Barandilla et al.

Conservacin de variedades de patata mediante la

tcnica de criopreservacin.
El mantenimiento de variedades de patata en un Banco de Germoplasma,
puede resultar problemtico cuando el nmero de cultivares a conservar es
muy elevado, ya que se requiere mucho espacio y condiciones especiales. La
criopreservacin es una nueva tcnica que nos permite almacenar un gran
nmero de cultivares de patata en un espacio mnimo, mediante la congelacin
de yemas de la planta en nitrgeno lquido. Tras un largo periodo de tiempo
dichas yemas pueden ser descongeladas y regenerar una nueva planta.
La criopreservacin aparece como alternativa para el mantenimiento de
variedades de patata a largo plazo y en un espacio mnimo. El mtodo consiste
en la congelacin de yemas o meristemos de plantas de patata en nitrgeno
lquido (-180 C). Este mtodo requiere una congelacin del material, y el
rellenar de forma regular los tanques de nitrgeno donde se almacenan las
muestras. De esta manera se eliminan riesgos como la aparicin de
contaminaciones o fallos en las cmaras de cultivo. Existen trabajos previos
para congelar yemas de patata mediante vitrificacin y posterior regeneracin
de los mismos con tasas de supervivencia de las yemas descongeladas en
torno al 80%, y regeneracin de plantas hasta del 40% dependiendo de la
variedad.

Castillo 2013, Aplicacin de la micropropagacin y criopreservacin a

la conservacin ex situ de especies vegetales de inters.
UNIVERSIDAD DE ALICANTE Instituto Universitario de Investigacin
CIBIO (Centro Iberoamericano de la Biodiversidad).
Convencin sobre Diversidad Biolgica ya reconoca dos estrategias
complementarias para abordar la conservacin de la diversidad vegetal:
estrategias de conservacin in situ, que incluye la proteccin no de una sola
especie, sino del hbitat completo donde se desarrolla de forma natural, y
estrategias de conservacin ex situ, dirigidas a la preservacin de la diversidad
gentica existente en cada especie fuera ya de su hbitat natural. Los mtodos
de conservacin ex situ surgen a partir de las complicaciones y deficiencias
que derivan de la aplicacin de medidas de conservacin de especies en sus
hbitats naturales y del hecho de reconocer que tales medidas de conservacin
in situ no resultan suficientes para luchar contra la galopante reduccin de la
diversidad biolgica.
Hay dos estrategias diferentes que permiten que las tcnicas de cultivo in vitro
pueden ser aplicadas a la conservacin de especies amenazadas. La primera
es la micropropagacin, cuyo objetivo es el de incrementar el nmero de
individuos en especies con problemas reproductivos y/o con poblaciones
extremadamente reducidas. Este tipo de material puede ser utilizado para
investigacin, colecciones vivas y, si se considera apropiado, para programas
de introduccin vegetal. La segunda es el desarrollo de tcnicas de

almacenamiento in vitro, particularmente la crioconservacin, que son

particularmente tiles cuando la conservacin de semillas no es posible
(Gonzlez-Benito, 1999). Estas tcnicas, aplicadas conjuntamente, presentan la
ventaja de producir una gran cantidad de material vegetal a partir de escaso
material de partida en un corto periodo de tiempo. Adems, pueden constituir
una alternativa de conservacin a los bancos de semillas en el caso de algunas
especies en las que el simple hecho de recolectar semillas en sus poblaciones
naturales puede afectar a su supervivencia (Gonzlez-Benito, 1999). Sin
embargo, en la aplicacin de estas tcnicas a la conservacin de germoplasma
vegetal es importante tener presente que su implementacin tambin puede
presentar inconvenientes, principalmente derivados de una posible prdida de
estabilidad gentica del material en cuestin (Lynch, 1999).

Dolce et al. 2000, Aplicacin de la tcnica Encapsulacin

Deshidratacin para la crioconservacin de pices de Citrus sinensis.
Laboratorio de Cultivo de Tejidos - Instituto de Botnica del Nordeste
(IBONE) - Facultad de Cs. Agrarias - UNNE.
La conservacin de los explantes a temperatura ultrabaja del nitrgeno lquido
196C se denomina crioconservacin (Ashmore, 1997). La crioconservacin,
es una valiosa herramienta para conservar a largo plazo (aos) nuestros
recursos fitogenticos. En el Laboratorio de Cultivo in vitro, desde hace algunos
aos se viene trabajando en la conservacin y crioconservacin de
germoplasma vegetal (Scocchi et al, 1998; Scocchi et al, 2000; Faloci et al,
2000; Scocchi y Mroginski 2001). En nuestro pas, no se reportan antecedentes
bibliogrficos respecto al uso de esta tcnica con cultivares ctricos. Sin
embargo, se citan en el mundo antecedentes referidos a la crioconservacin de
Citrus sinensis mediante la utilizacin de distintos explantes, como ser: callos
nucelares (Kobayashi et al, 1990; Sakai et al, 1990; 1991); embriones
somticos (Marin y Duran-Vila, 1998); pices de Poncirus trifoliata L. (GonzalezArnao et al, 1998) y suspensiones celulares de Citrus deliciosa (Aguilar et al,
1993).
Metodo
Se cultivaron pices de naranja dulce Citrus sinensis var. Valencia late
provenientes de la germinacin de embriones somticos obtenidos por cultivo
in vitro de nucelas a partir de frutos inmaduros de 14-15.semanas postpolinizacin (aproximadamente de 3.5 a 4 cm de dimetro). Los frutos fueron
desinfectados por inmersin en etanol 70% durante 5 minutos, luego inmersin
en una solucin de NaOCl al 1.6% durante 30 minutos. Posteriormente se
realizaron tres lavados con agua destilada estril. Luego de disectar los frutos y
aislar las semillas siguiendo el procedimiento desarrollado por Rey, et al, 1995;
las nucelas fueron cultivadas en el medio basal de Murashige y Skoog (1962)
MSms la adicin de AIA (cido indolactico) 1 mg/L + CIN (cinetina) 0.1 mg/L.
El pH de los medios fue ajustado a 5,8 antes del agregado de 0,85% de agar
Sigma (A-1296). El cultivo fue realizado en frascos de vidrio de 100 cm3 de

capacidad conteniendo 30 mL de medio de cultivo. Los frascos fueron

obturados con papel de aluminio y esterilizados en autoclave (0,101 Mpa
durante 20 min).

Westendorp y Encina, Crioconservacin de plantas

-La crioconservacin, puede ser aplicada ventajosamente a la conservacin de
especies y variedades vegetales silvestres o cultivadas como alternativa a las
colecciones y bancos de germoplasma clsicos (bancos de semillas,
colecciones en campo). La crioconservacin de plantas es un proceso
consistente en la preparacin, mantenimiento y preservacin a largo plazo de
un material vegetal, en unas condiciones de temperatura ultra bajas de 196
C, obtenidas mediante nitrgeno lquido (NL). Este mtodo de conservacin de
material vegetal presenta una serie de ventajas frente a otros sistemas de
preservacin de recursos filogenticos: es un mtodo rpido, sencillo, no altera
la estabilidad gentica del material y reduce sustancialmente el esfuerzo y los
costes que representan el mantenimiento de colecciones de germoplasma
vegetal in vivo o in vitro, al eliminar casi por completo la mano de obra y evitar
los riesgos fitopatolgicos y fisiolgicos que habitualmente aparecen en el
mantenimiento de los bancos de germoplasma vegetales. Hay que sealar el
importante ahorro de espacio que supone mantener una coleccin de especies
hortcolas o leosas en pocos metros cuadrados en vez de en plantaciones de
cientos o miles de metros cuadrados.
-El elemento fundamental de la crioconservacin es el NL que se almacena y
mantiene en tanques especiales hermticos que permiten que se mantenga en
estado lquido y se evapore muy lentamente, manteniendo una temperatura de
196 C. El NL es incoloro, inodoro y no combustible y est a una temperatura
de 196 C a presin atmosfrica, por lo que el contacto con los tejidos provoca
el congelamiento del rea. Es de fcil manejo pero, teniendo en cuenta que
desplaza el oxgeno del aire, hay que tener cuidado al manipularlo, lo que se
debe hacer en lugares bien ventilados.
-El material vegetal a utilizar puede proceder de cualquier parte de la planta:
meristemos, yemas, pices, tallos, callos, embriones somticos, etc. Debe ser
selec-cionado de plantas sanas y, en el caso de proceder de material de
cultivo in vitro, los parmetros de cultivo se deben optimizar antes de la
crioconservacin, ya que el xito de ste proceso de conservacin va a
depender tanto de los tratamientos utilizados antes de someter al material al

NL, como de los utilizados una vez recuperado el material del NL. Por lo tanto,
es de extrema importancia poner especial atencin en la composicin de los
medios de cultivo donde se incube el material vegetal antes y despus de
introducirlo en NL para su conservacin [Sakai y cols., 1993, Cryopreservation
of Plant Genetic Resources 6: 5-26].

Marco-Medina, F. Serrano-Martnez, Crioconservacin: herramienta

para la conservacin ex situ de material vegetal, INSTITUTO DE
INVESTIGACIN
CIBIO
(CENTRO
IBEROAMERICANO
DE
LA
BIODIVERSIDAD). UNIVERSIDAD DE ALICANTE.
Dentro de las diferentes estrategias existentes en la actualidad para la
conservacin ex situ de germoplasma vegetal encontramos las tcnicas de
cultivo in vitro, permitiendo conservarlo a corto, medio y largo plazo. Para la
conservacin a largo plazo, la tcnica empleada es la crioconservacin. sta se
define como la preservacin de clulas viables, tejidos y rganos a
temperaturas ultrabajas, principalmente en nitr- geno lquido (NL), cuya
temperatura es de -196C. Este procedimiento de almacenamiento puede ser
aplicado a un amplio rango de organismos y tejidos biolgicos, y es
considerado el mtodo ms estable de conservacin de germoplasma, puesto
que la actividad metablica y muchos procesos fsicos cesan a esa temperatura
(PANIS & LAMBARDI, 2005). Dentro de la crioconservacin, existen diferentes
tcnicas para llevarla a cabo, aunque en todas ellas lo que se persigue es
evitar la formacin de hielo intracelular, lo que supondra causar daos
irreversibles en la membrana celular (PANIS & LAMBARDI, 2005). En general,
distinguimos las tcnicas clsicas, basadas en la deshidratacin inducida por la
congelacin (congelacin lenta o por etapas) y las modernas, basadas en la
vitrificacin (ENGELMANN, 2000). El trmino vitrificacin hace referencia a la
transicin de una solucin acuosa desde lquido a un estado amorfo vtreo,
evitando la formacin de hielo (FAHY et al. 1984). Esto es seguido por la
inmersin directa en NL. Se han descrito diferentes mtodos de
crioconservacin basados en la vitrificacin: encapsulacin-desecacin,
vitrificacin, encapsulacin-vitrificacin, desecacin, precultivo, precultivo-

desecacin, congelacin en gota (droplet freezing) y ms recientemente la

vitrificacin en gota (droplet vitrification) (ENGELMANN, 2000).
Fernndez et al 2011, Criopreservacin de germoplasma de aguacate,
El rescate de germoplasma de aguacate es fundamental para iniciar los
programas de mejoramiento gentico en este frutal, adems de evitar la
erosin gentica, se demanda como en cualquier especie el contar con la
variabilidad que sirva de base en la bsqueda de genes que coadyuven en la
formacin de un excelente genotipo. La conservacin y caracterizacin de las
accesiones permite en principio guardar bajo condiciones controladas y sin
riesgo de prdida el germoplasma y por otra parte proporciona informacin
sobre las caractersticas y genes de inters. Sin embargo, la conservacin ex
situ en campo resulta costosa, imprctica y expuesta a factores climticos que
podran eliminar los buenos propsitos; como alternativa ms segura es la
conservacin a travs de mtodos alternativos in vitro a corto-mediano plazo y
la criopreservacin a largo plazo.