Mdulo 5

Conservacin y Control
Las fermentaciones producidas por las bacterias cido lcticas se han
reconocido desde la antigedad. Se han utilizado diferentes cultivos en muchas
partes del mundo con la finalidad de mejorar caractersticas en el
almacenamiento, palatabilidad y valores nutrimentales de los alimentos
perecederos tales como leche, verduras, carne, pescado, legumbres y
cereales. Los microorganismos que producen este tipo de fermentacin, las
bacterias cido lcticas, han tenido un importante papel en la conservacin de
los alimentos, en la prevencin de enfermedades a travs del consumo de
alimentos, e indirectamente, en la alimentacin de personas desnutridas en
todos los continentes.
En los pases desarrollados, las bacterias cido lcticas principalmente se han
asociado con los productos lcteos fermentados, tales como queso,
mantequilla, y yogurt. La utilizacin de cultivos iniciadores se ha vuelto toda
una industria desde el siglo pasado. Debido a esto, los aspectos tecnolgicos
de la fermentacin cido lctica se han cubierto tanto en el aspecto de la
investigacin, como en el de capacitacin, en el campo de la ciencia de los
alimentos.
Desde pocas ancestrales, las bacterias cido lcticas se han asociado con
efectos benficos para la salud. En la actualidad, un nmero creciente de
alimentos benficos y los llamados alimentos funcionales, as como
preparaciones farmacuticas promotoras de la salud utilizan las caractersticas
de ciertas especies de bacterias cido lcticas. Algunas bacterias lcticas,
sobre todo especies de lactobacilos se han identificado como bacterias
probiticas, las cuales tienen la capacidad de colonizar el intestino humano,
confiriendo proteccin ante algunos microorganismos patgenos, interactuando
con el sistema inmunolgico mediante las clulas dendrticas, provocando la
inactivacin de actividades de otras especies sobre stas y favoreciendo la
buena digestin de los alimentos, entre otras caractersticas.
Para que una bacteria sea considerada como probitica, debe cubrir ciertos
requisitos como son: resistir el paso a travs del tracto gastrointestinal, y la
presencia de fenol, producir sustancias antimicrobianas, ser capaz de crecer en
un medio con sales biliares, y no presentar resistencia a antibiticos; entre
otras caractersticas. Los microorganismos probiticos se pueden encontrar
comnmente en productos fermentados, por ejemplo leche, productos lcteos,
yogurt de soya, carne, vino, yuca; con toda seguridad tambin en el pulque y
ciertos quesos. Adems, se han aislado a partir de heces de puerco, humanas,
de nios y leche bronca de vaca.
Existe una amplia evidencia de experimentos realizados en los laboratorios,
que comprueban que la ingesta de microorganismos probiticos, especialmente
bacterias cido lcticas y bifidobacterias, alivian o previenen varios desrdenes
como la intolerancia a la lactosa y la diarrea por rotavirus, reducen la
incidencia de enterocolitis necrosante neonatal, disminuyen la duracin de la
diarrea gastroentrica, reducen el nivel de colesterol en sangre, tienen un
efecto positivo en el sistema inmunolgico de nios con VIH y reducen la
111

recurrencia de diarrea provocada por Clostridium difficile, entre otros beneficios

reportados.
La secuenciacin genmica de Bifidobacterium longum, Lactobacillus
plantarum WCFS1, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri,
Lactobacillus casei, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus johnsonnii,
Lactobacillus bulgaricus y Lactobacillus rhamnosus proveen de informacin
acerca de la actividad potencial como bacterias benficas para el hospedero.
Se define como alimento funcional aquellos que pueden satisfactoriamente
demostrar que afectan benficamente una o ms funciones del organismo
humano, mas all de los efectos nutricionales adecuados, en una forma
relevante para mejorar el estado de salud y la reduccin de enfermedades. De
esta manera, los alimentos fermentados que contienen probiticos, prebiticos
(ingredientes del alimento que no son digeribles y que tienen un efecto benfico
en la salud del hospedero mediante la estimulacin selectiva de crecimiento o
actividad de una o algunas bacterias en el colon), o ambos, son considerados
alimentos funcionales.
En la actualidad, el desarrollo de nuevos productos para la industria alimenticia
est enfocado a crear alimentos funcionales que confieran al consumidor una
propiedad extra que beneficie su salud.
Es necesario realizar correctamente tcnicas microbiolgicas confiables para
enumerar microorganismos viables en estos productos, en los cuales el
beneficio adicional, depende precisamente del nmero de microorganismos
viables.
Como parte fundamental de un buen control de calidad de los procesos en la
industria alimentaria, se requiere de respaldar analticamente la estimacin de
de microorganismos presentes en los alimentos funcionales de aquellos
considerados como probiticos, ya que la legislacin mexicana, as como la
internacional, coinciden en que para que dichos microorganismos aporten
beneficios al consumidor, es requisito que se encuentren en el alimento
funcional en cierto nmero y no menor.
De igual manera, como parte del control de calidad, por ejemplo, en la
industria que elabora
leches fermentadas,
es importante
enumerar
confiablemente las bacterias lcticas que se han aadido a la leche con la
finalidad de obtener productos con caractersticas mejoradas en el
almacenamiento, palatabilidad y/o valores nutrimentales. Errores en la
proporcin de los microorganismos iniciadores o bien, la utilizacin de cepas no
adecuadas dar como resultado productos terminados de pobre calidad.
Referencias:
(2004). Lactic acid bacteria. Microbiological and Functional Aspects. 3th
ed. Seppo, S. & Atte von Wright. (Eds.) Marcel Dekker, Inc. New York.USA.
Pascual, M. R & Caldern, V. (2000). Microbiologa Alimentaria. Metodologa
analtica para alimentos y bebidas. 2. Ed. Diaz de Santos. Madrid, Espaa.
112

Marshall, R. T. (1992) Standard methods for the examination of Dairy

Products. American Public Health Association. Copyright, Washington, D. C.

113

Objetivos:

Determinar
microorganismos
intencionalmente.

viables

en

alimentos

inoculados

Aplicar mtodos de enumeracin para establecer la presencia de

microorganismos viables y/o con caractersticas probiticas.

En el caso de microorganismos probiticos, correlacionar la estimacin de

la cifra de microorganismos presente obtenida con la calidad del producto
para concluir acerca de posibles efectos benficos para la salud del
consumidor.

En el caso de microorganismos viables, correlacionar la estimacin de la

cifra de microorganismos presente obtenidos para concluir acerca de la
calidad del producto.

Ejercicio:
1. Con base en bibliografa especializada, qu grupo o grupos de
microorganismos de control, viables o probiticos, se sugiere analizar
para el alimento que se le asign?
2. Cules son los lmites o especificaciones microbiolgicas recomendadas
en bibliografa especializada para que las bacterias viables o probiticas
presenten efectos benficos para la salud del consumidor?
3. A qu nicho de consumidores se recomendara el consumo del alimento
analizado adicionado de microorganismos viables y/o con caractersticas
probiticas que analizaste y por qu?

114

Estimacin de la cifra de microorganismos presentes en yogurt

OBJETIVOS:
Aplicar el mtodo de enumeracin de microorganismos caractersticos en
yogurt mediante la tcnica de cuenta en placa a 37 C.
Comprobar que en el yogurt los microorganismos caractersticos estn
viables y presentes.
.
GENERALIDADES
La fermentacin desde el punto de vista econmico, es un mtodo temporal de
conservacin de los alimentos. De ah que, desde hace tiempo se utilizan
cultivos iniciadores lcticos con fines comerciales para realizar los procesos de
fermentacin de forma controlada, sobre todo en productos lcteos.
Las bacterias cido lcticas (LAB) constituyen un grupo de bacterias grampositivas que se han unido debido a sus caractersticas morfolgicas,
metablicas y fisiolgicas. La descripcin general de las bacterias incluye en
este grupo a cocos o bacilos gram-positivo, no esporulados, que produce cido
lctico como producto terminal debido a la fermentacin de los carbohidratos.
La fermentacin del alimento por bacterias cido lcticas principalmente,
aunque tambin las levaduras y otros microorganismos pueden estar
involucrados, depende adems, de la concentracin de las sales y otros
factores en el medio. Existen muchas clases de medios selectivos y
diferenciales disponibles para caracterizar las bacterias cido lctico viable.
El agar MRS y M17 son medios de cultivo ampliamente recomendados para
estimar el nmero de bacterias lcticas viables en yogurt, Lactobacillus
bulgaricus y Streptococcus thermophilus. La mayora de los biotipos de S.
thermophilus no forma colonias viables en el MRS acidificado en diluciones que
normalmente se utilizan para la estimacin de la cifra de microorganismos
presente de bulgaricus, y por otra parte, la mayora de los L. bulgaricus no
forman colonias visibles en placas de agar M17 en las diluciones que
normalmente se utilizan para efectuar cmputos de S. thermophilus.
El L. bulgaricus es un microorganismo mesoflico de forma lenticular y colonias
generalmente en forma puntiaguda, con dimetro de 1-3 mm, en medio MRS
acidificado. Su apariencia microscpica corresponde a la de bacilos
generalmente largos, no esporulado, gram-positivo, catalasa-negativo.
El S. thermophilus es un microorganismo termoflico que forma colonias
lenticulares de 1-2 mm en el medio M 17. Su apariencia microscpica
corresponde a clulas ovoides o esfrica, 0.7-0.9 m, en forma de pares o
cadenas largas, gran-positivo, catalasa-negativo.

115

FUNDAMENTO
El principio del mtodo de prueba, consiste en inocular diluciones decimales
de la muestra en:
1. agar MRS acidificado, seguido de incubacin anerbica a 37C/72 hr, para la
estimacin de la cifra de microorganismos presente de L. bulgaricus.
2. agar M17, seguido por incubacin aerbica a 37 C/48hr para la estimacin
de la cifra de microorganismos presente de S. thermophilus.
MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES
1 matraz Erlenmeyer de 250,0 mL con tapa rosca conteniendo 90,0 mL de
solucin amortiguadora de peptonas a.
6 tubos de 16 x 150 con tapa rosca conteniendo 9,0 mL de solucin
amortiguador de peptonas a.
1 matraz de 500,0 mL con 250,0 mL de medio MRS acidificadoa.
1 matraz de 500, mL con 250,0 mL de medio M17 completoa.
SOLUCIONES Y REACTIVOS
Colorantes para Tincin de Gramd.
MATERIALES Y EQUIPO

Incubadora 37 1Ca.
Motor para licuadora estril o Stomachera.
Agitador de tubos tipo vortexa.
Contador de coloniasc,d.
Bao de agua con control de temperatura de 45 1 Ca.
6 pipetas graduadas de 1,0 mLa.
1 pipetas graduada de 10,0 mLa.
16 cajas de Petria.
Esptula de metala
Microscopio pticod.
Asa bacteriolgica d.
Portaobjetosd.

NOTAS
a
b
c
d

Material necesario al inicio de la prctica.

Material necesario a las 24 horas de iniciada la prctica.
Material necesario a las 48 horas de iniciada la prctica.
Material necesario a las 72 horas de iniciada la prctica.

116

PROCEDIMIENTO
1. Preparacin de la muestra y porcin de prueba.
NOTAS
Antes de abrir el envase del yogurt, limpiar la superficie externa que rodea la
parte por la cual la muestra ser tomada, con el objeto de retirar cualquier
material que pueda contaminar la muestra. Desinfectar el rea de trabajo con
etanol al 70% (v/v) para prevenir futura contaminacin, Abrir el envase
aspticamente.
En esta etapa es importante obtener no solamente una dilucin homognea,
sino poder fragmentar las cadenas de estreptococos y lactobacilos en clulas
individuales o cadenas cortas para que en el resultado sea posible expresar la
estimacin de la cifra de microorganismos presente de viables por gramo de
muestra.
1.1. Yogurt natural.
Mezclar el contenido del envase con esptula estril. Pesar 10,0 a 10,1 g de la
muestra en un recipiente adecuado.
1.2. Yogurt con fruta cereales
Licuar el contenido del yogurt durante un minuto utilizando stomacher.
Pesar 10,0 a 10,1 g de la muestra.
2. Preparacin de la primera dilucin.
NOTA
Aadir la solucin amortiguadora de peptonas a la porcin de prueba hasta
que la masa de la porcin de ensayo y diluyente sea de 50 g, homogeneizar
durante un minuto.
Llevar a 100,0 g con el mismo diluyente para obtener la dilucin 1:10.
3. Preparacin de diluciones decimales.
Realizar diluciones seriadas en tubos con 9,0 mL de solucin amortiguadora
de peptonas aadiendo 1,0 mL de la primera dilucin al primer tubo.
Repetir esta operacin hasta obtener la dilucin requerida (10-7) utilizando
una pipeta diferente para cada dilucin.

117

4. Inoculacin e incubacin.
El tiempo mximo entre la inoculacin de las diluciones y el vertido en cajas
petri, no debe exceder de 15 min.
Colocar un mL de las cuatro ltimas diluciones duplicado en cajas Petri.
Para S. thermophilus, verter 12-15 mL de M17 mantenido a 45 1C en un
bao de agua.
Para L. bulgaricus, verter 12-15 mL de MRS acidificado mantenido a 45
1C en un bao de agua.
Mezclar cuidadosamente, y dejar solidificar en una superficie horizontal las
cajas Petri en posicin invertida.
Incubar las placas destinadas para la numeracin de L.bulgaricus a 37 1C
durante 72 h. en jarra de aneorobiosis (atmsfera de 90 % nitrgeno y 10 %
CO2). No apilar ms de 6 cajas Petri.
Incubar las placas destinadas para la enumeracin de S. thermophilus 37
1C durante 48 h.
5. Cmputo de colonias.
Despus del periodo de incubacin especificado, contar las colonias que
muestren las caractersticas para cada microorganismo en las placas que
tengan de 10-300 colonias. Evitar contabilizar la materia extraa utilizando un
lente de ampliacin.
6. Confirmacin.
Teir estas colonias utilizando el mtodo de Gram, y confirmar que no son
formadoras de esporas. Bacilos Gram-positivo, catalasa-negativo para aquellos
que crecen en el medio MRS, y cadenas de cocos o diplococos Gram-positivo,
catalasa-negativo en el caso de que crezcan en el medio M17.

CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS.

Utilizar las cuentas de las placas que contengan 10-300 colonias.
El nmero de microorganismos caractersticos por gramo es igual a:
C / (n1 + 0,1n2) d
Donde:
C:
Es la suma de colonias contadas en las placas n1 y n2.
n1:
Es el nmero de placas contadas en la menor dilucin.
n2:
Es el nmero de placas contadas en la mayor dilucin.
d:
Es la dilucin en la cual la primer cuenta se obtuvo.
NOTA
Si hay ms de dos diluciones contables, la frmula se modifica:
As para tres diluciones:

118

 EC / (n1 + 0,1n2 + 0,1n3) d

Redondear el resultado obtenido en a dos cifras significativas. Para un

nmero de tres dgitos, redondear el tercer dgito al cero ms cercano. Si el
tercer dgito es cinco redondear el dgito hacia abajo en caso de que los dos
primeros dgitos sean nmero par, y al dgito superior en caso de que los dos
primeros dgitos sean nmero impar, por ejemplo:
Para

234
235
225
245

redondear a

230
240
220
240

Si existen solamente cuentas menores de 10, reportar el nmero de

microorganismos por gramo como menor que,
siendo el valor
correspondiente a la menor dilucin.
El nmero total de microorganismos caractersticos por gramo de yogurt.
Nl + Ns
Donde:
Nl
Ns

Es el nmero de L. bulgaricus por gramo.

Es el nmero de S. thermphilus por gramo.

Ejemplo:
Asumir que la estimacin de la cifra de microorganismos presente L. bulgaricus
dio los siguientes resultados en dos cajas de Petri por dilucin:
10- 5, 295 y 245 colonias,
10- 6, 33 y 40 colonias,
C/(n1 + 0,1n2) d = 295 + 245 + 33 + 40 /(2 + 0,1 x 2) 10-5
= 613 / 2.2 x 10-5 = 278,6 x 105
Con el redondeo el nmero estimado de L. bulgaricus es 2,8 x 107 UFC/ g de
yogurt.
BIBLIOGRAFA
(2004). Lactic acid bacteria. Microbiological and Functional Aspects. 3th
ed. Seppo, S. & Atte von Wright. (Eds.) Marcel Dekker, Inc. New York.USA.
Pascual, M. R & Caldern, V. (2000). Microbiologa Alimentaria. Metodologa
analtica para alimentos y bebidas. 2. Ed. Diaz de Santos. Madrid, Espaa.
Marshall, R. T. (1992) Standard methods for the examination of Dairy
Products. American Public Health Association. Copyright, Washington, D. C.
De Man. J.C. Rogosa, M & Sharpe, M. E. (1960). J. Applied Bacteriology.
23,130-134.
119

International IDF Standard 117 A. Yogurt, enumeration of characteristic

microorganisms colony count technique at 37C.

120

Medios de Cultivo
Solucin amortiguadora de peptonas (cuentas viables en yogurt)
Peptona 1 (digerido trptico de casena)
Peptona 2 (digerido trptico de carne)
Agua
pH final25C

0,5 g
0,5 g
1,0 L
7,0 0,2

Disolver las peptonas en agua. Distribuir la solucin en porciones de 90,0 o 9,0

mL en recipientes segn se requiera. Esterilizar a 121 C / 15 min.
NOTA
La mezcla de peptonas de este tipo (peptona 1 y 2), se consigue en forma
comercial con el nombre de polipeptonas.
Reactivos para ajustar el pH
Hidrxido de sodio (Na OH), aproximadamente 0,1 mol/L de solucin.
Acido clorhdrico (HCl) aproximadamente 0.1 mol/L de solucin.
Agar MRS acidificado
Peptona de casena
Extracto de malta
Extracto de levadura
Dextrosa
Tween 80 (sorbitn mono-oleato)
Fosfato diptasico (K2HPO4)
Acetato de sodio trihidratado (CH3CO2Na)3. 3 H2O
Citrato de amonio [C6H6O7( NH4) 2]
Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O)
Sulfato de manganeso heptahidratado (MnSO4.7H2O)
Agar bacteriolgico

10,0 g
10,0 g
5,0 g
20,0 g
1,0 mL
2,0 g
2,0 g
2,0 g
0,2 g
0,05 g
15,0 g

Reactivos para ajustar el pH

Acido actico (CH3COOH), 100% glacial.
Disolver los componentes en un bao de agua. Enfriar a 50 C y aadir cido
actico para ajustar el pH, comprobar por medio de potencimetro, de tal forma
que despus de esterilizado llegue a 5,4 a temperatura ambiente. Distribuir en
porciones de 500,0 mL. Esterilizar a 121 C durante 15 min.

121

Principio de accin
La peptona es fuente de carbono y nitrgeno. El extracto de levadura es fuente
de elementos traza, vitaminas y amino cidos. La dextrosa es fuente de
carbohidratos que proporciona carbono. El acetato de sodio y citrato de
amonio, inhiben los estreptococos, hongos y otros microorganismos. El sulfato
de magnesio y sulfato de manganeso son fuente de iones inorgnicos. El tween
80 acta como surfactante.
Medio M17
Medio bsico:
Peptona 1 (digerido trptico de casena)
Peptona 2 (digerido pptico de carne)
Peptona 3 (digerido papanico de soya)
Extracto de levadura
Extracto de carne
Sal disdica del - glicerofosfato (C3H7O6PNa2)
Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O)
Acido ascrbico
Agar bacteriolgico
Agua

2,50 g
2,50 g
5,00 g
2,50 g
5,00 g
9,00 g
0,25 g
0,50 g
15,0 g
950,0 mL

Disolver los componentes en agua hirviendo enfriar a 50C y ajustar el pH,

utilizando los reactivos para ajustar el pH de tal forma que despus de
esterilizado llegue a 7,1-7,2 a temperatura ambiente. Transferir el medio en
porciones de 95,0 mL en frascos de 150,0 mL de capacidad. Esterilizar a
121C/15 min.
Solucin de lactosa:
Lactosa
Agua

10,0 g
100,0 mL

Disolver la lactosa en agua. Esterilizar a 121C/ 15 min.

Medio completo:
Medio bsico
Solucin de lactosa

950,0 mL
5,0 mL

Inmediatamente antes de utilizar, fundir el medio bsico en un bao de agua

hirviente y enfriar a 48-50C. Calentar la solucin de lactosa a 48-50C. Aadir
la solucin de lactosa al medio bsico y mezclar. Mantener el medio en un
bao de agua (48-50C) hasta su utilizacin.
Principio de accin.

122

El agar M17 contiene peptonas y carne que son fuente de carbono, nitrgeno,
vitaminas y minerales. El extracto de levadura proporciona vitaminas del
complejo B que estimula al crecimiento bacteriano. La sal disdica del glicerofosfato amortigua el cido que se produce por la fermentacin de la
lactosa. El cido ascrbico estimula el crecimiento de estreptococos lcticos. El
sulfato de magnesio provee de iones esenciales para el crecimiento. El agar es
el agente solidificante.

123

Estimacin de la cifra presente de Lactobacillus casei o de

Lactobacillus acidophilus
OBJETIVO
Estimar la cifra presente de Lactobacillus casei o de Lactobacillus acidophillus,
en asociacin o no, con Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, y
Bifidobacterium, en productos lcteos.

FUNDAMENTO
El principio del mtodo de prueba, consiste en inocular diluciones decimales
de la muestra en
1. agar MRS acidificado adicionado con clindamicina, seguido de
incubacin anerbica a 37C/72 h., para la estimacin de la cifra de
microorganismos presente de L. acidophillus.
2. agar MRS acidificado adicionado con sales biliares, seguido de
incubacin anerbica a 37C/72 h., para la estimacin de la cifra de
microorganismos presente de L. casei.
MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES
1 matraz Erlenmeyer de 250,0 mL con tapa rosca conteniendo 90,0 mL de
solucin de triptona sala.
6 tubos de 16 x 150 con tapa rosca conteniendo 9,0 mL de solucin de
triptona sala.
1 matraz de 500,0 mL con 250,0 mL de medio MRS + clindamicina
acidificadoa (para enumeracin de L. acidophilus).
1 matraz de 500,0 mL con 250,0 mL de medio MRS + oxgall acidificadoa
(para enumeracin de L. casei).

SOLUCIONES Y REACTIVOS
Colorantes para Tincin de Gramd.
MATERIALES Y EQUIPO

Incubadora 37 1Ca.
Motor para licuadora estril o Stomachera.
Agitador de tubos tipo vortexa.
Contador de coloniasc,d.
Bao de agua con control de temperatura de 45 1 Ca.
5 pipetas graduadas de 1,0 mLa.
124

1 pipetas graduada de 10,0 mLa.

6 cajas de Petria.
Esptula de metala
Microscopio pticod.
Asa bacteriolgica d.
Portaobjetosd.

NOTAS
a
b
c
d

Material necesario al inicio de la prctica.

Material necesario a las 24 horas de iniciada la prctica.
Material necesario a las 48 horas de iniciada la prctica.
Material necesario a las 72 horas de iniciada la prctica.

PROCEDIMIENTO
Preparacin de la muestra y porcin de prueba.
NOTAS
Para productos con frutas, nicamente tomar la masa sin la fruta, porque la
masa sola contiene las bacterias lcticas viables.
En el caso de producto slidos, homogeneizar el producto que se va analizar
haciendo 8 (una docena de veces) con ayuda de una pipeta estril.
Eliminar esta pipeta. De ninguna manera utilizar la pipeta para efectuar las
dems diluciones porque contiene producto en el interior y exteriormente.
En el caso de productos lquidos, homogeneizar agitando en forma de arco
durante 1 min.
Para la preparacin de la muestra, realizar la primera dilucin tomando
aproximadamente 10,0 mL de producto y trasvasarlo aspticamente en 90,0
mL de diluyente. Enjuagar la pipeta varias veces hasta la completa
disolucin. Asegurar de no sumergir demasiado la pipeta dentro de la
muestra con el fin de evitar agregar producto residual de las paredes
externas de la pipeta.
Para homogenizar las diluciones seriadas del alimento a analizar, se
recomienda una rotacin manual y no en vortex debido a que se pueden
daar las bacterias viables.
1. Una vez realizada la primera dilucin al 10-1, desechar la pipeta despus de
su uso. Realizar agitaciones en arco durante 25 veces en cada dilucin.
2. Realizar diluciones seriadas con la ayuda de una pipeta nueva estril, tomar
1,0 mL de la dilucin al 10-1 e introducirlo en la pared de un nuevo tubo con
9,0 mL de diluyente sin tocar este diluyente y sin enjuagar. Se obtiene una
dilucin al 10-2, desechar la pipeta despus de utilizarla. Continuar as las
diluciones sucesivas hasta 10-8.
3. Simultneamente a las diluciones, sembrar por duplicado las 3 ultimas
diluciones a razn de 1,0 mL por caja de Petri

125

4. Vaciar inmediatamente el medio de cultivo fundido y enfriado y homogenizar

por rotacin las cajas. Despus de solidificar (aprox. 30 min) sobre una
superficie horizontal).
5. Despus de la solidificacin poner las cajas en jarra de anaerobiosis
(invertidas).
6. Incubar a 37C (+2C) durante 72 h. (+ 3 h) bajo atmsfera de CO2.
CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS.
Utilizar las cuentas de las placas que contengan 20-200 colonias.
Para efectuar los clculos y expresin de resultados, consultar el protocolo de
enumeracin de microorganismos viables en yogurt.
BIBLIOGRAFA
(2004). Lactic acid bacteria. Microbiological and Functional Aspects. 3th
ed. Seppo, S. & Atte von Wright. (Eds.) Marcel Dekker, Inc. New York.USA.
Pascual, M. R & Caldern, V. (2000). Microbiologa Alimentaria. Metodologa
analtica para alimentos y bebidas. 2. Ed. Diaz de Santos. Madrid, Espaa.
Marshall, R. T. (1992) Standard methods for the examination of Dairy
Products. American Public Health Association. Copyright, Washington, D. C.

126

Medios de Cultivo
Triptona sal, solucin de
Triptona (peptona de casena)
Cloruro de sodio (NaCl)
Agua destilada

1g
8,5 g
1,0 L

Disolver los componentes en el agua destilada. Si es necesario, ajustar antes

de la esterilizacin el pH para obtener 7,0 (+ 0,1) a 25 C (+ 2C). Repartir para
tener 9,0 mL por tubo y despus de la esterilizacin. Esterilizar durante 20 min
a 121C (+ 2C).
Utilizar solucin de triptona sal, solo si el producto a analizar no contiene
Bifidobacterium.
MRS + oxgall, medio
MRS, agar + 1,5 g/L de Bacto oxgall (sales biliares)
Poner en suspensin 70,3 g del polvo MRS en agua destilada, aadir las sales
biliares. Disolver la suspensin en bao Mara hirviente hasta la obtencin de
un lquido claro.
Ajustar el pH antes de la esterilizacin a 5.65 (+0,1) con cido actico glacial
concentrado (alrededor de 5,0 mL) para que el pH despus del autoclave sea
5,4 (+ 0,1) a 25C (+ 2C). Esterilizar en autoclave durante 15 min. a 121C (+
2C). Almacenar hasta por un mximo de un mes a 4C
Principio de accin
El principio selectivo de este medio reposa en la resistencia a las sales biliares
de L. casei
MRS + clindamicina, medio cido.
MRS (polvo comercial listo para su uso)
70,3 g
Agua destilada
1,0 L
Solucin de clindamicina al 0,005% (clindamicina 5,0 mg, agua destilada 100,0
mL), esterilizada por filtracin (0,45 m). Almacenar mximo por un mes a
4C.
Poner en suspensin 70,3 g del polvo MRS en agua destilada. Disolver la
suspensin en bao Mara hirviente hasta la obtencin de un lquido claro.
Ajustar el pH antes de la esterilizacin a 5.65 (+ 0,1) con cido actico glacial
concentrado (alrededor de 5,0 mL) para que el pH despus del autoclave sea
5,4 (+ 0,1) a 25C (+ 2C). Esterilizar en autoclave durante 15 min. a 121C (+
127

2 C). Aadir 0,2% de solucin de clindamicina en 100, 0 mL de medio MRS,

en condiciones de asepsia. Conservar mximo un mes en oscuridad a una
temperatura entre 0 y 5 C.
Principio de accin
El principio selectivo de este medio reposa en la resistencia a la clindamicina
del L. acidophilus.

128

Estimacin de la cuenta de Bifidobacterium

OBJETIVO
Estimar el nmero presente de Bifidobacterium en las leches fermentadas en
asociacin o no, con Streptococcus thermophilus y Lactococcus lactis,, en
productos lcteos.

FUNDAMENTO
El principio del mtodo de prueba, consiste en inocular diluciones decimales
de la muestra, en agar MRS neutro adicionado con dicloxacilina, seguido de
incubacin anaerbica a 37C/120 h., para la estimacin de la cifra de
Bifidobacterias presente.
MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES
1 matraz Erlenmeyer de 250,0 mL con tapa rosca conteniendo 90,0 mL de
solucin de triptona sal cistenaa.
6 tubos de 16 x 150 con tapa rosca conteniendo 9,0 mL de solucin de
triptona sal cistenaa.
1 matraz de 500,0 mL con 250,0 mL de medio MRS neutro + dicloxacilinaa
(para enumeracin de Bifidobacterias).
SOLUCIONES Y REACTIVOS
Colorantes para Tincin de Gramc.
MATERIALES Y EQUIPO

Incubadora 37 1Ca.
Motor para licuadora estril o Stomachera.
Agitador de tubos tipo vortexa.
Contador de coloniasc.
Bao de agua con control de temperatura de 45 1 Ca.
5 pipetas graduadas de 1,0 mLa.
1 pipetas graduada de 10,0 mLa.
6 cajas de Petria.
Esptula de metala
Microscopio pticod.
Asa bacteriolgica c.
Portaobjetosc.

NOTAS
129

a
b
c

Material necesario al inicio de la prctica.

Material necesario a las 24 horas de iniciada la prctica.
Material necesario a las 120 horas de iniciada la prctica.

PROCEDIMIENTO
Preparacin de la muestra y porcin de prueba.
NOTAS
Para productos con frutas, nicamente tomar la masa sin la fruta, porque la
masa sola contiene las bacterias lcticas viables.
En el caso de producto slidos, homogeneizar el producto que se va analizar
haciendo 8 (una docena de veces) con ayuda de una pipeta estril.
Eliminar esta pipeta. De ninguna manera utilizar la pipeta para efectuar las
dems diluciones porque contiene producto en el interior y exteriormente.
En el caso de productos lquidos, homogeneizar agitando en forma de arco
durante 1 min.
Para la preparacin de la muestra, realizar la primera dilucin tomando
aproximadamente 10,0 mL de producto y trasvasarlo aspticamente en 90,0
mL de diluyente. Enjuagar la pipeta varias veces hasta la completa
disolucin. Asegurar de no sumergir demasiado la pipeta dentro de la
muestra con el fin de evitar agregar producto residual de las paredes
externas de la pipeta.
Para homogenizar las diluciones seriadas del alimento a analizar, se
recomienda una rotacin manual y no en vortex debido a que se pueden
daar las bacterias viables.
1. Una vez realizada la primera dilucin al 10-1, desechar la pipeta despus de
su uso. Realizar agitaciones en arco durante 25 veces en cada dilucin.
2. Realizar diluciones seriadas con la ayuda de una pipeta nueva estril, tomar
1,0 mL de la dilucin al 10-1 e introducirlo en la pared de un nuevo tubo con
9,0 mL de diluyente sin tocar este diluyente y sin enjuagar. Se obtiene una
dilucin al 10-2, desechar la pipeta despus de utilizarla. Continuar as las
diluciones sucesivas hasta 10-8.
3. Simultneamente a las diluciones, sembrar por duplicado las 3 ultimas
diluciones a razn de 1,0 mL por caja de Petri
4. Vaciar inmediatamente el medio de cultivo fundido y enfriado y homogenizar
por rotacin las cajas. Despus de solidificar (aprox. 30 min) sobre una
superficie horizontal).
5. Despus de la solidificacin poner las cajas en jarra de anaerobiosis
(invertidas).
6. Incubar a 37C (+ 2C) durante 120 h. (+ 3 h) bajo atmsfera de CO2.
CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS.
Utilizar las cuentas de las placas que contengan 20-200 colonias.
130

Para efectuar los clculos y expresin de resultados, consultar el protocolo de

enumeracin de microorganismos viables en yogurt.
BIBLIOGRAFA
(2004). Lactic acid bacteria. Microbiological and Functional Aspects. 3th
ed. Seppo, S. & Atte von Wright. (Eds.) Marcel Dekker, Inc. New York.USA.
Pascual, M. R & Caldern, V. (2000). Microbiologa Alimentaria. Metodologa
analtica para alimentos y bebidas. 2. Ed. Diaz de Santos. Madrid, Espaa.
Marshall, R. T. (1992) Standard methods for the examination of Dairy
Products. American Public Health Association. Copyright, Washington, D. C.

131

Medios de Cultivo
Triptona sal, solucin de, (TSC)
Triptona (peptona de casena)
Cloruro de sodio (NaCl)
Clorhidrato de L-cisteina

1g
8,5 g
0,30 g

Agua destilada

1,0 L

Disolver los componentes en el agua destilada. Si es necesario, ajustar antes

de la esterilizacin el pH para obtener 7,0 (+ 0,1) a 25 C (+ 2C). Repartir para
tener 9,0 mL por tubo despus de la evaporacin que se presenta durante la
esterilizacin. Esterilizar durante 20 min a 121C (+ 2C).
Es recomendable regenerar los tubos de TSC durante 20+/- 5 min a 100 +/2C en un bao Mara antes de su uso.
MRS neutro + dicloxacilina, medio
MRS neutro pH 6,5 + 0,1 despus autoclave + 1,0 mL de solucin antioxgeno
+ 1,0 mL de una solucin al 1/10 de antibitico dicloxacilina por cada 100,0 mL
de medio de cultivo.
Poner en suspensin 15 g de agar bacteriolgico en un recipiente con 500,0
mL de agua destilada. Disolver la suspensin en bao Mara hirviente hasta la
obtencin de un lquido claro.
Poner en suspensin 55g de polvo MRS neutro en otro recipiente con
igualmente 500,0 mL de agua destilada (alrededor de 50C).
Mezclar las dos soluciones agitando bien.
Ajustar el pH antes de la esterilizacin a 6,5 (+ 0,1).
Esterilizar en autoclave durante 15 min a 121C (+ 2C).
Conservar un mes mximo a la oscuridad a una temperatura entre 0 y 5 C.

Solucin antioxigeno
Hidrocloruro de L-cistena

3,0 g

Agua destilada

100,0 mL

132

Despus de la disolucin, esterilizar por filtracin en membrana estril de

0.45 m. Conservacin 15 das a 4C. (Despus de este tiempo la solucin
pierde su efectividad).

Solucin de antibitico
Dicloxacilina

25,0 mg

Agua

50,0 mL

Despus de la disolucin, esterilizar por filtracin sobre membrana estril de

0,45 m. Conservacin 15 das a 4C. Repartir a razn de 10,0 mL en tubos
estriles. Conservacin 15 das a 4C. En el momento del empleo, efectuar una
dilucin al 1/10 de esta solucin madre con solucin de triptona sal cistena
regenerada.

133