Universidad Tcnica Federico Santa Mara

Departamento de Ingeniera Qumica y Ambiental

Laboratorio de Introduccin a la Microbiologa

Practico N 6
ANLISIS DE MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS Y AMBIENTE

1.- Anlisis de Microorganismos en Alimentos

a) Recuento de microorganismos eucariotas hongos
Se entiende por recuento total de mohos y levaduras revivificables, el nmero de
colonias que se desarrollan a partir de 1 gramo o ml de muestra de alimento, sobre el
medio agar Saboureaud-dextrosa o Patata-dextrosa, durante cinco das de incubacin a
22-25C.
Los mohos son generalmente, hongos multicelulares que forman estructuras
ramificadas externas, coloreadas o no. Algunos mohos pueden formar sobre ciertos
alimentos toxinas denominadas micotoxinas. Causan alteraciones en productos
alimenticios, sobre todo de bajo pH como son frutas, zumos, yogurt, etc., o los de
presin osmtica elevada como son harinas, avena, miel, leches concentradas y
productos salados.
Las levaduras son hongos unicelulares de forma esfrica, alargada, ovoide y a
veces, en forma de micelio. Su tamao supera al de las bacterias. Originan como los
mohos, alteraciones de los productos alimenticios, sobre todo en los de bajo pH y
presin osmtica elevada.
Las levaduras y los mohos crecen ms lentamente que las bacterias en los
alimentos no cidos que conservan la humedad y por ello pocas veces determinan
problemas en tales alimentos. Sin embargo, en los alimentos cidos y en los de baja
actividad de agua (Aw), crecen con mayor rapidez que las bacterias determinando por
ello importantes prdidas por alteraciones de frutas frescas y jugos vegetales, quesos,
productos cereales, alimentos salados as como alimentos congelados y deshidratados,
cuyo almacenamiento se realiza en condiciones inadecuadas.
Adems existe el peligro potencial de produccin de micotoxinas por parte de
los mohos.
Para eliminar estos problemas, los manipuladores de alimentos susceptibles de
enmohecimiento debern:
a) Reducir la carga de esporas, observando unas buenas prcticas higinicas.
b) Reducir los tiempos de almacenamiento y vender los alimentos lo antes
posible.
c) Almacenar los alimentos congelados a temperaturas inferiores a los -12C.
d) Eliminar o reducir el contacto con el aire (mediante envasado o por otros
procedimientos).

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e) Calentar el alimento en su envase final para reducir las clulas vegetativas y

las esporas.
f) Aadir conservantes qumicos tales como los sorbatos y benzoatos.
Ni el hombre ni los animales deben consumir alimentos visiblemente
enmohecidos, excepto, por supuesto los quesos tales como Roquefort y ciertos Salames
que deben sus sabores especiales a algunos mohos.
Las levaduras crecen ms rpidamente que los mohos, pero con frecuencia junto
a ellos. Mientras que los mohos son casi siempre aerobios estrictos, las levaduras
generalmente crecen tanto en presencia como en ausencia de oxgeno, aunque con
mayor rapidez en presencia de oxgeno.
En los alimentos frescos y en los congelados, pueden encontrarse nmeros
reducidos de esporas y clulas vegetativas de levaduras, pero su presencia en estos
alimentos es de escaso significado. Slo cuando el alimento contiene cifras elevadas de
levaduras y mohos visibles, el consumidor se dar cuenta de su alteracin. La alteracin
causada en los alimentos por las levaduras no constituye un peligro para la salud.
Materiales.
Pipetas estriles de 1 ml
Placas de Petri estriles
Estufa de cultivo regulada a 25C.
Medio de cultivo.
Agar Sabouraud-dextrosa en g/l.
Dextrosa
Extracto de levadura
Agar
Agua destilada

20
10
20
1000

Tcnica.
Se realiza para el medio en duplicado. Se realizan tres diluciones decimales. Se toma 1
ml de las diluciones y se vierten sobre las placas previamente rotuladas y luego se
agregan 15 ml de agar a cada una, se homogeniza bien y luego se deja solidificar. Se
incuban las placas durante cinco das a la temperatura sealada de 25C. Las lecturas
deben comenzar al tercer da, repitindose al quinto da. Se cuentan las colonias de
levaduras y de mohos en forma separada. Las primeras colonias que aparecen en el
medio son las de las levaduras, posteriormente se desarrollan los mohos.
Realice una observacin al microscopio de una preparacin de levaduras y
mohos segn su diversidad.
Calcule el nmero de levaduras y de mohos por gramo de alimento.

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b) Recuento total de microorganismos aerobios revivificables.

Principio.
Este mtodo se basa en la hiptesis de que las clulas microbianas que contiene una
muestra mezclada con un medio de agar forman, cada una, colonias visibles y
separadas. Pare ello se mezclan diluciones decimales de la muestra del alimento
homogeneizado con el medio. Despus de incubar las placas a 36C durante 72 horas, se
calcula el nmero de bacterias aerobias mesfilas por gramo de la muestra del alimento,
basndose en el nmero de colonias obtenidas en las placas de Petri elegidas con
diluciones que proporcionen resultados significativos.
Hay que tener en cuenta que este mtodo, como todos los dems, tiene sus
inconvenientes. Las clulas microbianas se presentan a menudo en los alimentos
agrupadas, o en racimos, cadenas o parejas, que pueden no estar bien distribuidas,
cualquiera que sea la mezcla y la dilucin de la muestra. Por consiguiente, cada colonia
que se forma en la placa de agar puede proceder de una sola clula o de grupos de
clulas, por lo que el cmputo de colonias puede no reflejar el nmero real de bacterias
viables contenidas en el alimento. Adems algunos microorganismos pueden no
desarrollarse ni formar colonias visibles en el medio de agar si las condiciones de
temperatura, oxgeno o nutricin no son favorables, o por la debilidad de las clulas.
El nmero de microorganismos aerobios mesfilos encontrados es uno de los
indicadores microbiolgicos de calidad ms utilizado. Es aplicable a todos los alimentos
con excepcin de los productos fermentados o madurados tales como yogurt, ciertos
tipos de embutidos y quesos.
Los resultados de este anlisis permitiran:
-

Verificar efectividad de los procedimientos de limpieza y desinfeccin.

Determinar si las temperaturas aplicadas en los procesos fueron las adecuadas.
Determinar el origen de la contaminacin durante los procesos de elaboracin de
los alimentos.
Verificar condiciones de almacenamiento y transporte.
Obtener informacin acerca de la vida til de los alimentos
Indicar alteracin incipiente en ciertos alimentos.

Materiales.
Placas de Petri estriles.
Pipetas graduadas de 1; 5 y 10 ml.
Bao de agua a 45C.
Incubadora a 36C.
Contador de colonias.
Medios de cultivos
Medio Plate Count Agar (P.C.A) en g/l.
Triptona
5
Extracto de levadura
2,5
Glucosa
1
Agar
15
Agua destilada
1000

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Agua peptonada segn la siguiente formulacin en g/l.

Peptona
NaCl
Agua destilada

10
5
1000

Procedimiento.
1.- Homogenizacin del alimento
Se pesan 25 gramos de la muestra en forma asptica y se coloca en una mezcladora
esterilizada, se aaden 225 ml de solucin reguladora peptonada. Se agita durante 2,5
minutos como mximo.
2.- Dilucin
a) Se mezcla el alimento homogeneizado, agitndolo; se toma 1,0 ml con una pipeta
estril y se vierte en un tubo que contenga 9 ml de solucin reguladora peptonada; se
mezcla.
b) Con una pipeta estril nueva, se toma 1,0 ml de la primera dilucin y se vierte en el
tubo de la segunda dilucin, que contiene 9 ml de solucin reguladora peptonada; se
mezcla por agitacin
c) Se repite la operacin con el tercer, cuarto o ms tubos hasta hacer el nmero
requerido de diluciones.
d) Se agitan cuidadosamente todas las diluciones.

3.- Versin en placas

a) Se vierte, con una pipeta estril, 1 ml del alimento homogeneizado y de cada una de
sus diluciones en cada una de las placas de Petri adecuadamente mercadas, duplicadas y
estriles.
b) Se vierten, en cada placa de Petri, 15 ml del agar PCA que se ha mantenido en el
bao de agua a 45-50C en los 15 minutos siguientes al momento en que se hizo la
primera dilucin.
c) Mezclar bien, y uniformemente, la muestra diluida con el medio de agar, y se deja
solidificar.
4.-Incubacin.
Las placas de Petri preparadas una vez solidificadas se incuban invertidas durante 72
horas a 36C.
5.- Recuento de colonias.
Despus de la incubacin se cuentan todas las colonias de las placas que contienen entre
30 y 300 UFC, y se anotan los resultados por cada dilucin contada.

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6.- Clculo.
Cuando las placas examinadas no contienen ninguna colonia, el resultado se expresa en
la forma siguiente:
menos de 1 x 10 bacterias por gramo o mililitro de muestra
Cuando las placas (dilucin 1:10) contienen menos de treinta colonias, el resultado se
expresa en la forma:
menos de 3 x 10 bacterias por gramo o mililitro de muestra
Cuando hay ms de 30 colonias, se cuentan las colonias de las dos placas de una
dilucin y se calcula la media, con dos cifras significativas solamente, y se multiplica
por el inverso de la dilucin correspondiente, a fin de obtener el nmero de bacterias por
gramo o mililitro de muestra.
Ejemplo: Dilucin 10-2

placa 1 = 175 colonias

placa 2 = 208 colonias

Clculo: 175 + 208 = 383/2 = 191 = 191 x 102

Resultado: 1,9 x 104 microorganismos por gramo o mililitro de alimento.

c) Identificacion y recuento de enterobacterias lactosa positivas (coliformes).

En el siglo pasado se comenz a usar a los coliformes como microorganismos
indicadores para el anlisis de agua. Por este procedimiento, mediante la identificacin
de Escherichia coli, se buscaba la posible presencia de Salmonella typhi, mucho ms
difcil de detectar. E. coli detectado en el agua indica que puede haber contaminacin
con aguas residuales, pudiendo tambin estar presentes las Salmonellas y otros
patgenos intestinales.
Como resultado del uso de los coliformes como indicadores en el agua, tambin
se emplean como posibles indicadores de contaminacin fecal en alimentos.
Los coliformes incluyen a microorganismos bacilares Gram negativos, aerobios
y anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con formacin de
gas a 35C en 48 horas.
Incluyen las especies: Escherichia coli, Citrobacter freundii, Enterobacter
aerogenes, Enterobacter cloacae y Klebsiella pneumoniae.
Su hbitat es el tracto intestinal del hombre y animales de sangre caliente. No
obstante las bacterias de este grupo son de origen fecal y no fecal. Se encuentran en el
suelo, plantas, cscara de huevo, leche (pezn y piensos contaminados), plumas de aves,
pelo de los animales. En los mataderos las carnes se contaminan por la evisceracin o el
contacto con materiales contaminados y en los moluscos por su crecimiento en aguas

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contaminadas. Por su amplia distribucin se pueden detectar en muchos tipos de

alimentos, sobre todo de origen animal.
Estos microorganismos se pueden multiplicar an en condiciones de
refrigeracin. Persisten en el agua durante largos perodos de tiempo. No resisten la
pasteurizacin. Los alimentos pasteurizados en los que se detectan coliformes indican
un tratamiento deficiente o una recontaminacin.
Los coliformes fecales se pueden definir como bacilos Gram negativos que
fermentan la lactosa con formacin de gas a 44,5C. este grupo esta constituido
principalmente por Escherichia coli , pero tambin algunas cepas de Enterobacter y
Klebsiella pueden producir gas en caldo lactosado a 44,5C.
La investigacin de coliformes consiste en poner de manifiesto la presencia de
tales microorganismos mediante su aislamiento
de los alimentos y posterior
identificacin por tcnicas adecuadas.

Materiales.
Pipetas de 1 ml estriles
Placas de Petri estriles
Estufa de cultivo
Medios de cultivo.
Agar V.R.B.G ( Agar rojo violeta bilis)

Tcnica.
A partir de la serie de de diluciones decimales, y por duplicado, se aade 1 ml de cada
dilucin sobre placas de Petri estriles. En cada placa se vierten 15 ml del medio de
cultivo V.R.V.G a 45C. Mezclar cuidadosamente.
Las placas, en posicin invertida, se cultivan a 35C durante 24 horas.
Las colonias de coliformes aparecen en este medio con tonalidad rojo prpura y
rodeadas de una zona de precipitacin de las sales biliares.
Para enumerar los coliformes por esta tcnica, se eligen las placas que contengan entre
30 y 300 colonias caractersticas. El nmero de colonias contadas y confirmadas se
multiplica por el factor de dilucin de la placa, obteniendo as el nmero total de
coliformes por gramo o ml de alimento.

d) Numeracin en tubos. Tcnica del NMP sobre medio caldo lactosadobiliado al verde brillante.
Materiales.
Gradillas
Pipetas de 1 ml estriles
Estufa de cultivo.

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Medio de cultivo.
Caldo lactosado Verde Brillante

Tcnica.
Se preparan tres series de tres tubos conteniendo medio Caldo lactosado verde brillante
con campana Durham.
A cada tubo de la primera serie se le aade 1 ml de la dilucin del alimento 10-1. En
cada uno de los tres tubos de la segunda serie se pone 1 ml de la dilucin 10-2, haciendo
lo mismo con los tubos de la tercera serie, a los que se aade 1 ml de la dilucin 10-3.
Los tubos de las tres series se incuban a 35C, leyndose los resultados a las 24-48
horas. Los que presentan gas se consideran positivos, y el nmero ms probable de
coliformes por gramo o ml de alimento se lee en las tablas del NMP.

Tabla nmero ms probable.

Combinacin
0-0-0
0-0-1
0-1-0
1-0-0
1-0-1
1-1-0
1-1-1
1-2-0
2-0-0
2-0-1
2-1-0
2-1-1
2-2-0
3-0-0
3-0-1
3-0-2
3-1-0
3-1-1
3-1-2
3-2-0
3-2-1
3-2-2
3-3-0
3-3-1
3-3-2
3-3-3

NMP/ gramo o ml

<3
3
3
4
7
7
11
11
9
14
15
120
21
23
39
64
43
75
120
93
150
210
240
480
1100
>2400

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2.- Cultivo de microorganismos en el ambiente

Los microorganismos se encuentran presentes en todos los ambientes: en el aire, en el
agua, en la superficie de los objetos e incluso sobre nuestra piel. Cuando se trabaja en
microbiologa de alimentos es importante determinar el grado de contaminacin
ambiental, ya que de las condiciones higinicas del lugar de trabajo (utensilios,
superficies, etc.) y del propio manipulador van a depende en parte el nmero y tipo de
microorganismos del alimento.

a) Anlisis de aire
El aire, adems de partculas en suspensin, es portador de bacterias o sus esporas. Por
ello puede ser causa tanto de contaminacin de alimentos y superficies como de
infecciones en el hombre (patologas respiratorias, etc.)
Existen distintos mtodos para el anlisis del aire: sedimentacin, filtracin, choque en
lquidos y precipitacin electrosttica, entre otros.
En este captulo vamos a explicar los dos primeros por ser los mtodos ms empleados.
El mtodo de sedimentacin en placa es uno de los ms sencillos para la determinacin
de microorganismos del aire. A pesar de ello, los resultados obtenidos son orientativos
de las cifras de microorganismos presentes en el aire, ya que los niveles varan en
funcin de las corrientes de aire y del tamao de las partculas en suspensin.
Para realizar el mtodo de filtracin es necesario disponer de un aparato que aspira
mediante vaco volmenes conocidos de aire.

1.- Anlisis por sedimentacin

a) Destapar las placas de PCA en el lugar cuyo nivel de contaminacin se desee
examinar durante diferentes intervalos de tiempo 0.5, 1 y 1.5 horas.
b) Tapar las placas e incubar durante 24-48 horas a 37C. Utilizando este medio de
cultivo determinaremos los aerobios mesfilos totales ambientales. Para investigar la
presencia de determinados microorganismos se pueden emplear medios de cultivo
selectivos.
2.- Anlisis por filtracin
a) Conectar la bomba de vaco y aspirar durante 2 minutos. El aire pasa por uno o ms
tamices de dimetro de poro variable y los microorganismos quedan atrapados en la
superficie de una o ms placas de agar con el medio de cultivo que se desee.
b) Incubar durante 24-48 horas a 37C.

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b) Anlisis de superficies
Para llevar a cabo una correcta manipulacin de los alimentos es necesario
mantener una limpieza adecuada tanto en las superficies de trabajo como en los
utensilios que hay que emplear. A no ser que los alimentos hayan sido esterilizados,
todos los productos llevarn microorganismos. En la manipulacin, el envasado y el
almacenaje de los alimentos, estos microorganismos deben mantenerse en todo
momento en niveles que aseguren la calidad microbiolgica del alimento.
El objetivo de los anlisis microbiolgicos de superficies es comprobar el estado
higinico del lugar de trabajo, de modo que evitemos contaminacin cruzadas durante el
procesado de los alimentos. Existen distintos mtodos para el examen microbiolgico de
las superficies: mtodo del hisopo, de la placa de contacto,de la lengeta (o pelcula
pegajosa), etc. En esta prctica se describen el mtodo del hisopo y los de placas de
contacto Rodac y lengetas.
1.-Anlisis de superficies planas por placas de contacto (RODAC: Replicate
organism direct agar contact)
a) Emplear placas de Petri especiales de 6 cm de dimetro que llevan el medio de
cultivo PCA (medio para recuperar aerobios mesfilos totales). El medio, una
vez fundido y atemperado a 55 C se vierte en las placas de manera que
sobresalga del borde de la placa para facilitar el contacto con la superficie a
examinar.
b) Presionar suavemente la placa sobre la superficie elegida.
c) Incubar las placas durante 24-48 horas a 37C. La superficie delimitada por las
placas es de 25 cm2, por lo que el resultado se expresa en UFC/ 25 cm2
Nota: El principal inconveniente de ste mtodo es su ineficacia en superficies muy
contaminadas y la posibilidad de no recuperar todos los microorganismos presentes
en la superficie. Sin embargo, en los casos en los que la carga microbiana es baja, da
buenos resultados.
2.- Anlisis de superficies planas por lengetas (slidos y lquidos):
a) Emplear lengetas proporcionadas por diversas casas comerciales. Este sistema
se compone de un contenedor de plstico transparente en el que va incluida una
lengeta de plstico articulada, recubierta de medio de cultivo por los dos lados.
El medio de cultivo puede ser general para recuento de microorganismos totales
(PCA) o selectivo para identificacin de microorganismos especficos (VRBG,
OGA, etc.). Existen lengetas que llevan un medio diferente por cada lado.
b) Presionar ligeramente ambos lados de la lengeta de manera que todo el medio
de cultivo quede en contacto con la zona que se ha de analizar. La posibilidad de
articulacin de la lmina facilita el contacto con la superficie. En el caso de
muestras lquidas se sumerge la lmina 3 o 4 seg.
c) Introducir la lmina despus de la toma de muestras en el contenedor de
plsticos, en el que se puede transportar y almacenar hasta su anlisis.
d) Incubar durante 24-48 horas a 37C.

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Nota: en el recuento se tendr en cuenta el medio de cultivo empleado. En el medio

PCA se contarn todas las colonias crecidas (recuento de microorganismos aerobios
mesfilos totales). En el caso del VRBG slo se tendrn en cuenta las colonias rojo
violeta, que corresponden a Enterobacteriaceae. El medio OGA se emplear para el
recuento de mohos y levaduras.
3.- Anlisis de superficies no planas: mtodo del hisopo
Este sistema es el ms antiguo y el ms utilizado en el examen microbiolgico de
superficies, ya que sirve para el anlisis tanto de superficies planas como no planas. Es
especialmente recomendado para analizar superficies de aparatos y utensilios (mquina,
picadoras de carne, cubiertos, etc). Adems, se pueden estudiar superficies muy
contaminadas, ya que a partir de la solucin salina estril es posible realizar las
diluciones decimales precisas.
a) Delimitar la superficie que se va analizar mediante una plantilla de papel de
aluminio estril con una abertura de dimensiones conocidas.
b) Humedecer el hisopo estril en una solucin con 10 ml de solucin salina estril
y restregar varias veces sobre la superficie delimitada por la plantilla.
c) Introducir el nuevo hisopo en el tubo con solucin salina estril y dejar durante
15-30 minutos de manera que los microorganismos se liberen del algodn al
caldo.
d) Sembrar 0,1 ml de dicho caldo en una placa d PCA y/o VRBG.
e) Incubar durante 24-48 horas a 37C. el recuento se expresa como UFC/9 cm2.
c) Anlisis de manipuladores.
Un alimento puede ser contaminado en su origen o bien puede ser el manipulador quien
lo contamine durante el procesado. La persona que va a manipular un alimento tiene una
abundante carga microbiana en su piel. Pero nunca debern aislarse de ella bacterias
patgenas o que indiquen poca higiene. Por lo tanto, resulta evidente la necesidad de
que el manipulador mantenga unas perfectas condiciones de higiene durante el
procesado de los alimentos.
El objeto de un anlisis de manipuladores es comprobar que la persona que procesa el
alimento no es una fuente de contaminacin de ste. Se pueden estudiar: manos, uas y
fosas nasales.
1.- Para realizar esta prctica el alumno no se lavara las manos, ya que la tcnica
consiste en pasar la mano por la superficie de placas con diferentes medios de cultivo.
2.- Incubar las placas durante 24-48 horas a 37C.
3.- Observar el crecimiento de colonias caractersticas en cada medio de cultivo:
colonias violetas con halo del mismo color en el caso de Enterobacteriaceae en placas
de VRBG y amarillas en el Staphylococcus aureus en placas de agar manitol sal (otras
especies de Staphylococcus tambin pueden dar esta coloracin). Nota. El anlisis de
fosas nasales o de uas se realiza tomando la muestra mediante hisopo estril

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humedecido en solucin salina estril y sembrando directamente en las placas antes

mencionadas.

Ejercicios
1.-De una muestra de 100 grs. De pasta ave-mayonesa se toman 25 grs y se diluyen en
225 ml de agua peptonada, posteriormente se realiza 5 diluciones de 1 en 9 ml de
solucin salina al 0,8%, de la antepenltima dilucin toma 0,01 ml y realiza una serie de
7 diluciones de 0,01 en 9,99ml de solucin salina al 0,8%, de la ltima dilucin toma 10
ml y lo lleva a 90 ml de agua peptonada y de
ah realiza 5 diluciones de 0,0
en placas obtenindose los siguientes resultados 150,200 ,20, 60, 350, 280, 310, 29,100.
Calcular el N de MO/ml
2.- De acuerdo al reglamento sanitario de los alimentos la cantidad mxima permitida de
la bacteria E.coli es 1*104. Se le entrega una muestra de un alimento posiblemente
contaminado con la bacteria. Ud. Realiza la tcnica de dilucin y plaqueo encontrando
50 microorganismos por gramo de alimento, lo cual cumple con el reglamento. Si el
alimento permanece sin refrigeracin. A las 10 horas esperara que el alimento alcance
la concentracin mxima permitida.
Dato: tg:20 minutos.
3.- En una muestra de queso de 100 grs, se toman 25 grs y se disuelven en 225 ml de
agua peptonada. Se hacen 5 diluciones de 1 en 9, posteriormente 3 diluciones de 0,1 en
9,9 y 7 diluciones de 0,01 en 9,99. Posteriormente de la ltima dilucin se toma 0,1 y se
plaquea obtenindose los siguientes resultados: 31, 78, 15, 8, 380, 230. Calcular el N de
MO/ml.Calcular el N de MO / muestra de queso.