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Universidad Francisco de Paula Santander

Facultad de Ciencias Agrarias y del Ambiente
Plan de Estudios de Ingeniera Biotecnolgica

Informe 1

EL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES. PLANEACION,

ORGANIZACIN Y NORMAS DE TRABAJO

RESUMEN
En la presente prctica, se realiz un recorrido en cual se identificaron las reas
de trabajo con sus respectivos materiales, equipos y las actividades que se
realizan en cada uno de ellos. Adems se identificaron las concentraciones de los
componentes de los medios basales y con esto se prepararon las soluciones
Stock de micronutrientes, macronutrientes, de calcio y de yoduro clcico; esto se
envaso en frascos mbar para utilizar en las siguientes prcticas de cultivo in vitro.
Palabras clave: Medios basales, soluciones stock

INTRODUCCION
El cultivo de tejidos, como tcnica,
consiste esencialmente en aislar una
porcin de la planta y proporcionarle
artificialmente las condiciones fsicas
y qumicas apropiadas para que las
clulas
expresen
su
potencial
intrnseco o inducido. Es necesario
adems adoptar procedimientos de
asepsia para mantener los cultivos
libres de contaminacin microbiana.
Para llevar a cabo bien esta labor se
necesita tener una planeacin y
organizacin del laboratorio; tiene

que estar dividido esquemticamente

en reas separadas para poder
diferenciar las distintas funciones que
se desarrollan en las diferentes
prcticas.
Ya teniendo el diseo, planeacin y
organizacin del laboratorio se
deber garantizar la mayor asepsia
en cada una de ellas, sobre todo
haciendo nfasis en el rea de
transferencia y el crecimiento del
material vegetal.

Practica # 1 de laboratorio

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Adems, el medio puede ser
enriquecido
con
aminocidos,
vitaminas
y
reguladores
del
crecimiento.
Los medios de cultivo se preparan a
partir de soluciones concentradas 10
o 100 veces (Soluciones Madre o
Stock). En la solucin madre se
pueden
mezclar
varias
sales
minerales siempre que no se
produzcan
problemas
de
precipitacin. Algunos elementos,
como el Fe, se utilizan en forma de
quelatos
para
mantener
su
disponibilidad durante el cultivo.

Antes de realizar la asepsia del

material vegetal que se va a introducir
in vitro, es necesario disponer de
Medios de Cultivo esterilizados y
dosificados
en
recipientes
adecuados.
Una parte importante del cultivo in
vitro son los Medios de Cultivo ya que
en ellos se encuentran las sustancias
necesarias para el crecimiento y
desarrollo de los tejidos vegetales. Un
medio de cultivo es una solucin
acuosa en donde se encuentran
disueltas sales minerales que aportan
los
elementos
esenciales,
Macronutrientes (N, P, K, S. Ca y Mg)
y Micronutrientes (Fe, B, Mn, Zn, Cu,
Mo, y Co). Normalmente es
imprescindible
una
fuente
de
carbono, generalmente la sacarosa,
debido a la escasa actividad
fotosinttica del tejido in vitro.

El medio de cultivo MS (Murashige y

Skoog 1962) es uno de los ms
utilizados. Para la realizacin del
medio MS se elaboran las siguientes
soluciones madre:
Soluciones stock de nutrientes: stock
de macronutrientes, stock de calcio,
stock de micronutrientes, stock de
hierro en forma de quelato EDTA Na.
MATERIALES Y METODOS
Ejercicio prctico # 1
Diseo, Organizacin y Normas de
trabajo.
Se discuti sobre la planeacin, all
se necesita saber para que se va a
usar, el objetivo, un presupuesto,
ubicacin del mismo la demanda
vegetal y obtencin y recepcin del
material vegetal.

Practica # 1 de laboratorio

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Para el diseo se requieren de unos
planos los cuales tienen dimensiones,
conexiones entre reas y un estudio
de suelos; a su vez llevan rutas de
evacuacin, recepcin de material
vegetal, transporte y almacenamiento
de
residuos
y
normas
de
bioseguridad.
Por ltimo se mir la organizacin del
laboratorio
y
se
le
hizo
reconocimiento de las distintas reas
con sus respectivos equipos en cada
una de ellas.

Ejercicio prctico # 2
Preparacin de soluciones madre o
soluciones stock para el medio
basal de MURASHIGE Y SKOOG
(1962)
Para preparar el medio MS, como
primer paso, se averiguo la
concentracin, para esto tomamos el
dato de la gua de la cantidad del
reactivo a usar y lo dividimos en el
dato de la tabla de medios basales y
con eso hallamos la concentracin.
Cada grupo preparo la solucin stock,
se pesaron los respectivos reactivos y
se mezclaron uno por uno con ayuda
de una plancha agitadora.

Pesando reactivos

Reactivos

Practica # 1 de laboratorio

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cido brico
Plancha agitadora

RESULTADOS
Se
utilizaron
las
siguientes
cantidades
de
compuestos
nutricionales para la obtencin de las
diferentes soluciones madre:

6.2 g/l

Sulfato de magnesio x 5 H2 O 22.3 g/l

Sulfato de cinc x 5 H2 O

8.6 g/l o

Sulfato de cinc x 6 H2 O

10.5 g/l

Molibdato de sodio x 2 H2 O 0.25 g/l

Sulfato de cobre x 5 H2 O 0.025g/l
Cloruro de cobalto x 6 H2 O 0.025 g/l
CONCENTRADO: 1000X

SOLUCION A: MACRONUTRIENTES
SOLUCION C: CALCIO
Cloruro de calcio x 2 H2 O
CONCENTRADO: 341X

150 g/l

SOLUCION D: YODURO DE POTASIO

Yoduro de potasio
0.83 g/l
CONCENTRADO: 1000X
Nitrato de Amonio 66.0 g/l
Sulfato de Magnesio x 7 H2 O 14.8 g/I
Nitrato de Potasio 76.0 g/l
Hidrogeno fosfato de potasio 6.8 g/l

SOLUCION E: HIERRO EN FORMA DE

QUELATO
EDTA Na

CONCENTRACIN: 40X

SOLUCION B: MICRONUTRIENTES

3.73 g/l

DISCUSIONES

Practica # 1 de laboratorio

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La
decisin de establecer
un
laboratorio de cultivo de tejidos
vegetales requiere de un estudio y
anlisis crtico acerca de la necesidad
de hacerlo, dentro de un contexto
integral
del desarrollo de la
investigacin y la produccin agrcola
o forestal de una regin o pas. Por lo
tanto,
el
establecimiento
y
funcionamiento del laboratorio debe
ser, idealmente, el producto de
esfuerzos multidisciplinarios.
Debido a que el medio de cultivo es
uno de los factores ms importantes
en el xito del proceso, se debe
trabajar despacio y con mucho
cuidado al principio para poder
anticipar las consecuencias de cada
accin y familiarizarse con el equipo,
cristalera, etc.
El procedimiento para la preparacin
de los medios depende en primera
instancia del tipo de medio, de su
consistencia y de la presencia de
componentes termolbiles.
Al momento de preparar soluciones
madre se recomienda hacerlo en
cantidades relativamente altas y con
anterioridad para ahorrar el tiempo y
el trabajo que implica pesar cada uno
de los ingredientes cada vez que se
prepara un medio de cultivo, ya que
teniendo en cuenta que muchos de
los componentes (microelementos,
vitaminas, hormonas) son requeridos
en pequeas cantidades, si se
multiplica esa cantidad por un

determinado nmero de veces para

preparar la solucin madre, la labor
de pesado ser ms fcil y ms
precisa.
Un factor importante a considerar es
la concentracin de la solucin
madre, ya que al ser muy
concentrada
tiende
a
formar
precipitados. En algunos casos estos
precipitados son el resultado de
mezclar sustancias incompatibles, por
ejemplo, calcio y fosfato o sulfato,
magnesio y fosfato. En caso de que
la
solucin
madre
presente
precipitados es mejor descartarla ya
que no poseer el balance adecuado
de sustancias.
No se recomienda que la solucin
madre sea mayor de 100 veces la
concentracin final del medio; sin
embargo el volumen de medio a
preparar por semana en el laboratorio
dar la pauta para considerar el
grado de concentracin de la solucin
madre.
CONCLUSIONES
Con la realizacin de la prctica de
preparacin de medios para el cultivo
de tejidos vegetales, se pudo
establecer las concentraciones de
nutrientes basales que necesita la
especie vegetal.
Los medios nutritivos para el cultivo
de clulas y tejidos vegetales son, en
general, menos complejos que los de
cultivos microbianos y son formulados

Practica # 1 de laboratorio

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en forma ms o menos emprica. Si
bien se desarrollan peridicamente
nuevas frmulas comerciales, no
existe hasta el presente un diseo
racional que tenga en cuenta la
composicin centesimal de la clula
vegetal y el conjunto de condiciones
que controlan el crecimiento y la
diferenciacin.
El hierro es esencial para el
crecimiento celular y se agrega al
medio
de
cultivo
en
una
concentracin de 0,01 a 0,15 mM. Se
utiliz el quelato Fe-EDTA el cual
permiti la solubilidad del hierro.

tejidos
en
la
agricultura:
Fundamentos y aplicaciones. Roca
W. M y Mroginski, L. A. (eds.). Cali,
Colombia.
Alvez Beatriz, Menndez Andrea,
Oropeza Maira, Vargas Teresa.
Cultivo de Tejidos Vegetales, Gua de
Prcticas. Universidad Central de
Venezuela. Facultad de Ciencias, II
Semestre 2012.
http://annymojica.blogspot.com/2012/
02/215-preparacion-y-manejo-desoluciones.html
http://helmermartinez.blogspot.com/2
012/02/practica-2.html

Se pudo observar en la composicin

que el medio MS (Murashige &
Skoog,
1962)
presenta
altas
concentraciones de nitrato, potasio y
amonio.

BIBLIOGRAFIA
CATIE (Centro Agronmico Tropical
de Investigacin y Enseanza).
Abdelnour-Esquivel Ana y Escalant
Jean V. Conceptos bsicos del cultivo
de tejidos vegetales. 1994.
CIAT (Centro
Internacional
de
Agricultura Tropical). 1991. Cultivo de

Practica # 1 de laboratorio

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CUESTIONARIO
1. Elabore, mediante un esquema, un diseo propio para un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales.
a. Tenga en cuenta seales, con lneas de puntos, el flujo de trabajo.
DISEO DE UN LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

2. Seale dentro del medio de cultivo basal preparado los elementos esenciales estudiados.
a. Estn presentes todos ellos? Porque ocurre esto?

RTA// Los elementos (C, H, O, N, P, K, Ca, Mg, S, Fe, Mn, B, Mo, Cu, Zn y Cl) son considerados esenciales para el
normal desarrollo de las plantas mientras que otros (Na, Si, Co y V) son considerados solo esenciales para
algunas de ellas. Todos estos elementos desempean funciones muy importantes en las plantas, y cuando estn
presentes en cantidades insuficientes, pueden producirse graves alteraciones y reducirse notablemente el
crecimiento de las mismas.
Estos elementos nutritivos suministrados por el suelo se pueden clasificar en macro y microelementos,
dependiendo de si las plantas necesitan absorber cantidades relativamente grandes o pequeas de ellos. Como
macroelementos cabe destacar el N, P, K, Ca, Mg y S y como microelementos, elementos traza u oligoelementos
esenciales para las plantas se encuentran el Fe, Mn, B, Mo, Cu, Zn, y Cl.

b. Qu consecuencias podra traer algn error en las cantidades pesadas de los elementos qumicos?
Justifique su respuesta.
RTA// Hay ciertos elementos que pueden presentar una aceptabilidad en el rango de variacin de
concentracin, pero si se presenta en una forma inadecuada de suministros de nutrientes, ya sea por falta o
por exceso, esto podra afectar el desarrollo y el crecimiento de la especie. Debido a que los medios

desarrollados han sido en parte empricos, en otros casos tambin al haber un suministro de suplementos de
forma inadecuada, se afectan, generalmente en forma negativa, tanto el crecimiento del cultivo como la
produccin de metabolitos.
La naturaleza y concentracin de los micronutrientes empleados en los medios de cultivo surgen
principalmente de resultados empricos al evaluar la capacidad de cada elemento de afectar el crecimiento. En
general el boro, el manganeso, el iodo y el cinc se utilizan en concentraciones variables entre 1 y 100 mM,
mientras que el resto de los micronutrientes se agregan en valores inferiores a 0,1 mM. No hay un estudio
sistemtico de su influencia en el crecimiento y la productividad, aunque existen varios trabajos puntuales como
los referidos a la estimulacin de la produccin de shikonina al aumentar 30 veces el in cobre (Fujita et al.,
1981), al incremento de la produccin de compuestos fenlicos por deficiencia de boro (Ertola et al., 1994) y a
la mejor formacin y calidad de callos de caa de azcar al incrementar el calcio y el magnesio (Gomez Kosky,
1998a).

3. Que son las soluciones madre o stock? Con que fin se preparan en el laboratorio? Cules son los
factores que debern tenerse en cuenta para su preparacin y conservacin en el laboratorio?
RTA// Se denomina solucin madre o stock a composiciones concentradas de nutrientes las cuales estn
formuladas por sales minerales que se emplean en un medio particular. Debido al elevado nmero de compuestos
que incluye y a que algunos de ellos se emplean a muy baja concentracin, resulta ms prctico preparar
soluciones madre o "stocks" concentrados. Esto hace ms rpida la futura preparacin de medios y minimiza los
errores, ya que La composicin de una solucin se debe medir en trminos de volumen y masa, por lo tanto es
indispensable conocer la cantidad de soluto disuelto por unidad de volumen o masa de disolvente, es decir su
concentracin.
Componentes de soluciones madres o stock que en conjunto con otros elemento (sacarosa, phytagel y hormonas
de crecimiento) conforman un medio de cultivo MS.

Los factores que se tienen que tener en cuenta para su preparacin es a penas ya este la solucin o stock hay que
llevarlo a refrigeracin 4 C para conservarlo.
4. Investigue sobre los pasos que continan en la preparacin del medio de cultivo final.
RTA// Preparacin del medio de cultivo de Murashige y Skoog
La elaboracin de los medios de cultivo se realiza diluyendo las soluciones madre previamente realizadas.
Adems, se aade la fuente de carbono y el agente gelificante, que normalmente es agar. Se pueden hacer
distintos medios de cultivo manteniendo la misma concentracin de algunas sustancias, por ejemplo sales
minerales y vitaminas, y modificando o eliminando otras como los reguladores de crecimiento.
Tomando como base las sales minerales, vitaminas y fuente de carbono de Murashige y Skoog se pueden
realizar mltiples medios de cultivo variando los reguladores de crecimiento o su concentracin. Por ejemplo, se
pueden realizar los siguientes medios de cultivo:
- MS-0: medio MS sin reguladores
- MS-K: MS con 0.3 mg/L de cido indol-actico y 1 mg/L de kinetina
- MS-R: MS con 1 mg/L de AIB