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Los fenoles totales se determinarn de acuerdo a la metodologa descrita por Brat et al. (2005), con el
reactivo de Folin-Ciocalteu y usando cido glico como estndar.
Preparacin de la curva de calibracin
Se utilizar una solucin estndar de cido glico (0.1 mg/mL) de la cual se tomarn volmenes de 0 L a
640 L y se completar el volumen de cada uno a 1000 L con agua destilada. Los volmenes y
concentraciones se describen en la siguiente tabla.
Volumen a tomar de la
Volumen de agua
Concentracin de cido
destilada (L)
1000
840
680
600
440
360
glico (g/mL)
0
160
320
400
560
640
Los flavonoides totales se determinarn de acuerdo a la metodologa descrita por Lee et al. (2003), usando
catequina como estndar.
Preparacin de la curva de calibracin
Se pesar 10 mg de catequina y se transferirn a un matraz volumtrico de 10 mL y se aforar con agua
destilada. De la solucin madre se tomarn volmenes de 0 L a 640 L y se completar el volumen de
cada uno a 1000 L con metanol. Los volmenes y concentraciones se describen en la siguiente tabla.
Volumen a tomar de la
Volumen de MeOH
Concentracin de
(L)
1000
840
680
600
440
360
catequina (g/mL)
0
160
320
400
560
640
Volumen de MeOH
Concentracin de
(L)
1000
840
680
600
440
360
naringenina (g/mL)
0
160
320
400
560
640
Procedimiento
1. Alcuotas de 100 L de muestra se aaden a un microtubo de 2 mL, despus se aaden 1000 L de la
solucin 0.1 mM de DPPH en etanol.
2. Se utiliza como control una mezcla que cosiste en 100 L de agua destilada y 1000 L de la solucin
0.1 mM de DPPH en etanol.
3. La muestra y el control se agitan en vortex y se dejan reaccionar por 30 min.
4. La absorbancia de la muestra y el control se determina a una longitud de onda de 517 nm.
5. El porcentaje de captacin de radicales se calcula empleando la siguiente formula:
(AC - AM/AC) x 100
Donde AC es la absorbancia del control y AM es la absorbancia de la muestra.
Referencia
Shimada, K., Fujikawa, K., Yahara, K., Nakamura, T. (1992). Antioxidative properties of xanthan on the
autioxidation of soybean oil in cyclodextrin emulsion. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 40:
945-948.
Procedimiento
1. A 250 L de muestra o estndar aadir 250 L de buffer fosfato (0.2M, pH 6.6) y 250 L de
ferrocianuro de potasio (1%). Mezclar vigorosamente e incubar a 50 C durante 20 min.
2. Concluida la incubacin, adicionar 250 L de cido tricloroactico (10%) y centrifugar a 3000 rpm por
10 min. Tomar 500 L de sobrenadante y agregar 400 L de agua destilada y 100 L de cloruro frrico
(0.1%). Mezclar vigorosamente e incubar a 50 C por 10 min. Finalmente se deja reposar por 10 min y
se determina la absorbancia a una longitud de onda de 700 nm.
3. Se calcula el porcentaje de poder reductor de la forma siguiente: PR = (AM-AB/AM) (100) Dnde:
AM = absorbancia en presencia de muestra o control y AB = absorbancia del blanco.
4. Obteniendo los porcentajes de poder reductor a diferentes concentraciones de una misma muestra es
posible relacionar ambas variables y obtener una ecuacin para determinar el IC50, que se define como
la concentracin de muestra necesaria para reducir el 50% del Fe oxidado presente en la solucin.
Referencia
Oyaizu, M. (1996). Studies on products of browning reactions: antioxidative activities of products of
browning reaction prepared from glucosamine. Japanesse Journal of Nutrition, 44: 307-315.
Procedimiento
Blanco: mezclar 250 L de solucin reguladora de pH de acetato de sodio + 250 L de solucin patrn de
Cu (II) + 25 L de violeta de pirocatecol 0.1% + 250 L de agua destilada. Dejar reaccionar 10 min a
temperatura ambiente y leer la absorbancia a 632 nm. El complejo formado es estable por 30 min.
Muestra: mezclar 250 L de tampn de acetato de sodio + 250 L de solucin patrn de Cu (II) + 25 L
de pirocatecol 0.1%, dejar reaccionar 5 min a temperatura ambiente y luego aadir 250 L de muestra.
Referencia
Dinis, T.C.P., Madeira, V.M.C., Almeida, L.M. (1994). Action of phenolic derivatives (acetaminophen,
salicylate, and 5-amino salicylate) as inhibitors of membrane lipid peroxidation and as peroxyl radical
scavengers. Arch Biochem Biophys, 315: 161-169.