MANUAL DE MTODOS

GENERALES PARA
DETERMINACIN DE
CARBOHIDRATOS

ELABORADO POR: Leidy Milena Cristancho Cruz

Ricardo Alonso Monroy Soler
UPTC
2014

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1. INTRODUCCION
Los carbohidratos constituyen la mayor parte de los componentes vegetales. Son
carbohidratos los diferentes azcares, almidones, celulosa, hemicelulosas, pectinas y
numerosas gomas. Los azcares como la glucosa, fructosa y sacarosa se acumulan
especialmente en el jugo celular; los almidones son los carbohidratos de reserva y se
encuentran en forma de plastidios; la hemicelulosa y pectinas son los polisacridos que
conforman el material estructural y las gomas son productos de desecho. Dada la
importancia de estos compuestos se han desarrollado varios mtodos para su
determinacin: Fehling, Benedict, Somogy, Lane-Enyon, Hagerdorn-Hensen, etc., pero
todos ellos se basan en el mismo principio:
Todos los azcares con un grupo aldehdo libre o un grupo cetnico se clasifican como
azcares reductores y se transforman fcilmente en enedioles (reductonas) al calentarlos
en soluciones alcalinas; dichos enedioles son altamente reactivos y se oxidan fcilmente
en presencia de oxgeno u otros agentes oxidantes, por lo tanto, los azcares en solucin
alcalina rpidamente reducen iones oxidantes como Ag+, Hg+, Cu2+ y Fe(CN)63- y los
azcares se oxidan formando mezclas complejas de cidos. Esta accin reductora es la
que se utiliza tanto en las determinaciones cualitativas como cuantitativas.
Una de las tcnicas analticas ms potentes consiste en determinar la cantidad de una
substancia disuelta midiendo la cantidad de radiacin absorbida por la misma es conocida
como Espectrofotometra
Dentro de la bromatologia un apartado escencial son las pruebas analiticas las cuales no
son otra cosa que la identificacion y cuantificacion de los diversos carbohidratos
presentes en un alimento, pudiendo aprovechar un carbohidrato con fienes industriales o
para aseguarar la composicion que un producto alimentario pueda tener; la analitica

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permite entre otras cosas el control del estado de las materias primas o los productos
durante todo el proceso de transporte almacenamiento o transformacion.
El muestreo de los productos o materias primas hace uso de analisis quimicos e
intrumentales que no requieren cantidades grantes de muestra para poder hacer un
analisis y determinar su composicion; algunas tecnicas de espectrofotometria tienen un
carcter dual, al permitir la identificacion y la cuantificacion de un compuesto de
cualquier alimento; los analisis de cualificacion de la molecual de carbohidrato utiliza
tecnicas quimicoas de reacciones oxidativas, adicion y demas, con lo que se logra
catalogar un carbohidrato

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INDICE
1. INTRODUCCION

2. METODOS CUANTITATIVOS

2.1 DETERMINACION DE CARBOHIDRATOS TOTALES POR

ESPECTROFOTOMETRIA UV (METODO DE FENOL-SULFURICO)

2.2 DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES TOTALES POR

ESPECTROFOTOMETRIA UV (METODO DE ACIDO DINITROSALICILICO DNS)

2.3 DETERMINACION DE AZUCARES POR EL METODO OPTICO DE

POLARIMETRIA

10

2.4 DETERMINACION DE AZUCARES (GLUCOSA, SACAROSA Y FRUCTUOSA)

POR HPLC (CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION)

12

2.5 DETERMINACION DE AZUCARES POR ESPECTROSCOPIA POR

INFRARROJO CERCANO

17

2.6 ANALISIS DE POLISACARIDOS (DETERMINACION DE FIBRA DIETETICA)

20

3. METODOS CUALITATIVOS

22

3.1 PRUEBA DE MOLISCH

22

3.2 PRUEBA DE BENEDICTO

23

3.3 PRUEBA DE LUGOL

24

3.4 PRUEBA DE BIAL

24

3.5 PRUEBA DE SELIWANOFF

26

3.6 PRUEBA DE BARFOED

27

3.7 PRUEBA DE FEHLING

28

3.8 EZQUEMA DE ANALISIS CUALITATIVO PARA CARBOHIDRATOS

28

4. BIBLIOGRAFIA

29

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2. METODOS CUANTITATIVOS
2.1 DETERMINACION DE CARBOHIDRATOS TOTALES POR
ESPECTROFOTOMETRIA UV (METODO DE FENOL-SULFURICO)
INTRODUCION
El metodo por espectrofotometria UV hace referencia al uso de la luz para medir las
concentraciones de ciertas sustancias quimicas. Para que este fenomeno pueda llegar a medirse
se debe tener presente la concentracion de las especies abosorbentes dado a que esta es
proporcional a la absorbancia segn la ley de lamber-bee donde:
A=ebc

A es la absorbancia (magnitud adimensional)

e es un coeficiente de proporcionalidad denominado coeficiente de extincin molar.
Indica la absorbancia de una determinada sustancia a una longitud de onda dada y se
expresa en M-1 .cm-1.
b es el ancho o espesor de la celda donde se deposita la muestra y se expresa en cm.
c es la concentracin expresada en moles / Litro (M)

FUNDAMENTO
La reaccion de color para medir la concetracion de carbohidratos solubles por espectrofotometria
se basa en la utilizacion del metodo colorimetrico de fenol-sulfurico que depende de la
deshidratacion de sacaridos derivados de hidrolisados a furfural que transcurre en el proceso de la
reaccion. Los derivados del furfural con las formas del fenol coloreado abdorbe la luz en el rango
visible a una longitud de onda de 490 nm.
Reaccion:
FENOL+ H2SO4 (concentrado) + CARBOHIDRATO

HMF (amarillo naranja)

Para hexosas (hidroximetil furfural)

Para pentosas (metil furfural)
METODOLOGIA

Preparacion de la muestra

A 2 ml de alcuota de una solucin de hidratos de carbono se mezcla con 1 ml de solucin acuosa

al 5% de fenol en un tubo de ensayo. Posteriormente, se aade 5 ml de cido sulfrico

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concentrado rpidamente a la mezcla. Luego los tubos de ensayo se dejan en reposo durante 10
min, se agitan durante 30 segundos y se colocan durante 20 min en un bao de agua a
temperatura ambiente para el desarrollo de color. El blanco y la solucin patrn se preparan
conforme al procedimiento anteriormente descrito, utilizando el carbohidrato de inters.
Finalmente se lleva a una celda donde se deposita en el espectrofotmetro para programar la
longitud de onda a 490 nm y se procede a leer la absorbancia (M. DuBois, K. Gilles, J. Hamilton, P.
Rebers y F. Smith, 1956).

Preparacion de la curva patron

Se procede a determinar las diferentes concentraciones del carbohidrato partiendo de 0.01 % que
indica 0.1 gramos en 1000 ml de agua. Posteriormente se toman alcuotas de 0.1; 0.2; 0.3 y se
completa a volumen para 1.0 ml con agua destilada. Por ltimo se aade el fenol y el cido
sulfrico siguiendo la metodologa anterior, para ser ledas en el espectrofotmetro (R. Matissek,
F.M. Schnepel y G. Steiner, 1992).
Tabla 1: Preparacion de las soluciones patrones para elaborar una curva patron.

N de
tubos
1
2
3
4
5
6
7
8
blanco

patrn del
azcar (0.1 g/
1000 ml)
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9

agua
(ml)
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1

fenol 5%
(ml)
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0

H2SO4 Concentracin
(ml)
/ml
Absorbancia
5.0
10 /ml
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
-

Fuente: Anlisis de alimentos. 2da edicin, Editorial Acriba S.A Zaragoza Espaa.

Se determina la concentracin molar del carbohidrato patrn siguiendo la siguiente relacin:

Entonces: 1000 ml
0.1 ml

0.1 gramos de X azcar

X

X= 0.1 x0.1/ 1000

X = 10ug/ml (as determinamos para cada una de las concentraciones del azcar)
RESULTADOS

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Para leer los resultados de la muestra a analizar, es necesario contruir una curva de calibracion o
curva patron a diferentes concentraciones con el carbohidrato de interes (disacaridos y
monosacaridos) para determinar la absorbancia. Para calibrar el espectrofotometro se procede a
ubicar el blanco que se tiene provisto en la celda, ajustandolo al 100% de transmitancia y 0,000 de
absorbancia. Una vez obtenida la absorvancia de cada concentracion, se grafica sobre excel o una
hoja de papel milimetrado absorvancia vs concentracion de cada solucion preparada. La ecuacion
de linealidad que arroje la grafica de la curva patron se tomara como referencia para hallar
matematicamente la concentracion del azucar presente en la muestra.
Luego se procede a medir la absorbancia de la muestra de interes.
Entonces:
Se tiene que Y= mx+b (ecuacion de linealidad expresada en la curva patron)
Donde Y es la absorbancia del analito
m. es la pendiente (valor numerico) que tomo de la ecuacion de linealidad de la curva patron
x, es el dato que no conozco
b. es el intercepto (valor numerico) que tomo de la ecuacion de linealidad de la curva patron
teniendo en cuenta los datos de la ecuacion lineal despejamos X (lo tomamos como
concentracion del analito). Como obtenemos la concentracion diluida en ppm se realizan los
calculos necesarios para determinar la concentracion en gramos de la muestra analizada en
determinado alimento. O de igual manera la absorbancia que obtenemos cuando medimos la
muestra se interpola o extrapola en la grafica segn el valor arrojado.

2.2 DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES TOTALES POR

ESPECTROFOTOMETRIA UV (METODO DE ACIDO DINITROSALICILICO DNS)
INTRODUCCION
Los azucares reductores poseen poseen un grupo carbonilo libre formando un grupo hemiacetal
que le confiere la caracteristica de poder reaccionar con otros compuestos. El metodo de miller o
DNS (acido dinitrosalicilico como reactivo tiene la capacidad de oxidar los azucares reductores
mostrando un comportamiento diferencial hacia mono y disacaridos, dando resultados
colorimetricos que se puede medir con una longitud de onda de 575 nm.

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FUNDAMENTO
En disolucion alcalina el azucar se hidroliza produciendo un compuesto que se reduce a un grupo
nitro del DNS, para dar el producto monoamino correspondiente. Esta reaccion da un producto
colorido en solucion alcalina (SOUTHGATE, D.A.T, 1991). La reaccion que se lleva a cabo es la
siguiente:
Imagen 1: Reaccion de reduccion del Acido dinitrosalicilico.

Fuente: Nielsen, 2003

METODOLOGIA

Preparacion del reactivo DNS

Se prepara segn el metodo propuesto por Coughlan y Moloney. Se aade 10 g de cido

dinitrosaliclico (DNS) y 300 g de tartrato de sodio y potasio (sal de Rochelle) a 800 ml de NaOH
0,5 N y se calienta suavemente para disolver los reactivos. El volumen se completa hasta 1,0 L con
agua destilada (MP Coughlan, AP Moloney, 1988).

Preparacion de la curva patron

Se implementa el mismo metodo para realizar la curva patron, como se describio en el metodo
fenol-sulfurico. Emplendo una solucion patron de glucosa con una concentracion de 1.0 g/L, para
la cual se disuelve 0.1 gramos de glucosa en 90 ml de agua y se lleva a volumen a 100 ml. Esta
solucion patron se prepara a difentes concentraciones adicionando a cada tubo 1 ml del reactivo

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de DNS con agitacion constante. Posteriormente se lleva a bao maria durante 15 minutos se deja
enfriar y se aade agua destilada hasta completar el volumen respectivo. Se determina la
absorbancia de cada tubo a 575 nm en el espectrofotometro UV.

Preparacion de la muestra

Se toma 1 ml de la solucion acuosa de la muestra, enseguida se adiciona 1ml del reactivo de DNS
y se calienta por 15 minutos en bao maria. Se deja enfriar y se diluyen con 10 ml de agua
destilada. Se procede a leer la absorbancia junto con el blanco a la misma longitud de onda que
las muestras para la curva patron.
RESULTADOS
para realizar la curva patron se grafica concentracion en ppm de la glucosa vs absorbancia de las
muestras diluidas a diferentes concentraciones.
Imagen 2. Cruva patron por Espectrofotometria.

Fuente: Determinacin de azucares reductores por la tcnica de Miller.

https://es.scribd.com/doc/56421369/DETERMINACION-DE-AZUCARES-REDUCTORES-POR-LA-TECNICA-DE-MILLER

Para determinar la concetracion de azucares reductores en la muestra se aplica el mismo metodo

matematico (con el fenol-sulfirico) utilizando la ecuacion lineal de la curva patron. Tambien se
puede emplear una curva de calibracion para azucares reductores como la celobiosa u otro tipo de
azucar para determinar su respectiva absorbancia y asi su concentracion.

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2.3 DETERMINACION DE AZUCARES POR EL METODO OPTICO DE

POLARIMETRIA
INTRODUCCION
La polarimetria es una tecnica no destructiva basada en la medicion de la rotacion optica
producida sobre un haz de luz polarizada al pasar por una sustancia opticamente activa. La
actividad optica rotatoria de una sustancia tiene su origen en la asimetria estructural de los
atomos de carbono, nitrogeno, fosforo o azufre en la molecula, lo cual es conocido como
quiralidad. La quiralidad se describe como la imagen en un espejo de una molecula la cual no
puede suporponerse sobre ella misma.
FUNDAMENTO
Se coloca un tubo de muestra que contiene un liquido en solucion, entre dos elementos
polarizantes. El primer elemento (polarizador) polariza la luz antes de que esta pase a traves de la
muestra. El segundo elemento (analizador) puede girarse para contrarrestar cualquier rotacion
por la muestra y por tanto, localiza la posicion angular resultante del plano de la luz, y por tanto la
cantidad de rotacion causada por la muestra, donde se expresa en grados angulares. En la
industria del azucar la rotacion se expresa sobre una escala diferente que se denota como Z. A
continuacion un esquema de polarizacion de una muestra de azucar en solucion.
Imagen 3. Dsitribucion de la luz en polarimetria.

Fuente: https://es.scribd.com/doc/89862717/Analisis-polarimetrico.

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Cada sustancia opticamente activa tiene su rotacion especifica, determinada por la siguiente
ecuacion:
[] (t,) = (t,) / c I
Donde:
[] =rotacion especifica a una determinada sustancia
=rotacion optica (viene determinada por la estructura)
c= concentracion
I = paso optico a traves de la muestra
t= temperatura
=longitud de onda
Imagen 4.Esquema de un polarimetro

Fuente: TECNICAA., Manual de laboratorio para el anlisis azucarero Tecnicaa. 1986.

1 - Entrada de luz de Na
2 - Lente de iluminacin
3 - Filtro de luz
4 - Polarizador

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5 - Placa
6 - Cilindro conteniendo la solucin a medir
7 - Analizador
8 - Objetivo para el enfoque
9 - Ocular para visualizacin.
10 - Lupa
11 - Panel de lectura
12 - Tornillo para la escala
METODOLOGIA
Se toman 13 gramos de azucar y se disuelven en 40 ml de agua en un vaso precipitado en
constante agitacion, luego se traspasa a un matraz y se enraza a 50 ml con agua destilada.
Posteriormente se verte el contenido a un erlenmeyer y se aade 5 ml acido concentrado. Se
pone a bao maria de 7 a 15 minutos. Se deja enfriar la solucion y se procede a agregarla en el
tubo polarimetrico hasta llenarlo completamente (CHEN C. P, James, 1996). Se registra la lectura
del polarimetro una vez se estabiliza.
RESULTADOS
Se determina la concentracion del azucar segn la ecuacion y el angulo de rotacion, junto con la
temperatura al momento de la lectura con el equipo:
[] (t,) = (t,) / c I
la concentracion del azucar se expresa en gramos/ 100 ml de solucion.

2.4 DETERMINACION DE AZUCARES (GLUCOSA, SACAROSA Y FRUCTUOSA)

POR HPLC (CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION)
INTRODUCCION
La HPLC o cromatografia liquida de alta resolucion es una tecnica cromatografica usada para
separar componentes de una muestra que se fraccionan entre una fase movil liquida y una fase
estacionaria solida compuesta por particulas muy finas contenidas en una columna, y donde se
utiliza una presion muy elevada para forzar el paso del disolvente a traves de ella, consiguiendo
asi separaciones de gran resolucion, permitiendo su identificacion y cuantificacion. La
cromatografa lquida de alta resolucin tiene ventajas en el anlisis de los azcares debido a su

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gran solubilidad en agua y su idoneidad para la separacin de especies no voltiles o termolbiles

(Chicharro, Manuel 2007).
FUNDAMENTO
La muestra se introduce en pequeos volumenes a la corriente de la fase movil bombeada con
alta presion a una columna rellena de fase estacionaria y alli el analito se retarda preparandose
por medio de interacciones quimicas con la fase estacionaria mientras atraviesa la columna. El
retardo se conoce como tiempo de retencion, unico para cada analito.
Para la separacion de carbohidratos como sacarosa, glucosa y fructosa se utiliza una columna de
separacion rellena de una resina de intercambio cationico con base calcica, que exhiben
propiedades como intercambio de ligandos y exclusion por tamaos.
La muestra diluida es previamente filtrada para la inyeccin en la columna, dependiendo de la
geometra de los hidroxilos de los diferentes azcares, estos interactan con los cationes de la
resina por afinidad, variando gradualmente los resultados de los tiempos de elucin de las
diferentes especies. El mtodo se aplica a molculas de bajo peso molecular relativo, que puedan
entrar en los poros de la resina y establecer enlaces temporales con los iones contrarios. Las
molculas largas no entran fcilmente en los poros y ellas eluyen con mayor rapidez. La
estimacin exacta de la altura de pico para un azcar se obtiene por un sistema de integracin
electrnico que luego lo relaciona al obtenido por un estndar (Herrera,Ana C 2011).
MATERIALES Y EQUIPOS

Cromatgrafo lquido de alta resolucin con detector de ndice de refraccin WATERS I.

Inyector de la muestra automtico
Bomba isocrtica de alta presin para HPLC
Columna rellena de resina de intercambio con base clcica, con tamao de
partcula de 10 15 m, longitud 250-300m (Sugar Pack I).
Calentador de columna para 90 C
Integrador electrnico
Instrumentos de filtracin (Filtros de jeringa de 25 a 50 mm de dimetro en conjunto con
membranas de filtracin de 0.45 m,)
Balanza analtica de precisin de 0.1 mg
Viales

Reactivos

Sacarosa Grado analtico

Glucosa Grado analtico
Fructosa Grado analtico

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EDTA (Clcico) Grado analtico

METODOLOGIA

Preparacion de la fase movil

Se preparan 1000 ml de solucin de EDTA (Sal Clcica) de 50 ppm, se filtra por membrana de
0.45 m y se desgasifica.

Preparacion de estandares de calibracion externos

Se preparan 100 ml de soluciones para los estndares indicados en la tabla 1, registrando el

peso exacto utilizado en la preparacin
Tabla 2. Concentraciones de estandares de calibracin externos para HPLC

Analito de calibracion

Concentracion (ppm)

Sacarosa

Glucosa

0.5

Fructosa

0.5

Preparacion de la muestra

Se pesa aproximadamente de 0,75 g a 1.0 g de melaza de caa, registrando el peso exacto de

la muestra, que se transfiere cuantitativamente a un matraz volumtrico de 100 ml y se diluye
100 ml y se homogeniza.
La solucin se filtra por una membrana de 0.45 m provista de un prefiltro Sepak.

Condiciones para la operacin de HPLC

Velocidad de la Fase mvil : 0.5 a 0.6 ml/min en elucin isocrtica

Presin 1300 psi
Temperatura de 80 a 85 C
Volumen de inyeccin de muestras 20 L
RESULTADOS
Tres parametros instrumentales que afectan la sensibilidad son: la temperatura del detector,
presion del gas de nebulizacion y la ganancia. La temperatura del detector se estudia a un
intervalo de 40-60 C. una temperatura de 45 es suficiente para permitir la evaporacion completa

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del disolvente y por lo tanto dando un ruido insignificante. Una velocidad de flujo (presin) del
sistema del aire a 3 bar y una ganancia de 5 proporcionaron una buena sensibilidad y una
adecuada relacin seal-ruido (Luciana C. Nogueira 2005).

Clculos

Clculo del Porcentaje Sacarosa, Fructosa y Glucosa por HPLC

El integrador suministra porcentajes de reas y alturas con su correspondiente tiempo de
retencin que se relacionan con las reas de los estndares de calibracin externos de Sacarosa,
Glucosa y Fructosa, con las reas de los picos cercanos a los tiempos de retencin.
Clculo del porcentaje de Sacarosa en la muestra
Se toma el rea de la sacarosa correspondiente a un tiempo de elucin de aproximadamente 7.53
minutos y se calcula el Factor de Respuesta (FR).

Donde:
Area = Dada por el integrador para el estndar de Calibracin de Sacarosa
Concentracin = Gramos exactos de Sacarosa Pesados
Para hallar el % de sacarosa:
% sacarosa= Area de la muestra a 7. 53 min x 100%
FR x concentracion muestra
Clculo del porcentaje de Glucosa en la muestra
Se procede igual que para el clculo de la Sacarosa, teniendo en cuenta que el tiempo de elucin
de la glucosa es en aproximadamente 9.52 min. Se toma el rea de la Glucosa correspondiente a
un tiempo de elucin de aproximadamente 9.52 minutos y se calcula el Factor de Respuesta (FR).

Donde:
Area = Dada por el integrador para el estndar de Calibracin de Glucosa
Concentracin = Gramos exactos de Glucosa Pesados
Para hallar el % de glucosa:
% glucosa = Area de la muestra a 9.52 min x 100%
FR x concentracion muestra

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Clculo del porcentaje de Fructosa en la muestra

Se procede igual que para el clculo del porcentaje de Sacarosa y glucosa, se identifica el rea de
la fructosa correspondiente a un tiempo de elucin de aproximadamente 11.17 min y para el
calculo el Factor de Respuesta (FR).

Donde:
Area = Dada por el integrador para el estndar de Calibracin de fructosa
Concentracin = Gramos exactos de fructosa Pesados
Para hallar el % de fructosa:
% fructosa = Area de la muestra a 11.17 min x 100%
FR x concentracion muestra
Imagen 5. Muestra un cromatograma tpico para la separacin de los cinco hidratos de carbono
utilizados en el proceso de optimizacin.

Fuente: Journal of Chromatography A, Volume 1065, Issue 2, 2005, 207 210. (1) La fructosa
(t R 8,76 min), (2) la glucosa (t R 9,71 min), (3) la maltosa (t R 15,45 min), (4) maltotriosa (t R 22,21
min), (5) maltotetraosa (t R 29,41 min). La concentracin de los estndares en la mezcla fue de 2 g
/L

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La figura anterior representa el mtodo estndar externo que se usa generalmente para calibrar el
sistema cromatogrfico para la cuantificacin de hidratos de carbono. Para ello, las soluciones
estndar azcares con diferentes concentraciones (0,05-5,0 g / L para la fructosa, 0,05-5,0 g / L
para la glucosa, 0,05 a 15,0 g / l de maltosa, 0,05 a 10,0 g / L para maltotriosa, y 0.05- Se utilizaron
5,0 g / L para la maltotetraosa), de acuerdo a la concentracin de la muestra en el alimento Y.
(Wei, MI Ding J. Chromatogr. A, 904 (2000))

2.5 DETERMINACION DE AZUCARES POR ESPECTROSCOPIA POR

INFRARROJO CERCANO
INTRODUCCION
La espectroscopia por infrarrojo cercano (NIRS) es una metodologa instrumental que ha
presentado un desarrollo creciente en los ltimos aos en la industria azucarera mundial. Se la
utiliza tanto en centros de investigacin como en diversas industrias, por ser una tcnica no
destructiva, rpida, que no emplea reactivos qumicos y que requiere menos mano de obra que los
mtodos tradicionales empleados en el laboratorio. La espectroscopia estudia la interaccin de la
radiacin electromagntica con la materia. NIRS comprende el segmento de luz de longitudes de
ondas entre 800 y 2600 nm del espectro electromagntico y analiza la absorcin de energa en
dicha regin por los grupos funcionales de las molculas de la muestra (ZOSSI, Silvia; RUIZ,
Roberto M 2010).
FUNDAMENTO
La espectroscopia IR se fundamenta en la absorcin de la radiacin IR por las molculas en
vibracin. Una molcula absorber la energa de un haz de luz infrarroja cuando dicha energa
incidente sea igual a la necesaria para que se d una transicin vibracional de la molcula. Es decir,
la molcula comienza a vibrar de una determinada manera gracias a la energa que se le
suministra mediante luz infrarroja.
Pueden distinguirse dos categoras bsicas de vibraciones: de tensin y de flexin. Las vibraciones
de tensin son cambios en la distancia interatmica a lo largo del eje del enlace entre dos tomos.
Las vibraciones de flexin estn originadas por cambios en el ngulo que forman dos enlaces. En
principio, cada molcula presenta un espectro IR caracterstico (huella dactilar), debido a que
todas las molculas (excepto las especies diatmicas homonucleares como O2 y Br2) tienen
algunas vibraciones que, al activarse, provocan la absorcin de una determinada longitud de onda
en la zona del espectro electromagntico correspondiente al infrarrojo.
En la zona del espectro electromagntico IR con longitudes de onda del infrarrojo medio (entre
4000 y 1300 cm-1) se suelen observar una serie de bandas de absorcin provocadas por las
vibraciones entre nicamente dos tomos de la molcula. Estas vibraciones derivan de grupos
que contienen hidrgeno o de grupos con dobles o triples enlaces aislados. (Nakamoto K., 1997).

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Tabla 3. Intervalo de frecuencia de las bandas como medidas estndar

Intervalo de frecuencia
(cm-1)
3600-3200
3500-3200
3000-2800
1600-1700
1640-1550
1400-1200
1350-1000
900-800
700-750
500-400

Enlace
O-H
N-H
C-H
O-H
N-H
C-H
C-N
As-O
As-O
As-O

Tipo de vibracin
Tensin
Tensin
Tensin
Flexin
Flexin
Flexin
Flexin
Tensin (simtrica)
Tensin (anti-simtrica)
Flexin

Fuente: Rubinson K.A., Rubinson J.F., Anlisis Instrumental, Ed. Pearson Educacin, 2000
METODOLOGIA

Preparacin de muestras liquidas

Para medir disoluciones diluidas de muestras slidas y liquidas disueltas en disolventes

transparente al IR, se utiliza un tipo especial de celda. Los disolventes ms utilizados para este
tipo de muestras son el CCl4 para la regin 4000-1330 cm-1 y el CS2 para la regin 1330-625
cm -1. Ambos disolventes son bastante txicos por lo que deben manejarse con precaucin o
sustituirse con n-hexano o n-heptano. La preparacin de disoluciones es un paso importante
en los estudios por IR. Disolver muestras slidas, reducir la viscosidad de lquidos y sobre todo,
diluir la muestra para as poder usar caminos pticos ms largos y reproducibles en el anlisis
cuantitativo. Tpicamente se analizan disoluciones de una concentracin de 0,05 % a 10% en
clulas de 0,1 a 1 mm de espesor. Una combinacin prctica puede ser un 10 % de
concentracin y un camino ptico de 0,1 mm. Puesto que se necesitan volmenes pequeos
de muestra, se suele utilizar el mtodo gravimtrico en su preparacin (B. Stuart John Wiley &
Sons 2004).

Preparacin de muestras solidas

Generalmente las muestras slidas se debe pulverizar hasta que el tamao de sus partculas
sea menor que la longitud de onda de la radiacin (<2 m) para evitar los efectos de la
dispersin de la misma.
Una de las tcnicas ms populares es la formacin de pastillas de KBr (tambin se han usado
otros haluros de metales alcalinos). Las sales de haluros tienen la propiedad de flujo en fro
(cold flow), por lo que, cuando se somete a la presin adecuada este material finamente
pulverizado, sinteriza y forma una tableta transparente que se asemeja a un cristal. Al usar

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esta tcnica, se mezcla a fondo un miligramo o menos de la muestra finamente pulverizada,

con aproximadamente 100-300 mg de polvo de KBr. La mezcla se puede realizar con un
mortero y su mano o en un pequeo molino de bolas. Posteriormente se presiona la mezcla
en un troquel especial entre 700 y 1000 kg/cm2 hasta obtener un disco transparente. Se
obtienen mejores resultados si el disco se prepara a vaco para eliminar el aire ocluido. A
continuacin, el disco se coloca en la trayectoria del haz del instrumento para su examen
espectroscpico. Los espectros obtenidos presentan a menudo bandas a 3450 y 1640 cm-1
debidas a la humedad absorbida.
Imagen 6. Troquel para fabricar discos uniforme con reproducibilidad

Anlisis cuantitativo

Para el anlisis cuantitativo en el caso del IR se utiliza la cantidad de radiacin

electromagntica absorbida, y el parmetro a medir es el cociente entre la intensidad de la
radiacin (de una longitud de onda determinada) antes y despus de atravesar la muestra. La
ley de Beer describe la relacin entre esta magnitud determinada experimentalmente y la
concentracin:
A = -log (I/Io) = a b c
Donde b es el espesor de la celda que atraviesa la radiacin y a, la absortividad molar, es una
constante para cada sustancia a una longitud de onda. Esta relacin de proporcionalidad
directa motiva que sea la absorbancia la magnitud utilizada en estudios cuantitativos,
mientras que la transmitancia se prefiere en los estudios cualitativos. As pues, una
representacin de la absorbancia frente a la concentracin debe ser lineal con una pendiente
ab y debe pasar por el origen.
Para analizar una disolucin de concentracin desconocida se deben preparar disoluciones
patrn, elegir una banda adecuada, medir la absorbancia a esa longitud de onda y dibujar una

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recta de calibrado. La concentracin de la muestra problema se hallar en esta recta de

calibrado a partir del dato experimental de absorbancia medido en el aparato (Nakamoto, k.
2004).
RESULTADOS
Para los compuestos carbonilicos, como aldehdos, cetonas, cidos carboxlicos y sus derivados, el
grupo funcional principal en los carbohidratos es el que absorbe con una alta intensidad en la
regin del infrarrojo en la zona de 1850- 1650 cm-1. Estas vibraciones generalmente por
alargamiento de este grupo especficamente.
Imagen 7. Representacin del espectro de la molcula de glucosa

Fuente: Mc.Murry J. Qumica Orgnica, quinta edicin .Thomson Editores Mxico 2000).
Los picos que identifican cada banda en el espectro se relaciona a la longitud de onda entre los
enlaces de la molcula. As tenemos enlace C-C, C-H etc.

2.6 ANALISIS DE POLISACARIDOS (DETERMINACION DE FIBRA DIETETICA)

INTRODUCCION
La fibra diettica se define como los polisacridos y lignina que no son digeridos por enzimas
humanas (Lee y Prosky, 1995). Los mtodos (AOAC 985.29, 993.21, Horwitz, 2005) se
fundamentan en aislar la fraccin de inters con la precipitacin selectiva y despus determinar su
peso. Una muestra gelatinizada de alimento seco, desengrasado se digiere enzimticamente con
alfa-amilasa, amiloglucosida y proteasa para hidrolizar el almidn y la protena. El contenido total

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de la fibra de la muestra se determina agregando etanol al 95% a la solucin para precipitar toda
la fibra. La solucin entonces se filtra, se recupera, se seca y se pesa, el residuo se reporta como
fibra. (Prosky et al, 1984, Prosky et al, 1985)

FUNDAMENTO
Muestras en duplicado de alimentos secos y desgrasados son gelatinizados con a amilasa
trmicamente estable y luego digerida enzimticamente con proteasa y amiloglucosidasa para
remover la protena y el almidn. La fibra diettica soluble es precipitada por la adicin de etanol,
el residuo total se filtra, se lava, se seca y se pesa. En el residuo en duplicado se determina
protena, y en el otro cenizas (Official Methods of Analysis. A.O.A.C 1990).
Fibra diettica total = Peso del residuo - Peso (protena + cenizas).
METODOLOGIA
Correr un blanco a lo largo de toda la determinacin.
Pesar por 1g de muestra (exactitud de 0.1g) en matraces de 500 mL. El peso de las muestras no
debe diferir en ms de 20 mg. Adicionar 50 mL de buffer de fosfatos 0.08M pH 6 0, Medir pH y
ajustar a pH 6 0.2 si es necesario.
Adicionar 0.1 mL de la solucin de amilasa y cubrir el matraz con papel aluminio, colocar el matraz
en un bao a ebullicin durante 15 min. Agitar suavemente cada 5 minutos. Verificar con
termmetro que los matraces mantengan 95-100C durante 15 minutos. Enfriar a temperatura
ambiente Ajustar a pH 7.5 0.2 adicionando 10 mL de NaOH 0.275N, agregar 5 mg de proteasa
(disolver 50 mg de proteasa en 1mL de buffer de fosfatos. Adicionar 0.1mL de la solucin a cada
matraz). Cubrir el matraz con papel aluminio y colocarlos en un bao a 60C por 30 minutos con
agitacin continua.
Enfriar a temperatura ambiente, adicionar 10 mL de HCL 0.325N. Ajustar el pH a 4.0- 4.6,
adicionar 0.1mL de amiloglucosidasa, incubar a 60C por 30 minutos con agitacin continua.
Adicionar 280 mL de etanol 95% precalentado a 60C (medir el volumen antes de calentar). Dejar
en reposo 1 h. Pesar el crisol conteniendo la celita, humedecer y redistribuir la cama de celita con
etanol 78%. Aplicar succin.
Mantener la succin y cuantitativamente transferir el precipitado de la digestin enzimtica.
Lavar el residuo con 3 porciones de 20 mL de etanol 78%, lavar con 2 porciones de 10 mL de
etanol 95%, lavar con 2 porciones de 10 mL de acetona, si se forma una forma una goma, mover
con la esptula para mejorar la filtracin
Secar el crisol conteniendo el residuo toda la noche a 70C

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Enfriar en desecador y pesar

Restar el peso del crisol con la celita para conocer el peso del residuo
RESULTADOS
Clculo de fibra diettica total:
% FDT = [ (masa del residuo - P - C - B)/ masa de la muestra)] x 100
Donde:
- m = masa de la muestra = promedio de la masa de 2 muestras (mg).
- m1 = masa del residuo = promedio de las masas de las muestras determinadas en duplicado
(mg).
- P y C = masa (mg) de protena y cenizas, respectivamente en los residuos de las muestras.
Informar el % de fibra al 0,1 %, sobre la base de la muestra original considerando que ha sido
desgrasada en el caso de contener ms de 10 % de grasa.

3. METODOS CUALITATIVOS
3.1 PRUEBA DE MOLISCH
Es la prueba especfica para determinar la presencia de carbohidratos en una muestra, al
deshidratar el glcido (monosacridos-alta reaccin y disacridos, polisacridos-baja reaccin)
forma Furfural; este al reaccionar con -Naftol produce un complejo de color morado
(Condensacin del Furfual) (Quesada, 2007; Amalesh, Et.Al., 2006).
Imagen 8. Reaccin qumica en la Prueba de Molisch.

Fuente: Fuente: Harper College (n.d.).

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Mtodo: se colocan 1-2 mililitros (ml) de una solucin muestra en un tubo de ensayo, se aaden
dos gotas de reactivo de Molisch (una solucin de -napthol en etanol al 95%). se vierte luego
lentamente por la pared del tubo (Quesada, 2007) 1-2 ml de cido sulfrico concentrado de
(Harpercollege, n.d.).
Resultados: la formacin de una capa intermedia de color Purpura es indicativo de la presencia de
furfural (Glcido deshidratado) condensados; el tiempo que demore la reaccin es indicativo del
nmero de carbonos que tenga el glcido, as, una pentosa (5c) tiene una alta reaccin y por el
contrario una hexosa (6c) tiene una baja reaccin (Harpercollege, n.d.).

3.2 PRUEBA DE BENEDICTO

Cuando un carbohidrato posee en su estructura un grupo carbonilo libre (C=O) esta reducir el
reactivo de Benedicto por oxidacin con los iones cobre en una solucin de pH alcalino y la accin
del calor (Punto de ebullicin); y formara acido carboxlico; al reaccionar se puede denominar
como azcar reductor (Sakuta, n.d.).

Imagen 9. Reaccin de Oxidacin del cobre en presencia del glcido-reductor

Fuente: Fuente: Harper College (n.d.).

Mtodo: Coloque 2-5 ml de solucin de Benedicto en un tubo de ensayo pequeo y el calor en un
bao de agua hirviendo suavemente durante 2-3 minutos. Aadir 10 gotas de la solucin de
hidratos de carbono a ensayar, mezclar bien, y colocan de nuevo en el bao de agua hirviendo
durante 5 minutos adicionales (Universidad Nacional, n.d.; Firdouse y Alam, 2011). Un cambio de
color de azul a verde a rojo ladrillo amarillo y finalmente (Cu2O) indica que el hidrato de carbono
es un azcar reductor. La velocidad de reaccin es muy importante. La fructosa reacciona muy
rpidamente, glucosa y galactosa ms lentamente. Incluso el almidn y la celulosa darn
resultados dbiles si la solucin se calienta ampliamente (UNIVERSIDAD NACIONAL, n.d.).
Resultados: la reaccin positiva es una coloracin que va desde verde, amarillo, naranja y rojizo, el
grado de coloracin y el tono radica en la concentracin de cobre oxidado (Cu2O); esta reaccin
indica que es un azcar reducido.

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3.3 PRUEBA DE LUGOL

La interaccin del yodo o yodo potsico con el almidn forma coloraciones azules oscuras, debido
a la ocupacin de los espacios libres del glcido, este es un glcido alterado, al cual, sus
propiedades fsicas son modificadas, como la no absorcin lumnica
Mtodo: se toman 2 ml de la solucin de muestra, se colocan en un tubo de ensayo; se agrega dos
gotas de lugol y 1 ml de agua (HARPER COLLEGE, n.d.); o agregar 1 ml de reactivo para un peso
de muestra de 100 mgr (Girish, Et.Al., 2009).
Resultados: la formacin de un complejo azul oscuro, debido a la adhesin del colorante a la
molcula de azcar.

Imagen 10. Resultados negativos

de la prueba de Lugol

Fuente: HARPER COLLEGE, n.d.

Imagen 11. Resultado positivo de la

prueba de Lugol

Fuente: HARPER COLLEGE, n.d.

3.4 PRUEBA DE BIAL

Esta prueba detecta las pentosas. El reactivo deshidrata las pentosas formando furfural
(derivados de las pentosas). Estos derivados de las pentosas adems reaccionan con orcinol y los

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iones de hierro presentes en el test reactivo, generan productos de color azul (HARPER COLLEGE,
n.d.).
Imagen 12. Reaccin de deshidratacin y formacin de furfural.

Fuente: Fuente: Harper College (n.d.).

Mtodo: tomar dos ml o 1-2 gotas (Mahesh, Murugesh y Mohana, 2006) de una muestra de
solucin y colocarla en un tubo. Tomar dos ml del reactivo de Bial (solucin de orcinol, HCl y
cloruro frrico) y adicionarlo en el tubo. Entonces calentar la solucin lentamente con un
mechero Bunsen o en bao de Mara (HARPER COLLEGE, n.d.). Se debe calentar a 60 C durante
10 minutos (Daz, Jorrn y Brcena).
Resultados: es positivo si se observa un derivado azulado. Otros colores indican negativo (ver
imagen 13). Las hexosas generalmente producen un resultado de color verde, rojo o caf
(HARPER COLLEGE, n.d.).
Imagen 13. Resultados negativos
de la prueba de Bial

Fuente: HARPER COLLEGE, n.d.

Imagen 14. Resultado positivo de la

prueba de Bial

Fuente: HARPER COLLEGE, n.d.

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3.5 PRUEBA DE SELIWANOFF

Esta prueba detecta cetosas (hexosas). En el test se provoca una reaccin de deshidratacin de
cetohexosas para formar 5 hidroximetilfurfural. La formar 5 hidroximetilfurfural adems
reacciona con el resorcinol presente en el test (HARPER COLLEGE, n.d.).
Imagen 15. Reaccin de deshidratacin de Cetohexosas

Fuente: Fuente: Harper College (n.d.).

Metodo: tomar 0.5-2 ml (CRUZADO, GUTIERREZ y RUIZ, 2007) de muestra de solucin y
colocarla en un tubo. Tomar 1-2 ml del reactivo de Seliwanoff (solucin de resorcinol y HCl) y
adicionarlo. Calentar la solucin en un bao de Maria por dos minutos (HARPER COLLEGE, n.d.) o
llevar la muestra son reactivo a ebullicin y luego adicionar el reactivo y observar (CRUZADO,
GUTIERREZ y RUIZ, 2007).
Resultados: Un producto rojo indica un resultado positivo; debido a la formacion de 5
hidroximetilfurfural, reaccionando junto con el resorcinol.
Imagen 16. Resultado positivo
de la prueba de Seliwanoff

Fuente: HARPER COLLEGE, n.d.

Imagen 17. Resultado negativo de la

prueba de Seliwanoff

Fuente: HARPER COLLEGE, n.d.

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3.6 PRUEBA DE BARFOED

Se utiliza para detectar monosacaridos reductores en disolucin. Los monosacaridos reductores
son oxidados por el ion de cobre, formandose cido carboxilico y una precipitacion rojiza de ion
cobre. Los disacaridos reductores tiene la misma reaccin pero lo hacen mas lento (HARPER
COLLEGE, n.d.).
Imagen 18. Reaccin de oxidacin y formacin de cidos carboxlicos.

Fuente: Fuente: Harper College (n.d.).

Metodo. Tomar 1 ml de la solucin y colocarla en un tubo. adicionar 1-3 ml del reactivo de Barfoed
(Danmalam, Et. Al., 2009) (solucin de acetato cprico y cido actico) y adicionarla. Calentar la
solucion al bao de maria durante tres minutos (HARPER COLLEGE, n.d.).
Resultados: la formacion de precipitaciones rojizas dentro de los tres minutos indican un
resultado positivo (HARPER COLLEGE, n.d.).

Imagen 19. Resultado positivo

de la prueba de Barfoed

Imagen 20. Resultado negativo de la

prueba de Barfoed

Fuente: HARPER COLLEGE, n.d.

Fuente: HARPER COLLEGE, n.d.

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3.7 PRUEBA DE FEHLING

La prueba hace reduce el cobre (Cu++) por oxidacion con los todos los azucares reductores,
siempre que este en medio alcalino con una presencia de tartrato de sodio y potasio para permitir
la estabilizacion del cobre (De, Dey y Ghosh, 2010); (ver imagen 9).
Metodo: se llevan las dos fracciones del reactivo a un tubo de enzayo; la fraccion A es el sulfato de
cobre 7% disuelto en agua y la fraccion B es el Tartrato de potacio 35% y hidroxido de sodio 10%
diluidos en agua, una vez completado el reactivo (A:1-2ml+B:1-2ml) (UNIVERSIDAD DE LA
LAGUNA, n.d.) se mescla bien y se adicionan 1-5 ml del la muestra al tubo de enzayo y se lleva al
bao de maria por 5 minutos (Danmalam, Et. Al., 2009)
Resultado: la reaccion positiva forma un presipitado de color rojo ladrillo por la oxidacion del
cobre (reduccion).
Imagen 21. Coloracion positiva (derecha) y negativa (Izquierda) de Fehling.

Fuente: University of Oregon (n.d.)

3.8 EZQUEMA DE ANALISIS CUALITATIVO PARA CARBOHIDRATOS

La secuencia de analisi cualitativo a carbohidratos en cadena e identifica las cualidades de los
carbohidratos analisados, una vez es terminado el esquema puede ser determinadas algunas
propiedades y estrcutura de varios glucidos.
Imagen 22. Ezquema de analisis a carbohidratos.

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Fuente: Fuente: Harper College (n.d.).

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