PREPARACION DE EXTENDIDOS Y COLORACIONES

DIFERENCIALES
Moreno Luis Miguel1, Polanco C. Alejandro2, Ramirez R. Nayibe3
Escuela Ingeniera de Alimentos, Universidad del Valle
16 Diciembre 2015

RESUMEN
Se emplearon los diferentes mtodos de coloracin para distinguir de cada bacteria su
reaccin frente a estas tinciones, para la E.Coli y la E.Aureus se us la tcnica de tincin de
Gram identificando en estas que son gram negativas y gram positivas respectivamente, a la
B.Cereus se le identifico su espora mediante la coloracin necesaria posteriormente
mencionada, a la Proteus su motilidad, aunque no fue posible su observacin debido a que
la bacteria se muri o y finalmente a la Klebsiella se le identifico su capsula por el mtodo de
Anthony. Debido al pequeo tamao de los microrganismos se dispuso de un microscopio
ptico para que le campo fuese ms claro y poder identificar y observar estas bacterias.
Todos los resultados, a excepcin de la prueba de motilidad, fueron los esperados.
Palabras claves
Escherichia Coli, Estafilococos Aureus, Bacillus Cereus, Proteus, Klebsiella Pneumoniae,
capsula, espora, tincin de Gram, coloracin,
Abstract
Different staining methods were used to distinguish from each bacterium their reaction to
these dyes, for E.Coli and E.Aureus the Gram staining technique used in identifying these
are gram negative and gram positive respectively, the B. cereus spore was identified by his
later mentioned necessary coloration, the Proteus motility, although his remark was not
possible because the bacteria eventually died to Klebsiella his capsule was identified by the
method of Anthony. Due to the small size of the microorganisms were available for light
microscopy field will be clearer and to identify and observe these bacteria. All results,
except for the motility test, were as expected.
Keywords
Escherichia Coli, Estafilococos Aureus, Bacillus Cereus, Proteus, Klebsiella Pneumoniae,
capsule, spore, Gram stain, coloration.

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1. Luis.miguel.moreno@correounivalle.edu.co
2.Alejandro.polanco@correounivalle.edu.co
3.Nayibe.ramirez@correounivalle.edu.co

1428106
1423958
1429076

INTRODUCCIN
Las bacterias se caracterizan por ser microorganismos unicelulares que no poseen
membrana nuclear, en las cuales el material nuclear est organizado en una tira continua, a
veces circular, contenido en el citoplasma y presentan una actividad metablica. Existen
bacterias en forma redondeada denominadas cocos, en forma cilndrica, denominadas
bacilos y una tercera morfologa como son las que tienen forma de espirales, denominadas
espirilos. (Evelyn, 2005).
Se denomina frotis a la extensin que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o
cultivo con objeto de separar lo ms posible los microorganismos, ya que si aparecen
agrupados en la preparacin es muy difcil obtener una imagen clara y ntida. Este frotis
debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los mtodos
habituales de tincin que permiten la observacin al microscopio de las bacterias sin que la
muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijacin de una extensin bacteriana
hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible
la morfologa y bacteriana y las posibles agrupaciones de clulas que pudiera haber. El
frotis se prepara haciendo una extensin de los microorganismos sobre una superficie
transparente, en la cual se fijan y se tien los microorganismos. (Tortora et al, 2007).
La coloracin de gram permite separar a las bacterias en dos grandes grupos: Gram
positivos y Gram negativos, basados en que si retienen o no el colorante primario (cristal
violeta), luego del proceso de decoloracin. Los organismos que retienen el cristal violeta
luego de la adicin de agentes decolorantes como el alcohol, aparecen como azul oscuro o
violeta y se designan como Gram positivos: aquellos que pierden e cristal violeta y se tien
con el colorante secundario, la safranina, aparecen como rojos y se designan como Gram
negativos. (Gerard et al, 2005).
OBJETIVOS

Aprender las tcnicas de preparacin del frotis, de fijacin y coloracin ms

utilizadas en el estudio macroscpico de cultivos bacterianos, para poder as dar
pauta a la identificacin de las principales formas bacterianas y comprender la
importancia de las tinciones y su adecuado uso.
Identificar las tcnicas de coloracin ms comunes utilizadas para identificar
morfologa y estructuras de bacterias.

METODOS
Tabla 1 resultados observados de la tincin de gram de las bacterias E. Coli y E.Aureus
Escherichia Coli

Estafilococos Aureus

FOTO
Ilustracin 1 Coloracin de la E. Coli.

DESCRIPCIN DE
LO OBSERVADO

Ilustracin 2 Coloracin de la E. Aureus

Miden alrededor de 0.5u

Son circulares y cortas
Elevacin Convexas
Borde liso
No forman esporas

Miden alrededor de 0.5 a

1u
Se distingue un patrn con
forma de racimo de uvas
Borde ondulado
Elevacin convexa

COLORACIN DE La bacteria se tio de color rosado

La bacteria se tio de color
LA BACTERIA
morado
TEIDA
REACCIN A LA Segn el color rosado la bacteria es
Gram positivo
COLORACIN DE gram negativo
GRAM
Tabla 2 resultados observados de la bacteria Bacillus Cereus
Bacillus Cereus

FOTO

1
3

Ilustracin 3 Coloracin de Bacillus Cereus.

DESCRIPCIN
DE LO
OBSERVADO

Redondeados
Forman cadenas
Son gram positivos
presentan color verde en la parte externa (2)
Presencia de color verde en la parte interna(endoesporas)(1)

Tabla 3 resultados observados de la prueba de motilidad de la bacteria Proteus

PROTEUS

FOTO

Ilustracin 4 Prueba de motilidad de Proteus.

DESCRIPCIN
DE LO
OBSERVADO

Circulares y cortos
Borde ondulado y elevacin convexa
No se distinguieron los flagelos

ANLISIS DE LOS RESULTADOS Y DISCUSIN

Coloracin de Gram

Las bacterias gram positiva y las gram negativas presentan una gran diferencia en su pared
celular, las paredes de las gram positivas estn conformadas principalmente por
peptidoglicano, la cual se cree que es la responsable de retener el cristal violeta de la
tincin de gram debido a su gruesa capa, aunque estas clulas tambin presentan una gran
cantidad de cido teicoico (polisacridos que se unen al cido N-acetilmurmico o a los
lpidos de la membrana plasmtica.) este acido tiene una funcin de estabilizar la pared
celular. Adems los cidos teicoicos tienen un rol en la virulencia de estos
microorganismos, porque actan como antgenos de superficie que se unen a receptores
especficos en las clulas del husped. (Prescott et al, 1999).
Por otro lado la pared celular de la gram negativa est constituida de tres zonas, la
membrana plasmtica, el espacio periplsmico que incluye una fina capa de peptidoglicano
y la membrana externa. Esta ltima, exclusiva de las bacterias gram negativas, es una
bicapa lipdica que difiere de otras membranas por su capa externa, que est constituida por
una molcula anfiptica. Una de las funciones ms importantes de la membrana externa es
servir como barrera protectora. Evita o disminuye la entrada de sales biliares, antibiticos y
otras sustancias txicas que podran destruir o lesionar la bacteria. La membrana externa es
ms permeable que la plasmtica y permite el pasaje de pequeas molculas como glucosa
y otros monosacridos. (Prescott et al, 1999).
Una vez clara la composicin de las paredes celulares de las dos bacterias analizadas
(Escherichia Coli, Estafilococos Aureus) y de acuerdo a los resultados presentados en la
tabla 1. Es posible que la diferencia entre las bacterias gram positivas y negativa se deba a
su estructura conformada en la pared celular, el peptidoglicano no se tie por s mismo, ms
bien parece actuar como barrera de permeabilidad para evitar la prdida de cristal violeta.
Durante el proceso de coloracin las bacterias se tien primero con cristal violeta y luego se
tratan con yoduro para favorecer la retencin del colorante. En la decoloracin con etanol,
se cree que el alcohol contrae los poros de la capa gruesa de peptidoglicano y se retiene el
complejo colorante yoduro; as las bacterias adquieren color violeta. Por el contrario, la
capa de peptidoglicano de las bacterias gram negativas (Escherichia Coli) es muy fina, con
menos enlaces y con poros de mayor tamao. Adems, es posible que le tratamiento con
alcohol extraiga suficientes lpidos de la membrana externa como para aumentar su
porosidad. (Prescott et al, 1999). Por estos motivos el alcohol elimina ms fcilmente el
complejo cristal violeta yoduro en las bacterias gram negativas
Coloracin de capsula (Mtodo de Anthony)
Para realizar el mtodo de Anthony nos dieron la bacteria ( Klebseilla pneumoniae): este
mtodo nos dio positivo ya que se pudieron observar dos tonalidades, primero se ve un aro incoloro
alrededor de la bacteria la cual est de un tono morado, se puede diferenciar la capsula ya que esta
no permite la adhesin de partculas, por lo que la bacteria est rodeada de esta escritura que le
ayuda a protegerse de la fagocitosis y la acumulacin de alimento entre otras funciones. La capsula
puede englobar ms de una bacteria, pero en la Klebseilla pneumoniae solo rodea una elemento
5

bacteriano el cual es visible en la figura n o 3; la composicin qumica de la capsula es de glucdica

la cual est conformada habitualmente de polisacridos complejos, formadnos por una mezcla de
monosacridos y cido urnicos a los cuales se le asocian en ocasiones azcares aminados y
acetilados. Contienen gran cantidad de agua (hasta el 90%). Los azcares ms habituales que
constituyen los polisacridos son la D-galactosa, D-glucosa y D-manosa. (Pumarola, Rodriguez,
Garcia y Piedrola 1999).

CAPSULA

BACTERIA

Ilustracin 4 Observacin de la capsula bacteriana (Klebsiella Pneumoniae) por mtodo Anthony

Coloracin de esporas
Algunas bacterias Gram positivas forman estructuras inactivas de gran resistencia
denominadas esporas o endoespora, se desarrollan dentro de las bacterias de los gneros
bacillus y clustridum entre otros. Estas estructuras son resistentes a situaciones vitales
estresantes como el calor, la desecacin, la radiacin ultravioleta, los cidos y los
desinfectantes qumicos.
Las esporas son impermeables a la mayora de los colorantes, se observan como reas
incoloras dentro de las clulas coloreadas. Existen adems coloraciones especiales para
teir las esporas, como el verde malaquita al 5% utilizado en la bacteria Bacillus Cereus.
La situacin de la espora en la clula madre o esporangio, es caracterstica para una especie
bacteriana determinada, siendo esto importante para la identificacin de la bacteria. Para
esto se
Dentro de una clula vegetativa se produce una espora nica, que se diferencia de la clula
madre en su morfologa y composicin, en el aumento de la resistencia a los ambientes
adversos y en la ausencia de actividad metablica evidente. El proceso incluye la formacin
de numerosas cubiertas y la captacin de calcio con sntesis de cido dipicolnico. Al final
de la esporulacin queda una partcula deshidratada que contiene ADN genmico. Ese
6

ADN se vuelve resistente a la desecacin, al calor extremo, a la radiacin y al ataque por la

mayora de las enzimas y agentes qumicos.
De acuerdo a lo mencionado anteriormente se pudo observar utilizando el microscopio en
la bacteria Bacillus Cereus, confirmando con los datos registrados en la Tabla 2.

Prueba de motilidad
De acuerdo a los resultados de la tabla 3, Los flagelos son filamentos proteicos,
helicoidales, delgados y rgidos, de longitud y dimetro uniforme, responsables de la
movilidad de la bacteria. Los flagelos son tan delgados que no pueden observarse
directamente con un microscopio de campo claro, deben teirse con tcnicas especiales
para aumentar su grosor. (Schaechter et al, 1993). Esta puede ser una de las razones por las
cuales no se distinguieron los flagelos en la prueba de motilidad.
Los flagelos no son necesarios para la vida bacteriana. Su sntesis est regulada por las
necesidades nutricionales o el estado energtico y ocurre por la adicin de monmeros de
flagelina al extremo distal de los flagelos en crecimiento. La sntesis del filamento es un
ejemplo excelente de auto ensamblaje, es decir que la informacin necesaria para construir
el filamento est en la propia estructura de la subunidad de flagelina; no colaboran enzimas
especiales u otros factores. (Schaechter et al, 1993).
ANEXOS
CUESTIONARIO
1

Las esporas son ms difciles de colorear que las clulas vegetales por qu?
Rta// Las esporas son ms difciles de colorear que las clulas vegetales ya que estas
son impermeables a la mayora de los colorantes habituales y se identifica como una
zona clara, redondeada u ovalada, que contrasta con el resto de la bacteria que
aparece coloreada existente, no obstante, medios de tincin especiales que permiten
reconocerlos.

En su preparacin se observaron esporas libres y en el interior de la clulas

vegetativas. Como puede incrementarse el contenido del material capsular?
Rta// Las clulas vegetativas de las bacterias formadoras de endosporas comienzan
el proceso de esporulacin en el momento en que el nutriente esencial, como el
carbono o el nitrgeno se toma escaso o inaccesible. En el primer estadio
identificable de la esporulacin se forma un nuevo cromosoma bacteriano, que es
separado junto con una pequea fraccin de citoplasma mediante una invaginacin
7

de la membrana plasmtica denominada tabique de la espora. Ms tarde el tabique

de la espora se convierte en una membrana de doble capa que rodea al cromosoma y
al citoplasma. Esta estructura se localiza ntegramente en el interior de la clula
progenitora y se denomina preespora. Entre ambas capas de la membrana se
depositan capas espesas de peptidoglucano. Ms tarde se forma una capa gruesa de
protenas alrededor de la membrana externa llamada cubierta de la espora; esta capa
es responsable de la resistencia de las endosporas a numerosas sustancias qumicas
agresivas. La degradacin de la clula original determina la liberacin de la
endospora.
3

Los frotis de bacterias encapsulada no se lavan con agua ni se calientan. Porque?

Rta// los frotis bacterianos encapsulados no se lavan ni se calientan ya que la tincin
de la capsula es ms difcil que otros tipos de procedimientos de tincin porque los
materiales capsulares son sensibles al calor, hidrosolubles y pueden desprenderse o
eliminarse durante los procesos rigurosos de lavado y la fijacin. (Tortora, 2007)
Para localizar el lugar de la clula donde se encuentran estos componentes se
utilizan Mtodos Citoqumicos, consistentes en utilizar medios que pongan de
manifiesto un compuesto concreto en el interior celular.

Cmo se correlaciona la presencia de capsula de virulencia de una bacteria

patgena?
Rta// Patogenidad y virulencia bacteriana:
La adhesin, colonizacin y penetracin Agresinas, Mecanismos de defensa del
husped. Inmunidad Humoral y celular. La patogenicidad es la capacidad de un
microorganismo de producir enfermedad. La aparicin de la enfermedad depende en
gran parte de las defensas inmunolgicas del husped. La virulencia se refiere al
grado de patogenicidad. Una determinada cepa bacteriana puede ser virulenta o
altamente virulenta. El grado de virulencia se relaciona con el nmero de
organismos requeridos para producir la enfermedad o el tiempo en que tarda en
manifestarse sta. La patogenicidad microbiana puede expresarse slo cuando se
produce la enfermedad en el husped. Por el contrario, la resistencia del husped a
una enfermedad infecciosa, se advierte slo como una respuesta a la presencia del
microorganismo.

CONCLUSIN

Para una correcta visualizacin de la motilidad de la bacteria Proteus se deben tener

cuidados estrictos para poder observarla, de lo contrario como sucedi en el
laboratorio no pudo ser posible su movimiento en el microscopio.
8

Dependiendo de la composicin de la membrana de la bacteria, de si tiene mucho o

poco peptidoglucano, se puede dar que sea gram negativa o gram positiva.
Por medio de la tincin con verde de malaquita, el cual requiri del calor para la
penetracin; se pudo observar las endosporas aunque la estructura de la batera fuera
muy pequea.

Por medio de la tincin de cpsula se pudo observar y verificar la estructura de la

bacteria y su forma.

BIBLIOGRAFA

Prescott, Harley, Klein. Microbiologa. Mc Graw-Hill Interamericana de Espaa. 4

ed. 1999.
Schaechter M, Medoff G, Eisenstein BI, Guerra H. Microbiologa. Mecanismos de
las enfermedades infecciosas. Ed Panamericana. 2 ed. Buenos Aires 1993.
Pumarola, A. (1987). Microbiologa y parasitologa mdica.
Evelyn Rodrguez Cavallini, Bacteriologa General: Principios Y Prcticas de
Laboratorio 2005.
Tortora, G. J., Funke, B. R., & Case, C. L. (2007). Introduccin a la Microbiologa.
Ed. Mdica Panamericana.
Gerard J. Tortora,Berdell R. Funke,Christine L. Case. Introduccin a la
microbiologa, 2005.