Seminario Ingeniera Gentica

Definicin
La ingenieragentica es la tecnologa del control y transferencia de ADN de un organismo a otro, lo
que posibilita la creacin de nuevas especies, la correccin de defectos genticos y la fabricacin
de numerosos compuestos.
Clonacin celular de molculas de DNA
Objetivos de la clonacin celular
La clonacin cumple el propsito bsico de amplificar la muestra gentica de partida, generando un
nmero elevado de copias. Para el caso de la clonacin de molculas de cido nucleico, a la mera
amplificacin se aaden las aplicaciones derivadas de la expresin de su producto gnico.

La
clonacin se basa en la
realizacin de mltiples rondas de replicacin, pero en este caso catalizadas por la DNA polimerasa
propia de la clula en la que se llev a cabo el proceso, clula anfitriona. Para ello el fragmento
de DNA que debe clonarse (llamado inserto) se une a otro DNA (llamado vector) y la molcula
resultante (DNA recombinante) se incorpora a la clula anfitriona donde tiene lugar la amplificacin
por replicacin. La clonacin puede describirse en 7 etapas.
1 etapa: Preparacin del ADN
2 etapa: preparacin del vector
3 etapa: unin del ADN al vector
4 etapa: incorporacin del ADNr
5 y 6 etapas: propagacin celular y seleccin.
7 etapa: expresin del DNA clonado
1.-Insertos de DNA
Se parte de un lisado de clulas, a partir del cual se purifica el DNA. Este posteriormente se
fragmenta con enzimas de restriccin, para dar lugar a una mezcla cuyo contenido, en nmero y
tamao de fragmentos, depende del nmero de sitios de restriccin y de su accesibilidad por las
enzimas. En principio el fragmento que se va a clonar debe aislarse, o separarse del resto,
mediante alguna tcnica adecuada, por ejemplo electroforesis en gel de agarosa, centrifugacin en
gradiente de densidad o HPLC. En la prctica en muchos casos es difcil aislar un nico fragmento
de DNA para su clonacin que clonar la mezcla de fragmentos y ms tarde seleccionar el clon que
contiene el fragmento de inters.
Insertos de DNA procedentes de un mRNA

En muchos casos interesa clonar la secuencia codificante de un gen eucaritico, para lo cual se
parte de muestras de mRNA que debe convertirse en el DNA correspondiente para clonarse. Una
vez lisadas las clulas del rgano, tejido, tipo celular, estadio de desarrollo, etc., elegidas, se
purifica el mRNA, generalmente aprovechando la presencia de la cola poliA. Se emplea para ello
cromatografa de afinidad en columna o microesferas magnticas de afinidad, en ambos casos la
matriz cromatogrfica o la microesfera magntica llevan unido un oligo dT. Cuando el mRNA que va
a clonarse no es abundante, puede amplificarse mediante PCR. Para preparar el inserto de DNA se
utiliza la transcriptasa inversa.
1.1 Endonucleasa de restriccin
En 1975 Daniel Nathans y Hamilton O. Smith descubrieron un tipo de protenas -las enzimas
endonucleasas o enzimas de restriccin- que actan como "tijeras moleculares", cortando la doble
cadena de ADN a travs del esqueleto de fosfatos sin daar las bases. El descubrimiento de estas
enzimas condujo a dichos microbilogos al Nobel en 1978 y dio origen a la ingeniera gentica.
Las enzimas de restriccin cortan dejando extremos cohesivos o romos. Los extremos cohesivos son
generados cuando la enzima corta las dos hebras asimtricamente. Por otro lado, los extremos
romos son generados cuando la enzima corta las dos hebras por el mismo lugar.

Existen 3 tipos de enzimas de restriccin:

1.

Tipo I y Tipo III:

a.

Tienen actividad de restriccin (cortan) y modificacin (metilan).

b.

Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan lejos

de la secuencia de reconocimiento, ya sea ro arriba o ro abajo. Las Tipo III cortan de 5-8 bases
antes o despus de la secuencia que reconocen.
c.
Necesitan ATP para moverse a travs de la molcula de DNA, desde el lugar de
reconocimiento hasta el sitio del corte.

2.

Tipo II:

a.

Slo tienen actividad de restriccin.

b.

Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen.

c.

Slo requieren Mg++ como cofactor.

d.

No necesitan ATP.

Otras enzimas de restriccin de Tipo II, como SmaI, cortan el DNA formando fragmentos romos. Los
fragmentos de DNA con extremos romos tambin pueden unirse y formar molculas recombinantes,
pero primero deben modificarse. La enzima desoxinucleotidil transferasa terminal se utiliza para
crear extremos de cadena sencilla mediante la adicin de colas de nucletidos. Si a uno de los
DNA se le aade una cola de polidA, y al otro DNA se le aade una cola de poli-dT, se forman colas
complementarias, y los fragmentos pueden unirse mediante puentes de hidrgeno.
Entonces, por ligacin, pueden formarse molculas recombinantes.
La diferencia estructural ms importante estriba en que los sistemas de tipo II estn formados por
dos enzimas, una responsable de la modificacin y otra de la restriccin, en los sistemas de tipo I y
II por el contrario, ambas actividades residen en la misma enzima.
Las enzimas de restriccin son producidas por bacterias como mtodo de defensa contra virus y
degradan el ADN extrao.
A su vez, el propio genoma bacteriano est protegido contra sus enzimas de restriccin mediante
metilaciones (es decir, el agregado de un grupo metilo [-CH3)]) en un tomo especfico de ciertos
nucletidos.
La caracterstica central de un sistema de modificacin-restriccin es que las bacterias poseen
metilasas y restrictasas con la misma especificidad de secuencia. La metilasa introduce grupos
metilo en la misma secuencia reconocida por la enzima de restriccin. La metilacin hace que la
diana sea resistente a la restriccin.

Nomenclatura
E
co
R
I

Ejemplo
Escherichia
coli
RY13
La primera enzima identificada

Corresponde a:
Gnero de la bacteria
Especie de la bacteria
Cepa de la bacteria
Orden de identificacin de la enzima en la bacteria

Ejemplos
EcoRI
Es una enzima de restriccin de tipo 1, est constituida por 2 subunidades simtricas en donde
cada una de ellas tiene un sitio de reconocimiento y un sitio activo de corte. De esta manera cada
subunidad lleva a cabo un corte, es decir la ruptura de la unin fosfodister por hidrlisis, y deja un
fosfato sobre el carbono 5 en la cadena con direccin 5 y un hidroxilo en el sitio 3 del extremo de
cada cara del corte. Al producirse el corte cada pedazo queda con un extremo colgante de 4
nucletidos en una de las dos cadenas. Estos extremos colgantes son sumamente provechosos
porque permiten la unin especfica con un extremo complementario.
BamHI
Es una enzima de restriccin de tipo II, produce extremos pegajosos , tambin constituida de dos
subunidades simtricas.

2.- Preparacin del vector de clonacin

El vector es un portador, una molcula de DNA cuya misin es unirse con el fragmento de DNA que
se desea clonar para facilitar su entrada en la clula anfitriona y su replicacin. En general el vector
tiene un tamao pequeo, es fcil de aislar y caracterizar, se conocen su secuencia y su mapa de
restriccin, es fcil de introducir en la clula anfitrion. Es conveniente que el vector posea la mayor
variedad posible de sitios de restriccin, para facilitar su unin con el fragmento de DNA que se
quiere clonar, y que incluso al menos un gen marcador (por ejemplo un gen de resistencia a algn
antibitico) que permite identificar o seleccionar las clulas que llevan el DNA recombinante.
2.1 Tipos de vectores
Los vectores utilizados para la clonacin de DNA son muy variados. Pueden clasificarse segn
varios criterios, tales como:
Procedencia procaritica o eucaritica
El tamao del inserto que admiten
El tipo de molcula a partir del que se preparan:
Plsmidos: Bacterianos, de levadura o de plantas
Bacterifagos
Cromosomas artificiales: derivados de elementos cromosmicos de fagos, bacterias o
levaduras
Quimeras: Molculas formadas combinando partes de otras cuyo origen es diferente,
normalmente quimeras de plsmido y fago (csmidos, fagmidos, fsmidos)
Plsmidos como vectores
Los plsmidos poseen propiedades muy tiles, como vectores de clonacin. En esas propiedades se
incluyen:
Su pequeo tamao: Hace que el DNA sea fcil de aislar y manipular
Son molculas de DNA circular: Confiere estabilidad al DNA durante su aislamiento
Origen de replicacin independiente: De manera que la replicacin del plsmido en la clula
transcurre independientemente del control directo del cromosoma
Mltiple nmero de copias: En la clula pueden estar presentes varias o numerosas copias
Presencia de marcadores seleccionables: Facilita la deteccin de clones que
contienen el plsmido
Dependiendo del sistema hospedador-plsmido, la replicacin del plsmido puede estar bajo un
estricto control celular, en cuyo caso solo se hacen unas pocas copias, o bajo un control celular
relajado, en cuyo caso se produce un gran nmero de copias.
Plsmido pBR322
Como se sabe el sitio para BamHI est dentro del gen de resistencia a la tetraciclina u el sitio para
PstI est dentro del gen de resistencia a la ampicilina, si se inserta un trozo de DNA en uno de estos
sitios, la resistencia al antibitico conferida por el gen que contiene este sitio se pierde, fenmeno
conocido como Inactivacin por insercin. La inactivacin por insercin se utiliza para detectar
la presencia de DNA clonado dentro del plsmido. Por tanto cuando pBR322 es digerido con BamHI
y se liga a un DNA, y luego se aslan, aquellas clulas que presenten resistencia a tetraciclina y
ampicilina no portan DNA clonado, porque tras la digestin y linearizacin se ha producido la
recircularizacin del plsmido.
Los primeros plsmidos de clonacin utilizados eran plsmidos que existan de forma natural. El
plsmido pBR322 constituye una generacin posterior de vectores de clonacin in vitro. El gen de
resistencia a tetraciclina proviene de un plsmido, el origen de replicacin de otro y el gen de
resistencia a la ampicilina del transposn Tn3. Hay ahora nuevas generaciones de vectores que se
han construido de manera que posean caractersticas ms tiles y que sean ms fciles de
manejar. Estos nuevos vectores incluyen un sitio mltiple de clonacin o polylinker, que es un
corto segmento de DNA con muchos sitios de restriccin diferentes, cada uno de ellos nico para el

vector.El sitio mltiple de clonacin forma parte de un ORF responsable de alguna caracterstica
fenotpica, por lo que resulta sencillo confirmar si tras la restriccin se ha clonado un fragmento de
DNA.
Bacterifagos como vectores
Los vectores de plsmido son confiables para segmentos de DNA de 10kb. Para clonar DNA de
hasta 20Kb, se usan genomas de bacterifagos lambda como vectores.
Se han identificado y cartografiado todos los genes de lambda, y se conoce toda la secuencia
nucleotdica de su genoma
El tercio central de su cromosoma es prescindible, y puede reemplazarse por DNA exgeno sin
afectar la capacidad del fago para infectar clulas y formar calvas. Se han desarrollado ms de 100
vectoresbasados en el fago lambda, eliminando diversas porciones del grupo gnico central.
El fago (a diferencia de muchos otros tipos de bacterifagos) puede llevar a cabo, adems de un
ciclo ltico un ciclo de infeccin lisognica.
Se han desarrollado 2 tipos de vectores:
Vectores de insercin: en los que se ha eliminado parte del DNA prescindible o su totalidad, y se
ha introducido un nico sitio de restriccin en alguna posicin dentro del genoma recortado.
Vectores de remplazo:en los que el DNA prescindible esta contenido dentro de un fragmento de
la parte central flanqueado por los sitios de restriccin que es reemplazado cuando se liga al vector
el DNA que va a ser clonado.
El genoma es lineal, pero los dos extremos naturales de la molcula tienen segmentos
protuberantes monocatenarios de 12 nucletidos, denominados sitios cos, que presentan
secuencias complementarias entre s. Por lo tanto, se puede obtener un vector de clonacin como
una molcula circular que puede ser manipulada en el tubo de ensayo de la misma manera que un
plsmido y reintroducirla en E. coli por transfeccin, trmino aplicado a la captacin de DNA
desnudo al fago. Como alternativa se puede recurrir a un sistema de captacin ms eficiente
denominado empaquetamiento in vitro. Este procedimiento comienza con la versin lineal de un
vector de clonacin: la restriccin inicial corta la molcula en 2 segmentos, los brazos izquierdo y
derecho, cada uno con un sitio cos en cada extremo. El ligamiento se lleva a cabo con cantidades
de cada brazo cuidadosamente medidas y el DNA que se va a clonar; el objetivo es producir
concatmeros en que los distintos fragmentos estn unidos en el orden brazo izquierdo-DNA
nuevo-brazo derecho. Despus se agregan los concatmeros a una mezcla de empaquetamiento in
vitro, que contiene todas las protenas necesarias para fabricar una partcula de fago . Estas
protenas forman partculas de fago de manera espontnea e incorporarn a las partculas cualquier
fragmento de DNA que tenga entre 37 y 52Kb de longitud y est flanqueado por sitios cos.

Csmidos
Los csmidos son vectores hbridos construidos utilizando partes del cromosoma del fago lambda y
de DNA plasmdico. Los csmidos contienen la secuencia cos del fago lambda, necesaria para el
empaquetamiento del DNA del fago dentro de su cubierta proteica, y secuencias plasmdicas de
replicacin y de genes de resistencia a antibiticos, que permiten identificar las clulas husped
que los contienen. El DNA de los csmidos que contiene insertos de DNA se empaqueta en la
cpside proteica de lambda para formar partculas fgicas infectivas. Una vez el csmido entra en
la clula husped, se replica como un plsmido. Puesto que la mayora del genoma de lambda se ha
delecionado, los csmidos pueden transportar insertos de DNA mucho ms grandes que los que
lambda puede llevar. Los csmidos pueden transportar casi 50kb de DNA insertado, mientras que
los vectores
fgicos pueden acomodar insertos de DNA de unas 15kb y los plsmidos
generalmente estn limitados a insertos de 5-10kb.
Cromosomas artificiales bacterianos

Para cartografiar y analizar genomas eucariticos complejos, se ha desarrollado un vector multiuso

denominado cromosoma artificial bacteriano (BAC) basado en el factor F de bacterias. El factor F es
un plsmido que se replica independientemente y que est implicado en la transferencia de
informacin gentica durante la conjugacin bacteriana. Puesto que los factores F pueden
transportar fragmentos del cromosoma bacteriano de hasta 1Mb, han sido diseados para que
funcionen como vectores de DNA eucaritico. Los vectores BAC tienen los genes de replicacin y
de nmero de copias del factor F, e incorporan un marcador de resistencia a un antibitico y sitios
de restriccin para insertar el DNA exgeno que se desee donar. Adems, el sitio de donacin est
flanqueado por regiones promotoras que pueden utilizarse para generar molculas de RNA y
expresar as el gen donado, o para utilizadas como sonda para paseo cromosmico, y para
secuenciar el DNA del inserto clonado.
3.- Unin del ADN al vector
Habiendo cortado el DNA y el vector con una misma enzima de restriccin, ambos pueden unirse
por accin de la ligasa. Al conjunto vector + inserto se le llama DNA recombinante.
4.- Incorporacin del DNA recombinante en la clula anfitriona
La replicacin de las molculas de rDNA requiere que stas se introduzcan en una clula anfitriona.
Para que esta incorporacin se eficaz es preciso emplear clulas especializadas (con un genotipo
seleccionado) adecuadas para el vector de clonacin utilizado y con capacidad para dividirse
rpidamente.
Tipos de clulas anfitrionas
Con frecuencia las clulas anfitrionas son procariticas, principalmente cepas de E. coli, porque son
fciles de obtener, manipular y multiplicar.
Las clulas anfitrionas eucariticas son ms difciles de preparar y mantener, por lo que se utilizan
con fines especficos, fundamentalmente para el anlisis de la regulacin gentica, la expresin de
una protena eucaritica, etc. De entre ellas, las ms manejables en cultivo son las levaduras que,
aunque mantienen algunas caractersticas similares a procariotas tienen una organizacin celular
propia de eucariotas y son de inters biotecnolgico por su capacidad de expresin y maduracin
de protenas.
Mtodos de introduccin del rDNA
El tratamiento ms frecuenta es de tipo fsico-qumico y se dice que la clula se hace
competente. Se comienza con una incubacin en presencia de CaCl2 a 0C, seguida de un
brusco calentamiento hasta 37-43C, lo que induce a las bacterias a aceptar molculas de
DNA. Aunque el mecanismo de este proceso no se ha podido confirmar, posiblemente la
neutralizacin de la carga del DNA por parte de los iones calcio posibilite el paso del DNA a
travs de la membrana celular. Se dispone de cepas establecidas que son especialmente
susceptibles a este proceso.
Lipofeccin: Es mediada por liposomas, se puede llevar a cabo de forma convencional por la
fusin de membranas lipdicas; mediante interacciones electrostticas con liposomas
catinicos.
Un mtodo de elevada eficacia es el empleo de vectores de tipo vrico, que por su va natural
de infeccin introducen en la clula anfitriona su DNA, en este caso recombinante. Para este
tipo de incorporacin se ha acuado el trmino transfeccin.
Aplicando descargas elctricas en forma de pulsos breves de alto voltaje se consigue la
apertura de poros transitorios en la membrana, por lo que puede pasar el rDNA. Este mtodo
de electroporacin es bastante habitual para las clulas eucariotas, aunque da resultados
muy variables.
Un mtodo curioso y de aplicacin creciente, la biolstica, consiste en el bombardeo de las
clulas anfitrionas con microesferas (de tungsteno u oro) recubiertas con el rDNA. Se
emplean dispositivos adecuados (pistolas de genes) que impulsan estos microproyectiles
mediante un gas a presin, y pueden aplicarse sobres suspensiones celulares, clulas en
cultivo, o in vivo (sobre la piel, hojas, etc.). Algunos de los proyectiles impactan y penetran

en las clulas, cuya membrana se resella rpidamente, quedando el DNA incorporado en su

interior.
En casos en los que la eficiencia de suministro del rDNA debe ser mxima se acude a la
microinyeccin directa del DNA en la clula o en su ncleo, empleando micromanipuladores y
agujas de vidrio, bajo observacin al microscopio. El inconveniente es el escaso nmero de
clulas que se pueden tratar por este mtodo manual, por lo que en general se utiliza sobre
oocitos y cigotos. Dado a su carcter directo, se puede incluso prescindir del vector y
suministrar el fragmento de DNA deseado sin modificar.
5 y 6. Seleccin y deteccin de clones recombinantes
Dado el gran nmero de clulas empeladas en la clonacin, y la diversidad de productos que
pueden originarse en el proceso de formacin de rDNA, es esencial poder diferenciar que clulas
han incorporado el rDNA deseado. Esta deteccin se puede combinar con una seleccin, es decir
conseguir que solo las clulas adecuadas sobrevivan en el cultivo.
Se pueden considerar tres categoras de mtodos de deteccin:
Mtodos de hibridacin: Deteccin de una secuencia del DNA clonado, o del mRNA transcrito a
partir de l, por hibridacin con una sonda marcada.
Mtodos inmunoqumicos: Deteccin de la protena codificada por el gen clonado, mediante un
anticuerpo especfico.
Mtodos genticos o de seleccin fenotpica: En ciertos casos, la expresin del propio inserto
produce cambios apreciables en la clula anfitriona, que sirven para reflejar su clonacin con xito.
Sin embargo, la estrategia ms comn es la deteccin y seleccin basadas en la presencia de
genes marcadores en el vector:
Genes que codifican una protena detectable: Habitualmente una enzima para la que se
dispone de un ensayo. Por ejemplo, la beta-galactosidasa transforma el sustrato sinttico Xgal en un producto de color azul.
Genes de resistencia a un antibitico: Codifican una protena que permite el crecimiento de la
clula anfitriona en presencia de un determinado antibitico. Por ejemplo el gen ampr codifica
una beta-lactamasa capaz de degradar la ampicilina, una penicilina semisinttica. El gen de
resistencia a tetraciclina tetA codifica una protena de membrana que acta como una
bomba, extrayendo este antibitico de la clula.
Genes que complementan defectos nutricionales: En este caso, se emplean cepas mutantes
de la clula anfitriona, que no pueden crecer en ausencia de un determinado nutriente. Por
ejemplo clonando en clulas auxtrofas a cierto aminocido, se emplea un vector que
contenga el gen que codifique para ste, con lo que solo las clulas transformadas crecen en
un medio carente de Trp.
Southern blot
El Southern blot hace referencia a un mtodo sensible de deteccin de uno o ms fragmentos
especficos de DNA dentro de una mezcla de fragmentos de DNA compleja y aleatoria. El
procedimiento recibi su nombre en honor a E. M. Southern, quien desarroll este mtodo en 1975.
En la transferencia de Southern, el DNA clonado se corta con fragmentos en fragmentos con una o
ms enzimas de restriccin, y estos fragmentos se separan por electroforesis en gel. El DNA se
desnaturaliza dentro del gel en fragmentos de cadena sencilla, y stos se transfieren a un filtro de
un material, normalmente nitrocelulosa o un derivado del nailon. La transferencia se hace
colocando la hoja de la membrana encima del gel, y provocando que el tampn pase por el gel y
por la hoja de nitrocelulosa por capilaridad. El tampn pasa por el gel y por la membrana,
arrastrando al DNA fuera del gel e inmovilizndolo en la membrana.
En la prctica, esto se hace poniendo el gel con el DNA desnaturalizado sobre una gruesa esponja
que acta de mecha. La esponja est parcialmente sumergida en una cubeta con tampn. Se pone
una membrana encima del gel, y se cure con hojas de papel secante o absorbente y un peso. La
accin capilar arrastra el tampn de la cubeta a travs de la esponja, el gel, la membrana y del

montn de papel secante. Al pasar el tampn por el gel, los fragmentos de DNA se transfieren a la
membrana, a la que se unen. Despus de la transferencia, el DNA de cadena sencilla se fija a la
membrana calentndola a 80C o exponindola a luz ultravioleta para que se hagan uniones entre
los fragmentos y la membrana.
Entonces los fragmentos de DNA del filtro se hibridan con una sonda. Slo formarn hbridos los
fragmentos de DNA de cadena sencilla presentes en la membrana que sean complementarios a la
secuencia nucleotdica de la sonda. Se lava la sonda no unida, y se visualizan los fragmentos
hibridados. Si se utiliza una sonda radiactiva, la posicin de la sonda se determina por
autorradiografa, utilizando una pelcula fotogrfica.
Existe una tcnica de transferencia relacionada que puede utilizarse para determinar si un gen
clonado es transcripcionalmente activo en un tipo celular o en un tejido dado. Esta tcnica detecta
la presencia de RNA que sea complementario al segmento de DNA clonado. Esto se lleva a cabo
extrayendo RNA de la clula. Se fracciona el RNA por electroforesis en gel, y el patrn de bandas se
transfiere a una membrana que una al RNA como en la transferencia de Southern. El filtro se hibrida
con una sonda de DNA de cadena sencilla, proveniente del DNA genmico clonado, Si hay RNA
complementario a la sonda de DNA, ste se detectar por autorradiografa como una banda en la
pelcula fotogrfica. Este protocolo que utiliza RNA unido al filtro se denomina transferencia
Northern.
Algunas tcnicas de uso comn
Electroforesis
El trmino electroforesis se usa para describir la migracin de una partcula cargada bajo la
influencia de un campo elctrico. La electroforesis en gel es una tcnica muy utilizada para separar
molculas o fragmentos de molculas de cidos nucleicos. Los materiales ms comunes para
separar molculas de cidos nucleicos son polmeros como la poliacrilamida o la agarosa. Estos gel
es se colocan en la cubeta de electroforesis, sumergidos en un tampn de pH alrededor de 8. De
esta forma, las molculas de DNA o RNA sometidas a electroforesis se desplazarn al polo positivo
ya que a pH superiores a 5 poseen carga negativa. Los geles se comportan como un tamiz
molecular y permiten separar molculas cargadas en funcin de su tamao y forma. As, molculas
de DNA de diferente tamao, van a emigrar de forma distinta en un gel de electroforesis. La
distancia recorrida por cada fragmento de DNA va a ser inversamente proporcional al logaritmo de
su peso molecular. Es importante la utilizacin de marcadores de tamao conocido porque nos
permitirn calcular los pesos moleculares de las muestras de DNA problema.
En el caso de los geles de agarosa, se le aade bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre
las bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la electroforesis, se
visualiza el gel con una lmpara de luz UV, y se vern las bandas correspondientes a las muestras
de DNA aplicado y los marcadores de peso molecular.