Arquitectura celular:

El citoesqueleto

2012

-composicin
-dinmica
-modificadores

El citoesqueleto
Red dinmica de filamentos
proteicos:
POLIMEROS NO COVALENTES

Morfologa y resistencia celular

Movimiento celular, contraccin muscular
Transporte de organelas, partculas y
cromosomas durante la mitosis
Microfilamentos (8 nm): polmeros
bicatenarios de actina que forman cordones
lineales y arreglos geles bi- o tri
dimensionales.
Pueden estar anclados a la membrana
plasmatica. Define morfologa superficie
celular (filopodios, lamelipodios)
Microtbulos (25 nm): cilindros de y
tubulina. Ms rgidos que los microfilamentos con un extremo asociado a un
centrosoma (MTOC: centro organizador
de microtubulos)
Filamentos intermedios (10 nm):
protenas fibrosas que proporcionan
resistencia mecnica a la clula. Suelen
estar anclados a la membrana plasmtica.

Tilney and Porter

J.Cell Biol (1967)

25 nm
Microscopa
electrnica

MICROTUBULOS

Modelo de
plastilina

MICROFILAMENTOS

500 nm

125 nm

Tubulina

NIH 3T3

Actina

F-Actina
Tubulina

M.G. Thomas
Con los mismos componentes, las clulas elaboran distintos CSK y presentan distintas morfologas
Notar grosor de F-actin en fibroblastos (fibras de estrs) vs microtubulos

Filamentos
intermedios

Actina
alfa-actina (4 genes distintos): clulas musculares
beta-actina (lamelipodios) y gama-actina (stress fibers) : ubicuas (5 aa dif).
actividad ATPasa (hexokinasa ciclo gluclisis)
universal entre eucariotas (ancestro procariota?)
-altsima homologa (374-375 aa: 80 % identidad entre amebas y humanos)
-muy abundantes: actina y miosina: entre las TOP 5 en abundancia entre
las protenas naturales
actina en clulas musculares: 10 % (60 % actina-miosin)
clulas no musculares: 5 % (0.1-5 mM)

-modificaciones post-traduccionales:
N-acetilacin
3 metil histidina (His 73)
fosforilacin

Presenta NES
(seales de exportacin nuclear

Arginilacin de beta-actina:
N-acetilacin permite arginilacin en Asp3 (40 % in vivo)
-no afecta estabilidad
-afecta polimerizacin: sin Arg forma agregados
filamentosos, lamelipodios defectuosos

Modelo molecular:
Cargas positivias voluminosas de arg evitan agregacin,
Permite formacin de una red relajada
Karakozova et al., , Science 2006

beta

Tubulina: (GTPasa flia Ras;

procariotas: FtsZ)
alfa, beta, gama, delta y variantes de stas

Subunidad: dmero

alfa

mamferos (ratn): 7 genes alfa-tubulina

8 genes beta-tubulina
-muy homlogas (90% alfa-tub; 78-90 %
beta-tub)
-diferencias en C-terminal (15 aa) (zona
expuesta del MT)
-alta heterogeneidad de dmeros y de MT.
-MT muy regulados por diversas
modificaciones post-traduccionales
(PTMs)

Microtbulos
Polmeros tubulares constituidos por heterodmeros
de - y -tubulina

Estructura polar con un extremo (+) (beta)

que poli-meriza 3 veces ms rpido que el
extremo (-) (alfa)
Parten del centrosoma, ubicado en la
cercana del ncleo, hacia la periferia celular

Nucleacin de los microtbulos

Gama-tubulina: capaz de reclutar subunidades

Anillos: gama-Tubulin Ring Complex (gama-TuRC)

centrosoma

Beta-tubulina

Gamma tubulina
Actina
M. Loschi,

Microtbulos
Inestabilidad dinmica :

Rescate

Catstrofe
(varias veces por min)

Esta es la forma mas importante decontrolar la longitud de los

microtbulos, cuyo extremo - est en gral. capturado en el centrososma.
En microtbulos libres, tambien se observa treadmilling
-1984: se lo observ in vitro
-recientemente se lo confirm en vivo

En general, los microtbulos estn anclados al MTOC ubicado en el centrosoma, y

presentan los extremos + en la periferia celular. En esta regin se observa inestabilidad
dinmica.
Si un microtbulo se desprenden del MTOC, expone sus extremos y puede
experimentar treadmilling o depolimerizacin completa.
Clulas altamente polarizadas presentan arreglos especiales de microtbulos, con
polaridad mixta. Ej: dendritas neuronales; microtbulos corticales de clulas
epiteliales (polaridad basolateral-apical). Estas presentan numerosos MTOCs en la
zona apical, donde se concentra gamma-tubulina.

Polaridad de los microtbulos

CCW

+
CW
Scale bar, 0.2 m.

Filamentos intermedios (no polares) : protenas fibrosas

2 (polar)
N TERMINAL: (6-1200 AA),

POLIMERIZACIN: NO NUCLEACIN, FOSFORILACIN

4 (apolar)
8

32

8-10 nm

Cabezas globulares=entrecrutamiento (covalente)

Filamentos intermedios:
Existen 50 protenas fibrosas distintas, agrupadas en familias
PROTEINA

LOCALIZACION

Lamins A, B, C

lamina nuclear (lado interno envoltura nuclear)

Vimentina

mas o menos ubicua

Desmina

msculo

GFAP (glial fibrillary acidic protein)

astrocitos

Periferin

ciertas neuronas

Keratinas tipo I (acdicas)

Keratinas tipo II (bsicas)

celulas epiteliales y apndices (pelos, uas)

(variedad: 10-20)

Neurofilamento (NF L, H, M)

axones

NFL + NFH o NFM, densamente empaquetados Neurofilamentos controlan calibre axonal = transmisin impulso
-Estables quimicamente (purificacion diferencial)
Polimerizacion no requiere ATP/GTP
Regulacion por fosforilacion (mitosis)
IFAPs

Los tres tipos de filamentos interactan

Interaccin microfilamnetos, va nestin, con

filamentos nucleares (laminas)

Heart contractions cause periodic wavy buckling of microtubles.

El citoesqueleto es dinmico
1970s: estable

microtbulos
cromosomas

actual: remodelamiento es crucial para muchas funciones

celulares:
-mitosis
-cambios en forma celular (extravasado de linfocitos)
-movilidad
-extensin de lamelipodios, filopodios y prolongaciones en
general
-plasticidad sinptica
-activacin de TCR linfocitos T (y otras vas de sealizacin)

Los microfilamentos se reorganizan durante

la migracin celular

polimerizacin

De-polimerizacin

http://www.borisylab.nwu.edu/pages/movies.html

Sequence 1 (673 K) - Two types of crawling motion

Microfilamentos
Treadmilling (movimiento de
noria) en F-actina

El filamento de actina es una

estructura polar
Extremo (+) o barbado de rpida
polimerizacin
Extremo (-) o punta es de
polimerizacin lenta
La polimerizacin requiere de ATP
unido al monmero de actina
La hidrlisis de ATP a ADP debilita
la afinidad entre monmeros
Pequeas protenas controlan la
polimerizacin

Nucleadores de actina:
ramificado: ARP2/3
no ramificado:

-formina
-Cobl Cordon-Bleu (Cobl)
Ahuja, R., et al. 2007. Cell. 131:337350

Remodelacin de microfilamentos: ejemplo en extensin de lamelipodios y migracin celular

indicando formacin de lamelipodia

Thymosin (secuestra monomeros)

indicando formacin de lamelipodia

Thymosin

WASP: Wiskott-Aldrich Sindrome protein

Thymosin

Thymosin

Thymosin

Thymosin

Thymosin

50 % actina es g-actina (50-200 uM)

Como se regula la polimerizacin de actina (cortex) ?
1. Profilina: interviene en la polimerizacin
une G-actina,
secuencia: 1. intercambia ADP-ATP,
2. actina ATP-profilina se une a extremo +
3. se libera profilina
-se une a membranas fosfolipdicas
-Regulada por fosforilacin (conecta signaling con el CSK de
actina):

Thymosina beta-4: inhibe la polimerizacin

Secuestra g-actina,

ARP 2/3 complex

contiene
Arp 2
Arp 3
p40
p35
p18
p14

Es estrictamente regulada (WASP)

ADF/ cofilin: (15-19 kD)

Se une lateralmente (1:1),
preferentemente a actina-ADP, cambia conformacin === depolimeriza

dnde?
-en regiones subcelulares con remodelamiento microfilamentos:
(movilidad celular y citokinesis)

cmo?
Regulada por:

-LIMK 1 (responde a diversas kinasas)

-fosfatasas (dependientes y no dependientes de Ca)La forma desfosforilada tiene localizacin nuclear (lleva actina)
Ej: respuesta quimiotctica de neutrfilos a pptidos = defosforilacin

Caping (CP): heterodmero alfa/beta,

une a extremo + === estabiliza e impide polimerizacin,
inhibida por PIP2.

Gelsolina: caping y depolimeriza, regulada por polifosfoinostidos (PIP2)

Endosomas y Movimiento de Listeria monocytogenes

ActA: en la superficie
de la bacteria
(activador de Arp2/3)

La bacteria es un puntito
azul en la cabeza del
cometa

Vitriol and Zheng, Neuron 2012

Vitriol and Zheng, Neuron 2012

A diferencia de los microtbulos, la nucleacin de microfilamentos puede ocurrir en

muchos sitios dentro del citoplasma. Por ejemplo, asociado a las membranas de
ciertas organelas que utilizan cometas de actina para desplazarse.
Las organelas y membrana plasmtica son impulsadas por el crecimiento de Factina. (Modelo favorito: efecto de ltigo o mov browniano elstico).

Los microfilamentos tienen polaridad muy heterognea. Sus extremos + y libres

estn expuestos a polimerizacin y depolimerizacin, lo que se conoce como
treadmilling.

A diferencia de microtubulos y microfilamentos, los filamentos intermedios no

requieren un paso de nucleacin para iniciar su polimerizacin.

Drogas que afectan microfilamentos

falloidina (19..)

une y estabiliza filamentos

citocalasinas (1950)

bloquea extremo +: no permite polimerizacin

swinholide (1995)

se une a dmeros de actina y a microfilamentos,

fracturndolos. (Similar a gelsolina)

Latrunculina
y tolytoxina

secuestran subunidades

Citocalasina B: Inhibe polimerizacin

de actina por bloqueo del extremo en
crecimiento. Inhibe el anillo contrctil.
Afecta LTP, transporte de glucosa,
apoptosis y movilidad celular.

Drogas que afectan microtbulos

Taxol:

colchicina,
colcemida:

se une lateralmenrte a los microtbulos y los estabiliza.

Microtbulos supernumerarios, ondulados, engrosados.
Compite con tau (MAP). Antineoplsico.
se une con distinta afinidad a dmeros y a microtubulos.Cambia confromacin, hidroliza GTP, Impide polimerizacin

vinca alcaloides:
vinblastina
vincristina
unen subunidades y al extremo + e impiden polimerizacin
(afectan recambio GDP.Pi en el cap (50% normal))

nocodazole

unen subunidades e impiden polimerizacin

Colchicina: une a dmeros de

tubulina, activando la actividad
GTPasa. Previene polimerizacin.
de microtbulos.
Antimittico (huso mittico),
neurotxico, teratognico.

ACTINA TIAR

(cytochalysin B)

M. Loschi,

Control
Microfilam: OK
microtb:
OK

Cyto B
No!
OK

Colchicine
OK
No!

Densidad de microtbulos

Tratamiento con nocodazol

Prolongaciones
celulares

El equilibrio dinmico o estabilidad

vara en distintas regiones
subcelulares.

Cuerpo celular

Tiempo de exposicin a nocodazole

Inters farmacolgico:

Robotizacin y Screening automatizado de fenotipos

($$$$$$$$$$)

-CANCER: antimitticos (1980) (taxanos (TAXOL), alcoloides de vinca, criptofisinas, estramestina)

-afectan tambin clulas sistema inmune (mdula), folculos pilosos, clulas intestinales
-Resistencia a taxol (Goncalves et al., PNAS 2001)
-neurotxicos (transporte axonal dependientes de microtbulos)

-Fibrosis qustica: viscosidad del esputo disminuye con agentes depolimerizantes de actina (gelsolina)
-Infecciones por hongos
-Enfermedades cardiovasculares

En cuales funciones celulares es

relevante el Citoesqueleto ?
Interaccin CSK I. organelas con membraba
- II. maquinaria traduccional
-III. membrana plasmtica

Golgi
mitocondria

lisosomas
mitocondria

nocodazol

Golgi
Microtubulos

mitocondria

microtbulos
Cos-7 o/n anti-CSK drugs

ER
mitocondria

distribucin en el citoplasma (homognea o no)

herencia durante divisin celular
Microtbulos y microfilamentos,
segn tipo celular
.herencia de cloroplastos: microfil
.mov de mit en levaduras: microfil
.mitoc en Cos-7: microtub
.ER, Golgi: microt

II-Maquinaria traduccional

circa MCMLXX

(90 % total protena

celular)

75 % total polyA RNA + ribosomes

-sntesis de protenas es dependiente de la integridad de los microfilamentos (Penman, 1986)

En cuales funciones celulares es

relevante el Citoesqueleto ?
Interaccin CSK I. organelas con membraba
- II. maquinaria traduccional
-III. membrana plasmtica

III. Interacciones de microfilamentos y filamentos intermedios

con la membrana plasmtica:
-colabora en la sealizacin intracelular
-coordina el CSK de distintas clulas
-en mantener polaridad de la membrana (asimetras en la
composicin de lpido sy protenas)
-brinda soporte mecnico a uniones celulares

Microfilamentos anclados en uniones adherentes

Permite la
coordinacin del
movimiento de las
clulas en un tejido:
el ejemplo muestra
la invaginacin de
un epitelio

Filamentos intermedios (keratina) se anclan a

desmosomas y semidesmosomas

A Structural Scaffolding of
Intermediate Filaments in Health and
Disease
Elaine Fuchs, Don W. Cleveland
Science 1998

El CSK en uniones celulares:

soporte mecnico al complejo de la unin, sealizacin
intracelular, coordinacin de CSK de distinas clulas
tipo de unin

protena de membrana
involucrada en la adhesin

ligando
(extracelular)

protena ancladora
(intracelular)

tipo de filamento

adherente
(clula-clula)

cadherina

cadherina
(en la otra clula)

alfa y beta cateninas

vinculina
alfa actinina
placoglobina
(gama-catenina)

MICROFILAMENTOS

Desmosoma
(clula-clula)

cadherinas

desmogleins
y otras

desmoplakinas
placoglobina

FILAMENTOS
INTERMEDIOS

Adhesin
focal (ECM)

integrinas

ECM

talina, vinculina,
alfa-actinina
filamina

MICROFILAMENTOS

Hemidesmosoma
(ECM)

integrinas

ECM

plectina, BP230

FILAMENTOS
INTERMEDIOS

Regulacin del citoesqueleto:

-Protenas asociadas al citoesqueleto:
ABPs
MAPs
IFAPs
-Modificaciones post-traduccionales

Modificaciones post-traduccionales de tubulinas

De-tyrosinacin reversible C-terminal (alfa tub) (Caputo, BBRC 1974)
tambin marca estabilidad (no es causa, sino consecuencia de)
(detirosina el mT, se re-tirosina el dmero: MT estables estn
detirosinados). MT detyrosinados unen Kinesina 1, MT tyrosinados unen
CLIP170

2 Tubulin: pierde tambien glutamico C-terminal, no reversible, especfico de neuronas

TTL KO: severos defectos en SNC

Modificaciones post-traduccionales de tubulinas

De-tyrosinacin reversible C-terminal (alfa tub) (Caputo, BBRC 1974)
tambin marca estabilidad (no es causa, sino consecuencia de)
(detirosina el mT, se re-tirosina el dmero: MT estables estn
detirosinados). MT detyrosinados unen Kinesina 1, MT tyrosinados unen
CLIP170
acetilacin reversible de Lys 40 (lumen)(ausente en beta tub)
marca estabilidad (no es causa, sino consecuencia de)
(acMT unen kinesina 1)
Poliglutamilacin: adicin de 1-6 cido glutmico en C-terminal de
alfa1A tub(Glu445) y beta3 tub(Glu438).
Especfica de SNC (50% est polyGlutamilada!!!). PolyGlu-T interacta
con MAPs y kinesina dependiendo de la longitud. Binding de Tau es
optimo con 3E.

Tubulin Tyrosin Ligasa (TTL y TTL-like, 14 genes)

Fukushima et al., J Neurochem 2009

Las PTM muestran distinta distribucin subcelular

Axn: AcTub/TyrTub
Fukushima et al., J Neurochem 2009