Universidad Catlica Boliviana San Pablo

Laboratorio N-8

Alejandro Fuentes
Andres Gonzales
Cristhian Lopez
Mauricio Terrazas

PRCTICA N 8
CROMATOGRAFA EN CAPA DELGADA
Introduccin
Los metodos cromatograficos son metodos de separacion que involucran la
transferencia reversible de un compuesto que esta absorbido en una fase estacionaria
(absorbente) a una fase movil (disolvente) que fluye a traves de la fase estacionaria.
La separacion surge de las interacciones mutuas de componentes de una muestra,
disolvente y absorbente. El absorbente esta presente en un gran exceso, con una gran
superficie y con sitios polares capaces de unir reversiblemente pequenas
concentraciones de sustancias por un proceso esencialmente electrostatico.

El disolvente compite con los componentes de la muestra por los sitios de union. Estos
componentes son desplazados reversible y continuamente en la direccion del flujo del
disolvente. El proceso descrito puede escribirse como un equilibrio competitivo en
donde hay una particion de los componentes entre la fase estacionaria y la fase movil:
componentes - adsorbente disolvente - adsorbente componente-disolvente
Entre mas polar sea un compuesto, mas fuertemente se absorbe en la fase estacionaria,
por lo que su migracion a lo largo de ella es menor, siendo eluido (arrastrado) mas
lentamente por la fase movil, que los compuestos menos polares. De este modo, la
separacion selectiva de los componentes de una muestra, por cromatografia, se debe a

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las diferencias en la migracion de los componentes individuales a lo largo de la fase

estacionaria.
Departamento de Ingenieria y Ciencias Quimicas. Universidad Iberoamericana.
Laboratorio de Quimica Organica Aplicada. Practica 1. Cromatografia en Placa Delgada
y en Papel 10 En la cromatografia en fase liquida se usa una fase movil (liquida) y una
fase estacionaria (solida), siendo los
absorbente mas comunes la silica gel (SiO2.H2O), alumina (A2O3) y celulosa.
La distribucion de los componentes entre la fase solida y liquida es determinada,
ademas de por la polaridad propia de cada compuesto, por el grado de actividad del
absorbente (el cual depende principalmente del grado de hidratacion y de la polaridad
del disolvente).
El principal factor para controlar el movimiento de los diferentes compuestos en un
cromatograma es la polaridad del disolvente. Una lista de los disolventes mas usados en
los diferentes tipos de cromatografia, en orden de polaridad creciente, se indica en la
Tabla 1. Entre mas polar sea un disolvente, mas rapido es el movimiento de los
compuestos y menos efectiva la separacion.

Marco teorico
Para separar pequenas cantidades de una mezcla (hasta unos 100 mg) o averiguar el
numero de sus componentes e identificarlos por cromatografia, se puede usar una capa
delgada de adsorbente adherida sobre un soporte rigido. La tecnica se denomina
cromatografa en capa delgada, abreviada CCD. El adsorbente mas empleado es el
gel de silice o acido silicico finamente dividido. Para que los adsorbentes se adhieran a
la superficie rigida, se mezclan con 1 2% de yeso (sulfato de calcio monohidratado).
Como soporte se usa vidrio, laminas rigidas de poliester o de aluminio. Como
adsorbentes tambien se usan alumina neutra activada, celulosa pulverizada o
policaprolactama (nylon 6) o polivinilpirrolidona (PVP) (Polyclar AT).
Los adsorbentes, mezclados con el aglutinante, se embadurnan sobre la superficie del
soporte, usualmente de 7 a 20 cm de longitud. Cuando se usa vidrio, las placas pueden
ser portaobjetos o medir 2 x 5 x 10 cm y 20 x 20 cm. La capa embadurnada debe tener
un espesor constante, de 10 a 50 m. Una vez embadurnada la placa, se seca a 80 100
C durante unos 30 minutos. Posteriormente la muestra se coloca a 1 2 cm de un
extremo de la placa, mediante un tubo capilar, como una diminuta mancha circular o
como una delgada raya. La placa se introduce en una camara cromatografica que lleva
suficiente cantidad de una mezcla de disolventes, para que su superficie quede a unos
0,5 cm por debajo de la mancha o linea. La camara se tapa para que los solventes
asciendan por capilaridad y comiencen a eluir y mover diferencialmente a los
componentes de la mancha. Cuando los solventes se aproximan a la parte superior de la
placa, se la saca, rayandose la placa a la altura alcanzada por el frente del solvente. La
placa se seca, se examina a la luz natural, luego con luz ultravioleta y finalmente se le
aplica un agente cromogenico, que convierte en mancha colorida una incolora. El
numero de manchas determina el numero minimo de componentes de la mezcla. El
cociente de la distancia a recorrida por cada componente o mancha entre la distancia s
recorrida por el frente del solvente, se denomina Rf.

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Rf = a/s
Rf es una caracteristica para cada sustancia. El agente cromogenico puede ser
especifico para ciertos grupos funcionales. Asi, la 2,4-dinitrofenilhidrazina da manchas
con los grupos carbonilo, el azul de bromotimol con los acidos, el cloruro ferrico con
los fenoles. Otros, como el yodo, son generales.
Procedimiento
Los portaobjetos usados en microscopio son muy ventajosos para la CCD. Son muy
baratos, se pueden recubrir con capas muy delgadas de absorbente sin aplicadores
especiales, requieren muestras pequenisimas (1 a 20 g) y tiempos cortos (5 a 15
minutos) para separar sus componentes. Juntar por sus caras dos portaobjetos limpios y
desengrasados, introducirlos en un frasco de boca ancha (de unos 6 cm de ancho y 8 cm
de alto) con tapon de rosca, en el que se haya introducido una suspension previamente
bien dispersada de unos 10 g de gel de silice G (marca Merck o equivalente) en 40 mL
de cloroformo, tetracloruro de carbono o de agua. Sacarlos enseguida, separarlos y
ponerlos a secar. El frasco se tapa cuando no se usa.
Las placas embadurnadas se secan y activan calentandolas a 80 110 C durante 10 a 15
minutos. Las placas deben conservarse en atmosfera seca, pueden guardarse en una caja
para portaobjetos. Para usarse, a unos 5 a 10 mm del extremo inferior de la placa se
traza con un lapiz de grafito o con una navaja, una raya superficial que senala el origen
del cromatograma. Mediante una micropipeta, se aplican pequenisimos volumenes (5 a
10 l) de la muestra, procurando conservar el diametro de las manchas en 1 a 2 mm. Si
en una misma placa van varias manchas, se aplican separadamente a intervalos de 10 a
20 mm. Conviene delimitarlas mediante muescas verticales trazadas con la punta fina
de un lapiz o navaja. La placa se coloca verticalmente o en angulo de 80 en una
camara cromatografica, en la que previamente se estabilizo el disolvente con su
atmosfera. Para ello, conviene colocar sobre la pared un trozo de papel filtro. El
disolvente debe quedar a unos 3 a 5 mm de distancia por debajo del punto en que estan
las muestras. El disolvente asciende por la placa arrastrando los componentes de la
muestra. Cuando el frente del disolvente se aproxima a unos 10 a 15 mm del extremo
superior de la placa, se debe retirar la placa de la camara. La placa se seca a
temperatura ambiente o a 100 C. Una vez seca la placa, se examina visualmente,
buscandose manchas coloridas. Enseguida, se observa bajo una luz ultravioleta.
Despues la placa se trata con un agente cromogenico apropiado. Por ejemplo, se puede
introducir en una camara que tenga unos cuantos cristales de yodo y que en corto
tiempo dan manchas cafes. Se mide la distancia recorrida por el centro de cada mancha
y la recorrida por el disolvente. El cociente de la primera distancia sobre la segunda nos
da el Rf de la muestra.
Separacin de antocianinas
Pesar 5 g de cscaras de uvas negras. Triturar en un mortero el material vegetal,
mezclado con un poco de arena, con 20 mL de HCl al 1% en etanol. Dejar decantar la
suspensin en un vaso de precipitados de 50 mL. Aplicar con una micropipeta la fase

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etanlica a la placa con gel de slice. Introducir en un vaso de precipitados de 250 mL

20 mL de mezcla n-butanol cido actico agua (4:1:5) v/v, tapando con un vidrio
de reloj para que la atmsfera al interior de vaso de precipitados se sature con los
vapores de la mezcla de solventes. Introducir la placa cromatogrfica con la muestra
sembrada dentro del vaso de precipitados y tapar con el vidrio de reloj. Luego de la
elucin, dejar secar la placa, observar primero con luz normal y luego con luz
ultravioleta la placa. Marcar con la punta de un lpiz todas las manchas que se
observen. Medir las distancias recorridas por cada mancha y calcular sus Rf (medir
desde el centro de la mancha aplicada en la placa hasta el centro de la mancha eluida).
Preguntas
1. Cuantas manchas se observan y cuales son sus Rf?
Se muestran 4 manchas donde:
Mancha1:
Mancha2:
Mancha3:
Mancha4:

a = 0 cm
a = 4.1 cm
a = 4.6 cm
a = 5.5 cm

S=6.4 cm.
Para:
Mancha 1:
Mancha 2:
Mancha 3:
Mancha 4:

Rf: 0/64 = 0
Rf: 4.1/6.4 = 0.641
Rf: 4.6/6.4 = 0.719
Rf: 5.5/6.4 = 0.859

2. Que estructuras tienen las antocianinas y en que tipos de plantas se pueden

encontrar?
Las antocianinas al ser pigmentos, se encuentran en algunas frutas que van
del color rojo al azul o morado, como los arandanos, agonia, fresas,
frambuesas, las cerezas, la col lombarda y las ciruelas o las uvas.
Parece ser que algunos de estos principios se pierden cuando los frutos son
conservados en frio, por lo que seria recomendable tomarlos frescos en la
temporada de produccion.
Tambien se ha comprobado que las antocianinas aumentan en un fruto det
terminado a medida que esta madura, por la que no conviene comer los fru
tos bien maduros.

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