Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGA
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA DE MICROORGANISMO
SIXTO DAVID ROJO
Por:
Br. Eduardo A. Chalbaud Mogolln
ii
iii
iv
AGRADECIMIENTOS
DEDICATORIA
A m querida Mam:
Quien siempre ha luchado por darme lo mejor, y ha sido un ejemplo de rectitud, constancia,
respeto, educacin y superacin personal, adems por todo su cario con el que me ha formado. Y
porque siempre ha sido partcipe de mi desarrollo personal.
A mi hermano:
Con quien he compartido gran parte de mi vida, a quien agradezco su gran paciencia, cario y
ejemplo de constancia, y por estar presente en los momentos ms difciles.
Gracias a su apoyo y confianza que fueron parte fundamental para la realizacin de esta meta en mi
vida.
vi
NDICE
AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................................................. III
DEDICATORIA....................................................................................................................................................... VI
NDICE................................................................................................................................................................... VII
NDICE DE TABLAS ............................................................................................................................................ VIII
NDICE DE FIGURAS ............................................................................................................................................ IX
NDICE DE ANEXOS .............................................................................................................................................. X
RESUMEN ................................................................................................................................................................ 1
ABSTRACT .............................................................................................................................................................. 1
INTRODUCCIN ...................................................................................................................................................... 2
CAPITULO I ............................................................................................................................................................. 3
MARCO TEORICO ................................................................................................................................................... 3
I HONGOS............................................................................................................................................................... 3
I.1. TAXONOMA DE LOS HONGOS. ............................................................................................................................ 3
I.1.1 APLICACIN DE LA BIOLOGA MOLECULAR A LA TAXONOMA DE LOS HONGOS. ..................................................... 4
I.2 EL FILUM BASIDIOMYCOTA.................................................................................................................................. 7
I.2.1 Gnero Pleurotus ..................................................................................................................................... 8
CAPITULO II ..........................................................................................................................................................21
ANTECEDENTES ..................................................................................................................................................21
II.1 LOS HONGOS ..................................................................................................................................................21
II.1.1 LOS HONGOS COMESTIBLES .........................................................................................................................21
II.1.2 HISTORIA DEL CULTIVO DE LOS HONGOS COMESTIBLES..................................................................................22
II.1.3. TAXONOMA DEL GNERO PLEUROTUS .........................................................................................................22
II.1.3.1 EL CONTROL GENTICO Y MORFOLGICO DEL PROCESO DE FRUCTIFICACIN................................................25
II.1.3.2 ALGUNAS ESPECIES DEL GNERO PLEUROTUS EN LATINOAMRICA. .............................................................26
CAPITULO III .........................................................................................................................................................29
JUSTIFICACIN. ...................................................................................................................................................29
HIPOTESIS. ...........................................................................................................................................................29
OBJETIVO GENERAL ...........................................................................................................................................29
OBJETIVOS ESPECIFICOS..................................................................................................................................29
CAPITULO IV .........................................................................................................................................................30
MATERIALES Y METODOS..................................................................................................................................30
MATERIALES ........................................................................................................................................................30
MICROORGANISMOS..............................................................................................................................................30
MEDIOS DE CULTIVO..............................................................................................................................................30
METODOLOGAS ..................................................................................................................................................31
IV. DIAGRAMA GENERAL DE INVESTIGACIN............................................................................................................31
IV.1 DETERMINACIN DE LAS CARACTERSTICAS MORFO-ANATMICAS DE LAS CEPAS P3215, P132, POST, PCIT Y
PRAL PRESENTES EN EL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA DE MICROORGANISMOS...............................................31
IV.1.1 Cultivo de las cepas P3215, P132 y Post por fermentacin de estado slidos (FES) ........................32
IV.1.2 Caracterizacin macroscpicas y microscpicas de los pleurocarpos de las cepas P3215, P132 y
Post. ................................................................................................................................................................33
IV.2 IDENTIFICACIN TAXONMICA DE LAS CEPAS P3215, P132 Y POST BASADA EN LAS CARACTERSTICAS MORFOANATMICAS.........................................................................................................................................................34
vii
IV.3 CARACTERSTICAS DE LAS CEPAS P3215, P132, POST, PCIT, PRAL Y POST CRECIDAS EN MEDIOS
CONVENCIONALES Y NO CONVENCIONALES. ............................................................................................................34
IV.3.1 Caractersticas de las colonias fngicas en medios convencionales. .................................................34
IV.3.2 Determinacin del efecto de los medios de cultivo convencionales y la temperatura en el crecimiento
y produccin de biomasa de las cepas del gnero Pleurotus ........................................................................35
IV.4 IDENTIFICACIN MOLECULAR DE LAS CEPAS P3215, P132 Y POST. ..................................................................36
IV.4.1 Evaluacin de los mtodos de extraccin de los cidos nucleicos de las cepas P3215, P132 y Post.
........................................................................................................................................................................36
IV.4.2 Secuenciacin del ADN. ......................................................................................................................38
IV.4.3 Anlisis de secuencia de la regin ITS1, 5.8S ADNr e ITS2 ...............................................................39
CAPITULO V ..........................................................................................................................................................41
RESULTADOS Y DISCUSIN ..............................................................................................................................41
V.1.1 CARACTERSTICAS MORFO-ANATMICAS DE LAS CEPAS P3215, P132 Y POST PERTENECIENTES AL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA DE MICROORGANISMOS. ...................................................................................41
V.1.2 Caractersticas microscpicas de las cepas P3215, P132, Pcit, Post y PRAL. ...................................44
V.2 IDENTIFICACIN TAXONMICA DE LAS CEPAS LAS CEPAS P3215, P132 Y POST BASADA EN LAS CARACTERSTICAS
MORFOANATOMICAS. .............................................................................................................................................45
V.3 CARACTERSTICAS DE LAS CEPAS LAS CEPAS P3215, P132, POST Y PRAL CRECIDAS EN MEDIOS
CONVENCIONALES Y NO CONVENCIONALES. ............................................................................................................46
V.3.1 Caractersticas de las colonias fngicas en medios convencionales. ..................................................46
V.3.2 Efecto de la temperatura y el medio de cultivo en el crecimiento y la produccin de biomasa de las
cepas P132, P3215 y P.ost. ...........................................................................................................................46
V.3.3 Tasa de crecimiento de las cepas Post y P3215 en medios no convencionales .................................49
V. 3.3. Caractersticas morfolgicas de las cepas P3215 y Post en medios no convencionales. .................51
V.4 IDENTIFICACIN POR TCNICAS MOLECULARES DE LAS CEPAS P3215, P132, POST. ..........................................52
V.4.1 Extraccin del ADN ...............................................................................................................................52
V.4.1.1 La PCR de la regin ITS 1 a ITS 2 ....................................................................................................52
V.4.2 Anlisis de la secuencia de la regin ITS 1, gen 5.8 S ANDr y la regin ITS2 dentro de las cepas del
gnero Pleurotus ............................................................................................................................................54
CAPITULO VI .........................................................................................................................................................65
CONCLUSINES ...................................................................................................................................................65
RECOMENDACIONES ..........................................................................................................................................66
BIBLIOGRAFA ......................................................................................................................................................67
ANEXOS.................................................................................................................................................................75
GLOSARIO.............................................................................................................................................................80
SIGLAS Y ABREVIATURAS .................................................................................................................................81
NDICE DE TABLAS
TABLA I PRODUCCIN MUNDIAL DE HONGOS COMESTIBLES CULTIVA DOS EN 1986 HASTA EL 2010
PESO FRESCO. TOMADO DE MILES Y CHANG, 2004 MODIFICADO.RODRIGUEZ, 2007. ....................11
TABLA II COMPOSICIN PROXIMAL DE PROTENAS, VITAMINAS Y MINERALES DE ALGUNAS ESPECIES
DE HONGOS COMESTIBLES, LOS VALORES SE EXPRESAN COMO MG/100G DE PESO SECO.
TOMADO DE CHANG Y MILES, 2004; MILES Y CHANG, 1997. .................................................................12
TABLA III ESPECIES BIOLGICAS ESTABLECIDAS DENTRO DEL GNERO PLEUROTUS, SUS
SINNIMOS CORRESPONDIENTES Y/O TAXA DE NIVEL DE SUBESPECIES, Y GRUPOS
RESPECTIVOS DE NTERCOMPATIBILIDAD; Y SU DISTRIBUCIN MUNDIAL. TOMADO: VILGALYS
ET AL., 1996) Y KONG,. 2005. ......................................................................................................................24
TABLA IV MEZCLA DE REACCIN PARA EL SECUENCIA MIENTO DE LOS PRODUCTOS DE PCR.IVIC,
2014. ...............................................................................................................................................................39
TABLA V CARACTERISTICAS DE LA CEPA P132. .............................................................................................42
TABLA VI CARACTERISTICAS DE LA CEPA P3215. ..........................................................................................43
viii
NDICE DE FIGURAS
FIGURA I FILOGENIA Y CLASIFICACIN DEL REINO FUNG. SUB REINO DIKARYA Y HONGOS BASALES.
TOMADO DE HIBBETT ET AL., 2007. ............................................................................................................ 4
FIGURA II ESQUEMA DE LA ESTRUCTURA DE LOS GENES DEL ARN RIBOSOMAL. REGIONES NO
CODIFICANTES; IGS (ESPACIADORES INTERGNICOS), ITS (ESPACIADORES DE TRANSCRIPCIN
INTERNOS); REGIONES CODIFICANTES; 5.8S Y 5S [SSU (SUBUNIDAD PEQUEA)], Y LSU
(SUBUNIDAD GRANDE). TOMADO DE WHITE ET AL., 1990. ...................................................................... 5
FIGURA III REPRESENTACIN ESQUEMTICA DE LAS REGIONES ITS. TOMADO DE CIARDO ET AL.,
2010. ................................................................................................................................................................. 5
FIGURA IV ESQUEMA DE LA ESTRUCTURA DEL GEN DE LA -TUBULINA DE SCHIZOPHYLLUM
COMMUNE. REGIONES CODIFICANTES; (EXONES) SE INDICAN CON NMEROS. REGIONES NO
CODIFICANTES; (INTRONES) SON EN BARRAS NEGRAS. TOMADO DE RUSSO ET AL., 1992. ............ 6
FIGURA V ESQUEMA DE LA ESTRUCTURA DEL GEN DEL FACTOR 1 DE ELONGACIN DE LA
TRADUCCIN (TEF1) DE SCHIZOPHYLLUM COMUNA. LOS INTRONES SE INDICAN EN LAS BARRAS
NEGRAS. LOS EXONES ESTN INDICADOS CON LOS NMEROS. TOMADO DE WENDLAND Y
KOTHE, 1997. .................................................................................................................................................. 6
FIGURA VI ESQUEMA DE LA ESTRUCTURA DEL GEN RPB2. A) LOS INTRONES SE INDICAN EN LNEAS
GRUESAS NEGRAS Y EXONES ESTN CONTADOS. TOMADO DE MATHENY ET AL., 2006. B)
REPRESENTACIN DE LOS DOMINIOS CONSERVADOS DE LA PROTENA RPB2. LOS SEGMENTOS
NEGROS REPRESENTAN 12 MOTIVOS CONSERVADOS DE AMINOCIDOS (DOMINIOS
CONSERVADOS) ENTRE LOS EUCARIOTAS. TOMADO DE LIU ET AL., 1999.......................................... 7
FIGURA VII FILOGENIA Y CLASIFICACIN DEL FILUM BASIDIOMYCOTA. ...................................................... 7
FIGURA VIII CICLO DE VIDA DE LOS BASIDIOMYCOTA. TOMADO Y MODIFICADO DE JACKSON, 2010. .... 8
FIGURA IX LA SETA OSTRA P. OSTREATUS (JACQUIN: FRIES). TOMADO DE KUMMER, 1871. ................... 9
ix
FIGURA X CICLO DE VIDA DEL GNERO PLEUROTUS TOMADO DE: VALENCIA-DEL TORO, 2002............. 9
FIGURA XI CARACTERSTICAS ANATMICAS DEL GNERO PLEUROTUS. TOMADO DE LPEZ Y
GARCA, 2004. ...............................................................................................................................................13
FIGURA XII CRECIMIENTO DEL P. OSTREATUS ECS-0110 EN MEDIO LQUIDO. SE OBSERVAN LAS
DIFERENTES FASES DE DESARROLLO: L: LATENCIA; E: EXPONENCIAL; D: DECLINACIN; S:
ESTACIONARIA. CONDICIONES DE CULTIVO: CALDO DE GLUCOSA-EXTRACTO DE LEVADURA,
-1
AGITACIN 200 RPM, AIREACIN 1 VVM Y TEMPERATURA 26C. TASA DE CRECIMIENTO 0,036 H .
TOMADO DE MARQUEZ-ROCHA ET AL., 1999. .........................................................................................18
FIGURA XIII CULTIVO POR FERMENTACIN EN ESTADO SOLIDO (FES) DE HONGOS COMESTIBLES.
TOMADO DE STAMETS, 2000. .....................................................................................................................33
FIGURA XIV CARACTERIZACIN MACROSCPICA DE LA COLONIAL MICELIAL DE LOS HONGOS.
TOMADO DE PICCOLI ET AL., 2010). ..........................................................................................................34
FIGURA XIV CRECIMIENTO MICELIAL DE LAS CEPAS POST Y P3215 AL 6TO DA CULTIVADAS EN
MEDIOS NO CONVENCIONALES COMO SEMILLA DE SORGO (SORGHUM SP.), TUZA DE MAZ (ZEA
MAYS), ARROZ (ORYZA SATIVA) Y SEMILLA DE PARCHITA (PASSIFLORA EDULIS) INCUBADAS A
25C. ...............................................................................................................................................................50
FIGURA XV ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA AL 0,8% DE 1G DEL ADN GENMICO EXTRADO
DE LAS CEPAS DEL GNERO PLEUROTUS P3215, P132, POST, PCIT Y PRAL UTILIZANDO EL
MTODO DE LEE (1990) (A) Y EL MTODO DE SAGHAI-MAROOF, ET. AL.(1984) (B). ..........................53
FIGURA XVI ANLISIS ELECTROFORTICO DE LOS PRODUCTOS DE PCR DE LA REGIN ITS1, 5.8S Y
ITS2 AMPLIFICADOS CON LOS PRIMERS ITS1 Y ITS4 A PARTIR DEL ADN GENMICOS DE LAS
CEPAS DEL GNERO PLEUROTUS COMO P3215, P132, POST, PRAL Y PCIT EXTRADOS POR EL
MTODO DE LEE ( 1990) DILUIDA A UN FD DE 1000 (A) Y EL MTODO DE SAGHAI-MAROOF, ET. AL.
(1984) A UN FD DE 100(B). (EPM) ESCALERA DE PESO MOLECULAR 1 KB PLUS DNA LADDER (+)
CONTROL POSITIVO Y (-) AL CONTROL NEGATIVO. ...............................................................................54
FIGURA XVII PATRONES RFLP DE LOS FRAGMENTO ITS1-5.8S-ITS2 ADNR DE LAS SECUENCIAS
EF514248 PLEUROTUS OSTREATUS, EF514244 P. CYSTIDIOS, AB115043 P. CITRINOPILIATUS,
EF514250 P. TUBERREGIUM, EF514243 P. PULMONARIUS, P132, P3215A, P3215B Y POSTA,
DIGERIDOS CON LA ENZIMA HAEIII A TRAVS DE LA HERRAMIENTA NEBCUTTER V2.0 (VINCZE ET
AL., 2003). MARCADOR DE PESO MOLECULAR 100PB. ..........................................................................56
FIGURA XVIII CLADOS DE LOS ARBOLES FILOGENTICOS DE LAS REGIONES ITS1 Y 5.8S (A) E ITS2 (B)
CONSTRUIDOS POR EL MTODO NJ-K2P- 1000 BOOTSTRAP. ..............................................................61
FIGURA XIX MOTIVOS CONSERVADOS 5.8S Y 28S EN LA REGIN ITS2 DEL GNERO PLEUROTUS ......63
FIGURA XXI ESTRUCTURA SECUNDARIA DE LA SECUENCIA ITS2 DE LA CEPA P3215 (PLEUROTUS
OSTREATUS VAR. FLORIDA). .....................................................................................................................64
NDICE DE ANEXOS
RESUMEN
Algunas especies del gnero Pleurotus han sido una alternativa alimentara en muchos pases, por
sus propiedades nutricionales y medicinales. En Venezuela, el cultivo de este tipo de setas es
mnimo, as como la investigacin y las fuentes de informacin para llevar a cabo este tipo de cultivos.
En la presente investigacin se realiz la caracterizacin morfolgicas e identificacin molecular
utilizando la regin ITS1 e ITS2, de las cepas Post, P132, P3215, PRAL y Pcit que se sospechaba
pertenecan al gnero Pleurotus, tambin se evaluaron algunas caractersticas fisiolgicas siguiendo
su crecimiento en medios de cultivo a diferentes temperaturas. Se determin que las cepas P132 y
Post pertenecen a la especie P. ostreatus y la cepa P3215 a especie P. ostreatus var. florida, y que
existen diferencias significativas entre el comportamiento fisiolgico de estas cepas.
Palabras clave: cultivo de hongos comestibles, Hongo Orellana, Pleurotus, seguridad alimentara,
setas.
ABSTRACT
Some species genus Pleurotus have been a food alternative in many countries, for its nutritional and
medicinal properties. In Venezuela, the cultivation of this kind of mushroom is minimal, as well as
research and information sources to carry out this type of crop. In the present investigation was
performed the morphological characterization and molecular identification using the ITS1 and ITS2,
strains Post, P132, P3215, PRAL and PciT suspected of belonging to the genus Pleurotus, some
physiological characteristics were also evaluated according to their growth in culture media at different
temperatures. it was determined that the P132 and Post strains belong to the species P. ostreatus and
strain P3215 to P. ostreatus var. florida, and that there are significant differences between the
physiological behavior of these strains.
Keywords: cultivation of edible mushrooms, mushroom "Orellana", Pleurotus, food security,
mushrooms.
INTRODUCCIN
En Venezuela, el cultivo del gnero Pleurotus de forma industrial tiene registro desde el ao
1976 hasta 1998 con una produccin estimada en peso fresco de 18 ton/ ao (Snchez y Royse,
2001); cosecha destinada a niveles socioeconmicos altos como un alimento gourmet, que debido a
su baja oferta, sus precios elevados, pocas personas con las herramientas y la formacin bsica para
su cultivo y el hecho de implementar aislados de cepas comerciales importadas de regiones
templadas, se ha dejando de producir; lo que hace necesario aumentar los esfuerzos cientficos y
tecnolgicos por recuperar aislados o cepas silvestres de estos hongos comestibles con potencial de
cultivo y desarrollar su comercializacin.
CAPITULO I
MARCO TEORICO
I Hongos.
La denominacin proviene del latn 'fungus': seta; griego: 'sphongos': esponja. Definido en el
sentido Botnico como cualquier vegetal hetertrofo que carecen de flagelos y clorofila, que parasitan
o viven sobre materia orgnica en descomposicin y producen esporas (Alexopoulos et al., 1996).
Los hongos son el segundo grupo eucarionte ms numerosos despus de los insectos, conforman
una parte intrnseca y transcendental para la existencia y restauracin de los ecosistemas forestales;
estn presentes en la naturaleza con una gran diversidad de especies descomponedores que
mantienen los ciclados trficos del carbono, nitrgeno y azufre, y el transporte de los nutrientes
indispensables para la existencia de los biosistemas (Palm y Chapela, 1997). Son microorganismo
que estn presentes en los ecosistemas como saprfitos, parsitos facultativos y obligados, y en
asociacin simbiticas conformando a los lquenes o las micorrizas (Guzmn, 1998). Se caracterizan
principalmente por la produccin de esporas, crecen formando filamentos septados ramificados
llamados hifas que conforman el micelio, poseen crecimiento apical en redes filamentosas de masas
algodonosas y radiales; que le permite mejor aprovechamiento de nutrimentos del medio ambiente
(Kato y Ferreira, 2003); tienen capacidad de almacenamiento de polisacridos (trehalosa y
glucgeno), con nutricin heterotrfica por absorcin debido a su pared celular (quitina) que no le
permite fagocitar, teniendo que absorber nutrientes simples y solubles mediante la degradacin va
extracelular de materia orgnica compleja principalmente celulosa, hemicelulosa y lignina, esto por la
accin de un complejo sistema de enzimas hidrolticas que liberan al ambiente (Moore-Landecker,
1996), tienen reproduccin sexual y/o asexual (Malloch et al., 1980; Guzmn et al., 1993).
Estos microorganismos anteriormente incluidos dentro del reino vegetal, considerados como
plantas sin clorofila, constituyen un grupo muy variable y polimrfico clasificado con base en sus
caractersticas macroscpicas (Alexopoulos et al., 1996), luego segn estudios basados en la
caractersticas morfolgica macro y microscpicas segn Herrera, Ulloa, y Oronoz en (1998) fueron
ubicados dentro de un reino diferente al de las plantas, animales o protistas, denominado Reino Fung
o Myceteae, clasificado en dos divisiones naturales la divisin Myxomycota o hongos gelatinosos y
divisin Eumycota hongos verdaderos o superiores; comprendido por los grupos Phycomycota,
Ascomycota, Basidiomycota y Deuteromycota y una divisin artificial los lquenes, que incluye
organismos mixtos constituidos por algas y hongos asociados simbiticamente (Maldonado, 2007).
Durante mucho tiempo la taxonoma de los hongos estuvo basada en: estudios morfolgicos
de los rasgos macroscpicos, caractersticas ecolgicas, organolpticas (olor, sabor, consistencia y
aspecto) (Murakami y Takemaru. 1990). Rasgos microscpicos (las esporas, los elementos estriles
de las esporas, la conformacin del tejido por las hifas en el carpforo y de la estructura de la hifa),
propiedades bioqumicos y estructurales para as lograr la identificacin de las especies de este clado
(Buchanan, 1993). Pero ante la plasticidad fenotpica asociada a las condiciones ambientales de
crecimiento, se agregaron otros caracteres que permitieron identificar y clasificar de acuerdo a su
intercompatibilidad (Boidin, 1986), la tcnica consiste en el cruce de micelios monocariotico (haploide,
n) derivados a partir de una espora de una especie conocida, con micelios provenientes de una
espora de otra lnea pudindose obtener micelios dicaritico (n+n) en el caso de existir compatibilidad
(Petersen, 1992), permitiendo agrupar las distintas especies en grupos de incompatibilidad. Las
tcnicas antes mencionadas tienen desventajas con respecto al anlisis morfolgico influenciado por
el medio ambiente y condiciones experimentales in vitro; que afecta la interpretacin de los resultados
y no permite separar las homologas de las analogas.Sin embargo, no aclara la visin del Reino
Fung como un clado polifiletico; Este problema se resolvi con estudios masivos de biologa
molecular basados en el anlisis del genoma de todas las especies reportadas como miembros de
este grupo; que debido a su composicin gentica y su estructura se establecieron los diferentes
niveles taxonmicos segn su filogenias (Kauserud y Schumacher, 2003).
Figura I Filogenia y clasificacin del Reino Fung. Sub Reino Dikarya y Hongos basales. Tomado de Hibbett et
al., 2007.
Figura II Esquema de la estructura de los genes del ARN ribosomal. Regiones no codificantes; IGS
(espaciadores intergnicos), ITS (espaciadores de transcripcin internos); Regiones codificantes; 5.8S y 5S
[SSU (subunidad pequea)], y LSU (subunidad grande). Tomado de White et al., 1990.
Figura III Representacin esquemtica de las regiones ITS. Tomado de Ciardo et al., 2010.
B. Gen de la tubulina.
Es el gen que est presente en todos los organismos y codifica la -tubulina. En el caso de los
hongos el polimorfismo de este gen sirve para identificar y diferenciar especies cripticas (sin
diferencias morfolgicas y fisiolgicas y diferencias de incompatibilidad reproductiva) (Russo et al.,
1992; Kim et al., 1997; Matsuo et al., 1999; Kim et al., 2001). La figura IV muestra la estructura del
gen de la -tubulina.
Figura V Esquema de la estructura del gen del factor 1 de elongacin de la traduccin (TEF1) de Schizophyllum
comuna. Los intrones se indican en las barras negras. Los exones estn indicados con los nmeros. Tomado
de Wendland y Kothe, 1997.
Figura VI Esquema de la estructura del gen RPB2. a) Los intrones se indican en lneas gruesas negras y
exones estn contados. Tomado de Matheny et al., 2006. b) Representacin de los dominios conservados de la
protena RPB2. Los segmentos negros representan 12 motivos conservados de aminocidos (dominios
conservados) entre los eucariotas. Tomado de Liu et al., 1999.
Los hongos del filum Basidiomycota se reproducen de forma sexual y asexual como se
muestra en la figura VIII, el ciclo de vida inicia con la germinacin de 2 esporas conformando las
lneas de hifas monocarioticas (n) (micelio primario), que permite la sobrevivencia y mayor invasin
de estos hongos hasta que estas 2 lneas celulares converjan y se produzca la fase de reproduccin
sexual. Esta fase sexual ocurre en 3 procesos: El primero es la plasmogamia, en el que despus del
contacto las 2 hifas monocarioticas compatibles se fusionan originando hifas dicaritica (n+n) (micelio
secundario), Este micelio crece e invade el sustrato hasta que condiciones apropiadas, disparan los
procesos de formacin del cuerpo fructfero en el cual ocurre la cariogamia , fenmeno en el que se
fusiona los ncleos haploides formando el zigoto, y por ltimo la meiosis proceso en que se da la
formacin de las esporas que luego se dispersaran y germinaran desarrollando nuevamente el
micelio primario. (Miles y Chang, 2004). Dentro de este clado destacan los gneros Agaricus
(Champin), Lentinula (Shiitake), Pleurotus (Hongo ostra), Amanita, entre otros que conforman la
mayor parte de los hongos comestibles.
Figura VIII Ciclo de vida de los Basidiomycota. Tomado y modificado de Jackson, 2010.
El gnero Pleurotus fue descrito inicialmente por Kummer en 1871, comprende la familia
Pleurotaceae del orden Agaricales, definindolo como setas con un carpforo de estpite excntrico,
lateral o ausente; sin tejidos gelatinosos, lamelas decurrentes y conjuntas, que presentan esporas no
amiloideas de color blanco o lila plido, con una forma elptico-cilndrica, de un tamao de 4m de
longitud o ms; son hongos saprfitos en madera ssiles (Kummer, 1871). La Figura IX muestra la
representacin de estas setas establecidas en el ao 1871.
El ciclo de vida del gnero Pleurotus se muestra en la figura X est basado en un sistema de
incompatibilidad de especies heterotlicas bifactoriales; en que la cariogamia no es inmediata a la
plasmogamia y genera una fase dicaritica o dicariofase (clula dicaritico, binucleada) con diferentes
factores de incompatibilidad conocidos como dicarin, el cual sigue creciendo de forma vegetativa
(Herrera et al., 1998). Despus ocurre la reproduccin sexual, el micelio en estado vegetativo forma
clulas especializadas, los basidios en los que se llevar a cabo la cariogamia comenzando la fase
diploide, que inmediatamente inicia el proceso de meiosis (Valencia del Toro, 2002).
Figura X Ciclo de vida del gnero Pleurotus Tomado de: Valencia-del Toro, 2002.
Dentro del gnero Pleurotus se incluye las setas con una gran diversidad de especies
distribuidas por todo el mundo; entre ellas: P. pulmonarius y P. cystidiosus localizadas en regiones
tropicales y subtropicales, P. eryngiien Europa, frica y parte de Asa, P. djamor, P. smithi, P. levis, P.
sajor-cajou, P. citrinopileatus y P. ostreatus en Latinoamrica (Kong, 2005).
El gnero Pleurotus resulta de suma importancia por sus aplicaciones en mltiples reas: En
la agricultura por su capacidad de degradar una gran diversidad de substratos en un amplio rango de
temperaturas (0C a 30C; Ardon,2007); permitiendo el aprovechamiento de diversos desechos
agroindustriales (Morillo et al., 2012), como un depsito de nutrientes vitales (vitaminas y minerales)
para potenciar las cosechas agrcolas, estos nutrientes quedan como subproducto de los cultivos de
estos hongos en lo que se conoce como compost agotado; para ser utilizado como fertilizantes
(Chang et al., 1981; Fasidi et al., 2008). En la biorremediacin: por la habilidad de estos hongos de
acumular metales pesados, degradacin de petrleo debido a su alta actividad enzimtica y variedad
de catalasas (Perna et al., 2012). En la medicina, la especie P. ostreatus son un agente
quimioteraputico por la acumulacin de pequeas concentraciones de cesio (agente activo en las
quimioterapias), presencia de sustancias antitumorales en el carpforo (Ajith y Janardhanan, 2007);
alto contenido de sustancias biolgicamente activas de alto valor nutricional y propiedades curativas,
de las que destacan antioxidantes (cido ascrbico, compuestos de -tocoferol, -caroteno y fenoles),
que actan de forma similar a la vitamina E (Murcia et al., 2002); sustancias reductoras (cistena,
metionina y lovastatina) que tienen el efecto de disminuir los niveles de colesterol en sangre y la
presin arterial. Son muy utilizados como alimento humano debido a su bajo contenido de grasa y
sodio, alto contenido de potasio y de protena; los hacen un alimento que controla padecimientos
cardiovasculares y estados de hipertensin y combate la obesidad (Kumari y Achal, 2008).As mismo
tienen potencial como alimento para animales en poca de apareamiento como estimulante sexual y
para prevenir enfermedades que se presentan en esta etapa de reproduccin (Potter y Hotchkiss,
1995).
10
Tabla I Produccin mundial de hongos comestibles cultiva dos en 1986 hasta el 2010 Peso fresco. Tomado de Miles y Chang, 2004
modificado.Rodriguez, 2007.
1970
1974
1984
1981
1986
1990
1994
1997
2002
2010
Nombre
ton
ton
ton
ton
ton
Agaricus bisporus
185
62
260
55
410
57
900
72
1220
56
Lentinula edodes
94
31
148
31
191
27
180
14
320
15
400
11,3
830
17,5
Pleurotus
22
40
2,8
170
7,8
900
25,4
800
16,2
900
16,1
930
14,6 1190
14,6
Auricularia sp.
10
0,8
120
5,5
400
11,3
420
8,6
500
8,9
600
9,47
840
10,3
Volvariella volvacea
200
4,3
180
8,2
210
5,8
300
6,1
200
3,3
350
5,59
450
5,57
Flammulina velutipes
11
42
63
100
4,8
100
4,6
140
230
4,7
300
5,2
290
4,53
360
4,46
Tremella fuciformis
40
1,8
40
1,1
160
3,2
230
3,69
290
3,52
Hypsizygus
marmoreus
60
1,1
110
1,78
130
1,62
Pholiota nameko
12
20
20
1,35
30
1,1
20
0,6
30
0,6
60
60
1,01
80
0,92
Tricholoma
matsutake
272
Grifola frondoSa
10
0,3
40
0,58
40
0,52
Otros
10
0,5
10
0,3
24
4,9
330
5,13
410
4,97
4834
100
5832
100
6340
100
8160
100
Total
Incremento (%)
36
34
513
ton
120
100
100
51
73
62,9
11
ton
38,5
ton
10,8
ton
16,5
ton
%
36
28,7
Tabla II Composicin proximal de protenas, vitaminas y minerales de algunas especies de hongos comestibles, Los valores se expresan como mg/100g
de peso seco. Tomado de Chang y Miles, 2004; Miles y Chang, 1997.
Especie
Composicin
Agaricus bisporus
Flammulina velutipes
Lentinula edodes
P. ostreatus
V. volvacea
Humedad (%)
78,3 - 90,5
89,2
90,0 - 91,8
73,7 - 90,8
89,1
23,9 - 34,8
17,6
13,4 - 17,5
10,5 - 30,4
25,9
Grasa cruda
1,7 - 8,0
1,9
4,9-8,0
1,6-2,2
2,4
Totales
51,3 - 62,5
73,1
67,5-78,0
57,6 - 81,1
Sin N
44,0 - 53,5
69,4
59,5-70,7
48,9 - 74,3
45,3
Fibra cruda
8,0 - 10,4
3,7
7,3-8,0
7,5 - 8,7
9,3
Ceniza
7,7 - 12,0
7,4
3,7-7,0
6,1 - 9,8
8,8
Valor energtico
328 - 368
378
387-392
345 - 367
276
Tiamina
1,1 - 8,9
6,1
7,8
4,8
0,3 - 1,2
Rivoflavina
3,7 - 5,0
5,2
4,9
4,7
1,6 - 3,3
Niacina
42,5 - 51,0
106,5
54,9
108,7
47,6 - 91,9
cido ascrbico
26,5 - 81,9
46,3
20,2
Ca
23 - 71
19
98
33
35 - 347
790 - 1425
278
476
1348
978 - 1337
2849 - 4762
2981
Nd
3793
2005 - 6144
Fe
0,2 - 19,0
11,1
8,5
15,2
6,0
Na
106 - 156
278
8,5
837
151 - 347
Carbohidratos
Vitaminas
Minerales
12
Las especies del gnero Pleurotus se caracterizan por presentar carpforos blandos con un
olor y sabor caracterstico. Su tamao depende del medio donde crecen, siendo ms pequeo en
madera, que en substratos de desecho agroindustrial como de algodn y paja. Pueden ser de varios
colores, incluyendo el azul, blanco, crema a caf, amarillo y rosa, negro violceo, pardo, gris, segn
las especies; la intensidad del color se puede alterar de acuerdo a cambios en los factores
ambientales, como son la luz y la temperatura. En general, el color ser ms obscuro en condiciones
de luz intensa y clima fro, o ms claro en luz dbil y clima caliente. El estpite en este gnero se
dispone de forma excntrica, lateral o se encuentra ausente, inclusive algunas veces estos son
centrales, engrosados gradualmente hacia el lado del pleo, generalmente miden 2 cm de largo, 1 - 2
cm de grosor, y de coloracin blanquecina y contraste blanco, no presentan velo ni anillo, excepto en
algunas especies (Phillips, 1991). Como se observa en la figura XI el gnero Pleurotus presenta pleo
liso y convexo, raramente redondo, casi siempre en forma de ostra o concha, y en las etapas ms
viejas llegan a ser tipo embudo, pueden presentar escamas hacia el centro o en la base y de un
tamao de 5 - 30 cm de dimetro. El himenforo presenta laminillas con disposicin decurrente,
anastomosadas en la base, anchas, blancas, blanquecinas y a veces amarillas o grises, con un trama
himenoforal completamente irregular, conformada por hifas de pared delgada o gruesa, sus esporas
de color lila o crema en masa, en forma elipsoides de un tamao promedio de 9,5 x 3,5 m; los
basidios normales tetrapolares y cistidios como los queilocistidios usualmente presentes, un
subhimenio bien desarrollado y bien diferenciado y una trama del pleo inamiloide, con numerosas
fibulas (Singer, 1986; Largent y Stuntz, 1977; Largent et al., 1977).
Figura XI Caractersticas anatmicas del gnero Pleurotus. Tomado de Lpez y Garca, 2004.
13
14
Carbono: Las fuentes de carbono de estos microorganismos por lo general son polmeros de
naturaleza lignocelulsica ( la lignina, la celulosa y la hemicelulosa); adems azcares (la glucosa, la
manosa, la galactosa y la fructosa); y lpidos que se han reportado que la adicin de aceites vegetales
con un aumento del crecimiento micelial, los productos de la hidrlisis de estos (glicerol, cidos
grasos y saponinas) deprimen el crecimiento, pero la adicin de triglicridos y metil steres de cidos
grasos generalmente promueven su crecimiento.
Nitrgeno: Aunque a los hongos del gnero Pleurotus son capaces de degradar substratos con un
bajo contenido de nitrgeno, son capaces de emplear fuentes de nitrgeno inorgnico como Nitrato
de potasio o la urea; como tambin fuentes orgnicas.
Relacin C/N: En general estos hongos crecen en relaciones de C/N del 0,4 a 1,5; que en relaciones
de Carbono y Nitrgeno de 1-1,3 se da el crecimiento micelial ptimo, mientras que una relacin C/N
menos 0,6 se favorece la fructificacin de los carpforos.
15
contenido ptimo de humedad depende no solo de la especie de hongo que se cultiva, sino tambin
del tipo de substrato utilizado.
La humedad del aire: Factor fundamental para una ptima fructificacin, dado que el micelio
secundario est formado por un alto contenido de agua y su estructura no les permite retener la
humedad en condiciones adversas, un balance adecuado entre la humedad ambiental y el contenido
de humedad del hongo es necesario, por lo que para una correcto desarrollo la humedad debe estar
entre 85-90 %.
Tamao del sustrato: El tamao del sustrato afecta el crecimiento y la fructificacin, porque se
relaciona con la accesibilidad a los nutrientes, al agua y al aire por parte del micelio del hongo; en
relacin a esto el tamaos del sustrato para un ptimo de desarrollo es de 2-3 cm.
En la naturaleza los hongos del gnero Pleurotus suelen crecer en sustratos orgnicos
slidos, principalmente aquellos de naturaleza lignocelulosica que se encuentran hmedos y
aireados, lo cual los hace ideales para propagacin de inculos a ser utilizados en procesos de cultivo
en medios en estado slido, en los que se busca que el micelio invada lo ms extensamente posible
el sustrato, utilizando esta estrategia se han creado procesos para: produccin de biomasa destinada
a la alimentacin humana o animal (C. W. Hesseltine, 1972), composteo de desechos orgnicos para
la obtencin de abonos (A. Pandey, 1992), y de sustratos para el cultivo de otros hongos comestibles
(Derikx et al., 1990). Sin embargo, ha sido el estudio del crecimiento micelial de estos hongos
filamentos abordado a travs del cultivo en placas de agar para el estudio de los mecanismos de
crecimiento en ste sistema de cultivo; permitiendo la observacin de las condiciones de limitacin de
fuentes de carbono, la formacin de hifas y micelio de baja densidad o menor frecuencia de
ramificacin (Trinci, 1969, 1971, 1974); obteniendo como resultado que en medios solidos las
colonias fngicas se forman a partir de hifas que crecen apicalmente, ramificndose, las cuales se
16
superponen una con otra para el llenado de reas disponibles en el medio, formando complejas redes
radiales con bordes irregulares que le permiten al hongo desarrollarse y encontrar sus nutrientes
(Soddell et al., 1994; Lpez y Jensen, 2002; Matsuura, 2002), a una tasa que vara segn el estadio
del micelio y la disposicin de los nutrientes (Yang et al., 1992); condiciones en que el crecimiento de
las puntas y ramificaciones del micelial joven siguen una distribucin normal y las hifas madre
fngicas se extienden a una velocidad lineal constante cuando los nutrimentos del medio son
ilimitados y algunos otros factores ambientales permanecen estables.
El cultivo en medio slido (CMS) de micelio del hongo del gnero Pleurotus, es el mtodo
comn de propagacin del micelio para su posterior utilizacin en la produccin de inculos semilla
y consiste en el crecimiento de micelio en granos de cereales (trigo, sorgo, arroz, etc.), una vez
obtenido el inculo-grano se mantiene en condiciones ptimas para su conservacin, hasta su
utilizacin para inocular el sustrato que se emplear para la produccin de cuerpos fructferos
(Guilln-Navarro et al., 1998). Una alternativa para la obtencin de semilla es la utilizacin de
micelio crecido en medio lquido ya que permitir producir mayor cantidad de biomasa de mejor
calidad en menor tiempo, favorecer la adaptacin y dispersin del hongo en el trigo y facilitar su
manipulacin durante la siembra. La caracterizacin de la morfologa de crecimiento micelial es
importante en los estudios fisiolgicos y de ingeniera de los hongos filamentosos, como en el diseo
y operacin de fermentaciones fngicas. Los sistemas de CMS que se utilizan en el cultivo de los
hongos como Pleurotus, son mecanismos geomtricamente complejos con distribucin espacial
heterognea de los componentes del sistema. Por lo que el crecimiento est determinado por los
gradientes de concentracin que son difciles de medir, por lo que se hace nfasis en la produccin
de carpofros para hacer evidencia del efecto del sustrato en el desarrollo del hongo (Mitchell et al.,
1991).
Fase de adaptacin o Lag: Es una etapa en la que no se observa un crecimiento vigoroso, ms bien
los organismos adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de
nutrimentos generalmente) para poder iniciar el crecimiento exponencial.
Fase exponencial o logartmica (log): Una vez que el hongo crece en el medio nutritivo, ocurre una
fase de crecimiento equilibrado, donde se duplica la poblacin de clulas a intervalos regulares, en
esta etapa se aprovechan al mximo los nutrimentos y son consumidos continuamente.
17
Fase estacionaria: En esta fase el crecimiento cesa, est equilibrado por la muerte celular, esta fase
se alcanza si disminuye algn nutrimento esencial u otro cambio en el medio fsico. Esta fase tiene
gran importancia porque probablemente represente el estado metablico real de los microorganismos
en muchos ambientes naturales. El hongo puede reiniciar su crecimiento si es resembrado en nuevo
medio propicio. En esta fase se producen diversos tipos de enzimas autolticas que conducen a la
muerte del hongo (Snchez y Royse, 2001).
Fase de declinacin y muerte micelial: Al acumularse desechos metablicos del hongo, pueden
alcanzar niveles que limiten su crecimiento, o si algn nutrimento se termina. Pueden aparecer
mutaciones celulares, esto explica por qu la resiembra continua de un organismo en un medio de
cultivo, sobre todo sinttico, puede conducir rpidamente al agotamiento de la cepa o a la prdida de
la misma (Snchez y Royse, 2001).
Figura XII Crecimiento del P. ostreatus ECS-0110 en medio lquido. Se observan las diferentes fases de
desarrollo: L: latencia; E: exponencial; D: declinacin; S: estacionaria. Condiciones de cultivo: caldo de glucosa-1
extracto de levadura, agitacin 200 rpm, aireacin 1 vvm y temperatura 26C. Tasa de crecimiento 0,036 h .
Tomado de Marquez-Rocha et al., 1999.
18
El cultivo de Pleurotus de forma industrial, a pesar de ser relativamente reciente; ha tenido una
gran atencin como proceso biotecnolgico que permite la desgregacin de la variedad de substratos
lignocelulsicos en un amplio rango de temperaturas permitiendo as aprovechar diferentes desechos
agronmicos, fundamentado actualmente en el CMS y la FES, utilizada tanto en la transformacin de
residuos en alimentos para animales, como en la produccin de alimento de alto potencial nutricional
y biofertilizante. As mismo, en la fermentacin lquida sumergida para la produccin de biomasa,
complejos biolgicos activos y enzimas (Smith et al., 2002).
19
valor nutricional, dando origen a diferentes subproductos tras la colecta de la cosecha del cultivo,
denominados como compost agotado; producto con propiedades de inters en la agricultura por el
potencial de estos residuos y subproductos agrcolas, ya sea para la transformacin en alimentos
para animales o como sustratos primarios para la produccin de enzimas por otros microorganismos
o a partir de estos desechos.
20
CAPITULO II
ANTECEDENTES
Se estima que existen 1,5 millones de especies de hongos y 140 mil corresponden a hongos
macroscpicos, de los que se conoce slo el 10%. Un amplio nmero de estas setas han mostrado
una gran cantidad de propiedades farmacolgicas y potencial con alimento de alto valor nutricional;
estimndose recientemente entre 270 a 700 las especies de hongos comestibles y medicinales
(Smith et al., 2002; Wasser, 2002).
21
Desde los aos 70 se desarrollo en varios pases de Latinoamerica (Mxico, Ecuador, Chile y
Per) el cultivo de hongos comestibles de forma industrial, basados en el cultivo de especies del
gnero Pleurotus por las facilidades de cultivo y propiedades, como sus pocas necesidades
nutricionales, fcilidad de adaptacin a los ambientes de cultivo, requiriendo de tcnicas simples y
econmicas; siendo los desechos agroindustriales una de las mejores fuentes de carbono, nitrgeno,
azufre y fsforo necesarias para el desarrollo adecuado de la biomasa fngica de estos hongos
(Cabrera et al., 1998; Madigan et al., 2008).
La taxonoma y caracterizacin de las especies del gnero Pleurotus han resultado difciles al
realizarse por los miclogos para identificar y diferenciar unos de otro debido al parentesco morfoanatmico del carpforo entre en cada especie y cepa como respuesta a las condiciones ambientales
en que se encuentre (Zervakis et al., 2001). Sin embargo, ante este sesgo se ha encontrado entre
estos organismos debido a las barreras de reproduccin no absolutas que implican incompatibilidad
parcial y un proceso de especiacin, siendo necesario otra herramienta para el taxnomo en la
22
A pesar de todos los esfuerzos por aclarar el clado, la taxonoma de las especies de
Pleurotus, sigue siendo confusa; a pesar de que el estudio morfolgico y de intercompatibilidad
parcial de especies fueron herramientas que por largo tiempo soportaron la taxonmia para distinguir
y clasificar a estos microrganismos (Snchez y Roysee, 2001). Estas herramientas an tienen
algunas delimitacin entre la resolucin de los clados de especies a menudo difciles de resolver, que
viene a consecuencia de la definicin de especie biologica definida como grupo de organismos
iguales capaces de entrecruzarse y de producir descendencia frtil; pero para el caso de estos
hongos y otros, se maneja el concepto "complejo de especies" que se aplica ampliamente para definir
especies estrechamente relacionadas que son completamente o parcialmente intercompatibles
(cruces frtiles) y pertenecientes a un grupo interestril dado. Para el gnero Pleurotus se han
propuesto varios complejos de especies (Bao et al., 2004; Zervakis et al., 2001). Dada su amplia
diversidad y su complejidad estructural, fisiolgica y morfolgica, ha sido necesario clasificarlos segn
sus caractersticas ms intrnsecas como la interesterilidad o sistema de incompatibilidad sexual, con
la cual se permiti diferenciar y categorizar las diferentes especies, sinnimos y/o taxas de nivel de
subespecies en 11 grupos de complejos de especies (Tabla III), indicando adems la posibilidad de
compatibilidad entre ella, la posibilidad de crear nuevas especies dentro de este gnero; llevando a
las necesidad del uso de otras herramientas como la biologa molecular que ha conducido la mejor
comprensin de la identidad, variacin gentica y filogenia del gnero Pleurotus y otros
Basidiomycota; a travs del uso de marcadores moleculares de RFLP y secuenciacin de ADN de
diferentes regiones del genoma nuclear y extracromosmico (Vilgalys y Sun, 1994; Zervakis et al.,
1994; Gonzalez y Labarre, 2000; Zervakis el a., 2004).
23
Tabla III Especies biolgicas establecidas dentro del gnero Pleurotus, sus sinnimos correspondientes y/o taxa de nivel de subespecies , y grupos
respectivos de ntercompatibilidad; y su distribucin mundial. Tomado: Vilgalys et al., 1996) y Kong,. 2005.
Especie
Grupos
Norte
Amrica
Europa
Asia
Pleurotus otreatus
P. pulmonarius
P. sajor-caju; P. sapidus
II
III
*
*
P. populinus
P. cornopopiae
P. djamor
P. eryngii
P. cystidiosus
P. citrinopeliatus
P. flabellatus; P. otreatoroseus;
P. salmoneostramineus; P. euosmus
P. ferulae; P. nebrodensis; P.
hadamardii
P. abolanus
IV
V
VI
VII
P. caliptratus
VIII
P. levis
VIII
P. dryinus
IX
P. purpureo-olivaceus
P.turber-regiun
XI
P. agaves
XI
P. abieticola
XI
P. brazil
XI
P. australis
XI
24
Amrica
del Sur
frica
Australia
*
*
*
*
*
*
Para la identificacin del gnero Pleurotus, se pueden emplear algunas tcnicas moleculares
que faciliten descripcin y la seleccin de rasgos cuantitativos tales como la tasa de crecimiento,
rendimiento agronmico, acumulacin de metabolitos de inters, as como tambin de caractersticas
de resistencia a patgenos y formacin de esporas (Ramrez et al., 2010). Sin embargo, el anlisis
gentico de muchas especies del gnero Pleurotus como de otros hongos utilizando tcnicas de
biologa molecular, resultan ser procesos lentos debido, inicialmente, a los mtodos de extraccin de
ADN utilizados (Graham et al., 1994), siendo a travs del tiempo modificados las diferentes
metodologas para el proceso de obtencin de ADN genmico en plantas y hongos, arrojando que
dependiendo de la especie que se pretenda utilizar, se pueden aplicar procesos de rompimiento
mecnico de membranas para liberar ncleos, lisis celular y extraccin con amortiguadores
(compuestas de Sales, bromuro de hexadeciltrimetil amonio o Triton), seguidas de extracciones con
Fenol-Cloroformo, sucesivas centrifugaciones y precipitacin con alcoholes, principalmente etanol e
isopropanol y, con la finalidad de obtener ADN ms limpio y puro, se puede acoplar en la metodologa
el uso de enzimas tales como la ARNasa y proteinasa K, as como lavados con fenol equilibrado.
Actualmente existen reportes de diferentes metodologas para la extraccin de ADN genmico de
organismos vegetales como los protocolos de Murria y Thompson (1980), Dellaporta et al. (1983) y
Saghai-Maroof et al. (1984) y debido a la similitud estructural entre plantas y hongos (Zolan y Pukkila,
1986) y diferentes especies de gnero Pleurotus (Gonzalez y Labarre, 2000).
25
La tcnicas RAPD, seguido de la RFLP; ha sido una metodologa que ha permitido el estudio
de la estructura de poblaciones del gnero Pleurotus que son difcil de caracterizar con otros
marcadores o para aclarar la sistemtica basado en criterios tradicionales (Assigbetse et al., 1994;
Holmes et al., 1994), como fue determinar la sistemtica y valorar la diversidad de taxones de
Pleurotus asociado con umbelferas, y determinar el proceso de especiacin en el complejo de
especies asociado a P. eryngii (Zervakis et al., 2001b). La tcnica SCAR en el gnero Pleurotus se ha
utilizado con el fin de estimar la diversidad de los tipos de apareamiento en especies como P. eryngii
de diferentes regiones, evaluando el emparejamientos entre monocariones derivadas de inter e intra
grupos, identificacin 16 alelos en los loci A y B, que son responsables de la fertilidad en el ciclo de
vida; reflejando secuencias consenso como la caja TATA y caja GC; influyendo en la eficiencia
biolgica de esta especie.
Esta especie se caracteriza por tener un pleo liso, a veces algo escamoso hacia el centro o
base; de 5 a 10 cm de ancho, grisceo con tonos metlicos, lminas decurrentes de color blanco o
amarillento al secarse, poco o nada unidas entre s en la base; ms o menos delgadas y con bordes
lisos, ssiles con estpite excntrico muy corto y mal definido, contorno color blanco, consistencia
carnosa-correosa con color y sabor agradables. Crecen sobre troncos podridos o rboles en zonas
tropicales, subtropicales o bosque de pino y encino (Griffin, 1972; Argueta, 1983; Snchez, 1994). El
Micelio presenta una coloracin blanca, su crecimiento es radial, tornndose algodonoso; y al
envejecer secreta a menudo gotas amarillentas o anaranjadas (Rolf Singer, 1986). Las esporas de
esta especie son subcilndricas de forma de rion, en promedio de 8-9 x 3-4 m; su esporada es
blanca o ligeramente lila o gris (Kummer, 1871).
26
27
troncos menos pinos y abetos (Arora, 1986; Guzmn, 1998). P. cornucopiae presentan cheilocistidios
y esporas cilndricas y lisas de 8 11 x 3,5 - 5 m (Moore-Landecker, 1996).
F. P. citrinopeliatus Singer.
Los carpforos de P. citrinopileatus crecen en racimos, el pleo es de color amarillo brillante,
de 2 6,5 cm de dimetro, con una cutcula de marrn a dorada, con una textura aterciopelada y
textura agrietada; Sus caractersticas organolpticas su una contextura suave, un Sabor suave y sin
olor fuerte. El estpite es cilndricos, de 2 - 5 cm de largo y 0,2 0,8 cm de dimetro, de color blanco,
y a menudo curvo. Las lminas son blancas, decurrentes y poco espaciadas. La esporada es amarilla
(Ohira, 1990). Las esporas de estas seta son cilndrica o elptica, y de 6 - 9 x 2 3,5 m (Parmasto,
1987).
28
CAPITULO III
JUSTIFICACIN.
En las ltimas dcadas el cultivo de los hongos del gnero Pleurotus ha tomado gran inters
como proceso biotecnolgico por su alta capacidad de degradar por FES una gran diversidad de
sustratos lignocelulsicos en un amplio rango de temperaturas, aprovechando as los desechos
agroindustriales para la produccin de un alimento con un alto valor nutricional y medicinal, debido a
su acumulacin de agentes quimioteraputicos y presencia de sustancias biolgicamente activas que
actan como antioxidantes, agentes reductores y antitumorales que disminuyen los niveles de
colesterol en sangre y la presin arterial lo que lo hace atractivo para la dieta humana; adems de
generar un sub producto con potencial como fuente de nutrientes vitales directos para las plantas;
propiedades que hacen del cultivo de los hongos del gnero Pleurotus una alternativa en las
estrategias de seguridad alimentaria de muchos pases de Latinoamrica. Este Proceso
biotecnolgico puede ser implementado en Venezuela, partiendo de la caracterizacin e identificacin
taxonmica de las especies de este gnero, para la formacin y equipamiento de los agroproductores
con los conocimientos bsicos para su produccin y mercado del cultivo de estos hongos en pro a
instalarlo como una alternativa alimentaria.
HIPOTESIS.
En el Laboratorio de Biotecnologa de Microorganismos SIXTO DAVID ROJO de la ULA
Existen varias cepas del gnero Pleurotus Luego de su caracterizacin taxonmica y fisiolgica se
espera la identificacin de las especies y establecer diferencias fisiolgicas entre ellas.
OBJETIVO GENERAL
Caracterizar las cepas gnero Pleurotus existentes en el Laboratorio de Biotecnologa de
Microorganismos.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Determinar las caractersticas morfo-anatmicas de las cepas del gnero Pleurotus presentes
en el Laboratorio de Biotecnologa de Microorganismos.
Identificacin taxonmica de las cepas del gnero Pleurotus basada en las caractersticas
morfo-anatmicas.
29
CAPITULO IV
MATERIALES Y METODOS
MATERIALES
Microorganismos.
Las cepas de hongos comestibles P3215, P132, Post, PRAL y Pcit pertenecientes al cepario
de macrohongos SIXTO DAVIS ROJO del Laboratorio de Biotecnologa de Microorganismos SIXTO
DAVID ROJAS (BIOMI) del Departamento de Biologa de la Facultad de Ciencias de la Universidad
de los Andes, material biolgico donado por el ingeniero Osmar Morillo de la Fundacion Centro de
Investigaciones del Estado para la Produccin Experimental Agroindustrial (CIEPE). Se mantuvieron
en cuas de agar papa dextrosa (PDA) con repiques cada 15 das.
Medios de cultivo.
Se utilizaron dos medios de cultivo: PDA composicin: Papa 200,0 g, Agar-Agar 15,0 g,
Dextrosa 20,0 g, Levadura 2,0 g. Preparacin: pelar y poner a hervir 200 g de papa en 500 ml de
agua destilada durante 10 - 15 min, luego se filtra el extracto y se adiciona agua hasta ajustar a 1000
ml para reponer lo que se evapor, se agregaron los otros ingredientes y se calent con agitacin por
1 - 2 min hasta quedar homognea la preparacin de acuardo a lo indicado por (Gaitn, Salmones,
Merlo, y Mata, 2002).
Las semillas de sorgo (Sorghum bicolor) fueron adquiridas en el mercado local y mantenidas
en embaces hermticos hasta su uso, Los fardos de heno de pasto Bermuda (Cynodon dactylon)
fueron adquiridos en el mercado local y se procesaron en molino de martillo hasta un tamao de
particula de 1 cm.
Reactivos: A menos que se indique lo contrario los reactivos qumicos utilizados fueron de
grado analtico.
30
METODOLOGAS
Las experiencias que se detallan a continuacin se realizaron por triplicado a menos que se
indique lo contrario.
31
IV.1.1 Cultivo de las cepas P3215, P132 y Post por fermentacin de estado slidos
(FES)
Las semillas de sorgo (Sorghum bicolor) se lavaron con abundante agua y fueron sumergidas
en agua 12 h para su hidratacin, luego se cocinaron durante 15 min, se decantaron las semillas y se
empacaron en frascos de vidrio con tapa de rosca conteniendo 300g de semilla, y se esterilizaron
durante 40 min a 120 C, dejando enfriar durante 24 h para su posterior uso.
ii.
El heno de pasto Bermuda (Cynodon dactylon) fue cortado hasta tamao de partcula de 1 a 2
cm., se sumergi en agua durante 12 h, se decanto y empaco en bolsas plsticas transparentes a
razn de 1 kg del material hmedo/ bolsa. Las bolsas conteniendo el material fueron esterilizadas
durante 6h a 120 C, dejndose enfriar durante 24 h para luego utilizarse en los cultivos de las cepas
en estudio.
32
Figura XIII Cultivo por Fermentacin en Estado Solido (FES) de hongos comestibles. Tomado de Stamets,
2000.
Para determinar las caractersticas macroscpicas, los pleurocarpos fueron examinados con
una lupa tomando en cuenta parmetros como: color, apariencia, consistencia y forma de los
carpforos. Las esporas se obtuvieron, partiendo de carpforos frescos maduros. A los que se les
corto estpite a nivel del pice, se colocaron sobre papel blanco y se cubrieron con un frasco de vidrio,
luego de 30 a 60 minutos se obtuvo la impronta de las esporas de cada cepa. Las esporas se
recolectaron en tubos de ensayo estriles y se guardaron en frio.
33
IV.2 Identificacin taxonmica de las cepas P3215, P132 y Post basada en las
caractersticas morfo-anatmicas.
Una vez descritas cada una de las cepas P3215, P132 y Post, se comparar y evalu todas
las caractersticas taxonmicas, frente a claves taxonmicas permitiendo la identificacin a nivel de
gnero (Largent y Stuntz, 1977; Largent et al., 1977) (Anexo 1), y especie (Petersen et al., 2006)
(Anexo 2).
IV.3 Caractersticas de las cepas P3215, P132, Post, Pcit, PRAL y Post crecidas en
medios convencionales y no convencionales.
A partir de las cuas de las cepas P3215, P132, Post, Pcit, PRAL y Post se inocularon de
cajas de pettri con medio PDA y ASD, se incubaron en oscuridad durante 6 das a 22 C, partiendo de
estos cultivos se tomo un fragmento de 7 mm de dimetro y se colocaron en el centro de cajas de
pettri con el mismo medio, se incubaron a 22 C por 15 dias realizndose las observaciones diarias
de la forma, la elevacin, la textura, el aspecto, la superficie de la colonia micelial, el color, el margen
o borde y la pigmentacin de las colonias fngicas de cada cepa siguiendo las indicaciones
mostradas en la Figura XIV para el anlisis de las caractersticas macromorfolgicas.
Figura XIV Caracterizacin macroscpica de la colonial micelial de los hongos. Tomado de Piccoli et al., 2010).
34
Se procedi de acuerdo a (Mier et al., 2002)Las cajas con el medio (PDA, ASD) fueron
inoculadas en el centro con discos de micelio de 7mm dimetro obtenidos de cultivos en placas de los
mismos medios y que no superaban los 6 das de incubacin. La incubacin se realiz a 20 C, 25 C,
30 C y 35 C. Diariamente, las placas se colocaron en un escner y las imgenes obtenidas se
procesaron con el software ImageJ (Abrmoff et al., 2004) y se calcul la tasa radial de crecimiento
de los hongos (mm/da), al graficar la media del radio en mm contra el tiempo en das, la distancia o
radio de crecimiento se cacul a travs de la ecuacin del rea de un circulo figura geomtrica que se
asemeja al rea que cubren los hongos filamentosos tras su crecimiento. La cintica de crecimiento
radial de la colonia se ajust mediante el Software IBM SPS 20 (Field, 2013) a una serie de Fourier
de suma de senos y cosenos trigonomtricos; con los datos se estim la tasa de crecimiento (kr) en
dichos medios y en las formulaciones elaboradas en caja Petri, la cual se calcul con la funcin de
crecimiento lineal:
F(x) = k r (x) + c
Donde F(x) es la distancia y x es el tiempo, Kr expresada en milmetros por da (mm/da)
(Zervakis et al., 2001a).
La biomasa se cuantifico por determinacin del peso seco de los micelios presentes al final de
la incubacin en caja de Petri, el contenido de cada placa, se trasvaso a un vaso de precipitado
conteniendo 300 ml de H2O destilada hirviendo, una vez fundido el agar, la biomasa fngica se
recuper por filtracin en papel de filtros luego de varios lavados con agua caliente. La biomasa
obtenida se sec a 85 C hasta peso constante y se determin el peso seco gravimtricamente.
Realizando el anlisis estadstico de los datos mediante un ANOVA de dos vas y las diferencias
significativas proporcionado por la prueba de rangos mltiples de TUKEY a travs del IBM SPS 20
(Field, 2013).
35
Los cultivos se realizaron en cajas de Petri previamente esterilizadas a las que se les agrego
una capa de 20 g del medio no convencional, compactados a un espesor de 8 mm, se esterilizaron
durante 1 h a 120 C, se dejaron en reposo 24h y se inocularon, colocando en el centro de la placa un
disco de 7 mm de dimetro obtenido de un cultivo de las cepas en PDA previamente incubado
durante 6 das (Hernndez et al., 2002). Las variables a medir fuero tasa de crecimiento micelial en
los diferentes medios no convencionales a travs del registro fotogrfico diario y el procesamiento de
las imgenes obtenidas con el software ImageJ (Abrmoff et al., 2004), calculando la tasa igual como
fue para los medios convencionales (Sihuanca, 2011); y forma del micelio presente por cepa.
IV.4.1 Evaluacin de los mtodos de extraccin de los cidos nucleicos de las cepas
P3215, P132 y Post.
La extraccin de los ADNs genmicos de las cepas P3215, P132 y Post se realiz mediante
los mtodos de Saghai-Maroof et al. (1984) y el mtodo de Lee (1990). Para determinar qu protocolo
tiene mayor eficiencia, se evalu la integridad, grado de pureza y concentracin de los ADNs
genmicos de las muestras fngicas obtenidos con cada uno de ellos y se comprob si a partir de
dichos ADNs era posible la amplificacin por PCR de la regin ITS1, 5.8S y ITS2.
Siguiendo el mtodo de Saghai-Maroof, et al. (1984), se parti del cultivo de las cepas en
medio liquido Sabaraud bajo agitacin a 28 C por 6 das. 300mg de micelio obtenido por filtracin se
transfirieron a un mortero estril y se les agrego nitrgeno lquido y se maceraron hasta pulverizar;
con ayuda de una esptula se transfiri el macerado a tubos eppendorf de 1,5 ml conteniendo 600 l
de tampn de lisis (100 mM tris- HCl, pH 8,25; 0,2% B-mercaptoetanol; 20 mM EDTA; NaCl 1,4 M;
2% CTAB) y se incubo a 75 C durante 15 min bajo inversiones cada 3 min. Despus se dej reposar
a temperatura ambiente durante 10 min y se le agregaron 1 volumen de una mezcla cloroformo
alcohol isoamilico (24:1), agitando los tubos hasta formar una emulsin, se centrifug por 15 min a
3000 g, punto en que se formaron las fases acuosas, interface y orgnica, de las cuales se colecto la
fase acuosa en tubos Eppendorf nuevos obteniendo as los cidos nucleicos.
36
El mtodo de extraccin de los cidos nucleicos de Lee (1990), se realiz partiendo de 100 mg
de micelio de cada una de las cepas obtenidas del raspado con un palillo del cultivo en cajas de pettri
en medio PDA incuvadas a 28 C; se coloc cada muestra en un tubo ependroff de 1,5 ml con 300 l
de tampn de lisis (tris- HCl 120 mM, pH 8,25; EDTA 25 mM; NaCl 25 mM; SDS 2 %). El tejido fue
macerado con un micro macerador de plstico, despus las muestras al estar homogenizadas se
hirvieron a 95 C por 10 min para luego pasarlas por 5 min a 4 C, se centrifugan a 3000 g durante 5
min, se colectan los sobrenadantes en nuevos tubos eppendorf. Los cidos nucleicos se extrajeron
aadiendo 250 l de acetato de potasio 3 M e incubndose a 4 C por 1 h, seguido se centrifugan a
10000 g durante 12 min a 4 C; de las fases que se forman, se colectan las fases acuosas en tubos
eppendorf. El ADN se precipit a -20 C en presencia de 2 volmenes de la solucin etanol absoluto y
250 l de acetato de potasio 3 M por toda la noche. Posteriormente, las mezclas se centrifugaron a
3000 g durante 10 min y los precipitados se lavaron con etanol al 70 %. Despus de dejarse secar a
temperatura ambiente las muestras, el ADN se re suspendi en 50 l de H2O destilada, desionizada y
libre de Dnasas y Rnasas (MQ).
Al obtener los cidos nucleicos de cada una de las cepas a travs de los diferentes mtodos
de extraccin se procedi con la purificacin del ADN genmico, cada uno de los ADN extrados se
incubo con 0,6 volmenes de iso-propanol absoluto durante toda la noche a 4 C y se centrifugaron a
12000 g durante 30 min, los precipitados se lavaron varias veces con etanol al 70%, despus se
colocaron cerca de un mechero hasta evaporar totalmente el etanol, los cidos nucleicos se
resuspendi en 100 l de H2O MQ. Una vez purificados los cidos nucleicos, se procedi con
obtencin del ADN genmico, paso en que se tomaron 50 l de los cidos nucleicos en tubos
Eppendorf de 1,5 ml y se le agreg 450 ul de H2O MQ y 5 l de RNAasa, incubndose por 1 h a 37
C, se aadi 1 volumen de la mezcla fenol-cloroformo-alcohol isoamilico (25:24:1) pH 8, agitando los
tubos hasta formar una emulsin, las mezclas se centrifugaron durante 15 min a 12000 g, se colecto
la fase acuosa en tubos eppendorf nuevos obteniendo as los cidos nucleicos, luego se agreg un
volumen de cloroformo-alcohol isoamilico (24:1), se centrifugaron durante 15 min a 12000 g y se
colecto la fase acuosa en tubos eppendorf nuevos obteniendo as los cidos nucleicos. Despus las
fases acuosas recolectadas se incubaron con 0,6 volmenes de iso-propanol absoluto durante toda la
noche a 4 C, se centrifugaron a 12000 g por 30 min y se descartaron los sobrenadantes con ayuda
de una pipeta, los precipitados se lavaron con etanol al 70%.
Despus cada muestra se coloc cerca de un mechero hasta evaporar totalmente el etanol,
los cidos nucleicos se resuspendieron en 100 l de H2O MQ. Una vez purificados los ADN
genmicos se evalu la integridad de estos mediante electroforesis en gel de agarosa D-1
(Pronadisa) 0,8 %, en 1 % de buffer TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) al que se incorpor 0,5
g/mL de bromuro de etidio, a 70 voltios durante 45 min, cargando 5 ul de cada muestra. La pureza
del ADN se determino por espectrofotometra, realizando lecturas de absorbancia de las muestras a
230 nm, a 260 nm y 280 nm, relacionando la contaminacin con sales al valor de coeficiente A
230nm/A 260nm, comprendido entre 0,3 y 0,7 para un estndar del contenido en sales en la muestra,
y la contaminacin con protenas y fenol al valor del coeficiente A 260nm/A 280nm, comprendido
entre 1,8 - 2,0 a bajas concentraciones de protenas y fenol (Maniatis et al., 1982). La concentracin
del ADN genmico de las muestra se valor realizando lecturas de absorbancia de una dilucin de la
muestra a 260 nm. Teniendo en cuenta que una unidad de absorbancia a 260 nm corresponde a 50
g/mL de ADN bicentenario (Sambrook et al., 1989).
37
Los amplificados de la regin ITS 1 a ITS 2 tras la PCR, fueron diluidos a un volumen final de
100 l con agua MQ, se agreg un volumen de acetato de amonio 10 M y 2,5 vol de etanol 100% con
respecto a 200 l; se homogeneizo la mezcla e incub a 20 C durante 12 horas, se centrifugo a
14000 g durante 30 min. Se decant el sobrenadante y lavaron los productos de PCR con un volumen
de etanol 70%, de nuevo se centrifugo la solucin a 14000 g por 30 min. Se descart el sobrenadante
y agrego 1 volumen de etanol 70 %, la preparacin se centrifug a 14000 g por 15 min. Se decant el
sobrenadante y dejo evaporar el etanol a temperatura ambiente por 1 h. Se resuspendi el ADN en
11 l de agua MQ y se procedi a verificar el ADN amplificado a travs de la electroforesis en gel de
agarosa al 2 %. Los volmenes restantes de producto de PCR se utilizaron en las reacciones de
secuenciamiento.
Una vez obtenidos los 75 ng/l de la regin ITS1 a ITS2 de cada muestra fngica para la
secuenciacin, se procedi con la preparacin de la mezcla reaccin de secuencia en un tubo de
0,2uL como se muestra en la tabla IV; para luego llevarse a un termociclador a 40 ciclos de 96 C/10
seg, 58 C/ 5 seg y 60 C/ 4 min. El producto de la reaccin se precipit con isopropanol y lavado con
etanol, la secienciacin se realiz en el secuenciador ABI 3130, proceso basado en 3 pasos. 1) La
38
Tabla IV Mezcla de reaccin para el secuencia miento de los productos de PCR.IVIC, 2014.
Reactivo
Terminator ready reaction mix
(Big Dye)
Concentracin
inicial
5X
Primer F o R
10uM
Producto de PCR
5 - 20 ng/L
Concentracin
en la reaccin
0,5
1X
2
0,2
Agua
Completar
La reconstruccin del rbol filogentico del gnero Pleurotus se realiz por separado con las
secuencias problema de las regiones ITS1 a 5.8S e ITS2, comparando con las secuencias
recopiladas de mayor coincidencia encontradas tras el anlisis de secuencias y bioinformticos
anteriormente mencionado. Una vez obtenidas las secuencias se realizaron los diferentes
alineamientos a travs del algoritmo del software MUSCLE del EMBI (Edgar, 2004), utilizando el
programa MEGA 6.1 (Kumar et al., 2008) se realiz la reconstruccin de los arboles filogenticos por
el mtodo de vecinos ms cercanos (neighbor-joining), adicionalmente se utiliz el modelo de
sustitucin Kimura 2 parmetros (K2P con un valor de rplicas de 1000 bootstrap). Los arboles fueron
observados y editados en el mismo programa MEGA 6.1 (Kumar et al., 2008).
39
40
CAPITULO V
RESULTADOS Y DISCUSIN
P132
Post
a. Cepa P132
Descripcin: la cepa P132 se cultiv en heno de pasto bermuda (Cynodon dactylon) por FES
cerrada, observndose que solo se desarrollaron los carpforos de esta cepa y de forma individual.
Los carpforos de P132, presentaron forma Pleurocarpica con disposicin de las lamelas con forma
de hoja en posicin decurrente, sin volva presente, estpite excntrico. El pleo de estos carpforos se
desarrollo hasta los 6 cm de dimetro, en el plano anterior el pleo mostro una forma plana convexa
y en el plano lateral con una vista apical petaloide y cncavo, con un disco ligeramente deprimido,
margen arqueada y bordes desgarrados, con un grado de humedad seca; estas presentaron
tonalidades de blanco - mate, con una textura glabra, consistencia carnosa porosa. En cuanto al
estpite es de color blanco de 1,4 cm de largo y 9 mm de dimetro, con unin lateral al pleo y de
forma cilndrica ventricosa, una consistencia carnosa porosa y slida. El himenio es de color blanco a
claro, con patrones de ramificacin dicotmica, generalmente las lminas son atenuadas a
redondeadas, estrechas y poco separadas (Tabla V).
b. Cepa P3215.
Descripcin: la cepa 3215 se cultiv en heno de pasto bermuda (Cynodon dactylon ) por FES
cerrada, encontrando un desarrollo en conjunto de 8 a 12 primordios para dar origen a los carpforos,
estos caracterizados por presentar un pleo ssil de un color entre caf variando a mate de 7,5 cm de
dimetro, con una forma Pleurocrpica de lamelas decurrentes, en una vista lateral el pleo con una
forma plana convexa y en vista apical un forma lenguada, petaloide y cncavo, con un margen
arqueado; bordes de tipo crenulado, ondulados, enteros y desgarrados, con humedad seca, con
textura glabra y consistencia carnosa quebradiza y fibrosa; su esporada color blanco, sin presencia
de volva. En cuanto al estpite pose unin al pleo de forma lateral excntrica, con forma cilndrica y
compacta sinuosa, as como ventricosa, consistencia correosa, de cuerpo slido y colores desde el
blanco a crema, midiendo 1,5 cm de largo y 1,1 cm de dimetro. El himenio es de color blanco a
crema claro, no poseen patrones de ramificacin, las lminas son atenuadas o redondeadas,
generalmente estn muy juntas, son anchas como se ve en la tabla VI.
41
Carpforo (Anterior)
Carpforo (Posterior)
PLEO
Forma
Vista lateral: Plano convexo
Vista Apical: Petaloide y cncavo.
Disco: Obtuso.
Margen: Arqueado.
Borde: Ondulado.
Viscosidad: Seca.
Higroscopicidad: -
ESTIPITE
Unin: Lateral.
Forma: Comprimido
sinuosa.
Consistencia: Correosa.
Contextura: Dura.
Color: Crema claro.
Dimetro: 8,5 cm.
Largo: 3,5 cm.
HIMENIO
Frecuencia: Separados
Unin: Decurrentes.
Ancho: Anchas.
Lamelas: Atenuadas.
Ramificacin: Si.
Color: Blanco.
Grosor: 0,3 cm.
c. Cepa Post.
Descripcin: La cepa Post se cultiv en heno de pasto bermuda (Cynodon dactylon) por FES
cerrada, reflejando un desarrollo en conjunto de 6 a 10 primordios para dar origen a los carpforos.
Las setas obtenidas presentaron un pleo con una forma Pleurocarpica habitual a los hongos del
gnero Pleurotus sp, en su vista lateral son planos - convexos y en la vista apical tienen forma desde
el lenguado, petaloide y concado; con un disco desde el de tipo deprimido, umbilicado hasta el
obtuso; margen arqueada; bordes de tipo crenulado, ondulados, enteros, con un grado de humedad
seco y colores mate, pasando por los cremas claros y obscuros, con una textura glabra y consistencia
carnosa quebradiza y fibrosa. En cuanto al estpite poseen uniones al pleo de forma lateral y
excntrica, con formas cilndricas y comprimidas sinuosas, as como ventricosas, contexto slido y
colores desde el blanco a crema. El himenio es de color blanco a crema claro, no poseen patrones de
ramificacin, las lminas son atenuadas o redondeadas, muy juntas, anchas y de forma decurrente
(Tabla VII).
42
Carpforo (Anterior)
Carpforo (Posterior)
PLEO
Forma
Vista Laterial: Plano convexo
Vista Apical: Petaloide.
Disco: Obtuso.
Margen: Arqueado.
Borde: Degradado.
Viscosidad: Seca.
Higroscopicidad: ESTIPITE
Unin: Lateral.
Forma: Comprimido sinuosa.
Consistencia: Correosa.
Contextura: Dura.
Color: Crema claro.
Dimetro: 8,5 cm.
Largo: 3,5 cm.
Frecuencia: Separados
Unin: Decurrentes.
Ancho: Anchas.
Lamelas: Atenuadas.
Ramificacin: Si.
Color: Blanco.
Grosor: 0,3 cm.
43
Carpforo (Anterior)
Carpforo (Posterior)
PLEO
Forma
Vista Laterial: Plano convexo
Vista Apical: Petaloide.
Disco: Obtuso.
Margen: Arqueado.
Borde: Liso.
Viscosidad: Seca.
Higroscopicidad: ESTIPITE
Color: Crema.
Brillo: Mate.
Textura: Glabro.
Consistencia: Carnosa-quebradiza.
Dimetro: 11,5 cm.
Grosor: 4 cm.
HIMENIO
Unin: Lateral:
Forma: Compacta.
Consistencia: Correosa.
Contextura: Dura.
Color: Crema claro.
Dimetro: 0,8 cm.
Largo: 4,2 cm.
Frecuencia: Juntas.
Unin: Decurrentes.
Ancho: Anchas.
Lamelas: Redondeadas.
Ramificacin: No.
Color: Crema.
Grosor: 0,56 cm.
V.1.2 Caractersticas microscpicas de las cepas P3215, P132, Pcit, Post y PRAL.
En cuanto a las caractersticas microscpicas de las cepas del gnero Pleurotus evaluados se
pudo observar que las cepas P3215 y Post presentaron hifas de paredes delgadas y entrelazadas
junto a la presencia de perillas con pednculos, las cepas P132, Post, Pcit y PRAL presentaron hifas
44
de paredes gruesas con fbulas PRAL presentaron hifas de perillas con pednculo como se observa
en la tabla VIII.
Presencia fbulas
P3215
P132
Pcit
Post
PRAL
V.2 Identificacin taxonmica de las cepas las cepas P3215, P132 y Post basada en las
caractersticas morfoanatomicas.
Las cepas evaluadas se identificaron contrastando nuestros resultados con los caracteres
macroscpicos propuestos por Delgado et al., 2005 y Largent, 1977, que definen a un hongo del
gnero Pleurotus Encontrando que las cepas P132, P3215 y Post pertenecen al gnero Pleurotus por
presentar:
A travs de los caracteres macroscpicos propuestos por Petersen et al., 2006, tambin se
pudieron identificar las diferentes cepas a nivel de especie, encontrando que las cepas P132, P3215 y
Post presentan las caractersticas fundamentales al gnero Pleurotus con pleo de color blanco de
forma Pleurocarpica y la disposicin de las lamelas en posicin decurrente y borde liso, sin presencia
de volva, y un estpite excntrico de 2 a 4 cm, de contexto slido y color crema.
45
V.3 Caractersticas de las cepas las cepas P3215, P132, Post y PRAL crecidas en
medios convencionales y no convencionales.
Como puede observarse en la tabla IX los caracteres estudiados varan de acuerdo a cada
cepa y al medio de cultivo empleado; encontrando que la cepa Pcit difiere a las dems por presentar
textura polvorienta, no presentar micelio areo, su forma es filamentosa en PDA y circular en SA,
elevacin convexa umbilicada, de margen liso y superficie sectorizada, mientras que las dems cepas
mostraron tener textura algodonosa, micelio areo, formas filamentosas, convexa umbilicada, de
margen desflecado y superficie cerebriforme. En todos los casos la densidad fue mayor en el medio
PDA.
Tabla IX Caractersticas macroscpicas de las colonias de las cepas las cepas P3215, P132, Pcit, Post y PRAL
presentes en el Laboratorio BIOMI, evaluadas en medios de cultivo PDA y SA a 22C.
Cepa
Medios de
Cultivo
Caractersticas
Color
Textura
Blanco
Algodonosa
PDA
P3215
Algodonosa
SA
Media
PDA
Alta
Blanco
Polvorienta
SA
Si
Filamentoso
Elevada y
limitada
Desflecado
Sectorizada
Si
Filamentoso
Elevada y
limitada
Desflecado
Convexa
umbilicada
Liso
Elevada y
limitada
Desflecado
Elevada y
limitada
Desflecado
Filamentoso
No
Circular
Alta
Blanco
Algodonosa
Media
PDA
Alta
Blanco
Algodonosa
Filamentoso
Si
SA
SA
Superficie
Media
PDA
PRAL
Margen
Alta
Blanco
Post
Elevacin
Media
PDA
Pcit
Forma
Alta
SA
P132
Densidad
Micelio
areo
Media
Circular
Si
Filamentoso
Sectorizada
Cerebriforme
Sectorizada
Cerebriforme
Sectorizada
Cerebriforme
46
Para la cepa 3215, la tasa de crecimiento micelial mxima se obtuvo a 25 C en el medio PDA
5,45 mm/d y 3,72 mm/d en el medio SA a 30C. Sin embargo, los valores ms altos de produccin de
biomasa se obtuvieron a 30C en el medio PDA y SA (742,33 y 233,97 mg respectivamente). La cepa
Post presento mayor tasa de crecimiento micelial a 30C tanto en el medio PDA 5,75 mm/d como en
el medio SA 3,68 mm/d, en ambos casos el peor desempeo se registr a 35C. En cuanto a la
produccin de biomasa el valor mximo 146,33 mg se obtuvo a 20C en el medio PDA y en el medio
SA 106,65mg a 25 C, esta cepa no presento crecimiento a 35C en ambos medios. La cepa PRAL
presento el mximo de crecimiento micelial en el medio PDA a 25C (5,59 mm/d) y en el medio SA a
20C (3,41 mm/d) los valores ms bajos se obtuvieron a 35C (3,23mm/d) en el medio PDA y en el
medio SA a 30C (2,87mm/d). Los valores mximos de produccin de biomasa se lograron a 25C
(136 mg) en el medio PDA y a 30 C en el medio SA.
47
Tabla X Tasa de crecimiento micelial (mm/da) tras la incubacin por 9 da de las cepas P132, P3215, Post y PRAL en
PDA (Agar Papa Dextrosa) y ASD (Agar Sabouraud Dextrosa).
P132e
P3215f
Postg
PRALh
ASD
PDA
ASD
Temperatura
(C) i
5,22
2,42
558,97 *
230,40
20,00
5,07
3,25
158,17
269,67 *
25,00
4,51
3,24
166,80**
248,90
30,00
4,23**
3,17**
187,40
72,17**
35,00
5,33
2,60**
193,00
192,63
20,00
5,45*
3,37
106,67**
224,43
25,00
3,52
3,72*
742,33*
233,97*
30,00
3,45**
2,76
145,67
149,70**
35,00
3,36
2,13
146,33
59,23
20,00
3,99
2,31
107,00
106,65
25,00
5,75 *
3,68 *
117,67
99,33
30,00
0,30 **
0,30 **
0,00 **
0,30 **
35,00
4,78
3,41*
110,33
46,53
20,00
5,59*
3,01
136,00*
26,55
25,00
4,93
2,87**
58,33
63,60*
30,00
3,23**
3,01
34,33**
32,00**
35,00
48
En los resultados mostrados en la fig. XVI a los 6 das de incubacin se aprecia que la cepa
3215 se desarrolla ms rpido en el medio arroz seguida por tuza de maz y sorgo, observndose
poco desarrollo sobre las semillas de parchita. Comportamiento similar se observ en el caso de la
cepa Post, solo que en este caso el crecimiento en tuza fue ligeramente mayor al observado en
sorgo. Sin embargo, a los 15 das de la incubacin (tabla XI) se obtuvo que la cepa 3215 logr la
mayor tasa de crecimiento 4,9 y 4,6 mm/d en los medios, tuza de maz y arroz respectivamente, con
escaso desarrollo en la semilla de parchita. La cepa Post mostro un comportamiento similar con tasas
de crecimiento en tuza de maz y en arroz de 4,1 y 3,9 mm/d respectivamente. Estos resultados
indican que la tuza de maz podra ser un buen sustrato para la produccin de inculos (semilla) y
para el proceso de produccin de carpforos. Estos resultados nos permiten concluir que las cepas
estudiadas presentan diferencias significativas entre ellas, ya que tienen comportamientos diferentes
49
Tabla XI Tasa de crecimiento micelial (mm/da) a los 15 das de incubacin de las cepas Post y P3215 en
sustratos lignocelulsicos como tuza de maz, semilla de sorgo, arroz y semilla de parchita.
Sustratos
Post
Tuza a
4,1 0 0,1
Sorgo
2,1 0,1
3,2 0,1
3,9 0,2
4,6 0,2
1,49 0,09
1,6 0,1
Arroz
Parchita
Figura XVI Crecimiento micelial de las cepas Post y P3215 al 6to da cultivadas en medios no convencionales
como semilla de sorgo (Sorghum sp.), Tuza de maz (Zea mays), Arroz (Oryza sativa) y semilla de parchita
(Passiflora edulis) incubadas a 25C.
Estos resultados fueron parecidos a los obtenidos por (Grodznskaya et al., 2002), donde la
colonizacin total sepresent a los 14 das en las mezclas de medio no convencional; caa de azcar
y tusa de maz, y aserrn y caa de azcar con cepas de P. ostreatus, aunque no presentan tasa de
crecimiento micelial. Este crecimiento rpido, puede deberse al material lignocelulosico presente en
estos sustratos y a la actividad del paquete enzimtico presente en estas cepas, variando entre las
cepas, siendo as reflejo de diferencias genticas entre ellas.
50
Las caractersticas miceliales de las cepas Post y P3215 crecidas en los medios no
convencionales como semilla de sorgo (Sorghum sp.), Tuza de maz (Zea mays), Arroz (Oryza sativa)
y semilla de parchita (Passiflora edulis), se presentan en la Tabla XII. En la cepa P3215 se pudo
observar una densidad micelial de forma regular (tuza de maz (Zea mays) y semilla de sorgo
(Sorghum sp.)), abundante (arroz (Oryza sativa)) y escaso (semilla de parchita (Passiflora edulis)), el
micelio en cada medio se desarrollo de un color blanco y de forma aria, no present aglomeraciones
en los medios de cultivo. En los medios de cultivo semilla de sorgo (Sorghum sp.) y parchita
(Passiflora edulis) tuvo menor invasin manteniendo la coloracin de estos en donde no invadi el
micelio, mientras que en los medios como Tuza de maz (Zea mays) y Arroz (Oryza sativa), las
regiones sin invasin sufrieron decoloracin tornndose mas claros y mostrando estar secos.
En la cepa Post se pudo observar una densidad micelial de forma abundante (arroz (Oryza
sativa)), regular (tuza de maz (Zea mays) y semilla de sorgo (Sorghum sp.)) y escaso (semilla de
parchita (Passiflora edulis)). El micelio se desarrollo de color blanco en cada uno de los medios, no
hay presencia de micelio ario en los medios Tuza de maz (Zea mays) y Arroz (Oryza sativa), no
present aglomeraciones en los medios de cultivo. En los medios de cultivo semilla de sorgo
(Sorghum sp.) y parchita (Passiflora edulis) tuvo menor invasin manteniendo la coloracin estos en
donde no invadi el micelio, mientras que en los medios como Tuza de maz y Arroz, las regiones sin
invasin sufrieron decoloracin tornndose ms claros.
Tabla XII Caractersticas morfolgicas de las cepas estudiadas en en medios no convencionales como semilla
de sorgo (Sorghum sp.), Tuza de maz (Zea mays), Arroz (Oryza sativa) y semilla de parchita (Passiflora edulis)
incubadas por 15 das a 25C
Micelio
Cepa
Sustrato
Color
Sin micelio
Con micelio
Medios de
Cultivo
Densidad
Micelio
aerio
Color
Tuza de maz
Regular
Si
Blanco
Marron claro
Marron claro
S. Sorgo
Regular
Si
Blanco
Marron oscuro
Marron claro
Arroz
Abundante
Si
Blanco
Beige
Beige claro
S. Parchita
Escaso
Si
Blanco
Marron oscuro
Tuza de maz
Regular
Si
Blanco
Marron
Marron claro
S. Sorgo
Regular
No
Blanco
Marron oscuro
Marron claro
Arroz
Abundante
No
Blanco
Beige
Beige claro
S. Parchita
Escaso
Si
Blanco
Marron oscuro
P3215
Post
51
V.4 Identificacin por tcnicas moleculares de las cepas P3215, P132, Post.
Para llevar a cabo la identificacin gentica de las cepas del gnero Pleurotus, se
desarrollaron las siguientes actividades: 1) Puesta a punto de un mtodo de extraccin de ADN a
partir del micelial de cada cepa. 2) Amplificacin por PCR de las regiones ITS 1 e ITS2. A
continuacin se describen los resultados obtenidos con relacin a los objetivos planteados en este
trabajo.
La integridad de los ADN obtenidos en cada uno de estos mtodos de extraccin se evalu a
travs de una electroforesis en gel de agarosa al 0,8%; mostraron que la metodologa de SaghaiMaroof, et al. (1984) conservo la integridad del ADN y se obtuvo mayor concentracin de ADN. El
ADN obtenido por el mtodo de Lee, 1990 resulto parcialmente degradado y en menor concentracin
como se muestra en la figura XV. La concentracin de los ADNs genmicos obtenidas por el mtodo
de Saghai-Maroof, et. al.1984 variaron entre los 1.000 - 4.000 ng/L, permitiendo la amplificacin de
la regin ITS1, 5.8S y ITS2 por PCR a un factos de dilucin (FD) de 100 logrando amplificar todos las
muestras. El ADN extrado por el mtodo de Lee (1990) mostro degradacin y concentracin entre
450 - 680 ng/L, solo se pudo amplificar la regin ITS1, 5.8S e ITS2 por PCR tras un FD de 1000. En
el caso de la cepa Pcit, no se produjo amplificacin figura XVII.
La amplificacin de la regin ITS1-5.8S-ITS2 del ADNr con los primers ITS1 - ITS4. Arrojo
fragmentos con tamao de alrededor de 500-670 pb para las cepas P3215, PRAL, POST, Pcit y P132,
visualizando en geles de agarosa al 2% como muestra la figura XVIII.
La evaluacin de los mtodos Saghai-Maroof et al. (1984) y Lee (1990) para la extraccin del
ADN genmico de las cepas de estudio, permiti determinar que el protocolo con mayor eficiencia fue
el de Saghai-Maroof et al. (1984); ya que permiti conservar la integridad, el grado de pureza, altas
concentraciones de los ADNs genmicos y amplificar por PCR la regin ITS1, 5.8S e ITS2. Esto
debido a que este mtodo de extraccin una vez pulverizado el material fngico con nitrgeno
lquido, el CTAB como surfactante catinico es ms eficiente en la eliminacin de compuestos
secundarios que atrapan el ADN en una matriz gelatinosa (Guillemaut & Marchal-Drouard, 1992) y
de protenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN genmico (Do & Adams, 1991; Demeke &
Adams, 1992) los cuales inhiben la reaccin de amplificacin de ADN (Pandey et al., 1996), mientras
que el mtodo de Lee (1990); parte de la ruptura celular por accin mecnica, causando que la
actividad ltica se dispare y se termine por degradar el ADN, tambin la purificacin del ADN
genmico con un surfactante como el SDS es menos eficientes en la eliminacin de compuestos
segundarios que atrapan el ADN.
52
Tabla XIII Comparacin de las caractersticas del ADN obtenido a partir de las cepas del gnero Pleurotus a
partir de los mtodos de Saghai-Maroof, et al. (1984) (S) y Lee (1990) (L).
Minerales
Pureza
Concentracin (ng/ul)
Integridad
PCR (Dilucin)
Muestra
S
P3215
1,8
1,03
1,3
1,62
18,73
1,25
Integro
Degradado
100
1000
POST
0,72
3,39
1,7
1,75
6,92
0,28
Integro
Degradado
100
1000
PCIT
4,33
2,59
1,01
1,42
0,21
0,43
Degradado
Degradado
100
1000
PRAL
1,42
0,91
1,23
1,42
5,57
1,52
Integro
Degradado
100
1000
P132
0,73
3,05
1,7
1,08
11,03
0,17
Integro
Degradado
100
1000
Figura XVII Electroforesis en gel de agarosa al 0,8% de 1g del ADN genmico extrado de las cepas del
gnero Pleurotus P3215, P132, Post, Pcit y PRAL utilizando el mtodo de Lee (1990) (a) y el mtodo de
Saghai-Maroof, et. al.(1984) (b).
53
Figura XVIII Anlisis electrofortico de los productos de PCR de la regin ITS1, 5.8S y ITS2 amplificados con
los primers ITS1 y ITS4 a partir del ADN genmicos de las cepas del gnero Pleurotus como P3215, P132,
Post, PRAL y PCIT extrados por el mtodo de Lee (1990) diluida a un FD de 1000 (a) y el mtodo de SaghaiMaroof, et. al. (1984) a un FD de 100(b). (EPM) Escalera de peso molecular 1 Kb plus DNA ladder (+) Control
positivo y (-) al control negativo.
V.4.2 Anlisis de la secuencia de la regin ITS 1, gen 5.8 S ANDr y la regin ITS2 dentro
de las cepas del gnero Pleurotus
Una vez obtenidos los productos de PCR de la regin ITS1, 5.8S e ITS2, se determinaron las
concentraciones de AND a travs de la cuantificacin semicualitativa comparando con ADN de
lambda; obteniendo as entre 25 a 200 ng/l y se enviaron a secuenciar a la Unidad de Estudios
Genticos y Forenses (UEGF) del IVIC segn como se muestra en la tabla XIV.
Tabla XIV Concentraciones de los productos de PCR de la regin ITS1, 5.8S e ITS2 (PCR) de cada cepa
enviado a secuenciar a la a la Unidad de Estudios Genticos y Forenses del IVIC.
Muestras
P3215
Post
Pcit
PRAL
P132
Tipo de
ADN
templado
PCR
PCR
PCR
PCR
PCR
Mtodo de
Purificacin
Mtodo Alcalino
Mtodo Alcalino
Mtodo Alcalino
Mtodo Alcalino
Mtodo Alcalino
Tamao del
ADN
templado
560
710
690
720
730
54
Primer
ITS1 (FW)
ITS1 (FW)
ITS1 (FW)
ITS1 (FW)
ITS1 (FW)
Temperatura
Concentracin
de Annealing
de ADN (ng/l)
(C)
55C
100
55C
100
55C
50
55C
25
55C
200
Tabla XV Identidad de los productos de PCR de la regin ITS1, 5.8S e ITS2 de cada cepa enviada a secuenciar
a la Unidad de Estudios Genticos y Forenses del IVIC.
Cepa
P132
Post
P3215
Identidad
ADN
490/49(98.2%)
490/49(98.2%)
490/49(98.2%)
492/49(98.8%)
492/49(98.8%)
492/49(98.8%)
626/64(97.81%)
626/64(97.81%)
625/64(97.66%)
cdigo de
acceso
KJ020935
KF681359
KF309193
JX429940
KC686866
KC686865
KF309193
EU424300
KF681359
Especie
Pleurotus ostreatus
P. ostreatus
P. ostreatus
P. sapidus
P. ostreatus
P. ostreatus
P. ostreatus
P. ostreatus
P. ostreatus
V.4.2.1 Anlisis bioinformtico de las secuencia de la regin ITS 1, 5.8S e ITS2 de las
cepas del gnero Pleurotus
Una vez identificadas las secuencias de la regin ITS 1, gen 5.8 S ANDr a ITS2 de las
cepas del gnero Pleurotus a travs de la herramienta bioinformtica Blast del NCBI como Pleurotus,
se procedi con el anlisis del RFLP de las secuencias de P132, Post y P3215, junto a las con varias
secuencias del GenBank correspondientes a diferentes cepas de las especies P. eryngii, P.
tuberregium, P. citrinopileatus, P. cystidiosus, P. ostreatus, P. pulmonarius y P. djamor; empleando
las herramientas de bioinformtica NEBcutter V2.0 (Vincze et al., 2003) y Webcutter 2.0 (Maarek et
al., 1997); encontrando que comparten los sitios de reconocimiento de las enzimas de restriccin
ApoI, AciI, HaeIII, HinfI, Hpy166II, HpyCH4V, CviAII y MnLI, y cortan el ADN en 4 fragmento como se
muestra en la tabla XVI, en relacin a esto y con el anlisis de Martin et al. (2004) se hizo el anlisis
de RFLP virtual con base en la enzima Haelll, a cada una de las secuencia encontrando variaciones
en el patrn de digestin de la regin ITS1 a ITS2 entre las especies evaluadas (Figura XVII, carriles
EF514248, AB115043, AY265821, EF514243, EF514244 y EF514250), y cierta similitud del patrn de
digestin entre las cepas y la especie P. ostreatus (Figura XIX, carriles P3215a, Posta, P132, Postb,
P3215b y EF514248).
Los resultados por la tcnica RFLP permitieron diferenciar e identificar correctamente las
especies del gnero Pleurotus utilizadas en este estudio, obteniendo los patrones tericos de bandas
esperados. Adicionalmente, el patrn terico de bandas de la cepa P3215, P132 y Post permiti
ubicarla en la especie P. ostreatus, obteniendo una identificacin consistente con respecto a los
resultados obtenidos por mtodos convencionales. Aun as, esta metodologa presenta una baja
especificidad para la diferenciacin de especies estrechamente relacionadas como las subespecies
de especies en este clado. El anlisis electrofortico, anlisis de secuencias de dominios de la regin
28S y recientes comparaciones de las regiones ITS1-5.8s-ITS2 del ADNr han permitido distinguir
nuevas especies reubicadas como P. cystidius y P. abalonus (Zervakis et al., 2004).La similitud de
55
secuencias explica la alta probabilidad de obtener un perfil electrofortico RFLP similar que no
permite distinguir entre especies estrechamente relacionadas.
Figura XIX Patrones RFLP de los fragmento ITS1-5.8S-ITS2 ADNr de las secuencias EF514248 Pleurotus
ostreatus, EF514244 P. cystidios, AB115043 P. citrinopiliatus, EF514250 P. tuberregium, EF514243 P.
pulmonarius, P132, P3215a, P3215b y Posta, digeridos con la enzima HaeIII a travs de la herramienta
NEBcutter v2.0 (Vincze et al., 2003). Marcador de peso molecular 100pb.
56
Tabla XVI Patrones de bandas RFLP esperados para las especies del gnero Pleurotus tras la digestin terica con las enzimas de restriccin que cortan en 3
sitios. Negro (Las enzimas de restriccin que comparten todos), Rojo que comparten las cepas P132, Post y P3215.
Nombre de la Secuencia
EF514248 P.ostreatus
AciI (C^CG_C)
APoI (R^AATT_Y)
HaeIII (GG|CC)
Hindi (G^ANT_C)
HPy166II (GTN|NAC)
HPyCH4V (TG|CA)
Cortes
*7/9, *591/593,
*637/639
24/28, 331/335,
411/415
48/48, 230/230,
472/472
*64/64, 94/94,
*210/210
EF514244 P. cystidios
APoI (R^AATT_Y)
Cortes
8/12, 327/331,
407/411
AB115043 P. citrinopiliatus
AciI (C^CG_C)
HPy166II (GTN|NAC)
APoI (R^AATT_Y)
Cortes
*473/475, *593/595,
*614/616
*50/50, 83/83,
*171/171
9/13, 294/298,
374/378
EF514250 P. tuberregium
APoI (R^AATT_Y)
Cortes
10/14, 323/327,
403/407
EF514243 P. pulmonarius
APoI (R^AATT_Y)
HinfI (G^ANT_C)
HPy166II (GTN|NAC)
HP.yCH4V (TG|CA)
Cortes
8/12, 315/319,
395/399
324/327, *332/335,
546/549
*48/48, 78/78,
*194/194
AY265821 P. djamor
CviAII (C^AT_G)
Cortes
225/227, 383/385,
551/553
EU233990 P.eryngii
Cortes
P.132
AP.oI (R^AATT_Y)
HaeIII (GG|CC)
HP.y166II (GTN|NAC)
MnlI (CCTCNNNNNN_N^)
Cortes
6/10, 312/316,
392/396
29/29, 211/211,
455/455
*45/45, 75/75,
*191/191
P.3215a
APoI (R^AATT_Y)
CviAII (C^AT_G)
FatI (^CATG_)
MnlI (CCTCNNNNNN_N^)
NlaIII (_CATG^)
Cortes
18/22, 211/215,
291/295
63/59, 97/93,
237/233
P.3215b
AciI (C^CG_C)
HaeIII (GG|CC)
HinfI (G^ANT_C)
HPy166II (GTN|NAC)
HPyCH4V (TG|CA)
Cortes
*572/574, *619/621,
*643/645
26/26, 207/207,
451/451
317/320, 552/555,
612/615
42/42, 305/305,
479/479
P.osta
AgsI (TT_S^AA)
HaeIII (GG|CC)
HPy166II (GTN|NAC)
MnlI (CCTCNNNNNN_N^)
Cortes
64/63, 240/239,
335/334
29/29, 209/209,
454/454
*45/45, 75/75,
*189/189
P.ostb
AgsI (TT_S^AA)
CviAII (C^AT_G)
FatI (^CATG_)
HPy166II (GTN|NAC)
MluCI (^AATT_)
NlaIII (_CATG^)
Cortes
65/64, 241/240,
336/335
41/43, 369/371,
541/543
40/44, 368/372,
540/544
303/307, 311/315,
390/394
57
El anlisis filogentico de las regiones ITS1 e ITS2 arrojaron resultados con topologa
diferentes entre las regiones evaluadas, encontrando en la regin ITS1 valores bootstrap altos (60 99) para la resolucin de los clados correspondientes a las especies Pleurotus ostreatus, P. djamor,
P. citropileatus y P. eryngii, indicando una construccin filogentica solida (Figura XX a), y en ITS2 se
observ ser una regin ms variable en el gnero Pleurotus con valores de bootstrap altos (50 - 99)
para la resolucin de los clados correspondientes a las especies P. cystidios, P. citronopeliaus, P.
pulmonaris y P. ostreatus indicando una construccin filogentica solida exceptuando para las
especies P. ostreatus y P. eryngii (Figura XX b).
El anlisis filogentico fue realizado nicamente con las cepas P3215, P132 y Post, la
inferencia del rbol filogentico de las regin ITS1 y ITS2 no obtuvo una slida construccin dentro de
los clados de especies estrechamente relacionadas como son P. ostreatus, P. sapidus y P. florida al
obtener valores bajos de bootstrap (61 y 35).
Al evaluar las diferencias de los resultados del agrupamiento de los rboles filogenticos y el
nmero de sustituciones de bases por sitio de las regiones ITS1 e ITS2, se obtiene que estas
regiones no presentan igual conservacin evolutiva. Al comparar el valor total (overall) de nmero de
sustituciones de bases por sitio (K2P) se obtiene una mayor divergencia nucleotdica para la regin
ITS2 con respecto a la regin ITS1. Aun as, estos estudios revelan que esta divergencia y la
diversidad de estas secuencias difieren dependiendo del grupo taxonmico. Para este estudio la
regin ITS2 no permiti reducir la identificacin dentro del gnero Pleurotus, mientras que la regin
ITS1 permiti excluir las especies las especies Pleurotus eriingy y Pleurotus cornucopiea, reduciendo
la identificacin de las cepa P3215, P132 y Post de estudio a las especies P. ostreatus y P.
floridanus. Aun as, el anlisis pudo verse sesgado por la falta de un nmero representativo de
secuencias de cepas de referencia pertenecientes a dichas especies; siendo as las regiones ITS
ADNr insuficientes para la identificacin certera de las cepas evaluadas.
58
Tabla XVII Matriz de distancias genticas pareadas K2P para la regin ITS1.
Distancia
1,00000 AB115036ITS1P_cystidiosus
2,00000 AB115037ITS1P_cornucopiae
3,00000 AB115038ITS1P_pulmonarius
4,00000 AB115042ITS1P_eryngii
5,00000 AB115049ITS1P_javanicus
6,00000 AB115053ITS1P_djamor
7,00000 AB272091ITS1P_nebrodensis
8,00000 AB286152ITS1P_eryngii
9,00000 AB286153ITS1P_eryngii
10,00000 AB733142ITS1P_ostreatus
11,00000 AB733143ITS1P_ostreatus
12,00000 AY450345ITS1P_ostreatus
13,00000 AY540318ITS1P_citrinopileatus
14,00000 AY540319ITS1P_citrinopileatus
15,00000 AY540326ITS1P_sapidus
16,00000 AY540327ITS1P_sapidus
17,00000 AY540332ITS1P_ostreatus
18,00000 EF514243ITS1P_pulmonarius
19,00000 EF514244ITS1P_cystidiosus
20,00000 EF514248ITS1P_ostreatus
21,00000 EU424287ITS1P_djamor
22,00000 EU424288ITS1P_djamor
23,00000 EU424293ITS1P_dryinus
24,00000 EU424294ITS1P_dryinus
25,00000 EU424300IST1P_ostreatus
26,00000 EU424316ITS1P_sapidus
27,00000 FJ687276ITS1Pleurotus_sp
28,00000 FJ810181ITS1P_sapidus
29,00000 FN391585ITS1P_ostreatus
30,00000 GU721058ITS1P_floridanus
31,00000 HM561980ITS1P_sapidus
32,00000 JF758887ITS1P_ostreatus
33,00000 JF908604ITS1P_pulmonarius
34,00000 JF908619ITS1P_ostreatus
35,00000 JN234845ITS1P_sapidus
36,00000 JX403720ITS1Pleurotus_sp
37,00000 JX429940ITS1P_sapidus
38,00000 KC686865IST1P_ostreatus
39,00000 KC686866IST1P_ostreatus
40,00000 KF681359ITS1P_ostreatus
41,00000 P132
42,00000 P3215a
43,00000 P3215b
44,00000 Posta
45,00000 Postb
1,00000 2,00000 3,00000 4,00000 5,00000 6,00000 7,00000 8,00000 9,00000 10,00000 11,00000 12,00000 13,00000 14,00000 15,00000 16,00000 17,00000 18,00000 19,00000 20,00000 21,00000 22,00000 23,00000 24,00000 25,00000 26,00000 27,00000 28,00000 29,00000 30,00000 31,00000 32,00000 33,00000 34,00000 35,00000 36,00000 37,00000 38,00000 39,00000 40,00000 41,00000 42,00000 43,00000 44,00000 45,00000
0,06875 0,07796 0,09906 0,08383 0,10478 0,07987 0,09016 0,09906 0,07796 0,07796 0,07796 0,07782 0,07782 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,02251 0,07796 0,08758 0,10478 0,06259 0,06259 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,08572 0,07796 0,07796
0,17159
0,07091 0,09054 0,08684 0,09687 0,07105 0,08147 0,09054 0,07091 0,07091 0,07091 0,02260 0,02260 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,06333 0,07091 0,07986 0,09687 0,06866 0,06866 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07924 0,07091 0,07091
0,20101 0,17388
0,04063 0,07485 0,10201 0,03387 0,04786 0,04063 0,00000 0,00000 0,00000 0,06197 0,06197 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,07128 0,00000 0,08568 0,10201 0,07990 0,07990 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,28929 0,25861 0,06866
0,10153 0,11044 0,04786 0,02260 0,00000 0,04063 0,04063 0,04063 0,08147 0,08147 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,09228 0,04063 0,09256 0,11044 0,10441 0,10441 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04611 0,04063 0,04063
0,22735 0,25702 0,19813 0,29018
0,09081 0,07853 0,09723 0,10153 0,07485 0,07485 0,07485 0,09459 0,09459 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07743 0,07485 0,07562 0,09081 0,08283 0,08283 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,08204 0,07485 0,07485
0,32144 0,28831 0,32058 0,35478 0,25800
0,10454 0,10456 0,11044 0,10201 0,10201 0,10201 0,10426 0,10426 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,09727 0,10201 0,04030 0,00000 0,09965 0,09965 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201
0,20101 0,17388 0,04549 0,09248 0,19813 0,32058
0,04063 0,04786 0,03387 0,03387 0,03387 0,08060 0,08060 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,07324 0,03387 0,08851 0,10454 0,08144 0,08144 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,04230 0,03387 0,03387
0,25702 0,22735 0,09248 0,02223 0,26076 0,32144 0,06866
0,02260 0,04786 0,04786 0,04786 0,09054 0,09054 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,08333 0,04786 0,08705 0,10456 0,09634 0,09634 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,05369 0,04786 0,04786
0,28929 0,25861 0,06866 0,00000 0,29018 0,35478 0,09248 0,02223
0,04063 0,04063 0,04063 0,08147 0,08147 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,09228 0,04063 0,09256 0,11044 0,10441 0,10441 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04611 0,04063 0,04063
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866
0,00000 0,00000 0,06197 0,06197 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,07128 0,00000 0,08568 0,10201 0,07990 0,07990 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000
0,00000 0,06197 0,06197 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,07128 0,00000 0,08568 0,10201 0,07990 0,07990 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000
0,06197 0,06197 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,07128 0,00000 0,08568 0,10201 0,07990 0,07990 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,02223 0,14530 0,22735 0,28929 0,32058 0,20420 0,25861 0,22735 0,14530 0,14530 0,14530
0,00000 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,07283 0,06197 0,08707 0,10426 0,07789 0,07789 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06963 0,06197 0,06197
0,20101 0,02223 0,14530 0,22735 0,28929 0,32058 0,20420 0,25861 0,22735 0,14530 0,14530 0,14530 0,00000
0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,07283 0,06197 0,08707 0,10426 0,07789 0,07789 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06963 0,06197 0,06197
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530
0,00000 0,00000 0,00000 0,07128 0,00000 0,08568 0,10201 0,07990 0,07990 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000
0,00000 0,00000 0,07128 0,00000 0,08568 0,10201 0,07990 0,07990 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000
0,00000 0,07128 0,00000 0,08568 0,10201 0,07990 0,07990 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000
0,07128 0,00000 0,08568 0,10201 0,07990 0,07990 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,02210 0,14530 0,17388 0,25861 0,19890 0,28831 0,17388 0,22735 0,25861 0,17388 0,17388 0,17388 0,17388 0,17388 0,17388 0,17388 0,17388 0,17388
0,07128 0,08146 0,09727 0,05392 0,05392 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07920 0,07128 0,07128
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388
0,08568 0,10201 0,07990 0,07990 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,25679 0,22671 0,25702 0,28805 0,19813 0,06823 0,25702 0,25679 0,28805 0,25702 0,25702 0,25702 0,25702 0,25702 0,25702 0,25702 0,25702 0,25702 0,22671 0,25702
0,04030 0,08991 0,08991 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,09405 0,08568 0,08568
0,32144 0,28831 0,32058 0,35478 0,25800 0,00000 0,32058 0,32144 0,35478 0,32058 0,32058 0,32058 0,32058 0,32058 0,32058 0,32058 0,32058 0,32058 0,28831 0,32058 0,06823
0,09965 0,09965 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201
0,14545 0,17159 0,22735 0,32058 0,22737 0,29018 0,22735 0,28831 0,32058 0,22735 0,22735 0,22735 0,20101 0,20101 0,22735 0,22735 0,22735 0,22735 0,11882 0,22735 0,25679 0,29018
0,00000 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,08713 0,07990 0,07990
0,14545 0,17159 0,22735 0,32058 0,22737 0,29018 0,22735 0,28831 0,32058 0,22735 0,22735 0,22735 0,20101 0,20101 0,22735 0,22735 0,22735 0,22735 0,11882 0,22735 0,25679 0,29018 0,00000
0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,08713 0,07990 0,07990
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735
0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000
0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000
0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000
0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000
0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000
0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000
0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000
0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000
0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000
0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000
0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000
0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000
0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000
0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000
0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000
0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000
0,00000 0,02135 0,00000 0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000
0,02135 0,00000 0,00000
0,23227 0,20420 0,02223 0,09248 0,22671 0,32058 0,06988 0,11748 0,09248 0,02223 0,02223 0,02223 0,17388 0,17388 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,20420 0,02223 0,28929 0,32058 0,25861 0,25861 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223
0,02135 0,02135
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02223
0,00000
0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02223 0,00000
59
Tabla XVIII Matriz de distancias genticas pareadas K2P para la regin ITS2.
Distancia
1 AB115043ITS2P_citrinopileatus
2 AB286152ITS2P_eryngii_var_ferula
3 AB286153ITS2P_eryngii_var_ferula
4 AY265832ITS2P_floridanus
5 AY265851ITS2P_smithii
6 AY265852ITS2P_citrinopileatus
7 AY368665ITS2P_ostreatus
8 AY450345ITS2P_ostreatus
9 AY540327ITS2P_sapidus
10 AY540332ITS2P_ostreatus
11 DQ882570ITS2P_abalonus
12 DQ882571ITS2P_abalonus
13 DQ978222ITS2P_cystidiosus
14 EF514243ITS2P_pulmonarius
15 EF514244ITS2P_cystidiosus
16 EF514248ITS2P_ostreatus
17 EF514250ITS2P_tuberregium
18 EU424286ITS2P_ostreatus
19 EU424287ITS2P_djamor
20 EU424289ITS2P_djamor
21 EU424291ITS2P_dryinus
22 EU424300ITS2P_ostreatus
23 EU424316ITS2P_sapidus
24 EU622250ITS2P_ostreatus
25 EU622254ITS2P_ostreatus
26 FJ379271ITS2P_cornucopiae
27 FJ608594ITS2P_Florida
28 FJ810181ITS2P_sapidus
29 FN391585ITS2P_ostreatus
30 GU721058ITS2P_floridanus
31 GU7222811ITS2P_ostreatus
32 HM561980ITS2P_sapidus
33 HM590444ITS2P_ostreatus
34 P132
35 P3215a
36 P3215b
37 Posta
38 Postb
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
0,05687 0,05522 0,05378 0,04476 0,00000 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,04499 0,04415 0,04415 0,04761 0,04600 0,05378 0,06481 0,05378 0,03272 0,03272 0,04386 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,06128 0,05378 0,05598 0,06145 0,06497
0,20353
0,01528 0,01095 0,06812 0,05687 0,01095 0,01095 0,01095 0,01095 0,05443 0,05275 0,05275 0,02850 0,06789 0,01095 0,06260 0,01095 0,04747 0,04747 0,05686 0,01095 0,01095 0,01476 0,01476 0,01095 0,01476 0,01095 0,01095 0,01476 0,01095 0,01476 0,01476 0,02992 0,01095 0,01657 0,03023 0,03809
0,20159 0,02183
0,01027 0,06476 0,05522 0,01027 0,01027 0,01027 0,01027 0,05200 0,04766 0,04766 0,02777 0,06202 0,01027 0,05701 0,01027 0,04636 0,04636 0,05350 0,01027 0,01027 0,01460 0,01460 0,01027 0,01460 0,01027 0,01027 0,01460 0,01027 0,01460 0,01460 0,02919 0,01027 0,01550 0,02980 0,03679
0,18815 0,01087 0,01084
0,06382 0,05378 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,05054 0,04865 0,04865 0,02599 0,06325 0,00000 0,05889 0,00000 0,04487 0,04487 0,05247 0,00000 0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529
0,14595 0,25275 0,25002 0,23580
0,04476 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,03824 0,03550 0,03550 0,05460 0,04053 0,06382 0,06061 0,06382 0,04718 0,04718 0,04342 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,07207 0,06382 0,06708 0,07647 0,07427
0,00000 0,20353 0,20159 0,18815 0,14595
0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,04499 0,04415 0,04415 0,04761 0,04600 0,05378 0,06481 0,05378 0,03272 0,03272 0,04386 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,06128 0,05378 0,05598 0,06145 0,06497
0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815
0,00000 0,00000 0,00000 0,05054 0,04865 0,04865 0,02599 0,06325 0,00000 0,05889 0,00000 0,04487 0,04487 0,05247 0,00000 0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529
0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000
0,00000 0,00000 0,05054 0,04865 0,04865 0,02599 0,06325 0,00000 0,05889 0,00000 0,04487 0,04487 0,05247 0,00000 0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529
0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000
0,00000 0,05054 0,04865 0,04865 0,02599 0,06325 0,00000 0,05889 0,00000 0,04487 0,04487 0,05247 0,00000 0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529
0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000
0,05054 0,04865 0,04865 0,02599 0,06325 0,00000 0,05889 0,00000 0,04487 0,04487 0,05247 0,00000 0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529
0,14595 0,17691 0,17494 0,16198 0,10539 0,14595 0,16198 0,16198 0,16198 0,16198
0,02248 0,02248 0,04945 0,04463 0,05054 0,04957 0,05054 0,05053 0,05053 0,04389 0,05054 0,05054 0,05426 0,05426 0,05054 0,05426 0,05054 0,05054 0,05426 0,05054 0,05426 0,05426 0,06160 0,05054 0,05322 0,06225 0,05889
0,14595 0,17691 0,16024 0,16198 0,10539 0,14595 0,16198 0,16198 0,16198 0,16198 0,04497
0,00000 0,05200 0,04184 0,04865 0,05789 0,04865 0,04407 0,04407 0,04045 0,04865 0,04865 0,05192 0,05192 0,04865 0,05192 0,04865 0,04865 0,05192 0,04865 0,05192 0,05192 0,05377 0,04865 0,05171 0,06059 0,05808
0,14595 0,17691 0,16024 0,16198 0,10539 0,14595 0,16198 0,16198 0,16198 0,16198 0,04497 0,00000
0,05200 0,04184 0,04865 0,05789 0,04865 0,04407 0,04407 0,04045 0,04865 0,04865 0,05192 0,05192 0,04865 0,05192 0,04865 0,04865 0,05192 0,04865 0,05192 0,05192 0,05377 0,04865 0,05171 0,06059 0,05808
0,15872 0,06787 0,06756 0,05596 0,18815 0,15872 0,05596 0,05596 0,05596 0,05596 0,15872 0,17322 0,17322
0,05839 0,02599 0,05755 0,02599 0,03872 0,03872 0,05458 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,03975 0,02599 0,02815 0,04126 0,04616
0,15745 0,25906 0,22753 0,24151 0,13004 0,15745 0,24151 0,24151 0,24151 0,24151 0,14595 0,13206 0,13206 0,21941
0,06325 0,05532 0,06325 0,04180 0,04180 0,04677 0,06325 0,06325 0,06750 0,06750 0,06325 0,06750 0,06325 0,06325 0,06750 0,06325 0,06750 0,06750 0,07272 0,06325 0,06713 0,07716 0,07637
0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,16198 0,16198 0,16198 0,05596 0,24151
0,05889 0,00000 0,04487 0,04487 0,05247 0,00000 0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529
0,24757 0,24540 0,21530 0,22927 0,25992 0,24757 0,22927 0,22927 0,22927 0,22927 0,18499 0,23117 0,23117 0,22630 0,21530 0,22927
0,05889 0,06382 0,06382 0,04771 0,05889 0,05889 0,06220 0,06220 0,05889 0,06220 0,05889 0,05889 0,06220 0,05889 0,06220 0,06220 0,07171 0,05889 0,06317 0,06484 0,06728
0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,16198 0,16198 0,16198 0,05596 0,24151 0,00000 0,22927
0,04487 0,04487 0,05247 0,00000 0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529
0,09257 0,15872 0,15745 0,14464 0,16024 0,09257 0,14464 0,14464 0,14464 0,14464 0,17494 0,14595 0,14595 0,11761 0,14356 0,14464 0,25992 0,14464
0,00000 0,04501 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,05372 0,04487 0,04692 0,05366 0,06618
0,09257 0,15872 0,15745 0,14464 0,16024 0,09257 0,14464 0,14464 0,14464 0,14464 0,17494 0,14595 0,14595 0,11761 0,14356 0,14464 0,25992 0,14464 0,00000
0,04501 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,05372 0,04487 0,04692 0,05366 0,06618
0,14356 0,19229 0,19010 0,17691 0,15745 0,14356 0,17691 0,17691 0,17691 0,17691 0,14595 0,13206 0,13206 0,18815 0,16024 0,17691 0,18284 0,17691 0,15745 0,15745
0,05247 0,05247 0,05576 0,05576 0,05247 0,05576 0,05247 0,05247 0,05576 0,05247 0,05576 0,05576 0,05987 0,05247 0,05578 0,05392 0,05787
0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,16198 0,16198 0,16198 0,05596 0,24151 0,00000 0,22927 0,00000 0,14464 0,14464 0,17691
0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529
0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,16198 0,16198 0,16198 0,05596 0,24151 0,00000 0,22927 0,00000 0,14464 0,14464 0,17691 0,00000
0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529
0,18815 0,02198 0,02183 0,01087 0,23580 0,18815 0,01087 0,01087 0,01087 0,01087 0,17691 0,17691 0,17691 0,05596 0,25906 0,01087 0,24540 0,01087 0,14464 0,14464 0,19229 0,01087 0,01087
0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,02897 0,01031 0,01508 0,02970 0,03755
0,18815 0,02198 0,02183 0,01087 0,23580 0,18815 0,01087 0,01087 0,01087 0,01087 0,17691 0,17691 0,17691 0,05596 0,25906 0,01087 0,24540 0,01087 0,14464 0,14464 0,19229 0,01087 0,01087 0,00000
0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,02897 0,01031 0,01508 0,02970 0,03755
0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,16198 0,16198 0,16198 0,05596 0,24151 0,00000 0,22927 0,00000 0,14464 0,14464 0,17691 0,00000 0,00000 0,01087 0,01087
0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529
0,18815 0,02198 0,02183 0,01087 0,23580 0,18815 0,01087 0,01087 0,01087 0,01087 0,17691 0,17691 0,17691 0,05596 0,25906 0,01087 0,24540 0,01087 0,14464 0,14464 0,19229 0,01087 0,01087 0,00000 0,00000 0,01087
0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,02897 0,01031 0,01508 0,02970 0,03755
0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,16198 0,16198 0,16198 0,05596 0,24151 0,00000 0,22927 0,00000 0,14464 0,14464 0,17691 0,00000 0,00000 0,01087 0,01087 0,00000 0,01087
0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529
0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,16198 0,16198 0,16198 0,05596 0,24151 0,00000 0,22927 0,00000 0,14464 0,14464 0,17691 0,00000 0,00000 0,01087 0,01087 0,00000 0,01087 0,00000
0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529
0,18815 0,02198 0,02183 0,01087 0,23580 0,18815 0,01087 0,01087 0,01087 0,01087 0,17691 0,17691 0,17691 0,05596 0,25906 0,01087 0,24540 0,01087 0,14464 0,14464 0,19229 0,01087 0,01087 0,00000 0,00000 0,01087 0,00000 0,01087 0,01087
0,01031 0,00000 0,00000 0,02897 0,01031 0,01508 0,02970 0,03755
0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,16198 0,16198 0,16198 0,05596 0,24151 0,00000 0,22927 0,00000 0,14464 0,14464 0,17691 0,00000 0,00000 0,01087 0,01087 0,00000 0,01087 0,00000 0,00000 0,01087
0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529
0,18815 0,02198 0,02183 0,01087 0,23580 0,18815 0,01087 0,01087 0,01087 0,01087 0,17691 0,17691 0,17691 0,05596 0,25906 0,01087 0,24540 0,01087 0,14464 0,14464 0,19229 0,01087 0,01087 0,00000 0,00000 0,01087 0,00000 0,01087 0,01087 0,00000 0,01087
0,00000 0,02897 0,01031 0,01508 0,02970 0,03755
0,18815 0,02198 0,02183 0,01087 0,23580 0,18815 0,01087 0,01087 0,01087 0,01087 0,17691 0,17691 0,17691 0,05596 0,25906 0,01087 0,24540 0,01087 0,14464 0,14464 0,19229 0,01087 0,01087 0,00000 0,00000 0,01087 0,00000 0,01087 0,01087 0,00000 0,01087 0,00000
0,02897 0,01031 0,01508 0,02970 0,03755
0,24352 0,07937 0,07933 0,06746 0,29441 0,24352 0,06746 0,06746 0,06746 0,06746 0,23117 0,19991 0,19991 0,12893 0,30025 0,06746 0,32317 0,06746 0,19733 0,19733 0,23117 0,06746 0,06746 0,07937 0,07937 0,06746 0,07937 0,06746 0,06746 0,07937 0,06746 0,07937 0,07937
0,02686 0,02933 0,03309 0,04756
0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,16198 0,16198 0,16198 0,05596 0,24151 0,00000 0,22927 0,00000 0,14464 0,14464 0,17691 0,00000 0,00000 0,01087 0,01087 0,00000 0,01087 0,00000 0,00000 0,01087 0,00000 0,01087 0,01087 0,06746
0,01140 0,02734 0,03529
0,20353 0,02198 0,02183 0,01087 0,25275 0,20353 0,01087 0,01087 0,01087 0,01087 0,17691 0,17691 0,17691 0,06787 0,25906 0,01087 0,24540 0,01087 0,15872 0,15872 0,19229 0,01087 0,01087 0,02198 0,02198 0,01087 0,02198 0,01087 0,01087 0,02198 0,01087 0,02198 0,02198 0,07937 0,01087
0,03051 0,03809
0,24352 0,07937 0,07933 0,06746 0,31260 0,24352 0,06746 0,06746 0,06746 0,06746 0,23117 0,23117 0,23117 0,12893 0,31912 0,06746 0,27140 0,06746 0,19733 0,19733 0,19991 0,06746 0,06746 0,07937 0,07937 0,06746 0,07937 0,06746 0,06746 0,07937 0,06746 0,07937 0,07937 0,09156 0,06746 0,07937
0,04343
0,25992 0,11688 0,11639 0,10406 0,31260 0,25992 0,10406 0,10406 0,10406 0,10406 0,23117 0,23117 0,23117 0,16950 0,31912 0,10406 0,29197 0,10406 0,27687 0,27687 0,21530 0,10406 0,10406 0,11688 0,11688 0,10406 0,11688 0,10406 0,10406 0,11688 0,10406 0,11688 0,11688 0,18216 0,10406 0,11688 0,15475
60
(a)
(b)
Figura XX Clados de los arboles filogenticos de las regiones ITS1 y 5.8S (a) e ITS2 (b) construidos por el mtodo NJ-K2P- 1000 Bootstrap.
61
Una vez realizado el anlisis global de las estructuras secundarias para todas las secuencias,
se procedi bajo este mtodo comparativo de secuencias y estructuras homologas a inferir la
estructura segundaria completa de la regin ITS2 de la cepa P3215 obteniendo una estructura de
cuatro proyecciones o brazos (doble hlices auto complementarias), como muestra la figura XXII.
El anlisis de la cepa P3215 arroj coincidencias con un valor de e-value de 2,64 e-99 de las
cuales una perteneciente a la especie P. nebrodensis presentando una identidad de un 88,24 % y
85,71 % de las primeras 2 hlices, y 75,57% y 77,78% para la tercera y cuarta hlice respectivamente
(88,235 / 85,714 / 75,571 / 77,778). Las diez coincidencias restantes correspondieron a 5 P. ostreatus
con un e-value de 5,716 e-96, con porcentajes de 100 / 100 / 100 / 100 identidad como muestra la
tabla XX, corroborando la identidad de la cepa con respecto al anlisis filogentico de la regin ITS1.
Tabla XIX Motivos conservados 5.8S y 28S en la regin ITS2 del gnero Pleurotus
Especie
ID
Motivo 5.8S
Motivo 28S
P3215
GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA
TGACCTCAAATCGGGTAGGACTCCC
Post
GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA
P132
GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA
P. ostreatus
EF514248
GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA
TGACCTCAAATCAGGTAGGACTACC
P. djamor
AY265821
GAAGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA
TGACCTCAAATCAGGTAGGACTACC
P. pulmonarius
EF514243
GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA
TGACCTCAAATCAGGTAGGACTA
P. cystidiosus
EF514244
GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA
TGACCTCAAATCAGGTAGGA
P. citrinopileatus
AB115043
GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA
TGACCGCAAATCAGGTAGGACTACC
P. tuberregium
EF514250
GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA
TGACCTCAAATCAGGTAGGACTAC
P. eryngii
EU233990
GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA
El anlisis de estructuras secundarias del ITS2 ADNr se vio afectado debido a el posible
encuentro de secuencias mal anotadas, lo cual queda reflejado en la presencia de especies como P.
spodoleucus que pertenece actualmente al gnero Agaricus sp., pero la coincidencia con P. ostreatus
corrobor el estudio al patrn RFLP terico en que se le encontr relacin a esta cepa de estudio con
la especie P. ostreatus.
62
Figura XXI Motivos conservados 5.8S y 28S en la regin ITS2 del gnero Pleurotus
63
Tabla XX Coincidencias encontradas por comparacin de estructura secundaria ITS2 de la cepa P3215
(Pleurotus ostreatus var. florida).
ID
Especie
E-value
Modelo
EF470252
P. nebrodensis
1,203x 10-112
AY368663
P. floridanus
2,640x10-99
GU722281
P. ostreatus
3,416x10-98
AY265848
P. spodoleucus
1,228x10-97
EU424310
P. ostreatus
1,228x10-97
EU622256
P. ostreatus
5,716x10-96
FN391585
P. ostreatus
5,716x10-96
DQ077881.
Pleurotus
5,716x10-96
HM561980
P. sapidus
5,716x10-96
AY854077
P. ostreatus
2,056x10-95
Figura XXII Estructura secundaria de la secuencia ITS2 de la cepa P3215 (Pleurotus ostreatus var. florida).
64
CAPITULO VI
CONCLUSINES
Las caractersticas morfo-anatomicas permitieron clasificar a las cepas Post, P3215 y P132 en
el gnero Pleurotus.
En los medios PDA y ASD la temperatura de incubacin en el rango de 20 35 C, tiene poco
efecto sobre las tasas de crecimiento micelial de las cepas P3215, P132, Post y PRAL; no obstante,
afecto la produccin de biomasa dependiendo del medio de cultivo y de cada cepa.
Las diferencias en cuanto a las tasa de crecimiento y produccin de biomasa, cuando las
cepas fueron cultivadas en las mismas condiciones, indican que existe diferencias fisiologicas y
genticas entre ellas.
La tuza de maz resulto el mejor sustrato no convencional para el cultivo de las cepas Post y
P3215, siendo as una alternativa al sorgo para la produccin de semilla fngica o inoculo mayor.
Mediante las tcnicas moleculares se determino por anlisis filogentico de las regiones ITS1
e ITS2 del ADNr que las cepas Post, P3215 y P132 pertenecen a la especie P. ostreatus.
La tcnica de RFLP tericos a travs de la digestin virtual de las secuencias del regin ITS1,
5.8S a ITS2, corrobor el anlisis filogentico; logrando diferenciar e identificar correctamente las
especies del gnero Pleurotus utilizadas en este estudio, obteniendo los patrones de bandas
esperados. Adicionalmente, el patrn de bandas de la cepa Post de estudio permiti ubicarla en la
especie P.ostreatus. Por otro lado, los anlisis de la secuencia primaria y secundaria de la regin
ITS1 e ITS2 ubicaron las cepa P3215, P132 y Post de estudio dentro del clado de especies
estrechamente relacionadas P. ostreatus y P. floridanuss.
65
RECOMENDACIONES
Se requiere la constitucin de un mico-cepario de hongos comestibles del gneo Pleurotus spp., que
incluya cepas importadas y aislados autctonos; dicho material debe ser caracterizacin desde el punto de vista
morfologco y anatomico del micelio vegetativo y los cuerpos reproductivo, fisiologco evaluando su desarrollo
en diferentes medios de cultivo, a temperaturas, pH, luz y humedad; y identificacin molecular por medio de
diferentes marcadores moleculares a parte de la regin ITS 1, 5.8S e ITS2; buscando as la aplicabilidad
biotecnologca del cepario.
El anlisis filogentico de la regin ITS1 a ITS2 de las cepas del gnero Pleurotus presentes
en el Laboratorio de Biotecnologa de Microorganismos SIXTO DAVID ROJO, revelo una
incertidumbre para identificacin de especie, por lo cual se recomienda ampliar la recoleccin de
estos recursos genticos y repetir este tipo de anlisis junto a otros marcadores moleculares como el
gen del factor de elongacin de la traduccin 1 (EF1), los tres tipos de ARNr [18S (subunidad
pequea ARN-SSU), 5.8S y 28S (subunidad grande ARN-LSU)]; el de la ARN polimerasa II (RPB2)
para lograr una identificacin definitiva de las cepas de estudio, tal como lo sugieren varios autores
(Lutzoni et al.,2004; Marongiu et al., 2005; White et al.,1990), adems de evaluar el conocimiento
tradicional de estos en las comunidades y llevar a cabo pruebas de compatibilidad gentica con el
resto a los 15 grupos interestriles hasta ahora descritos para el gnero Pleurotus (Vilgalys et al.,
1996), lo cual confirmar la identidad del material aislado y evaluar la posibilidad de especies
genticamente aisladas e interestriles con el resto de los miembros de esta taxa, a partir del
concepto biolgico de especie.
El uso de las regiones ITSs ADNr no fueron suficientes para una identificacin definitiva entre
especies estrechamente relacionadas, por lo cual se concluye que es necesario la realizacin de
estudios adicionales de mtodos convencionales y diferentes marcadores moleculares para llegar a
una identificacin certera. Por ltimo, se recomienda la revisin de las especies estrechamente
relacionadas para lograr una correcta anotacin tanto de las secuencias como de las estructuras
secundarias que permitan una diferenciacin correcta entre estas especies, estableciendo lmites
claros entre ellas.
66
BIBLIOGRAFA
Abrmoff, M. D., Magalhes, P. J., & Ram, S. J. (2004). Image processing with ImageJ. Biophotonics
International, 11(7), 3642.
Ajith, T. A., & Janardhanan, K. K. (2007). Indian medicinal mushrooms as a source of antioxidant and
antitumor agents. Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition, 40(3), 157.
Argueta, J. (1983). Estudios de los macromicetos dela ciudad de Guatemala, Mixco y San Juan
Sacatepquez. (Tesis de Graduacin). Universidad de San Carlos de Guatemala, , Facultad
de Ciencias Qumicas y Farmacia, Guatemala:
Arora, D. (1986). Mushrooms Demystified (2nd ed.). Berkeley: Ten Speed Press.
Assigbetse, K., Fernandez., D., Dubois, M., & Geiger. (1994). Differentiation ofFusarium oxysporumf.
sp.vasinfectum races on cotton by random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis.
Phytopathology, 84, 622626.
Baldrian, P., & Gabriel, J. (2003). Lignocellulose degradation by Pleurotus ostreatus in the presence of
cadmium. FEMS Microbiology Letters, 220(2), 235240.
Bao, D., Ishihara, H., Mori, N., & Kitamoto, Y. (2004). Phylogenetic analysis of oyster mushrooms
(Pleurotus spp.) based on restriction fragment length polymorphisms of the 5 portion of 26S
rDNA. Journal of Wood Science, 50(2), 169176.
Bauer, R., Begerow, D., Sampaio, J., Wei, M., & Oberwinkler, F. (2006). The simple-septate
basidiomycetes: a synopsis. Mycological Progress, 5, 4166.
Bermdez, R., Morris, H., Donoso, C., Martinez, C., & Ramos, E. (2003). Influencia de la luz en la
calidad proteica de Pleurotus ostreatus, var. florida. Rev Cub Invest Biomed, 22, 22631.
Bolvar, F. (2004). Ingeniera gentica, herramientas moleculares y los mtodos para aislar,
caracterizar y manipular el DNA. In Fundamentos y casos exitosos de la biotecnologa
moderna. Mxico DF.: El Colegio Nacional.
Borrero, C. (2011). IDENTIFICACIN MOLECULAR DE UNA CEPA DE Candida sp. (TRABAJO DE
GRADO Presentado como requisito parcial Para optar a los titulos MICROBIOLOGA
INDUSTRIAL MICROBIOLOGA AGRICOLA VETERINARIA). PONTIFICIA UNIVERSIDAD
JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, Bogota.
Bunyard, B. A., Nicholson, M. S., & Royse, D. J. (1996). Phylogeny of the GenusAgaricusInferred from
Restriction Analysis of Enzymatically Amplified Ribosomal DNA. Fungal Genetics and Biology,
20(4), 243253.
Cabrera, J., Casas, F., Rojas, C., & Viveros, S. (1998). Alimentos en la naturaleza algunas plantas
comestibles, silvestres, arvenses y ruderales. Mxico, D.F.: SEMARNAP.
Cailleux, R., Diop, A., & Joly, P. (1981). Relations dinterfertilite entre quelques representants des
pleurotes des ombelliferes [Pleurotus, champignon comestible]. Bulletin Trimestriel de La
Societe Mycologique de France. Retrieved from http://agris.fao.org/agrissearch/search.do?recordID=FR19840079992
Camacho, B. (2009). Estudio morfomtrico-fractal de la bioestructura de Rhizopus oligosporus
durante sucrecimiento. (Tesis Doctoral en Ciencias en Alimentos.). Escuela Nacional de
Ciencias Biolgicas. Insituto Politcnico Nacional.
Cano, J., Aburto, R., & Ballesteros, J. (1997). Las Setas. Madrid: Penthalon Ediciones.
Chacn, S., Guzmn, G., Montoya, L., & Bandala, V. M. (1995). Gua ilustrada de los hongos del
Jardn Botnico Francisco Javier Clavijero de Xalapa, Veracruz y reas circunvecinas. Instituto
de Ecologa. Retrieved from http://www.sidalc.net/cgibin/wxis.exe/?IsisScript=sibe01.xis&method=post&formato=2&cantidad=1&expresion=mfn=01
0586
Chang, S., & Miles, P. (1989). Edible Mushrooms and their Cultivation. Florida. USA: CRC Press.
Boca Raton.
Chang, S.-T. (2008). Overview of mushroom cultivation and utilization as functional foods. Mushrooms
as Functional Foods, 133.
Chang, S. T., Lau, O. W., & Cho, K. Y. (1981). The cultivation and nutritional value of Pleurotus sajorcaju. European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, 12(1), 5862.
67
Ciardo, D. E., Lucke, K., Imhof, A., Bloemberg, G. V., & Bttger, E. C. (2010). Systematic internal
transcribed spacer sequence analysis for identification of clinical mold isolates in diagnostic
mycology: a 5-year study. Journal of Clinical Microbiology, 48(8), 28092813.
Croan, S. C. (2000). Conversion of wood waste into value-added products by edible and medicinal
Pleurotus (Fr.) P. Karst. species (Agaricales sl, Basidiomycetes). International Journal of
Medicinal Mushrooms, 2(1). Retrieved from
http://www.dl.begellhouse.com/journals/708ae68d64b17c52,684673684ea939cb,4fedbca922d
4e4b2.html
Danai, O., Olenik, I., Hadar, Y., Chet, I., & Levanon, D. (1998). The role of light in the morphogenesis
of Pleurotus ostreatus. J. Mush. Sci., 2, 3339.
Delgado-Fuentes, A., Villegas-Ros, M., & Cifuentes, J. B. (2005). Glosario ilustrado de los caracteres
macroscpicos en Basidiomycetes con himenio laminar. Facultad de Ciencias-FES Iztacala,
UNAM, Mxico.
Dellaporta, S. L., Wood, J., & Hicks, J. B. (1983). A plant DNA minipreparation: version II. Plant
Molecular Biology Reporter, 1(4), 1921.
Demeke, T., & Adams, R. P. (1992). The effects of plant polysaccharides and buffer additives on PCR.
Biotechniques, 12(3), 332334.
Dennis, R. (1970). Fungus flora of Venezuela and adjacent countries. Fungus flora of Venezuela and
adjacent countries. London.: Royar Botanic Gardens, Kew.
Derikx, P. J. L., Den Camp, H. O., Van Der Drift, C., Van Griensven, L., & Vogels, G. D. (1990).
Odorous sulfur compounds emitted during production of compost used as a substrate in
mushroom cultivation. Applied and Environmental Microbiology, 56(1), 176180.
Do, N., & Adams, R. P. (1991). A simple technique for removing plant polysaccharide contaminants
from DNA. BioTechniques, 10(2), 162164.
Edgar, R. C. (2004). MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput.
Nucleic Acids Research, 32(5), 17921797.
Eger, G., Gottwald, H., & Von-Netzer, U. (1974). The action of light and other factors on sporophore
initiation in Pleurotus ostreatus. Mushroom Science, 9, 575583.
Eger, G., Li, S. fong, & Leal-Lara, H. (1979). Contribution to the discussion on the species concept in
the Pleurotus ostreatus complex. Mycologia, 577588.
Fasidi, I. O., Kadiri, M., Jonathan, S. G., Adenipekun, C. O., & Kuforiji, O. O. (2008). Cultivation of
tropical mushrooms. Ibadan: Ibadan University Press 81pp.
Fennema, O. (2000). Qumica de los alimentos (Segunda Edicin). Zaragoza, Espaa.: Editorial
Acribia S.A.
Field, A. (2013). Discovering statistics using IBM SPSS statistics. Sage. Retrieved from
https://books.google.co.ve/books?hl=es&lr=&id=c0Wk9IuBmAoC&oi=fnd&pg=PP2&dq=Field,+
A.+(2013).+Discovering+statistics+using+IBM+SPSS+statistics.+Sage.&ots=LaCnHJYB5A&si
g=h_QH8MEJgRSgMNqIX066m0Ouqpo
Friel, M. T., & McLoughlin, A. J. (2000). Production of a liquid inoculum/spawn of Agaricus bisporus.
Biotechnology Letters, 22(5), 351354.
Gaitn, R., Salmones, D., Merlo, P., & Mata, G. (2002). Manual prctico del cultivo de setas:
aislamiento, siembra y produccin. Xalapa, Mxico: Instituto de Ecologa.
Gasteiger, E., Gattiker, A., Hoogland, C., Ivanyi, I., Appel, R. D., & Bairoch, A. (2003). ExPASy: the
proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research,
31(13), 37843788.
Gonzalez, P., & Labarre, J. (2000). Phylogenetic relationships of Pleurotus species according to the
sequence and secondary structure of the mitochondrial small-subunit rRNA V4, V6 and V9
domains. Microbiology, 146(1), 209221.
Graham., G., Mayers, P., & Henry, R. (1994). A simplified method for the preparation of fungal
genomic DNA for PCR and RAPD analysis. Biotechniques, 16, 4850.
Gregori, A., vagelj, M., & Pohleven, J. (2007). Cultivation techniques and medicinal properties of
Pleurotus spp. Food Technology and Biotechnology, 45(3), 238249.
Griffin, D. (1972). Ecology of soil fungi. USA: John Wiley and Sons, 2843.
68
Grodznskaya, A., Infante, D., & Piven, N. (2002). Cultivo de hongos comestibles utilizando desechos
agrcolas e industriales. Agronoma Tropical, 52(4), 427447.
Guillemaut, P., & Marchal-Drouard, L. (1992). Isolation of plant DNA: A fast, inexpensive, and reliable
method. Plant Molecular Biology Reporter, 10(1), 6065.
Guilln-Navarro, G. K., Mrquez-Rocha, F. J., & Sanchez-Vzquez, J. E. (1998). Produccin de
biomasa y enzimas ligninolticas por Pleurotus ostreatus en cultivo sumergido. Rev. Iberoam.
Micol, 15, 302306.
Guo, H. D., Wan, L. Z., Huang, C. Y., Yu, Y. C., Zhang, B. S., & Shan, H. T. (2006). Effect of
nutritional parameters and temperature on the growth of Pleurotus nebrodensis mycelium, and
an optimized cultivation method. Acta Edulis Fungi, 13, 7173.
Guzmn, G. (1990). Identificacin de los hongos comestibles, venenosos, alucinantes y destructores
de la madera (2ed. ed.). Mxico: Limusa.
Guzmn, G. (1998). Anlisis cualitativo y cuantitativo de la diversidad de los hongos de Mxico.
(Ensayo sobre el inventario fngico del pas). La Diversidad Biolgica de Iberoamrica, II
Volumen Especial, 111175.
Guzmn, G., Mata, G., Salmones, D., Soto-Velazco, C., & Guzmn-Dvalos, L. (1993). El cultivo de
los hongos comestibles: con especial atencin a especies tropicales y subtropicales en
esquilmos y residuos agro-industriales. Instituto Politcnico Nacional. Retrieved from
http://www.sidalc.net/cgibin/wxis.exe/?IsisScript=SIBE01.xis&method=post&formato=2&cantidad=1&expresion=mfn=00
6660
Hammel, K. E. (1997). Fungal degradation of lignin. Driven by Nature: Plant Litter Quality and
Decomposition, 3345.
Hernndez, D., Mata, G., & Andreu, L. G. I. (2002). Cambios en la produccin de lacasa por el hongo
Pleurotus pulmonarius (Fr.) Qul. cultivado en pulpa de caf en confrontacin con
Trichoderma viride Pers., un moho contaminante. Foresta Veracruzana, 4(1), 4752.
Hernndez, R., & Lpez, C. (2006). Evaluacin del crecimiento y produccin de Pleurotus ostreatus
sobre diferentes residuos agroindustriales del departamento de Cundinamarca (TRABAJO DE
GRADO Presentado como requisito parcial para optar al titulo de MICROBILOGO
INDUSTRIAL). Microbiologa Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias.
Departamento Microbiologa, Bogot D. C.
Hesseltine, C. (1977). Solid-state fermentation. Process Biochem, 12, 2224.
Hesseltine, C. W. (1972). Biotechnology report: solid state fermentations. Biotechnology and
Bioengineering, 14(4), 517532.
Holmes, G. J., Eckert, J. W., & Pitt, J. I. (1994). Revised description of Penicillium ulaiense and its role
as a pathogen of citrus fruits. Phytopathology, 84(7), 719727.
Iturriaga, T., & Minter, D. W. (2006). Hongos de Venezuela. Proyecto Hongos del Caribe (1998-2001).
Jackson, R. B. (2010). Campbell Biology. Pearson Benjamin Cummings, San. Retrieved from
http://textbooks-make-you-smart.info/wpcontent/uploads/pdfs/Campbell%20Biology%209th%20Edition%20by%20Robert%20B%20Jac
kson%20-%205%20Star%20Review.pdf
James, T. Y., Liou, S.-R., & Vilgalys, R. (2004). The genetic structure and diversity of the A and B
mating-type genes from the tropical oyster mushroom, Pleurotus djamor. Fungal Genetics and
Biology, 41(8), 813825.
Johnson, M., Zaretskaya, I., Raytselis, Y., Merezhuk, Y., McGinnis, S., & Madden, T. L. (2008). NCBI
BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research, 36(suppl 2), W5W9.
Kim, B.-G., Shin, P.-G., Jeong, M.-J., Park, S.-C., Yoo, Y.-B., Ryu, J.-C., & Kwon, S.-T. (1997).
Isolation and Sequencing of the cDNA Encoding $${$$\backslash$ beta$}$-tubulin $ from
Pleurotus sajor-caju. The Korean Journal of Mycology, 25(1), 15.
Kim, B.-G., Yoo, Y.-B., KwoN, S.-T., & Magae, Y. (2001). Molecular Characterization of -tubulin gene
from Pleurotus sajor-caju. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 65(10), 22802283.
Kirk, P. M., Cannon, P. F., Minter, D., & Stalpers, J. (2008). Ainsworth & Bisbys dictionary of the fungi
(10th ed.). Wallingford: CABI Publishing.
69
Koetschan, C., Frster, F., Keller, A., Schleicher, T., Ruderisch, B., Schwarz, R., Schultz, J. (2010).
The ITS2 Database IIIsequences and structures for phylogeny. Nucleic Acids Research,
38(suppl 1), D275D279.
Kohn, L. M. (1992). Developing new characters for fungal systematics: an experimental approach for
determining the rank of resolution. Mycologia, 139153.
Koltin, Y., Stamberg, J., & Lemke, P. A. (1972). Genetic structure and evolution of the incompatibility
factors in higher fungi. Bacteriological Reviews, 36(2), 156.
Kong, W.-S. (2005). Descriptions of commercially important Pleurotus species. In Mushroom Growers
Handbook 1: Oyster Mushroom Cultivation. (Vol. 1, pp. 5461). Repblica de Korea:
MushWorld.
Kumari, D., & Achal, V. (2008). Effect of different substrates on the production and non-enzymatic
antioxidant activity of Pleurotus ostreatus (Oyster mushroom). Life Sci. J, 5(3), 7376.
Kumar, S., Nei, M., Dudley, J., & Tamura, K. (2008). MEGA: a biologist-centric software for
evolutionary analysis of DNA and protein sequences. Briefings in Bioinformatics, 9(4), 299
306.
Kummer, P. (1871). Der fhrer in die pilzkunde. Zerbst.
Lacourt, I., Duplessis, S., Abb, S., Bonfante, P., & Martin, F. (2002). Isolation and characterization of
differentially expressed genes in the mycelium and fruit body of Tuber borchii. Applied and
Environmental Microbiology, 68(9), 45744582.
Largent, D. L., Johnson, D., & Watling, R. (1977). How to Identify Mushrooms to Genus III:
Microscopic Features. Eureka, Calif: Mad River Press.
Largent, D., & Stuntz, D. (1977). How to identify mushrooms to genus I: Macroscopic Features. U.S.:
Mad River Press, Eureka.
Larraya, L. M., Prez, G., Iribarren, I., Blanco, J. A., Alfonso, M., Pisabarro, A. G., & Ram rez, L.
(2001). Relationship between monokaryotic growth rate and mating type in the edible
basidiomycete Pleurotus ostreatus. Applied and Environmental Microbiology, 67(8), 3385
3390.
Larraya, L., Peas, M. M., Prez, G., Santos, C., Ritter, E., Pisabarro, A. G., & Ramrez, L. (1999).
Identification of incompatibility alleles and characterisation of molecular markers genetically
linked to the A incompatibility locus in the white rot fungus Pleurotus ostreatus. Current
Genetics, 34(6), 486493.
Laso, T. (1996). The Mushroom Book. U.S:A.: USA: DK publishing book.
Lee, S. B. (1990). Isolation of DNA from fungal mycelia and single spores. PCR Protocols, a Guide to
Methods and Applications, 282287.
Lee, S.-H., Kim, B.-G., Kim, K.-J., Lee, J.-S., Yun, D.-W., Hahn, J.-H., Kwon, S.-T., others. (2002).
Comparative analysis of sequences expressed during the liquid-cultured mycelia and fruit body
stages of Pleurotus ostreatus. Fungal Genetics and Biology, 35(2), 115134.
Lilly, V. G., & Barnett, H. L. (1951). Physiology of the Fungi. Physiology of the Fungi. Retrieved from
http://www.cabdirect.org/abstracts/19521603587.html
Liu, Y. J., Whelen, S., & Hall, B. D. (1999). Phylogenetic relationships among ascomycetes: evidence
from an RNA polymerse II subunit. Molecular Biology and Evolution, 16(12), 17991808.
Lpez, A., & Garca, J. (2004). Estructura del Pleuroma. Instituto de Gentica Forestal Universidad
Veracruzana.
Lpez, A., & Garca, J. (2009). Pleurotus levis Agaricales: Lentinaceae. Funga Veracruzana, 103, 14.
Lpez, J. M., & Jensen, H. J. (2002). Generic model of morphological changes in growing colonies of
fungi. Physical Review E, 65(2), 021903.
Lpez-Rodrguez, C., Hernndez-Corredor, R., Surez-Franco, C., & Borrero, M. (2008). Evaluacin
del crecimiento y produccin de Pleurotus ostreatus sobre diferentes residuos agroindustriales
del departamento de Cundinamarca. Universitas Scientiarum, 13(2), 128137.
Lutzoni, F., Kauff, F., Cox, C. J., McLaughlin, D., Celio, G., Dentinger, B., Baloch, E., others.
(2004). Assembling the fungal tree of life: progress, classification, and evolution of subcellular
traits. American Journal of Botany, 91(10), 14461480.
70
Maarek, Y. S., Jacovi, M., Shtalhaim, M., Ur, S., Zernik, D., & Ben-Shaul, I. Z. (1997). WebCutter: a
system for dynamic and tailorable site mapping. Computer Networks and ISDN Systems,
29(8), 12691279.
Madigan, M. T., Martinko, J. M., Dunlap, P. V., & Clark, D. P. (2008). Brock Biology of microorganisms
12th edn. International Microbiology, 11, 6573.
Malloch, D. W., Pirozynski, K. A., & Raven, P. H. (1980). Ecological and evolutionary significance of
mycorrhizal symbioses in vascular plants (a review). Proceedings of the National Academy of
Sciences, 77(4), 21132118.
Maniatis, T., Fritsch, E. F., & Sambrook, J. (1982). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold
Spring Harbor Laboratory.
Marino, R. H., Eira, A. F. da, Kuramae, E. E., & Queiroz, E. C. (2003). Morphomolecular
characterization of Pleurotus ostreatus (Jacq. Fr.) kummer strains in relation to luminosity and
temperature of frutification. Scientia Agricola, 60(3), 531535.
Marongiu, P., Maddau, L., Frisullo, S., & Marras, F. (2005). A multigene approach for the taxonomic
determination of Pleurotus eryngii isolates. Mushroom Biology and Mushroom Products.
Shanghai Xinhua Printing Co., Ltd., Shanghai, China, 8991.
Mrquez-Araque, A. T., Mendoza Martnez, G. D., Gonzlez Muoz, S. S., Buntinx Dios, S. E., &
Loera Corral, O. (2007). Actividad fibroltica de enzimas producidas por Trametes sp. EUM1,
Pleurotus ostreatus IE8 y Aspergillus niger AD96. 4 en fermentacin slida. Interciencia,
32(11), 780785.
Marquez-Rocha, F. J., Guilln, G. K., Snchez, J. E., & Vazquez-Duhalt, R. (1999). Growth
characteristics of Pleurotus ostreatus in bioreactors. Biotechnology Techniques, 13(1), 2932.
Martin, P., Muruke, M., Hosea, K., Kivaisi, A., Zerwas, N., & Bauerle, C. (2004). A rapid PCR-RFLP
method for monitoring genetic variation among commercial mushroom species*. Biochemistry
and Molecular Biology Education, 32(6), 390394.
Matheny, P. B. (2005). Improving phylogenetic inference of mushrooms with RPB1 and RPB2
nucleotide sequences (Inocybe; Agaricales). Molecular Phylogenetics and Evolution, 35(1), 1
20.
Matsuo, T., Yamamoto, Y., Muraguchi, H., & Kamada, T. (1999). Effects of amino-acid substitutions in
tubulin on benomyl sensitivity and microtubule functions inCoprinus cinereus. Mycoscience,
40(3), 241249.
Matsuura, S. (2000). Random growth of fungal colony model on diffusive and non-diffusive media.
School of High-Technology for Human Welfare, Tokai University, Forma, 15, 309319.
Matsuura, S. (2002). Colony patterning and collective hyphal growth of filamentous fungi. Physica A:
Statistical Mechanics and Its Applications, 315(1), 125136.
Mier, T., Toriello, C., & Ulloa, M. (2002). Hongos microscpicos saprobios y parsitos. UNAM.
Retrieved from
https://books.google.co.ve/books?hl=es&lr=&id=UD30RosdJSEC&oi=fnd&pg=PA47&dq=Hong
os+microsc%C3%B3picos+saprobios+y+par%C3%A1sitos&ots=XcPRgNdP6b&sig=k4kVyhpP
aMPQFCPz11DMab8xMsA
Miles, P. G., & Chang, S. (1997). Mushroom biology: concise basics and current developments. World
Scientific.
Miles, P. G., & Chang, S.-T. (2004). Mushrooms: cultivation, nutritional value, medicinal effect, and
environmental impact. CRC press.
Miro, N. (2004). Actividades Exocelulares Producidas por Phanerochaete chrysosporium, Trametes
elegans y Pleurotus sp. en Bagazo de Caa y Corteza de Pino. (TRABAJO DE GRADO para
obtar el titulo de Licenciado en Biologa). Universidad de los Andes, Venezuela.
Moore-Landecker, E. (1996). Fundamentals of the Fungi (4 edition). Upper Saddle River, N.J:
Benjamin Cummings.
Morillo, O., Guerrero, B., Toro, J., Castaeda, R., Garca, P., Cuervo, W., & Torres, Y. (2012).
Evaluacin de la eficiencia biolgica de Pleurotus ostreatus en hoja de caa y tuza de maz.
Observador Del Conocimiento, 2, 213221.
71
Murcia, M. A., Martnez-Tom, M., Jimnez, A. M., Vera, A. M., Honrubia, M., & Parras, P. (2002).
Antioxidant activity of edible fungi (truffles and mushrooms): losses during industrial
processing. Journal of Food Protection, 65(10), 16141622.
Murria, M., & Thompson. (1980). Rapad isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acid
Res., 7, 18691885.
Nilsson, R. H., Veldre, V., Hartmann, M., Unterseher, M., Amend, A., Bergsten, J., Abarenkov, K.
(2010). An open source software package for automated extraction of ITS1 and ITS2 from
fungal ITS sequences for use in high-throughput community assays and molecular ecology.
Fungal Ecology, 3(4), 284287.
Odds, F. C. (1991). Sabouraud (s) agar. Medical Mycology, 29(6), 355359.
Ohira, I. (1990). A revision of the taxonomic status of Pleurotus citrinopileatus. Rep. Tottori Mycol.
Inst., 28, 143150.
Pandey, A. (1992). Recent process developments in solid-state fermentation. Process Biochemistry,
27(2), 109117.
Pandey, R. N., Adams, R. P., & Flournoy, L. E. (1996). Inhibition of random amplified polymorphic
DNAs (RAPDs) by plant polysaccharides. Plant Molecular Biology Reporter, 14(1), 1722.
Parlad Izquierdo, X., Girbal i Llad, J., & lvarez Fernndez, I., others. (2011). Tcnicas de
inoculacin de abeto de Douglas (Pseudotsuga menziesi (Mirb.) Franco) con los hongos
Ectomicorrcicos y su aplicacin en reforestacin. Universitat Autnoma de Barcelona,.
Retrieved from http://ddd.uab.cat/record/99248
Parmasto, E. (1987). Pleurotus citrinopileatus, one of the favourites. Mycologist, 1.
Perna, B., Demey, J. R., Inojosa, Y., & Naranjo-Briceo, L. (2012). Biodiversidad y potencial
hidrocarbonoclstico de hongos aislados de crudo y sus derivados: Un meta-anlisis. Rev
Latinoam Biotecnol Amb Algal, 3(1), 140.
Petersen, R. H., Hughes, K. W., & Psurtseva, N. (2006). Biological species in Pleurotus. Retrieved
from the University of Tennessee. Retrieved from
http://www.bio.utk.edu/mycology/Pleurotus/literature_cited.htm
Phillips, R. (1991). Mushrooms of North America. Little Brown and Company. Boston, Toronto,
London: Little Brown and Company.
Piccoli, L., Bojanich, M., Lpez, M., & Sosa, M. (2010). Guia de Trabajos Prcticos de Micologa.
Argentina: Universidad Nacional Del Nordeste Facultad De Ciencias Exactas Y Naturales Y
Agrimensura.Departamento de Bioqumica.
Pointing, S. (2001). Feasibility of bioremediation by white-rot fungi. Applied Microbiology and
Biotechnology, 57(1-2), 2033.
Potter, N., & Hotchkiss, J. (1995). Ciencia de los alimentos. Zaragoza, Espaa: Editorial Acribia S.A.
Ramrez, L., Larraya, L. M., & Pisabarro, A. G. (2010). Molecular tools for breeding basidiomycetes.
International Microbiology, 3(3), 147152.
Raper, J. R. (1966). Genetics of sexuality in higher fungi. Genetics of Sexuality in Higher Fungi.
Ronald Press Company, New York. Retrieved from
http://www.cabdirect.org/abstracts/19671603466.html
Rodriguez, A. (2008). Molecular phylogeny and increases of yield and the antioxidants selenium and
ergothioneine in Basidiomata of Pleurotus eryngii. (Ph.D. dissertation). The Pennsylvania State
University.
Rodriguez, G. (2007). Cultivo de hongos comestibles., 52, 1015.
Roussos, S., Bresson, E., Saucedo-Castaeda, G., Martinez, P., Guinberteau, J., & Olivier, J. M.
(1997). Production of mycelial cell inoculum of Pleurotus opuntiae on natural support in solid
state fermentation. In Advances in Solid State Fermentation (pp. 483500). Springer. Retrieved
from http://link.springer.com/10.1007/978-94-017-0661-2_40
Russo, P., Juuti, J. T., & Raudaskoski, M. (1992). Cloning, sequence and expression of a -tubulinencoding gene in the homobasidiomycete Schizophyllum commune. Gene, 119(2), 175182.
Saghai-Maroof, M. A., Soliman, K. M., Jorgensen, R. A., & Allard, R. W. (1984). Ribosomal DNA
spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location, and
population dynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences, 81(24), 80148018.
72
Sambrook, J., Fritsch, E. F., & Maniatis, T. (1989). Molecular cloning (Vol. 2). Cold spring harbor
laboratory press New York. Retrieved from http://nhjy.hzau.edu.cn/kech/jycz/jczs/mlintroduction/Content.pdf
Snchez, E. (1994). Produccin de hongos comestibles. Mxico: Centro de Investigaciones
Ecolgicas del Sureste.
Snchez, J. E., & Royse, D. J. (2001). La biologa y el cultivo de Pleurotus spp. ECOSUR/LIMUSA.
Schultz, J., Mller, T., Achtziger, M., Seibel, P. N., Dandekar, T., & Wolf, M. (2006). The internal
transcribed spacer 2 databasea web server for (not only) low level phylogenetic analyses.
Nucleic Acids Research, 34(suppl 2), W704W707.
Selegean, M., Putz, M. V., & Rugea, T. (2009). Effect of the polysaccharide extract from the edible
mushroom Pleurotus ostreatus against infectious bursal disease virus. International Journal of
Molecular Sciences, 10(8), 36163634.
Selig, C., Wolf, M., Mller, T., Dandekar, T., & Schultz, J. (2008). The ITS2 Database II: homology
modelling RNA structure for molecular systematics. Nucleic Acids Research, 36(suppl 1),
D377D380.
Sihuanca, A. (2011). Desarrollo de un proceso biotecnolgico para la produccin de
variedadesespeciales de hongos comestibles (Pleurotus, Lentinula, Hypsizygus), empleando
bagazo de caa de azcar y otros subproductos agrcolas y forestales como sustrato de
cultivo (Tesis Doctoral en Ciencias). Institucin de Enseanza e Investigacin de Cienias
Agrcolas, Mxico, Puebla.
Singer, R. (1951). The Agaricales (mushrooms) in modern taxonomy. Liloa.
Singer, R. (1986). Agaricales in modern taxonomy. Koeltz Scientific Books. Retrieved from
http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201300626140
Smith, J. E., Rowan, N. J., & Sullivan, R. (2002). Medicinal mushrooms: a rapidly developing area of
biotechnology for cancer therapy and other bioactivities. Biotechnology Letters, 24(22), 1839
1845.
Sobal, M., Morales, P., & Martnez-Carrera, D. (1989). Efecto del pH sobre el crecimiento de diversas
cepas mexicanas y extranjeras de hongos comestibles en el laboratorio. Micol. Neotrop. Apl, 2,
1939.
Soddell, F., Seviour, R., & Soddell, J. (1994). Using Lindenmayer systems to investigate how
filamentous fungi may produce round colonies. Complex Systems: Mechanism of Adaptation,
61.
Stamets, P. (2000). Growing gourmet and medicinal mushrooms (Vol. 3). Ten Speed Press Berkeley.
Retrieved from
http://gribodel.ru/biblioteka/proizv_vesh/problemy_kultivirovanija_i_ikh_reshenija.pdf
Sunagawa, M., & Magae, Y. (2005). Isolation of genes differentially expressed during the fruit body
development of Pleurotus ostreatus by differential display of RAPD. FEMS Microbiology
Letters, 246(2), 279284.
Tan, K. (1977). Ligth-induced fungal development. In The filamentous fungi III (III, pp. 334357).
U.S.A.
Torres, M., & Hurtado, A. (2003). (2003). Potencial de la microbiota nativa comestible y medicinal en
el municipio de Quibd. (Trabajo de grado. Bilogo con nfasis en recursos naturales). acultad
de Ciencias. Universidad Tecnolgica del Choc., Quibd, Choc.
Trinci, A. P. J. (1969). A kinetic study of the growth of Aspergillus nidulans and other fungi. Journal of
General Microbiology, 57(1), 1124.
Trinci, A. P. J. (1971). Influence of the width of the peripheral growth zone on the radial growth rate of
fungal colonies on solid media. Journal of General Microbiology, 67(3), 325344.
Trinci, A. P. J. (1974). A study of the kinetics of hyphal extension and branch initiation of fungal
mycelia. Journal of General Microbiology, 81(1), 225236.
Valencia del Toro, G. (2002). Estudios sobre la expresin del color de los esporforos de Pleurotus
spp. por apareamiento de neohaplontes compatibles y progenies monospricas. Tesis de
doctorado. UNAM. Mxico, DF.
Vilgalys, R., Moncalvo, J.-M., Liou, S.-R., & Volovsek, M. (1996). Recent advances in molecular
systematics of the genus Pleurotus. Mushroom Biology and Mushroom Products, 91101.
73
Vilgalys, R., & Sun, B. L. (1994). Ancient and recent patterns of geographic speciation in the oyster
mushroom Pleurotus revealed by phylogenetic analysis of ribosomal DNA sequences.
Proceedings of the National Academy of Sciences, 91(10), 45994603.
Vincze, T., Posfai, J., & Roberts, R. J. (2003). NEBcutter: a program to cleave DNA with restriction
enzymes. Nucleic Acids Research, 31(13), 36883691.
Wasser, S. (2002). Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating
polysaccharides. Applied Microbiology and Biotechnology, 60(3), 258274.
Wendland, J., & Kothe, E. (1997). Isolation of tef1 encoding translation elongation factor EF1 [alpha]
from the homobasidiomycete Schizophyllum commune. Mycological Research, 101(07), 798
802.
Yang, F.-C., & Liau, C.-B. (1998). The influence of environmental conditions on polysaccharide
formation by Ganoderma lucidum in submerged cultures. Process Biochemistry, 33(5), 547
553.
Yang, H., King, R., Reichl, U., & Gilles, E. D. (1992). Mathematical model for apical growth, septation,
and branching of mycelial microorganisms. Biotechnology and Bioengineering, 39(1), 4958.
Yildiz, S., Gezer, E. D., Yildiz, ., Temiz, A., & Dizman, E. (2006). Effects of different substrate
combinations on mycelial growth of Pleurotus ostreatus. In Proceedings of the Fifth
International Conference on Mushroom Biology and Mushroom Products (p. 551).
Zadrazil, F. (1978). Cultivation of Pleurotus. In The biology and cultivation of edible mushrooms (pp.
521557). New York: Edit. Academic Press.
Zaidman, B.-Z., Yassin, M., Mahajna, J., & Wasser, S. P. (2005). Medicinal mushroom modulators of
molecular targets as cancer therapeutics. Applied Microbiology and Biotechnology, 67(4), 453
468.
Zervakis, G. I., Moncalvo, J.-M., & Vilgalys, R. (2004). Molecular phylogeny, biogeography and
speciation of the mushroom species Pleurotus cystidiosus and allied taxa. Microbiology,
150(3), 715726.
Zervakis, G. I., Venturella, G., & Papadopoulou, K. (2001). Genetic polymorphism and taxonomic
infrastructure of the Pleurotus eryngii species-complex as determined by RAPD analysis,
isozyme profiles and ecomorphological characters. Microbiology, 147(11), 31833194.
Zervakis, G., Philippoussis, A., Ioannidou, S., & Diamantopoulou, P. (2001). Mycelium growth kinetics
and optimal temperature conditions for the cultivation of edible mushroom species on
lignocellulosic substrates. Folia Microbiologica, 46(3), 231234.
Zervakis, G., Sourdis, J., & Balis, C. (1994). Genetic variability and systematics of eleven Pleurotus
species based on isozyme analysis. Mycological Research, 98(3), 329341.
Zolan, M. E., & Pukkila, P. J. (1986). Inheritance of DNA methylation in Coprinus cinereus. Molecular
and Cellular Biology, 6(1), 195200.
74
ANEXOS
Anexo 1 Key to identify Mushrooms to genus using only macroscopic features (Largent, 1986).
In this key, only characteristics of mushrooms that can be seen with the unaided eye or with a hand
lens are used. Since this key is based only on macroscopic features, you many not be able to identify
correctly all genera of mushrooms you study ( Langent, 1986).
1. Sporocarp not growing on other mushrooms6
6. Undersurface of pileus with normal, blade-like gills...10
10. Pileus with definite stipe that may be central, eccentric, or (rarely) even lateral21
10. Pileus sessile; laterally attached and sheving, or attached by a short lateral tubercle or
"pseudostipe", or basally attached and funnel-shaped or spatulate (pleurotoid habit)11
11. Spores not as above.13
13. Spores white to pale yellowish or cream-colored, or (rarely) pale dingy lilac15
15. Gills not split along their edges and rolled back laterally16
16. Gills narrow or broad, but not strongly crisped or sinuos; pileal thickness varies, but if thin enoufgh
to be membranous it is also soft and fleshy17
17. Pileus varying in consistency from soft and pulpy to pliable and leathery, but not corky; gills not
tough and leathery...19
19. Edges of gills entire20
20. Pileus soft and pulpy or fleshy Pleurotus
21. Gills not deliquescent23
23. Stipe when broken or split lengthwise showing evidence of fibrous context25
25. Volva not present..31
31.Annulus absent; however, a cortina may be present51
51. Gills attached.58
58. Flesh of mature pilei soft and pulpy to soft-fibrous, or very fragile (not reviving when moidtened
after having been dried); spores white, parle yellowish, or some other color61
61 stipe central, or nearly so65
61. Stipe definitely and consistenly escentric, sometimes almost lateral62
62. Spores white to pale yeloowish or cream-colored, or pallid lilacPleurotus
65. Gills variously attached, but neither adnate-subdecurrent not decurrent.77
77. Stipe stouter than the above, usually 5 mm or more thick, fleshyfibrous and soft, or pulpy, or with a
firm cartilaginou " rind" and soft interior; pileal fleh ordinarily at least 3-5 mm thick at the center , rarely
thin enough to be called membranous................91
91.Spores white to pale cream-colored (rarely cream-colored with a faint pinkish tinge) to pale pink, or
salomon-pink, dingy salmon, to brownish-salmon..92
92. Gills thin, usually close or crowded, rarely subdistant, and not waxy-appearing96
96. Spore wite to cream-colored to pale pink, al times cream-colored with a faint pinkish tinge; mature
gills not pink from the spores.97
97. Not as above..98
98. Carpophore growing out of cones or growing oud of decaying wood (i.e.lignicolous)...99
99.Carpophore on cones or on decaying wood; gills not completely sterile (some especies of
Pleurotus)
75
Keys abound for limited groups (Vilgalys et al., 1993, for the P. ostreatus complex) or of limited
accuracy (Pilt, 1935; Khner and Romagnesi, 1953; Hilber, 1982, 1993, 1997).
To devise a key to this group is fraught with problems, for basidiome colors, hosts, and stature often
intergrade, and geographical distribution is often wide and therefore creates overlaps. Especially
vexing is the separation of Pleurotus pulmonarius from its sister monomitic, pleurotoid species, P.
ostreatus and P. populinus. With these problems in mind, the following key to biological species is
offered.
1. Anamorphic spores produced on basidiomata or associated vegetative mycelium................ 2
1. Anamorphic spores, if formed, not associated with basidiomata ........... 4
2. Anamorphic state a lawn of simple conidiophores producing black arthrospores, dry initially but later
slimy; Australa, New Zeald.............................................................. P. australis
2. Anamorph coremioid, with black, slimy heads of arthrospores............ 3
3. Pileus pale tan to brown; distribution roughly pantropical....... P. cystidiosus
3. Pileus deep olive, olive-black, occasionally with purplish tints; New Zealand,
Australia..... P. purpureo-olivaceus
4. Stipe central to weakly eccentric ................. 5
4. Stipe strongly eccentric or lateral ......................... 11
5. Pileus tan, brown, rufous brown, usually concave ......6
5. Pileus pearl gray, white, or banana yellow ......................................... 8
6. Basidiomata arising from a sclerotium ............................................... P. tuber-regium
6. Basidiomata without sclerotium ..................................... 7
7. Root parasite; pileus tan to brown; Europe ....... P. eryngii
7. On rotting wood; pileus tan, brown, usually with ruddy tints............ P. cornucopiae
8. Pileus and stipe white to pearl gray .................... 9
8. Pileus banana yellow; stipe white (citrinopileatus form) ..................... P. cornucopiae
9. Stipe nearly lateral; on Agave, Opuntia; northern Africa, Mexico ........................... P. opuntiae
9. Stipe central; all basidiome parts white .. 10
10. Pileus surface velutinous to plushy; warm climates; anamorph unknown .......................... P. levis
10. Pileus surface strigose to wooly; cool, wet climates; anamorph of tan to Brown arthrospores in
culture ................................................................................ P. dryinus
11. Stipe tissue dimitic....................................... 12
11. Stipe tissue monomitic.................................... 14
12. Partial veil present over young lamellae....... P. calyptratus
12. Partial veil absent .................................................. 13
13. Basidiomata usually everted; pileus surface ruddy tan to ruddy brown.. P. cornucopiae
13. Basidiomata pleurotoid; pileus surface white, yellow-olive, brown, olive-brown, pink or gray
....................................................................................................... P. djamor
14. On coniferous wood; northern China, far eastern Russia ........... P. abieticola
76
ANEXO 3 Analisis estadstico del efecto del medio de cultivo y la temperatura en la tasa de
crecimiento micelial y produccin de biomasa de las cepas del gnero Pleurotus
Factores inter-sujetos
1,00
2,00
3,00
4,00
20,00
25,00
30,00
35,00
Cepa
Temperatura
N
6
8
12
10
10
10
9
7
Origen
Modelo
corregido
Sig.
Suma de
cuadrados
tipo III
Origen
83,239 a
14,00
5,95
68,02
32,753 b
14,00
2,34
107,32
14,00
118114,24
29,69
255295,762 d
14,00
18235,41
6,93
0,00
mgSA
478,48
1,00
478,48
5474,21
0,00
PDA
mgPDA
SA
1653599,307
0,00
201,90
1,00
201,90
9261,40
0,00
777234,89
1,00
777234,89
195,38
0,00
mgSA
388772,29
1,00
388772,29
147,76
10,96
3,00
3,65
41,78
SA
PDA
0,00 Cepa *
SA
0,00 Temperatura mgPDA
mgPDA
PDA
SA
33,28
0,00
1,50
68,69
0,00
877443,34
8,00
109680,42
27,57
0,00
45162,50
8,00
5645,31
2,15
0,08
1,84
21,00
0,09
0,02
3978,10
0,00
mgSA
55254,59
21,00
2631,17
0,00
PDA
724,41
36,00
2,36
108,37
0,00
130438,51
32,79
0,00
mgSA
114720,65
3,00
38240,22
14,53
0,00
mgSA
27,09
3,00
9,03
103,29
0,00
8,07
3,00
2,69
123,44
334083,15
3,00
111361,05
27,99
13831,52
3,00
4610,51
1,75
mgSA
2,91
8,00
21,00
3,00
mgPDA
8,00
21,00
3,00
300,26
36,00
2591962,84
36,00
787973,77
36,00
PDA
85,08
35,00
0,00 Total
0,00 corregida
SA
33,21
35,00
1737139,32
35,00
0,19
mgSA
310550,35
35,00
Total
77
SA
mgPDA
mgPDA
Sig.
11,98
0,46
7,09
23,27
83540,01
391315,54
SA
Media
cuadrtica
gl
mgPDA
Error
mgPDA
PDA
Temperatura
SA
PDA
Cepa
gl
PDA
mgSA
Interseccin
Media
cuadrtica
Anexo 4 Secuencias de la regin ITS 1 a ITS2 de las cepas del gnero Pleurotus P3215, P132 y Post
Regin ITS1 a 5.8S de las cepas P3215, P132 y Post del gnero Pleurotusp.
>P132ITS1
AAAAAGAATTCCTATGGAGTTGTTGCTGGCCTCTAGGGGCATGTGCACGCTTCACTAGTCTTTCA
ACCACCTGTGAACTTTTGATAGATCTGTGAAGTCGTCTTTCAAGTCGTCAGACTTGGTTTGCTGG
GATTTAAACGTCTCGGTGTGACAACACAGTCTATTTACTTAACACACCCCAAATGTATGTCTACGA
ATGTCATTTAATGGGCCTTGTGCCTATAAACCATAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTC
TCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAAAATTCAGTGAATCAT
CGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA
>P3215aITS1
CATTATTCCTATGGAGTTGTTGCTGGCCTCTAGGGGCATGTGCACGCTTCACTAGTCTTTCACCA
CCTGTGAACTTTTGATAGATCTGTGAAGTCGTCTTTCAAGTCGTCAGACTTGGTTTGCTGGGATTT
AAACGTCTCGGTGTGACAACACAGTCTATTTACTTAACACACCCCAAATGTATGTCTACAAATGTC
ATTTAATGGGCCTTGTGCCTATAAACCATAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCA
TCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAAAATTCAGTGAATCATCAAATC
TTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA
>P3215bITS1
CTGGGATTTAAACGTCTCGGTGTGACAACACAGTCTATTTACTTAACACACCCCAAATGTATGTCT
ACGAATGTCATTTAATGGGCCTTGTGCCTATAAACCATAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTG
GCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAA
TCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTC
A
>POstaITS1
CATAATTATTCCTATGGAGTTGTTGCTGGCCTCTAGGGGCATGTGCACGCTTCACTAGTCTTTCAA
CCACCTGTGAACTTTTGATAGATCTGTGAAGTCGTCTCTCAAGTCGTCAGACTTGGTTGCTGGGA
TTTAAACGTCTCGGTGTGACTACGCAGTCTATTTACTTACACACCCCAAATGTATGTCTACGAATG
TCATTTAATGGGCCTTGTGCCTTTAAACCATAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCG
CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGA
ATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA
>PostbITS1
GAATATTGATTCCTATGGAGTTGTTGCTGGCCTCTAGGGGCATGTGCACGCTTCACTAGTCTTTC
AACCACCTGTGAACTTTTGATAGATCTGTGAAGTCGTCTCTCAAGTCGTCAGACTTGGTTGCTGG
GATTTAAACGTCTCGGTGTGACTACGCAGTCTATTTACTTACACACCCCAAATGTATGTCTACGAA
TGTTATTTAATGGGCCTTGTGCCTTTAAACCATAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCT
CGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATC
GAATCTTTGAACGCCCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA
78
Region ITS2 de las cepas P3215, P132 y Post del gnero Pleurotusp.
>P132_ITS2
TTAAATTCTCAAACTCACTTTGGTTTTTTTTCCAATTGTGATGTTTGGATTGTGGGGGGCTGCTGG
CCTTGACAGGTGGGCTCCTCCTAAAAGCTTTAGCGGGACTTCTCATTG
>P3215a_ITS2
TTAAATTCTCAAACTCACTTTGGTTTTTTTCCAATTGTGATGTTTGGATTGTTGGGGGCTGCTGGC
CTTGACAGGTCGGCTCCTCTTAAATGCATTAGCAGGACTTCTCATTGCCTCTGCGCATGATGTGA
TAATTATCACTCATCAATAGCACGCATGAATAGATGTCCAGCTCTCCAATCGTCCGCAAGTGACG
AATTTGACAATTGACCTCAAAT
>P3215b_ITS2
TTAAATTCTCAAACTCACTTTGGTTTTTTTCCAATTGTGATGTTTGGATTGTTGGGGGGCTGCTGG
CCTTGACAGGTCGGCTCCCTCTTAAATGCATTAGCAGGATTTCTCATTGCCTCTGCGCATGATGT
GATAATTATCACTCATCAATAGCACGCATGAATAAGAGTCCAGCTCTCCAATCGTCCGCAGGGAC
AATTTGACAATTTGACCTCAAATCGGGTAGGACTCCCCCGCTGAACTTAAGCTTTCAATAAGCGG
AAAAAAA
>Postb_IT2
TTAAATTCTCAACTCACTTTGGTTTCTTTCCATTGTGATGTTTGGATTGTTGGGGCTGCTGGCCTT
GACAGGCCGGCTCCTCTTTAATGGATTAGGAGGACTTTCCATTGCCCTCTGCGCTGATGGGAAAA
ATATCACTCCTCAATAGCCCCGCATGAATAGAGTCCC
>Posta_ITS2
TTAAATTCTCAAACTCACTTTGGTTTCTTTCCAAATTGTGATGTTTGGGATTGTGGGGGGCTGCTG
GCCTTGACAGGTCGGCTCCTCTTAAATGCTTTAGCAGGGACTTCTCATTTGCCTCT
lxxix
GLOSARIO
C.
Cariogamia: Paso final en el proceso de fusin de dos clulas eucariontes haploides, en el cual se
fusionan los dos ncleos celulares dando origen al zigoto.
Carpforo: Cuerpo fructfero.
Cepa: En microbiologa, una variante fenotpica de una especie o incluso de un taxn inferior,
propagada clonalmente, debido al inters en la conservacin de sus cualidades definitorias.
Champin: hongo de botn: Agaricus bisporus
D.
Dicaritica: La carga gentica es n+n.
Diploide: La carga gentica es 2n.
H.
Haploides: la carga gentica es n.
Hiang-gu: Shiitake: Lentinula sp.
Hongo: fungus: seta.
Hongo Orellana: hongo ostra: hongo oreja de palo: Setas ostra: Pleurotus ostreatus.
L.
Lquenes: Asociacin simbiticas conformando por hongo y bacteria. o las micorrizas (hongo con
plantas superiores)
M.
Meiosis: Divisin celular que permite la reproduccin sexual, comprendido por 2 divisiones
sucesivas; una primera divisin meitica, en la cual una clula diploide se obtienen dos clulas hijas
haploides (n); y una segunda divisin meitica (divisin mittica), divisin en que las clulas hijas
tienen el mismo nmero de cromosomas que la clula madre. As, dos clulas haploides de la primera
divisin meitica se obtiene cuatro clulas haploides.
Micorrizas: Asociacin simbiticas conformando por hongo y plantas superiores.
O.
Oreja de judas: Auricularia sp.
P.
Parsitos facultativos y obligados: Alimentarse lentamente de otros seres vivos.
Plasmogamia: Es la unin ntima entre los citoplasmas de los gametos o clulas que se funcionen
como tales en los procesos de reproduccin sexual.
Pleurocarpo: Etimologa; del latn cientfico pleurocarpus, acuado como nombre del taxn
Pleurocarpi por Bridel en (1822) , a partir del neolatn pleuro-, del griego antiguo -, de
(pleur), "costado", o (pleurn), "costilla"; y el neolatn -carpus, del griego antiguo -
(karpos), forma combinatoria de (karps), "fruto".
S.
Saprfitos: alimentarse de material vegetal en descomposicin.
80
SIGLAS Y ABREVIATURAS
#.
C: Grados centrigrados.
5.8S: Unidad 5.8S del ARN ribosomal.
A.
A.C.: Antes de Cristo.
ADN: cido dexoribonucleico.
ADNr: ADN ribosomal.
ASD: Agar Sabarouad Dextrosa.
ARN: cido ribonucleico.
ARNr: ARN ribosomal.
C.
cm: Centmetro.
CMS: Cultivo en Medios Solido.
F.
FES: Fermentacin de estado slido.
G.
g: gramo
H.
h: Horas
I.
IGS: Espaciadores Intergnicos.
ITS: Espaciadores transcritos Internos.
L.
LSU: Subunidad Larga.
M.
mg: miligramos.
ml: mili litros.
mm: milmetros.
min: Minutos
P.
PCR: Reaccin en cadena de la polimerasa.
81
82