
células
tumorais
de
cólon
hipermutáveis,
com
variação
de
seus
espectros

de
 mutação.
 
 Por
 exemplo,
 taxas
 de
 mutação
 em
 seqüências
 (CA)n
 e
 HPRT
 [Hypoxantin
 PhosphoRibosyl

Transferase
(células
ficam
resistentes
a
6‐tioguanina)]
são
ambas
elevadas
centenas
de
vezes
em
MIN+
HCT116

(também
 chamada
 H6)
 e
 na
 linhagem
 RKO,
 enquanto
 a
 linhagem
 HCT‐15
 é
 caracterizada
 pelas
 centenas
 de

mutações
 em
 HPRT,
 mas,
 somente
 um
 aumento
 muito
 pequeno
 de
 mutações
 em
 seqüências
 de


dinucleotídeos
(CA)n,
sendo,
portanto,
uma
linhagem
MIN±.

Uma
terceira
classe,
Vaco410,
foi
designada
MIN‐,

embora
seja
hipermutável
para
HPRT.


 A
 maioria
 das
 famílias
 HNPCC
 examinadas
 tem
 mutações
 em
 MSH2
 ou
 MLH1.
 
 Mutações
 em
 PMS2
 são

responsáveis
por
uma
pequena
fração
dos
casos
de
HNPCC.

Como
 esperado
 pela
 herança
 dominante
 de
 HNPCC,
 as
 células
 normais
 dos
 indivíduos
 afetados
 são

tipicamente
MIN‐
e,
heterozigotas
para
um
defeito
em
um
dos
alelos.

Em
contraste,
as
células
tumorais
são

deficientes
 em
 ambos
 os
 alelos
 do
 gene
 em
 questão,
 com
 a
 perda
 do
 alelo
 selvagem
 por
 uma
 mutação

somática
ou
perda
da
heterozigose,
o
que
conduz
ao
desenvolvimento
do
tumor.


 As
células
tumorais
apresentam
deficiência
no
sistema
de
correção
de
erros
de
emparelhamento,
sendo

que
as
linhagens
mais
estudadas
(H6,
LoVo
e
HEC‐1‐A)
são
deficientes
em
ambos
os
alelos
de
MLH1,
MSH2
ou

PMS2,
respectivamente.



 O
desenvolvimento
do
tumor,
entretanto,
necessita
de
outros
estímulos
para
assegurar
a
sua
capacidade

proliferativa,
 necessária
 para
 suportar
 a
 expansão
 clonal,
 requerida
 para
 produzir
 uma
 massa
 tumoral.


Possivelmente,
 isto
 é
 conseguido
 pelas
 muitas
 mutações
 que
 se
 acumulam
 nas
 células
 deficientes
 na

reparação
de
erros
de
emparelhamento
e
a
outros
fatores
genéticos
ou
epigenéticos.


 Outra
 questão
 intrigante
 é
 a
 especificidade
 dos
 tecidos
 onde
 aparecem
 os
 cânceres
 devidos
 a
 erros
 de

emparelhamento.
Recentemente
foi
documentada
uma
grande
correlação
entre
defeitos
no
gene
do
receptor

do
TGF‐β
tipo
II
e
o
fenótipo
MIN+
em
células
de
câncer
coloretal.
As
mutações
neste
gene
são
raras
em
células

MIN‐,
 mas
 são
 comuns
 em
 células
 tumorais
 MIN+,
 com
 as
 mutações
 localizadas
 na
 repetição
 (A)10
 em
 sete

casos
 e
 na
 (GT)3
 em
 um
 caso.
 Desde
 que
 a
 falha
 de
 resposta
 à
 inibição
 do
 crescimento
 por
 TGF‐β
 é

característica
 de
 alguns
 tumores
 epiteliais
 estes
 achados
 ligam
 diretamente
 hipermutabilidade
 de
 “pontos

quentes”
de
mutagênese
em
um
locus
envolvido
com
o
controle
da
proliferação
celular.

Em
contraste
com
o
gene
humano,
o
gene
do
receptor
TGF‐β
tipo
II
de
camundongos
não
tem
o
ponto

quente
(A)10,
o
que
possivelmente
explica
o
não
desenvolvimento
de
câncer
coloretal
em
camundongos
com

mutações
em
PMS2
ou
MSH2.

Neste
caso
aparecem
linfomas.

Portanto,
pontos
quentes
para
mutagênese
em
genes
reguladores
da
proliferação,
cuja
função
é
restrita

com
 respeito
 ao
 tecido,
 podem,
 em
 princípio,
 ser
 uma
 explicação
 para
 a
 distribuição
 tecidual
 de
 cânceres

MIN+.


 Ainda
 não
 se
 sabe
 se
 a
 deficiência
 das
 proteínas
 que
 reparam
 erros
 de
 emparelhamento
 em
 humanos

também
pode
conduzir
à
desestabilização
da
recombinação
genética,
como
ocorre
em
bactérias,
podendo
se

especular
que
talvez
a
recombinação
ilegítima
poderia
contribuir
para
o
aparecimento
do
câncer.


 Defeitos
em
MSH2
causam
perda
do
MMR
e
junto
com
defeitos
em
MLH1
são
responsáveis
por
60
a
70%

dos
 cânceres
 HNPCC.
 
 Defeitos
 em
 MSH6
 estão
 implicados
 em
 câncer
 coloretal
 familiar,
 um
 tipo
 de
 câncer

diferente
de
HNPCC,
que
é
caracterizado
por
muitas
mutações
espontâneas
devidas
ao
acúmulo
de
erros
de

emparelhamento.



 VII
 67

Xeroderma
pigmentosum
(XP)


 Assim
nomeada
em
1870
por
M.
Kaposi,
esta
síndrome
manifesta‐se
primordialmente
pela
presença
de

pigmentação
heterogênea
na
pele
exposta
ao
sol.
Existem
também
desordens
neurológicas
associadas
devido

à
 degeneração
 neural,
 levando
 ao
 nanismo
 e
 desenvolvimento
 sexual
 incompleto.
 A
 visão
 é
 afetada
 por

intensa
 fotofobia
 e
 lesões
 oculares.
 A
 característica
 mais
 marcante
 dessa
 doença
 é
 a
 presença
 de
 uma
 taxa

elevada
de
carcinomas
cutâneos
observados
nas
zonas
da
pele
expostas
ao
sol.
Este
fato
reside
na
descoberta

de
J.
Cleaver
que
mostrou
a
incapacidade
de
células
retiradas
de
pacientes
XP
em
repararem
lesões
produzidas

pela
radiação
UV‐C.

‐ Epidemiologia
 –
 a
 doença
 aparece
 em
 todo
 o
 mundo
 e
 se
 transmite
 hereditariamente
 de
 uma
 forma

autossômica
recessiva
em
freqüências
variáveis
(de
1:1.000.000
na
Europa
e
Estados
Unidos
a
1:100.000

no
 Japão
 e
 norte
 da
 África
 do
 Norte,
 onde
 os
 casamentos
 consangüíneos
 são
 mais
 freqüentes).
 Os

heterozigotos
para
o
caráter
não
apresentam
sintomatologia.

‐ O
 XP
 clássico
 –
 assim
 é
 chamada
 a
 forma
 mais
 comum
 da
 doença,
 com
 75%
 dos
 doentes
 apresentando

sintomas
entre
2
e
4
anos,
decorrentes
de
exposição
ao
sol.

Além
 das
 anomalias
 cutâneas,
 alterações
 no
 sistema
 visual
 são
 extremamente
 comuns,
 tais
 como:

fotofobia,
lesões
na
conjuntiva
e
na
córnea.


 A
 característica
 mais
 marcante
 da
 forma
 XP
 clássica
 é
 a
 aparição
 de
 tumores
 malignos
 cutâneos
 ou

oculares
numa
idade
média
de
8
anos
(50
anos
mais
cedo
do
que
a
população
em
geral)
e,
em
97%
dos
casos,

nas
áreas
expostas
ao
sol.
Cerca
de
5%
do
total
de
pacientes
XP
desenvolvem
tumores
malignos,
número
que

representa
um
risco
duas
mil
vezes
maior
que
a
população
em
geral.
O
XPA
é
predominante
no
Japão,
o
XPC

na
 Europa
 e
 Egito
 e
 o
 XPD
 na
 Europa.
 Na
 figura
 VII.36
 está
 representada
 a
 incidência
 dos
 sintomas
 e
 do

aparecimento
do
câncer
de
pele
em
indivíduos
XP,
em
função
do
tempo
de
vida,
comparada
com
a
incidência

de
câncer
de
pele
em
indivíduos
normais.




Figura
 VII.36
 –
 Idade
 (anos)
 de
 aparecimento
 das
 manifestações
 cutâneas
 em
 pacientes
 XP
 e
 de

desenvolvimento
de
tumor
em
indivíduos
XP
e
sadios




 O
XP
variante
–
10‐15%
dos
pacientes
XP
expressam
sintomas
em
idade
maior
que
o
XP
clássico,
entre

15
 e
 45
 anos.
 Nesses
 pacientes,
 a
 progressão
 da
 doença
 é
 mais
 lenta
 e
 a
 expectativa
 de
 vida
 é

consideravelmente
 maior.
 A
 alteração
 bioquímica
 existente
 nessas
 células
 é
 diferente
 da
 do
 XP

clássico,
como
já
descrito.

 Características
 genéticas
 da
 célula
 XP
 –
 células
 obtidas
 a
 partir
 de
 pacientes
 XP
 são
 incapazes
 de

reparar
 uma
 série
 de
 lesões
 no
 seu
 DNA,
 como
 aquelas
 induzidas
 por
 UV‐C,
 radiação
 ionizante,

agentes
intercalantes
de
DNA,
psoralenos,
etc.

Testes
de
sensibilidade
ao
UV
revelam,
contudo,
não
existir
apenas
uma
forma
da
doença.
Dependendo
do

grau
de
tolerância
ao
UV‐C,
por
exemplo,
foram
identificadas
formas
clássicas
XPA,
XPB,
etc.
sendo
as
formas

clássicas
mais
sensíveis
que
a
forma
XP
variante.

 VII
 68

Além
das
diferenças
quantitativas
no
reparo
das
lesões,
existem
particularidades
qualitativas
na
forma
de

reparar
essas
lesões,
observadas
entre
os
diferentes
tipos
de
células
XP.
Células
obtidas
a
partir
de
pacientes

do
grupo
XPC,
por
exemplo,
possuem
reparo
preferencial,
ou
seja,
são
capazes
de
reparar
lesões
nas
regiões

de
 DNA
 onde
 haja
 grande
 atividade
 replicativa
 ou
 transcripcional,
 enquanto
 o
 genoma
 em
 geral
 não
 sofre

qualquer
tipo
de
reparo.

Células
 da
 forma
 XP
 variante
 são
 apenas
 ligeiramente
 mais
 sensíveis
 ao
 UV
 do
 que
 as
 células
 normais
 e

uma
 atividade
 de
 reparo
 por
 excisão
 –
 ressíntese
 normal.
 Clinicamente,
 o
 paciente
 portador
 da
 forma
 XP

variante
tem
sinais
semelhantes
aos
da
forma
XP
clássica,
entretanto
os
tumores
cutâneos
malignos
aparecem

bem
 mais
 tarde,
 entre
 15
 e
 40
 anos.
 O
 defeito
 bioquímico
 dessas
 células
 está
 na
 ausência
 de
 tolerância
 às

lesões
no
momento
da
replicação
do
DNA.
Uma
célula
normal
bloqueia
a
sua
replicação
transientemente
após

irradiação
 com
 UV,
 e
 a
 reparação
 pós‐replicativa
 restaura
 a
 massa
 normal
 de
 DNA
 nas
 horas
 pós‐irradiação.

Nas
células
XP
variantes,
a
Polη
está
mutada
e
é
substituída
pela
Polι,
que
erra
muito
e
conduz
às
mutações

que
gerarão
o
câncer.

 Mutagênese
–
culturas
de
células
obtidas
a
partir
de
pacientes
XP
clássicos
ou
variantes
apresentam

uma
taxa
muito
elevada
de
mutagênese
quando
tratadas
com
UV
ou
agentes
químicos
mutagênicos.

As
anomalias
pigmentares
observadas
na
pele
dos
pacientes
parece
derivar
de
proliferação
de
clones

mutados
 e
 a
 aparição
 de
 tumores
 nas
 áreas
 da
 pele
 expostas
 ao
 sol
 reforça
 a
 teoria
 de
 que
 a

hipermutabilidade
pode
ser
a
origem
da
cancerização
de
uma
célula.
O
XP
é
o
melhor
exemplo
para

correlacionar
acúmulo
de
lesões
não
reparadas
no
DNA
com
aumento
da
taxa
de
mutagênese
induzida

e
a
proliferação
precoce
de
tumores.

 Atividade
 catalase
 –
 as
 células
 XP
 de
 qualquer
 tipo
 são
 deficientes
 em
 atividade
 catalase,
 sendo

incapazes
 de
 detoxificar
 a
 água
 oxigenada
produzida
pelo
seu
metabolismo.
O
acúmulo
de
 produtos

tóxicos
 e
 as
 lesões
 celulares
 geradas
 por
 eles
 pode
 explicar
 a
 degeneração
 progressiva
 das
 células

nervosas
e
os
tumores
cerebrais
observados
nesses
pacientes.

 Ativação
 de
 oncogenes
 em
 tumores
 isolados
 de
 pacientes
 XP
 –
 os
 proto‐oncogenes
 são
 genes

indispensáveis
ao
desenvolvimento
normal
dos
tecidos.
A
regulação
anormal
ou
modificações
em
sua

mensagem
genética
podem
resultar
em
conseqüências
importantes
para
a
célula.

A
 ativação
 de
 oncogenes
 pode
 dever‐se
 a
 uma
 de
 quatro
 possibilidades:
 a)
 aumento
 da
 quantidade
 de

proteína
codificada
por
ele
por
amplificação
gênica;
b)
modificação
das
seqüências
de
nucleotídeos
nas
suas

regiões
 regulatórias
 por
 translocação
 gênica;
 c)
 mudança
 na
 estrutura
 primária
 da
 proteína
 codificada
 pelo

oncogene
 devido
 a
 alteração
 pontual
 na
 sua
 seqüência
 gênica;
 d)
 aumento
 da
 transcrição
 do
 gene
 devido
 à

inserção
de
elementos
regulatórios
de
oncovírus.

A
 análise
 genética
 de
 células
 colhidas
 de
 tumores
 espino‐
 ou
 basocelulares
 de
 pacientes
 XP
 revelou
 a

presença
de
mutações
puntiformes
no
códon
61
do
gene
N‐ras
ou
no
códon
12
do
gene
Ki‐ras.
Essas
mutações

podem
decorrer
de
danos
produzidos
pela
radiação
UV.

Após
exposição
da
pele
ao
UV,
lesões
do
tipo
dímero,
formadas
entre
timinas
adjacentes
no
gene
ras,
na

ausência
de
sua
reparação,
pode
levar
à
replicação
errônea
do
DNA
e
à
incorporação
indevida
de
uma
adenina

no
lugar
da
timina.
Este
tipo
de
mutação
é
observada
no
DNA
de
células
cultivadas
in
vitro
ou
em
DNA
de
vírus

SV‐40
irradiados
com
UV
e
usados
para
transformar
essas
células.

Importante
 frisar
 que
 este
 tipo
 de
 mutação
 no
 gene
 N‐ras
 não
 é
 encontrada
 nos
 fibroblastos
 não‐
transformados
do
mesmo
paciente,
sugerindo
que
a
predisposição
genética
que
leva
ao
desenvolvimento
de

câncer
nos
pacientes
XP
deve‐se
à
transmissão
hereditária
de
um
gene
N‐ras
mutado.

Obviamente,
 a
 tumorização
 das
 células
 mutadas
 pontualmente
 em
 ras
 depende
 de
 outras
 alterações

genéticas
como,
por
exemplo,
a
amplificação
gênica
e/ou
o
rearranjo
de
seqüências
de
DNA
dos
genes
c‐myc
e

Ha‐ras.



Tricotiodistrofia
(TTD)


 Sob
 a
 designação
 de
 TTD
 são
 incluídas
 várias
 síndromes
 que
 se
 originam
 de
 disfunções

neuroectodérmicas,
 como,
 por
exemplo,
 as
síndromes
 de
Sabinas,
de
Pollit
e
de
Tay,
e
descrições
 feitas
 por

 VII
 69

Brown,
Jackson,
Arbisser,
e
outros.
Trata‐se
de
uma
doença
autossômica
recessiva
provavelmente
transmitida

hereditariamente
pelo
cromossoma
X.
Atualmente
são
divididos
em
três
grupos
de
complementação,
TTD‐A,

TTD‐B
e
TTD‐C.
A
microinjeção
de
TFIIH
só
consegue
complementar
o
grupo
TTD‐A,
sugerindo
ser
esta
forma

de
 TTD
 associada
 à
 deficiência
 em
 algum
 fator
 de
 transcrição.
 Os
 demais
 grupos
 têm
 deficiências
 nos
 genes

XPB
ou
XPD.


 Ocorre
uma
hipoplasia
de
todos
os
pelos
e
dos
cabelos
que
apresentam‐se
secos,
curtos
e
frágeis.
Sob
o

microscópio
 óptico
 os
 fios
 aparecem
 com
 bandas
 claras
 transversais,
 correspondendo
 a
 pontos
 de
 fratura

gerando
 o
 quadro
 chamado
 “trichoschisis”.
 Existe
 uma
 diminuição
 característica
 –
 pelo
 menos
 50%
 ‐
 nos

teores
de
cisteína.
Outras
anomalias
incluem
retardamento
mental,
pequeno
porte,
ictiose,
fotossensibilidade,

catarata,
hipogonadismo,
microcefalia
e
orelhas
proeminentes.


 Cerca
 de
 50%
 dos
 pacientes
 TTD
 apresentam
 células
 com
 reparo
 de
 DNA
 deficiente.
 Como
 nas
 células

XPD,
elas
podem
ser
deficientes
na
atividade
helicase
associada
ao
gene
ERCC2,
mas
também
nas
atividades

dos
genes
XPB,
XPG
e
de
co‐fatores
do
acoplamento
transcrição‐reparo.
Ainda
assim,
os
quadros
clínicos
XP
e

TTD
 guardam
 características
 próprias
 diferentes
 entre
 si,
 como,
 por
 exemplo,
 a
 baixa
 ocorrência
 de
 câncer

cutâneo
em
pacientes
TTD,
que
é
elevada
em
pacientes
XPD.

Em
ensaios
de
reparo
de
plasmídeos‐vetor
irradiados
com
UV‐C,
e
depois
fotorrestaurados
para
retirada

dos
 dímeros
 ciclobutano,
 verificou‐se
 que
 células
 TTD
 são
 normais
 para
 reparação
 de
 outros
 fotoprodutos

não‐dímero.
 Quando
 os
 dímeros
 ciclobutano
 estão
 presentes,
 entretanto,
 o
 nível
 de
 mutagênese
 aumenta

consideravelmente
nessas
células.

A
deficiência
de
reparo
encontrada
em
TTD
e
XPD
é
a
mesma,
mas
são
diferentes
as
taxas
de
incidência

de
 câncer
 de
 pele
 nas
 duas
 síndromes.
 Isso
 implica
 em
 que
 a
 disfunção
 de
 reparo
 em
 si
 não
 deve
 ser

responsável
 pela
 propensão
 ao
 câncer,
 que
 parece
 decorrer
 de
 outras
 disfunções
 fenotípicas
 geradas
 pela

deficiência
nos
processos
de
metabolismo
de
DNA.
Ainda
que
hipotéticas,
as
explicações
propostas
para
esses

fatos
 sugerem
 que
 os
 pacientes
 XPD
 são
 imunossensíveis
 e
 essa
 característica,
 sim,
 poderia
 favorecer
 o

aparecimento
dos
tumores
nesse
grupo.
Mais
recentemente,
foi
constatado
que
as
células
TTD
poderiam
ter

transcrição
geral
defectiva
ou
então
níveis
reduzidos
de
TFIIH,
o
que
evitaria
a
expressão
gênica
das
anomalias

de
pele
derivadas
da
transcrição
de
genes
alterados
pela
disfunção
de
reparo.



Síndrome
de
Cockayne
(CS)


 É
 uma
 doença
 transmitida
 hereditariamente,
 autossômica
 e
 recessiva.
 As
 pessoas
 afetadas
 apresentam

nanismo,
surdez,
pigmentação
granulada
na
retina,
microcefalia
e
retardo
mental.
A
face
é
estreita,
pequena,

com
olhos
pequenos,
arcadas
supraciliares
salientes,
retrognatia
do
maxilar
inferior,
orelhas
descoladas
com

perda
 de
 gordura
 subcutânea.
 Em
 conjunto,
 essas
 características
 fazem
 o
 paciente
 ter
 uma
 aparência

envelhecida
e
similar
à
figura
de
um
camundongo.


 A
deficiência
genética
de
células
CS,
assim
como
das
XP,
causa
grande
sensibilidade
ao
UV,
sem,
contudo,

apresentarem
tendência
à
cancerização.
Os
pacientes
CS
fotossensíveis
estão
divididos
em
cinco
grupos.

Os

grupos
 CSA
 e
 CSB
 compreendem
 os
 pacientes
 que
 somente
 apresentam
 os
 sintomas
 CS,
 com
 a
 maioria
 dos

pacientes
estudados
mutados
no
gene
CSB.

Os
outros
três
grupos
estão
associados
aos
grupos
XPD,
XPB
ou

XPG
e
apresentam
os
sintomas
combinados
de
XP
e
CS.
A
deficiência
é
em
reparo
de
DNA
que
esteja
sendo

ativamente
 transcrito
 (TCR).
 A
 transcrição
 de
 RNA
 pós‐UV
 é
 defectiva
 nessas
 células.
 As
 seqüências
 de
 DNA

não‐transcrito
 são,
 todavia,
 reparadas
 normalmente.
 Desse
 modo,
 as
 células
 CS
 não
 apresentam
 o

acoplamento
transcrição‐reparo,
podendo
ser
deficientes
nos
genes
CSB,
XPB
e
XPD.
Sugere‐se
que
os
genes

CSB
e
CSA
possam
desempenhar
um
papel
de
TRF
(Transcription
Repair
Factor).


 As
proteínas
XPB
e
XPD
codificadas,
pelos
genes
mutados
em
certos
grupos
XP,
TTD
e
CS
têm
um
papel
no

reparo
 e
 também
 na
 transcrição.
 Para
 explicar
 a
 heterogeneidade
 dos
 sintomas
 clínicos
 associados
 às

mutações
XPB
e
XPD,
a
hipótese
da
síndrome
de
transcrição/reparo
foi
colocada
em
questão:
uma
mutação

em
 uma
 das
 proteínas
 poderia
 afetar
 o
 reparo,
 provocando
 os
 sintomas
 de
 XP
 e
 a
 fotossensibilidade
 dos

pacientes
 TTD
 e
 Cockayne,
 mas
 também
 diminuir
 a
 transcrição
 de
 certos
 genes,
 provocando
 os
 sintomas

especificamente
 associados
 a
 TTD
 e
 a
 CS,
 como
 anomalias
 do
 desenvolvimento
 físico,
 neurológico
 e
 sexual,

assim
como
as
anomalias
dos
pêlos
do
TTD
e
a
dismielinização.
 

 VII
 70


 Recentemente,
 o
 estudo
 do
 efeito
 das
 mutações
 XPD
 sobre
 o
 reparo
 e
 iniciação
 da
 transcrição
 revelou

que
 segundo
 suas
 posições
 no
 gene
 XPD,
 as
 mutações
 XPD
 diminuiriam
 o
 reparo
 e/ou
 a
 iniciação
 da

transcrição.
O
defeito
na
iniciação
da
transcrição
não
seria
devido
à
diminuição
da
atividade
helicase
de
XPD,

mas
devido
à
troca
de
conformação
do
complexo
TFIIH
induzida
por
essa
mutação.
Quanto
maior
for
a
troca

de
 conformação
 do
 complexo
 TFIIH,
 maior
 será
 o
 dano
 produzido
 na
 transcrição,
 podendo
 até
 ocasionar

mutações
 letais
 se
 essa
 troca
 de
 conformação
 do
 TFIIH
 for
 de
 grande
 importância.
 Contrariamente
 a
 XPD,
 a

atividade
 helicase
 de
 XPB
 é
 necessária
 para
 a
 iniciação
 da
 transcrição.
 As
 mutações
 afetando
 a
 atividade

helicase
de
XPB
seriam
letais
e
isso
explicaria
o
número
reduzido
de
pacientes
XPB
em
relação
aos
pacientes

XPD.



Ataxia
telangiectasia
(AT)

A
 Ataxia
 telangiectasia
 é
 uma
 doença
 autossômica
 recessiva
 caracterizada
 por
 uma
 sensibilidade

aumentada
 às
 radiações
 ionizantes.
 A
 incidência
 é
 de
 1
 pessoa
 afetada
 a
 cada
 40.000
 nascimentos
 e

apresenta‐se
sob
quatro
grupos
de
complementação.

Seus
 primeiros
 sintomas
 geralmente
 aparecem
 na
 infância
 e
 caracterizam‐se
 por
 uma
 ataxia
 cerebelar

progressiva.
Seguem‐se
anomalias
cutâneas
e
do
globo
ocular
–
dilatação
de
pequenos
vasos
–
aos
distúrbios

neurológicos.
 A
 telangiectasia
 não
 é
 restrita
 às
 áreas
 expostas
 ao
 sol
 e
 ainda
 podem
 ocorrer
 vitiligo
 ou

hiperpigmentação
 na
 pele.
 O
 sistema
 imunológico
 também
 é
 afetado
 pela
 doença,
 seja
 pela
 presença
 de

múltiplas
infecções
ou
pelo
aparecimento
de
câncer,
em
geral
das
próprias
células
imunitárias,
por
volta
dos

20
 anos
 de
 idade.
 A
 idade
 média
 para
 aparecimento
 de
 neoplasias
 na
 população
 em
 geral
 é
 de
 55
 anos.
 Os

pais
 de
 indivíduos
 AT,
 heterozigotos
 para
 o
 caráter,
 já
 são
 mais
 suscetíveis
 ao
 desenvolvimento
 de
 linfomas

quando
 comparados
 com
 a
 população
 em
 geral.
 Estima‐se
 que
 a
 presença
 do
 gene
 AT
 na
 população
 é

responsável
por
5%
dos
casos
de
cânceres
fatais
antes
dos
45
anos.

Além
 de
 sua
 alta
 sensibilidade
 às
 radiações
 ionizantes,
 as
 células
 de
 indivíduos
 AT
 apresentam
 taxa

elevada
 de
 anomalias
 cromossômicas.
 As
 alterações
 citogenéticas
 envolvem
 majoritariamente
 os

cromossomos
2,
7,
14
e
22,
correlacionados
com
a
localização
de
genes
da
superfamília
de
imunoglobulinas
e

de
rearranjos
ilegítimos.
Os
clones
pré‐tumorais
e
tumorais
presentes
em
10%
dos
pacientes
AT
têm
rearranjo

na
banda
q11.2
do
cromossomo
14,
levando
ao
desenvolvimento
de
leucemias
crônicas
de
células
T.
Contudo,

a
grande
sensibilidade
às
radiações
ionizantes
ligada
ao
quadro
AT
torna
inviável
o
tratamento
desses
tumores

com
radioterapia
ou
radiomiméticos.

As
 lesões
 produzidas
 pelas
 radiações
 ionizantes
 são
 reparadas
 normalmente;
 entretanto,
 a
 parada
 na

síntese
de
DNA
que
ocorre
após
a
irradiação
de
células
normais
não
é
encontrada
em
células
AT.
Para
explicar

o
efeito
pleiotrópico
da
mutação
AT
que
afeta
tanto
a
resposta
a
danos
oxidativos
no
tecido
nervoso
quanto
a

formação
de
imunoglobulinas
maduras,
tem
sido
sugerido
que
o
defeito
presente
nessas
células
pode
ser
em

alguma
DNA‐topoisomerase
ou
recombinase,
responsáveis
por
rearranjos
genéticos
necessários
à
formação
de

imunoglobulinas
e
pela
recuperação
de
lesões
no
DNA.

Achados
de
citogenética
apontam
que
o(s)
gene(s)
associado(s)
ao
fenótipo
AT
encontra(m)‐se
localizados

na
 posição
 q22‐23
 do
 cromossomo
 11.
 Recentemente,
 foi
 descoberto
 que
 todos
 os
 quatro
 grupos
 AT
 têm

mutações
no
gene
que
codifica
uma
Fosfatidil‐inositol
3’
cinase,
denominado
ATM,
envolvida
com
controle
do

ciclo
celular.
Mesmo
após
irradiação
com
radiação
ionizante,
a
síntese
de
DNA
não
é
interrompida,
indicando

serem
as
células
AT
deficientes
em
pontos
de
checagem,
“checkpoints”,
do
ciclo
celular.


 ATM
é
o
regulador
máximo
numa
rede
de
sinalizações
responsáveis
por
coordenar
o
reparo
de
quebras

duplas,
 funções
 de
 pontos
 de
 checagem
 e
 outros
 processos
 de
 sinalização
 que
 promovem
 sobrevivência
 e

recuperação
 celular.
 ATM
 cinase
 tem
 numerosos
 substratos
 que
 estão
 envolvidos
 na
 ativação
 de
 funções

celulares
 em
 resposta
 às
 quebras
 duplas
 no
 DNA,
 espontâneas
 ou
 induzidas.
 Enquanto
 algumas
 dessas

proteínas
 alvo
 estão
 diretamente
 envolvidas
 no
 reparo
 pela
 Recombinação
 Homóloga
 ‐
 
 HR
 (como
 NBS1
 e

RPA),
muitas
delas
participam
em
outros
processos
de
sinalização
e
funções
“checkpoints”
(como
H2AX,
TP53,

MDM2,
BRCA1,
CHK1,
CHK2),
ou
outras
respostas,
promovendo
apoptose
ou
proliferação
celular
(como
c‐ABL

e
E4‐BP1).



 VII
 71

Anemia
de
Fanconi
(FA)

Trata‐se
 de
 uma
 anomalia
 autossômica
 recessiva
 associada
 a
 uma
 instabilidade
 cromossômica

espontânea
 ou
 induzida
 e
 por
 uma
 marcante
 predisposição
 a
 ocorrência
 de
 leucemias
 e
 tumores
 sólidos.
 A

anemia
 característica
 da
 doença
 manifesta‐se
 por
 volta
 dos
 10
 anos
 de
 idade,
 afetando
 progressivamente

todos
 os
 elementos
 sangüíneos,
 sugestivo
 de
 uma
 disfunção
 da
 medula
 óssea.
 Cerca
 de
 80%
 dos
 pacientes

apresentam
anomalias
cutâneas:
hiperpigmentação
difusa,
manchas
marrons
ou
acromáticas.
A
incidência
de

leucemias
mielogênica
ou
pré‐leucemias
manifesta‐se
em
15%
dos
pacientes,
uma
taxa
~15.000
vezes
superior

àquela
da
população
em
geral.

Como
 cada
 doença
 está
 associada
 à
 sensibilidade
 a
 um
 agente
 específico
 –
 UV
 para
 XP
 e
 radiação

ionizante
 para
 AT
 –
 as
 células
 FA
 são
 sensíveis
 a
 agentes
 que
 formem
 ligações
 inter‐hélice
 com
 o
 seu
 DNA

(crosslinks),
 como
 os
 quimioterápicos
 antitumorais
 Mitomicina
 C
 (MMC)
 ou
 Mostardas
 Nitrogenadas
 ou

agentes
 anti‐psoríase
 como
 os
 Psoralenos
 ativados
 por
 UVA
 (PUVA).
 A
 sensibilidade
 dessas
 células
 a
 esses

agentes
 é
 tão
 marcante
 que
 o
 aumento
 no
 número
 de
 aberrações
 cromossômicas
 causadas
 pelo
 agente

diepoxibutano
em
células
do
líquido
amniótico
é
usado
para
diagnóstico
pré‐natal
da
doença.

Ainda
 que
 alguns
 tipos
 de
 células
 FA
 sejam
 capazes
 de
 fazer
 incisões
 nos
 sítios
 de
 ligações
 inter‐hélice,

essas
 lesões
 são
 reparadas
 mais
 lentamente
 do
 que
 nas
 células
 normais
 e
 é
 acompanhado
 de
 uma

mutagênese
 reduzida,
 sugerindo
 que
 a
 via
 ausente
 nessas
 células
 é
 sujeita
 a
 erros.
 No
 grupo
 de

complementação
A
(FA‐A),
a
atividade
de
incisão
endonucleolítica
nos
sítios
de
crosslinks
está
ausente
mas
as

incisões
 são
 verificadas
 nos
 sítios
 de
 monoadutos.
 Em
 geral,
 todos
 apresentam
 alta
 taxa
 de
 recombinação
 e

apoptose
desregulada,
sugerindo
que
os
genes
FA
regulem
o
metabolismo
de
DNA
e
apoptose.


 A
 anemia
 de
 Fanconi
 é,
 geneticamente,
 muito
 heterogênea,
 apresentando
 vários
 grupos
 de

complementação,
tendo
sido
clonados
e
identificados
genes
FANC
para
os
subtipos:
A,
C,
D1,
D2,
E,
F,
G
e
L.

Algumas
proteínas
FA
parecem
ter
tanto
funções
nucleares
como
citoplasmáticas.
O
complexo
nuclear
de
FA,

composto
das
proteínas
FANCA,
C,
E,
F,
G
e
L
é
essencial
para
a
proteção
contra
quebra
cromossômica
após

tratamento
com
MMC.
Após
tratamento
com
MMC
ou
radiação
ionizante,
as
proteínas
FANCA,
C,
E,
F,
G
e
L

são
todas
necessárias
para
ativação
da
proteína
FANCD2.
FANCD2
é
ubiquitinada
pela
proteína
FANCL
após
o

que
sofre
redistribuição
dentro
do
núcleo,
sendo
encontrada
nos
mesmos
“foci”
nucleares
que
BRCA1.


 Os
 modelos
 de
 camundongos
 nocaute
 construídos
 para
 FANCA,
 FANCC
 e
 FANCG
 não
 demonstraram

nenhum
defeito
no
desenvolvimento
e
nem
anemia
progressiva.


 Verificou‐se
 também
 que
 FANC
 interage
 com
 ATM,
 já
 que
 FANCD2
 é
 fosforilada
 pela
 ATM
 cinase.
 A

fosforilação
de
FANCD2
é
necessária
para
o
checkpoint
da
fase
S,
isto
é,
inibição
da
iniciação
da
replicação
do

DNA,
uma
característica
das
células
AT.


 Mais
recentemente
foram
identificadas
mutações
bialélicas
no
gene
BRCA2
em
pacientes
FA
do
grupo
de

complementação
 D1.
 Após
 transfecção
 com
 plasmídeo
 contendo
 o
 cDNA
 que
 codifica
 a
 proteína
 BRCA2

selvagem
as
células
mutantes
FANCD1
exibiram
sensibilidade
ao
quimioterápico
MMC
em
níveis
compatíveis

aos
das
células
normais.
Estas
observações
sugerem
que
BRCA2
é,
na
verdade,
o
gene
Fanconi
FANCD1
,
até

então
desconhecido.

A
 comparação
 entre
 diferentes
 fenótipos
 sugere
 alguns
 outros
 papéis
 para
 as
 proteínas
 FANC
 como
 na

replicação
do
DNA,
transcrição
ou
remodelamento
da
cromatina.



Síndrome
de
Nijmegen


 A
síndrome
de
Nijmegen
("Nijmegen
Breakage
Syndrome”
‐NBS)
é
uma
desordem
genética
que
foi

descrita
em
1981,
é
muito
próxima
a
Ataxia
Telangiectasia
(AT)
e
envolve
um
gene
distinto
que
foi
identificado

em
1998.
Os
pacientes
com
a
síndrome
da
quebra
Nijmegen
(NBS)
parecem
pacientes
AT
com
respeito
à

imunodeficiência,
radiossensibilidade,
e
predisposição
a
câncer,
mas
eles
não
apresentam
nem
ataxia
e
nem

telangiectasia.
O
fenótipo
celular
de
NBS
é
remarcadamente
similar
àquele
das
células
AT.
NBS
cresce

pobremente
e
exibe
um
defeito
parcial
no
checkpoint
da
fase
G1
em
resposta
à
lesão
provocada
pela
radiação

ionizante,
e
um
defeito
parcial
no
checkpoint
da
fase
S,
manifestado
como
síntese
de
DNA
radiorresistente.

Estudos
com
fibroblastos
NBS
não
imortalizados
tendo
respostas
normais
aos
checkpoints,
conduziram
à

conclusão
de
que
a
sensibilidade
à
radiação
ionizante
é
causada
pelo
defeito
no
reparo
de
duplas‐quebras
e

 VII
 72

não
falha
nos
“checkpoints”.
Um
defeito
no
reparo
de
DNA
parece
explicar
a
classe
deficiente
nos
rearranjos

dos
genes
da
imunoglobulina
que
prejudicam
o
desenvolvimento
do
sistema
imune.
Além
disso,
mutações
no

gene
NBS1
podem
ser
associadas
ao
encurtamento
dos
telômeros.


 NBS
é
um
componente
de
um
complexo
estável,
contendo
homólogos
de
mamíferos
das
proteínas
de

levedura
MRE11
e
RAD50.
O
complexo
MRN
se
associa
com
duplas
quebras
após
exposição
à
radiação

ionizante
e
forma
“foci”
nucleares
em
torno
de
8
horas
depois
de
muitas
junções
de
quebras
duplas
terem

ocorrido.
A
interação
direta
de
NBS1
com
MRE11
através
da
sua
região
C‐terminal
é
necessária
para
a

localização
nuclear
e
resistência
normal
à
radiação.
A
fosforilação
de
NBS1
na
Ser343
e
em
outros
locais
por

ATM
é
necessária
para
a
resistência
à
radiação
ionizante.
Além
do
mais,
a
fosforilação
e
ativação
da
cinase

CHK2
por
ATM
requerem
a
fosforilação
de
NBS1
na
Ser343.


 A
relevante
funcionalidade
do
gene
NBS1
deve
estar
relacionada
à
participação
deste
no
complexo
MRN.

Recentemente
mutações
no
gene
MRE11
foram
identificadas
em
4
pacientes
de
duas
famílias,
que
foram

descritas
tendo
“Ataxia
Telangiectasia‐Llike
Disorder”
(ATLD).
O
fenótipo
dessas
células
mutantes
parece
com

o
fenótipo
das
células
AT,
mas
os
fibroblastos
ATLD
mostram
sensibilidade
branda
à
radiação.


 A
idéia
da
necessidade
do
complexo
MRN
estar
intacto
para
a
resposta
celular
normal
às
quebras
duplas
é

evidenciada
por
vários
estudos.
Em
células
ATLD
a
estabilidade
das
interações
com
RAD50
e
NBS1
é
reduzida,

e
a
formação
dos
“foci”
nucleares
induzidos
pela
radiação
ionizante
para
NBS1
e
MRE11
é
grandemente

diminuída.
A
deficiência
transitória
de
MRE11
provoca
grande
aumento
na
radiossensiblildade
e
reduz

fortemente
a
freqüência
de
integrações
com
outros
alvos,
o
que
superestima
a
importância
de
MRE11
na

recombinação
homóloga
e
na
estabilidade
cromossômica.
Da
mesma
forma,
a
proteína
RAD50
é
também

indispensável
para
a
viabilidade
celular.
Análises
do
duplo‐mutante
ku70
mre11
sugerem
que
MRE11
atua

primariamente
no
reparo
pela
Recombinação
Homóloga
(HR)
e
não
no
reparo
por
Junção
das
Extremidades

Não
Homólogas
(NHEJ).



Síndrome
de
Werner


 A
síndrome
de
Werner
(WS)
é
uma
desordem
genética
autossômica
recessiva
rara,
com
uma
freqüência

estimada
de
1/22
casos
por
milhão
de
pessoas
da
população
do
mundo
inteiro.
Interessantemente,
a
maioria

dos
casos
de
WS
tem
sido
descrita
no
Japão:
de
aproximadamente
1200
casos
relatados
no
mundo
inteiro,

cerca
de
850
são
do
Japão,
onde
a
prevalência
de
portadores
heterozigóticos
na
população
é
predita
por
ser

maior
que
6
em
1000.
Conseqüentemente,
existem
aproximadamente
35
pacientes
WS
por
milhão
na

população
japonesa.


 WS
foi
descrita
primeiramente
por
Otto
Werner
em
1904
em
sua
tese
de
doutorado
pela
Universidade
de

Kiel.
Até
1945
não
era
feita
uma
clara
distinção
entre
as
síndromes
de
Werner
e
Rothmund‐Thomson,
devido
à

grande
similaridade
entre
os
seus
sintomas
clínicos.
Com
o
trabalho
de
Thannhauser
em
1945,
que
listou
as

principais
características
de
Werner,
o
diagnóstico
dessas
doenças
passou
a
ser
mais
facilitado.



 Geralmente,
a
síndrome
torna‐se
aparente
na
adolescência
devido
à
perda
da
habitual
aceleração
de

crescimento
nessa
época,
portanto,
os
paciente
WS
são
de
estatura
baixa.
Outras
características
clínicas

tornam‐se
aparentes
entre
os
20
e
30
anos
de
idade.
Ocorrem
mudanças
na
face,
com
afinamento
do
nariz,
a

pele
é
fina
e
seca
com
pigmentação
variável.
Os
pacientes
WS
apresentam
eritemas
(manchas
ou
placas

avermelhadas)
acompanhadas
de
edemas
(inchaço),
freqüentemente
sobre
as
áreas
dos
ossos,
que
podem

tornar‐se
ulceradas.
Cataratas
aparecem
numa
idade
bem
precoce
e
são
freqüentemente
bilaterais.
Um
dos

sinais
precoces
da
doença
é
o
prematuro
embranquecimento
e
perda
dos
cabelos.
Há
alta
incidência
de

osteosporose,
calcificação
dos
tecidos
flexíveis
e
“diabetes
mellitus”.
Vários
sintomas,
comuns
ao

envelhecimento
normal
surgem
precocemente
nos
pacientes
com
a
síndrome
de
Werner,
incluindo

 VII
 73

aterosclerose,
atrofia
cerebral
cortical,
depleção
linfóide
e
atrofia
do
timo.
Entretanto,
vários
outros
sintomas

diferem
entre
as
duas
“condições”.
Assim,
por
exemplo,
entre
os
pacientes
WS
encontramos
alta
incidência
de

cânceres
em
indivíduos
jovens,
mas,
por
outro
lado,
observa‐se
baixa
incidência
de
neuropatologias
como

Alzheimer.


 A
causa
mais
freqüente
da
morte
dos
pacientes
WS
é
o
câncer
e
as
doenças
cardiovasculares,
sendo
47

anos
a
idade
média
de
vida.
WS
está
associada
com
uma
taxa
muito
alta
de
cânceres
de
tipos
raros.
A
razão
de

cânceres
de
origem
epitelial
e
mesenquimal
é
normalmente
de
10:1
na
população
normal,
mas
em
pacientes

WS
é
de
1:1.
Conseqüentemente,
existe
um
excesso
de
sarcomas
de
tecido
flexível,
mas
também
carcinomas

de
tiróide,
meningiomas,
melanomas
e
osteosarcomas.


 O
gene
WRN
foi
mapeado
na
região
p11‐p12
do
cromossomo
8.
Todas
as
mutações
em
WRN

já

identificadas
conduzem
a
uma
terminação
prematura
da
tradução
através
da
criação
de
um
códon
de

terminação,
ou
de
uma
mudança
no
quadro
de
leitura
(“frameshift”),
levando
também
à
terminação

prematura,
ou,
através
de
um
erro
de
“splicing”,
gerando
alterações
no
quadro
de
leitura.
Os
transcritos

mutantes
são
freqüentemente
de
baixa
regulação,
provavelmente
devido
ao
decaimento
dos
RNA

mensageiros
mediado
por
códons
“nonsense”.
Os
níveis
de
mRNA
de
WRN
,
bem
como
os
níveis
da
proteína

WRN
em
células
de
portadores
heterozigóticos
são
aproximadamente
a
metade
daqueles
vistos
em
indivíduos

normais,
e
as
células
desses
pacientes
mostram
níveis
intermediários
de
sensibilidade
a
agentes
que
lesam
o

DNA.


 A
característica
mais
relevante
destas
células
é
sua
sensibilidade
aumentada
a
4‐nitroquinolina
1‐oxide

(4NQO),
relatada
por
muitos
grupos
de
pesquisa.
As
células
WS
são
também
mais
sensíveis
a
drogas
indutoras

de
“crosslinks”,
como
cisplatina,
mitomicina
C,
clorambucil
e
melfalan.
As
células
WS
são
levemente
mais

sensíveis
à
irradiação
γ
do
que
as
células
normais
e
essa
sensibilidade
é
revertida
pela
complementação
com
o

gene
de
WRN.
Outros
pesquisadores
encontram
também
uma
sensibilidade
incomum
das
células
WS
ao

peróxido
de
hidrogênio
(H2O2).


 Existe
uma
grande
evidência
de
que
WRN
participe
no
reparo
pela
Recombinação
Homóloga
(HR).
Esse

papel
na
HR
é
evidenciado
pela
atividade
helicase
de
WRN,
assim
como
a
de
BLM,
pois
funcionam
em

estruturas
específicas
de
DNA
como
as
junções
de
Holliday.
A
evidência
de
uma
associação
de
WRN
com
BLM

reforça
essa
idéia.
E
além
do
mais,
WRN
é
encontrada
nos
“foci”
nucleares
que
parcialmente
se
co‐localizam

com
RPA
e
RAD51
após
a
parada
na
replicação,
provocada
por
hidroxiuréia,
ou
lesão
no
DNA,
em

conseqüência
do
tratamento
com
camptotecina,
etoposídeo,
4‐NQO
e
bleomicina.
Tem
sido
sugerido
que

WRN
pode
evitar
eventos
de
recombinação
aberrante
em
sítios
da
forquilha
de
replicação
estagnada
pela

dissociação
de
intermediários
de
recombinação.
Entretanto,
as
funções
exatas
das
atividades
helicase
e

exonucleásica
de
WRN
ainda
não
foram
determinadas.



Síndrome
de
Bloom
(BS)


 Trata‐se
 de
 um
 exemplo
 de
 extrema
 instabilidade
 cromossômica
 espontânea
 gerando
 aberrações

cromossômicas
 e
 trocas
 entre
 cromátides
 irmãs
 (SCE
 =
 Sister
 Chromatid
 Exchange)
 ),
 que
 aparentemente

representam
 eventos
 de
 recombinação
 homóloga,
 ocorrendo
 durantes
 as
 fases
 S
 e
 G2
 do
 ciclo
 celular.
 Os

pacientes
 apresentam
 telangiectasia,
 sensibilidade
 ao
 sol
 e
 alta
 incidência
 de
 leucemias
 e
 linfomas.
 É
 muito

freqüente
entre
os
judeus
Ashkenazins,
que
apresentam
risco
de
câncer
300
vezes
maior
do
que
a
população

em
geral.
Citogeneticamente,
as
células
BS
apresentam
várias
figuras
de
cromossomos
quadrirradiais.


 As
crianças
portadoras
da
doença
nascem
com
baixíssimo
peso
e
têm
crescimento
deficiente.
A

teleangiectasia
induzida
por
luz
desenvolve‐se
na
face,
criando
aí
uma
lesão
em
forma
de
borboleta.

 VII
 74


 As
células
afetadas
são
variavelmente
sensíveis
ao
UV.
Tem
sido
relatado
que
pode
haver
alguma

deficiência
na
atividade
da
DNA
ligase,
de
modo
que,
o
alongamento
das
cadeias
de
DNA
torna‐se
mais
lento.

Não
foram
confirmados
os
achados
de
que
células
BS
sejam
deficientes
em
atividade
SOD
ou
uracil
DNA‐
glicosilase,
como
relatado,
uma
vez
que
a
complementação
com
o
cromossoma
15
restaura
o
fenótipo
normal

dessas
células
e
ele
não
é
portador
dos
genes
que
codificam
essas
enzimas.


 O
gene
deficiente
em
BS
foi
identificado
e
denominado
BLM.
O
gene
BLM
codifica
uma
proteína
de
1417

aminoácidos
que
é
membro
da
família
das
DNA
helicases
RECQ.
Esta
família
das
helicases
também
inclui
a

proteína
da
síndrome
de
Werner
e
RECQL4
e
a
proteína
defeituosa
na
síndrome
de
Rothmund‐Thomson.


 O
papel
da
proteína
BLM
na
HR
é
também
sugerido
pois
BLM
interage
diretamente
com
RAD51
e
se
co‐
localiza
parcialmente
com
RAD51
e
RPA
em
células
não
tratadas.
Após
a
lesão
decorrente
da
radiação

ionizante
a
fração
de
co‐localização
entre
BLM
e
RAD51
é
grandemente
aumentada.
Além
disso,
após
a

radiação
ionizante
BLM
é
fosforilada
pela
cinase
ATM
e,
como
também
ocorre
com
RAD51,
se
associa
nos

sítios
de
DNA
simples
fita,
reforçando
assim
seu
provável
papel
no
HRR.
Em
resposta
à
hidroxiuréia,
mas
não
à

irradiação
ionizante,
BLM
se
relocaliza
com
o
complexo
MRN
nos
sítios
de
parada
da
replicação.
Esta

relocalização
de
MRN,
dependente
de
BLM,
requer
a
fosforilação
de
BLM
pela
cinase
ATR.



 Embora
algumas
evidências
envolvam
a
proteína
BLM
na
HR,
seu
papel
preciso
não
está
claro.
Um

modelo
sugere
que
a
helicase
BLM
possua
uma
função
anterior
à
HR,
que
seria
diminuindo
a
fração
da

forquilha
de
replicação
estagnada,
que
é
reparada
pela
recombinação,
explicando
assim,
a
alta
troca
de

cromátides
irmãs.



Síndrome
de
Rapadilino



 Outra
desordem
clínica
relacionada
a
mutações
no
gene
RECQL4
é
a
Síndrome
de
Rapadilino.
Esta

síndrome
é
uma
desordem
autossômica
recessiva
cujas
principais
características
clínicas
são:
hipoplasia
radial,

hipoplasia
patelar,
fenda
palatar,
diarréia,
juntas
deslocadas,
baixa
estatura,
má
formação
dos
membros

superiores
e
inferiores,
nariz
muito
fino
e
inteligência
normal.


 Rapadilino
é
uma
doença
hereditária
que
apresenta
uma
grande
concentração
de
pacientes
na
Finlândia,

provavelmente
em
função
de
um
efeito
fundador.
Encontramos
na
literatura
cerca
de
quatorze
pacientes

finlandeses
e
dois
não
finlandeses.
As
principais
manifestações
clínicas
que
afetam
os
pacientes
Rothmund‐
Thomson
e
Rapadilinos
se
sobrepõem.


 As
similaridades
e
diferenças
observadas
no
quadro
clínico
entre
RTS
e
Rapadilino
suscitam
a

possibilidade
dessas
doenças
resultarem
de
uma
única
desordem
com
múltiplas
características
clínicas.


 Foram
encontradas
4
mutações
no
gene
RECQL4
em
pacientes
finlandeses,
sendo
a
mutação
mais

comum,
uma
deleção
no
exon
7,
sendo
que
esta
mutação
preserva
o
domínio
helicase
da
proteína
e
mostra

efeito
dominante
sobre
outras
3
mutações
“nonsense”
(códon
de
terminação
prematuro),
que
igualmente

encontram‐se
fora
do
domínio
helicase.



Síndrome
de
Rothmund‐Thomson


 A
síndrome
de
Rothmund‐Thomson
(RTS)
foi
descrita
primeiramente
por
um
oftalmologista
alemão

August
Rothmund,
em
1868.
Em
seu
relatório,
ele
descreveu
10
pessoas
aparentadas
de
uma
mesma

cidade
da
região
da
Bavária
que
desenvolveram
precocemente
poikiloderma
e
catarata
juvenil.
Setenta

anos
mais
tarde,
Sidney
Thomson,
um
dermatologista
britânico,
relatou
três
pacientes
com

anormalidades
de
pele
semelhantes
mas
acompanhada
de
má
formação
do
esqueleto
e
denominou
a

doença
como
“poikiloderma
congenitale”.
Um
paciente
morreu
na
infância
e
os
outros
nunca

 VII
 75

desenvolveram
cataratas.
Taylor,
mais
tarde,
reconheceu
que
os
sintomas
descritos
por
Rothmund
e

Thomson
eram
manifestações
da
mesma
doença,
e
cunhou
o
termo
síndrome
de
Rothmund‐Thomson
.

Mais
tarde,
mais
de
200
casos
foram
revisados
pela
literatura
médica
e
a
RTS
foi
estabelecida
como
uma

desordem
genética
autossômica
e
recessiva
rara.
Essa
síndrome
é
caracterizada
por
anormalidades
na
pele
e

esqueleto,
cataratas
juvenis,
envelhecimento
precoce,
instabilidade
cromossômica
e
predisposição
ao
câncer,

principalmente
osteosarcoma.


 A
característica
predominante
de
RTS
é
a
poikiloderma
da
face
e
extremidades,
que
começa
bem
cedo
na

infância
(3
a
6
meses
de
vida),
progredindo
e
persistindo
na
idade
adulta.
A
poikiloderma
se
caracteriza
por

eritemas
(manchas
ou
placas
avermelhadas)
acompanhadas
de
edemas
(inchaço),
algumas
vezes
com
bolhas
e

pruridos.
Essa
anomalia
se
inicia
nas
bochechas,
espalhando‐se
depois
pelo
rosto,
orelhas
e
pescoço;
e
se

manifesta
também
nas
extremidades,
como
dorso
das
mãos,
braços,
pernas
e
nádegas.
A
poikiloderma
é
mais

grave
nas
áreas
do
corpo
expostas
ao
sol,
mas
também
está
presente
nas
áreas
não
expostas.
A
fase
aguda
de

manifestações
cutâneas
pode
durar
de
meses
até
muitos
anos,
deixando
depois
traços
marcantes
como

atrofia,
despigmentação
e
telangiectasias
(lesão
constituída
pela
dilatação
de
grupos
de
pequenos
vasos

sangüíneos
ou
de
vasos
linfáticos).
A
fotossensibilidade
também
é
outra
característica
marcante
nos
pacientes

RTS,
agravando
os
sintomas
de
poikiloderma.


 A
maioria
dos
pacientes
RTS
apresenta
anomalias
dos
pêlos,
distrofia
das
unhas,
anomalias
do
esqueleto

(macrocefalia
frontal,
nariz
achatado
e
queixo
proeminente,
sindatilia
dos
dedos
das
mãos
e
pés,
atraso
na

formação
de
ossos,
etc).


 A
catarata
é
outra
anormalidade
bem
freqüente
nos
pacientes
RTS
e
se
apresenta
em
50%
dos
casos.
Essa

anomalia
se
manifesta
até
a
idade
de
13
anos
com
aparecimento
rápido.
Os
distúrbios
orais
se
apresentam
em

40%
dos
pacientes
e
se
manifestam
essencialmente
por
microdentia
com
modelo
cônico
(as
bases
dos
dentes

são
maiores
do
que
os
ápices),
concomitantemente,
há
uma
grande
incidência
de
cáries.


 A
incidência
de
câncer
nos
pacientes
com
a
síndrome
de
Rothmund‐Thomson
é
relevante
e
deve
estar
em

torno
de
20%.
O
tipo
mais
freqüente
é
o
osteosarcoma
e
todos
mostraram
alguma
evidência
radiológica
de

anormalidade
óssea,
aparecendo
bem
cedo,
entre
a
idade
de
5
e
19
anos

A
incidência
dos
cânceres
de
pele

também
é
maior
do
que
a
esperada,
como
os
carcinomas
de
células
escamosas,
os
carcinomas
basocelulares
e

os
espinocelulares.
Outros
cânceres
não
cutâneos
incluem
fibrosarcoma,
adenoma
paratireóide,
sarcoma
de

Hodgkins
(nos
vasos
linfáticos),
carcinoma
gástrico
e
leucemia
mielóide.


 A
síndrome
de
Rothmund‐Thomson
mostra
muitas
similaridades
clínicas
com
outras
síndromes
de

instabilidade
cromossômica
e
envelhecimento
precoce
como
as
síndromes
de
Werner
e
Bloom.
As

características
clínicas
e
genéticas
da
síndrome
de
Werner
têm
sido
atribuídas
às
mutações
na
helicase

RECQL3,
enquanto
os
distúrbios
da
síndrome
de
Bloom
têm
sido
atribuídos
às
mutações
na
helicase
RECQL2.

Células
provenientes
de
oito
indivíduos
diagnosticados
como
RTS
foram
seqüenciadas
no
gene
RECQL4.

Entretanto,
mutações
nesse
gene
que
codifica
uma
helicase
desconhecida
até
então,
foram
localizadas
em

somente
quatro
indivíduos
de
duas
famílias
com
RTS.
Isso
sugere
que
deva
existir
outro
gene
ou
genes

implicados
nessa
síndrome.


 RECQL4
é
um
gene
que
codifica
uma
proteína,
DNA
helicase
humana,
pertencente
à
família
das
helicases

RecQ.
Essa
família
inclui
quatro
outros
genes:
(a)
RECQL,
(b)
RECQL2,
(o
gene
afetado
na
síndrome
de
Bloom),

(c)
RECQL3,
(o
gene
afetado
na
síndrome
de
Werner),
e
(d)
RECQL5.
Os
genes
RECQL
e
RECQL5
não
foram

associados
a
nenhuma
desordem
genética
humana.



 Vários
estudos
com
células
de
pacientes
RTS
têm
sido
feitos;
entretanto
os
resultados
na
sua
maioria

revelam‐se
inconsistentes.
Experimentos
com
exposição
de
células
RTS
à
irradiação
UV‐C

e
à
radiação
gama


indicaram
reduzida
capacidade
no
reparo
de
DNA.
Por
outro
lado,
células
de
RTS
mostraram
sensibilidade

 VII
 76

normal
à
mitomicina
C,
bleomicina,
vincristina,
metotrexato,
cisplatina
e
adriamicina.
Em
trabalhos
recentes

foi
mostrado
que
as
células
RTS
são
sensíveis
a
Mostarda
nitrogenada
(HN2).
Entretanto,
ainda
é
discutível
o

mecanismo
de
reparação
que
deve
estar
atuando
neste
caso.




Esclerose
Lateral
Amiotrófica


 Esta
doença
caracteriza‐se
por
uma
progressiva
degeneração
neuro‐motora.
A
forma
hereditária

transmite‐se
de
forma
autossômica
dominante
e
alguns
desses
grupos
afetados
são
portadores
de
mutações

truncando
no
gene
Cu/Zn
SOD.
O
acúmulo
de
radicais
superóxido
decorrente
da
ausência
de
atividade
SOD

danificaria
particularmente
as
células
nervosas
das
vias
motoras.
Famílias
portadoras
de
mutações
em
outros

genes
que
não
SOD
também
foram
encontradas;
todavia,
a
atividade
enzimática
SOD
estava
afetada.
Desse

modo,
pode‐se
correlacionar
o
metabolismo
deficiente
de
EAO
com
esta
patologia.



Câncer
de
Mama
(BRCA)


 Algumas
famílias
tendem
a
ter
indivíduos
com
propensão
hereditária
a
câncer
de
mama.
Os
dois
genes

mutados
nessas
famílias,
BRCA1
e
BRCA2,
foram
clonados
recentemente
e
seus
produtos
gênicos

caracterizados
como
proteínas
envolvidas
com
reparo
de
DNA.


 Na
tabela
VII.4
estão
listadas
as
principais
doenças
associadas
a
defeitos
de
reparação.



TABELA
VII.4
–
Doenças
associadas
a
defeitos
de
reparação
do
dna


Mecanismo
de
reparo

 Genes

 Síndrome

 Tipo
de
câncer



Correção
 de
 erros
 de
 emparelhamento
 MSH1,
 MSH2,
 HNPCC

 Câncer
de
cólon



(MMR)

 MLH1,
 MSH6,

PMS2,
PMS1?


Reparo
por
excisão
de
Nucleotídeos
(NER)

 XPA
–
XPG

 Xeroderma
 pigmentosum
 Câncer
de
pele


(XP)


Síntese
translesão

 XPV

 XP
variante

 Câncer
de
pele


Reparo
de
quebras
duplas

 NBS1

 Nijmegen

 Linfoma



 MRE11

 Desordem
AT

 Linfoma/Leucemia



 
WRN

 Werner

 Vários



 BLM/RECQL3

 Bloom

 Leucemia/Carcinomas



 BRCA1,
BRCA3

 Câncer
de
Mama

 Mama/Ovário


Reparo
de
ligações
cruzadas

 FANCA
–
FANCG

 Fanconi

 Leucemia


Sinalização
 de
 lesões
 e
 Checagem
 do
 ciclo
 
ATM

 Ataxia
telangiectasia
(AT)

 Linfoma/leucemia


celular



 TP53

 Li‐Fraumeni

 Vários



 RB1

 Retinoblastoma

 Retinoblastoma