Fundamentos Da Cromatografia

SENAI - Curso de Tecnologia em
Processos Quimicos
Faculdade de Tecnologia SENAI Roberto Mange

Curso de Tecnologia em Processos Quimicos
CROMATOGRAFIA
FUNDAMENTOS
DE
CROMATOGRAFIA
Michael Tswett - 1906
Separao da clorofila de uma

mistura de pigmentos de planta.
EDUARDO SANTOS
LOUZADA
1
CROMATOGRAFIA
CROMATOGRAFIA
ter de
petrleo
Carbonato de clcio em p
mistura de
Pigmentos
(clorofila)
CaCO3
Pequena quantidade de amostra
pigmentos
separados
ter de petrleo
Bandas separadas e de cores distintas.
CROMATOGRAFIA
CROMATOGRAFIA
PROBLEMA:
Graph = escrever
Kroma = cor
Escrevendo em cores
5
Analise Instrumental Prof Eduardo Louzada
Uma amostra a ser analisada

freqentemente uma mistura de vrios
componentes numa matriz complexa.
Para
amostras
que
contenham
componentes desconhecidos, eles precisam ser
separados dos demais, de modo que cada
componente individual possa ser identificado .
6

Processos Quimicos
CROMATOGRAFIA
FASE ESTACIONRIA
Princpio Bsico
Separao de misturas por interao

diferencial dos seus componentes entre
uma FASE ESTACIONRIA e uma
FASE MVEL.
7
Nos processos
cromatogrficos, esto
envolvidos duas fases,
sendo que uma se
locomove atravs de uma
outra. Assim, a fase que se
move denomina-se
fase mvel, e a que no se
locomove denomina-se
fase estacionria ou
suporte.
CROMATOGRAFIA
10
CROMATOGRAFIA
USOS E APLICAES
Ferramenta analtica para separao de
misturas.
Combinada com qumica convencional ou
instrumental identificar espcies qumicas.
TEMPO
11
Qualitativamente e Quantitativamente
12

Processos Quimicos
CROMATOGRAFIA PLANAR
Mtodos Cromatogrficos
Cromatografia
Planar
Coluna
F.M. Lquida
C.Papel
C.Camada
Delgada
F.M. Gasosa
C. Gasosa
F.M. Lquida
CCC
CLAE
CCC
CCC-Cromatografia
em Coluna Clssica.
CLAE-Cromatografia Lquida de Alta Eficincia.
CLAE
A Fase
Estacionria
colocada em uma
superfcie plana
(Placa de Vidro
ou Papel)
13
CROMATOGRAFIA EM COLUNA
14
Critrios de Classificao
1) Quanto ao mtodo de aplicao da
amostra e seu subseqente
desenvolvimento:
A Fase Estacionria colocada em um

tubo cilndrico (Coluna Cromatogrfica)
Eluio
Deslocamento
Anlise Frontal
15
16
Eluio:
Deslocamento:
A Introduo da amostra feita

em uma nica aplicao, com uma fase
mvel pura, que arrasta a amostra
ao longo da placa ou coluna.
Este o mtodo mais utilizado
na cromatografia analtica.
Os componentes da amostra so
retirados da fase estacionria usando
uma fase mvel que tem mais
afinidade por
eles. Este mtodo mais utilizado
em cromatografia preparativa, em
nvel industrial.
17
18

Processos Quimicos
Anlise Frontal:
Critrios de Classificao
A amostra
continuamente
aplicada uma
coluna, contendo a
fase estacionria,
sendo o
componente
menos retido, o
nico que sai na
forma pura.
2) Mecanismos de separao:
Fsico
Qumico
Mecnico
19
Fsico:
Quando se trata da
fase estacionria
slida , a adsoro
do soluto ocorre na
interface entre o
slido e a fase
mvel, devido a
presena de grupos
ativos na suas
superfcies.
Qumico:
usado em
cromatografia por
troca inica. A
fase estacionria
constituda de
uma matriz onde
so adicionados
grupos funcionais
ionizveis
..
21
Mecnico:
usado em
cromatografia por
excluso. As
molculas menores
da amostra so
separadas das
maiores porque
so capazes de
penetrar
facilmente em
todos os poros da
fase estacionria.
20
22
PROCEDIMENTO SIMPLES DE SEPARAO
Centrifugao
Cristalizao
Destilao
Extrao
Filtrao
MTODOS INSTRUMENTAIS DE SEPARAO
Cromatografia
23
24

Processos Quimicos
Faculdade de Tecnologia SENAI Roberto Mange

Curso de Tecnologia em Qumica Frmaco-Industrial
Cromatografia
CROMATOGRAFIA
PLANAR
Planar
F.M. Lquida
C.Papel
EDUARDO SANTOS
LOUZADA
C.Camada
Delgada
Coluna
F.M. Gasosa
C. Gasosa
F.M. Lquida
CCC
CLAE
CCC
CCC-Cromatografia
em Coluna Clssica.
CLAE
25
CROMATOGRAFIA EM PAPEL
CROMATOGRAFIA EM PAPEL
Tcnica simples e econmica de separao dos

componentes de uma mistura.
Cromatografia
lquida-lquida e a
separao ocorre
por absoro
(solubilidade) do
soluto entre os dois
lquidos.
26
27
Diferentes solubilidades relativas dos

componentes da amostra na fase mvel (lquida solventes) e na fase estacionria (lquida gua
retida na celulose).
Componentes menos solveis na fase

estacionria tm uma movimentao mais rpida,
enquanto os mais solveis sero seletivamente
retidos com uma movimentao mais lenta.
28
FASE MVEL E
FASE MVEL E
FASE ESTACIONRIA
FASE ESTACIONRIA
Lquidos menos polares (solventes
orgnicos): so repelidos por essa estrutura
e funcionam como fase mvel.
A celulose do papel constituda por 2.000

ou mais unidades de glicose anidra ligadas
por tomos de oxignio.
Um lquido polar como a gua ter grande
afinidade pelas hidroxilas de cada glicose,
formando pontes de hidrognio: fica retido e
funciona como fase estacionria.
n-pentano, ciloexano, tetracloreto de carbono,
29
benzeno, tricloroetileno, clorofrmio, ter

etlico, acetato de etila, amnia, acetona,
etanol, metanol, acetonitrila e gua
30

Processos Quimicos
APLICAO DA AMOSTRA
TIPOS
Aplica-se atravs de
um tubo capilar ou
micropipeta.
recomendvel
que a amostra seja
dissolvida num
solvente bastante
voltil
Ascendente.
Descendente.
Horizontal (circular).
Bidimensional.
31
Ascendente.
32
Horizontal (circular).
Descendente.
Bidimensional.
33
Cromatografia em papel
Deteco
Cromatografia
Anlise qualitativa:
Rf (fator de reteno)
Cor da Mancha
Planar
F.M. Lquida
Anlise quantitativa:
Diretamente no papel
C.Papel
Comparao da intensidade das cores das manchas

rea da mancha
Densitmetria ( Intensidade da cor)
C.Camada
Delgada
Coluna
F.M. Gasosa
C. Gasosa
F.M. Lquida
CCC
CLAE
CCC
CCC-Cromatografia
em Coluna Clssica.
CLAE
35
34
36

Processos Quimicos
INTRODUO
INTRODUO
A Cromatografia em Camada Delgada

(CCD) ou Thin Layer Chromatography
(TLC) uma tcnica simples, sendo
desenvolvida sobre uma placa de
vidro, que contm uma fina camada de
adsorvente.
um tipo de cromatografia lquidoslido
Seu desenvolvimento por Eluio e o

mecanismo de separao, por Adsoro.
37
38
Separao
Fsica:
Desenvolvimento
Eluio:
A Introduo da amostra feita
em uma nica aplicao, com uma fase
mvel pura, que arrasta a amostra
ao longo da placa ou coluna.
Este o mtodo mais utilizado
na cromatografia analtica.
39
Quando se trata da
fase estacionria
slida , a adsoro
do soluto ocorre na
interface entre o
slido e a fase
mvel, devido a
presena de grupos
ativos na suas
superfcies.
..
40
APLICAES
APLICAES
- No estudo preliminar de um sistema ou de uma

situao..
situao
- No estudo preliminar de um sistema ou de uma

situao.
situao.
Os farmacuticos aprendem muito sobre a

complexidade dos componentes do extrato de
uma planta, qualitativamente, por exemplo,
aminocidos em vegetais, fermentao, soro
sangneo, urina etc.
41
Consiste num mtodo cromatogrfico

planar, com Fase Mvel lquida e Fase
Estacionria slida.
A medicina legal investiga casos de

envenenamento; emprega a tcnica na
identificao de estimulantes ingeridos por
atletas.
A tcnica pode ainda ser aplicada a reaes
de sntese e tambm para reaes de
degradao de um produto natural extrado de
uma
planta
ou
de
uma
substncia
desconhecida.
42

Processos Quimicos
APLICAES
APLICAES
- Especialmente na Qumica Orgnica temos estas

utilidades
- No isolamento de produtos de reao

Esta tcnica pode ser aplicada no
isolamento de produtos de reao de
diversas formas, analisando a eficincia e
a preciso de uma destilao ou de uma
cristalizao, podendo at mesmo
verificar a pureza das fraes obtidas.
43
estabelecer a identidade de dois ou mais

compostos;
determinar o nmero de componentes de uma
mistura;
determinar o solvente apropriado para uma
separao por cromatografia em coluna;
.
44
PRINCPIO DA TCNICA
APLICAES
Na CCD, a fase lquida se move atravs da

fase estacionria.
Em todas estas
aplicaes, a CCD tem a
vantagem de utilizar
pequenas quantidades de
amostras..
amostras
Como h uma interao preferencial do

composto a ser identificado com uma das
fases, o percurso total percorrido pelo composto
ser diferente do percurso percorrido pela fase
mvel.
45
46
PRINCPIO DA TCNICA
Se o percurso
percorrido pelo
composto for
menor do que o
percorrido pela
fase mvel, diz-se
que h uma maior
adsorso do
composto na fase
estacionria.
Preparao das Placas:

Espalhamento
Manual
Espalhadores
Pr-Fabricadas
47
48

Processos Quimicos
Manual:
Soluo do adsorvente aplicada
manualmente sobre a placa de vidro,
com o auxlio de uma bagueta.
Pode-se tambm fazer uma soluo
do adsorvente em solvente voltil e
mergulhar a placa.
Este tipo de espalhamento gera
superfcies no uniformes.
49
Preparao das placas

utilizando
Espalhador
Utiliza-se quando
h necessidade
de camadas bem
uniformes e
espessuras
definidas do
adsorvente
50
Placas PrFabricadas:
Existem no mercado Placas
Pr-Fabricadas, dos
adsorventes mais comuns.
Preparao
das placas
utilizando
Espalhador
51
PREPARAO DA SUSPENSO DO ADSORVENTE
Celulose
Aplicao: Utilizada para separao de compostos
hidroflicos (acares, aminocidos, ons
inorgnicos, cidos nuclicos).
Alumina ( Al2O3)
Aplicao: Geralmente empregadas na separao de
compostos lipoflicos. (Hidrocarbonetos, vitaminas
lipossoluveis, corantes sintticos)
Slica ( SiO2)
Aplicao: Utilizada para separao de compostos
53
lipoflicos (fenis, aminocidos, esterides ).
Apesar do custo mais

elevado, elas dispensam a
preparao e so bem mais
uniformes e homogneas, o
que melhora a separao e
torna o Rf mais reprodutvel.
52
ATIVAO DAS PLACAS
A ativao consiste em aquecer as placas

em temperaturas relativamente elevadas, por
tempo prolongado. Isto aumenta o seu poder
de adsorso.
Este processo promove a remoo de vapor
dgua e outros resduos possivelmente
adsorvidos na placa.
54

Processos Quimicos
ATIVAO DAS PLACAS
ATIVAO DAS PLACAS
Adsorventes como slica, alumina so ativadas

a 105-110C por 30 a 60 minutos.
A celulose no deve ser aquecida por mais de
10 minutos a 105C.
As placas podem ser conservadas, prontas para
uso, em ambientes secos como dessecadores ou
caixas tipo estantes fechadas.
55
56
ATIVAO DAS PLACAS
Aps estarem as
placas todas
ativadas, costuma-se
riscar as placas de
formas a fazer com
que uma amostra, na
sua ascenso, no
interfira na da outra
amostra.
57
ESCOLHA DA FASE MVEL
Um ensaio cromatogrfico eficiente

significa uma separao total dos
componentes de uma amostra, num
tempo relativamente curto.
Para isto acontecer, necessrio
empregar um solvente adequado a
cada sistema cromatogrfico, isto ,
amostra e adsorvente empregado
58
Aplica-se a soluo da amostra em pontos

diferentes separados por alguns centmetros.
Depois das manchas secas, aplica-se um
solvente diferente sobre o centro da mancha.
59
O lquido dever migrar radialmente se o

eluente for apropriado a separao ser
eficiente.
60
10

Processos Quimicos
61
62
APLICAO DA AMOSTRA
As amostras so aplicadas
nas cromatoplacas na forma
de solues, em solventes
bem volteis.
Grandes quantidades de
amostras geram manchas
muito grandes, o que no
desejado.
63
64
APLICAO DA AMOSTRA
APLICAO DA AMOSTRA
A amostra deve ser aplicada com micropipeta,

quando a quantidade da amostra importante, ou
com tubo capilar, quando no, de 1,5 cm a 2,0 cm,
da base da placa.
Tcnica de aplicao
Ponto -anlise qualitativa e quantitativa.
Faixa - Anlise quantitativa e preparativa.
A
distncia entre as gotas no deve ser

menor a 1,0 cm
65
Forma incorreta
de aplicao
Forma correta de
aplicao
66
11

Processos Quimicos
APLICAO DA AMOSTRA
DESENVOLVIMENTO DA CROMATOGRAFIA
Cromatografia ascendente o mtodo

mais utilizado e pode ser considerado a
tcnica mais bsica.
67
As cubas cromatogrficas, em geral de vidro

com fundo plano, devem ter junto s paredes
um pedao de papel de filtro que permita a
subida da fase mvel, saturando rapidamente
o interior das mesmas.
68
As placas so colocadas numa cuba

cromatogrfica quase na posio vertical,
apoiadas no fundo da cuba e inclinadas para
as paredes laterais.
69
70
Cuba saturada
71
Quando a fase mvel atinge uma

determinada posio nas placas (2/3), estas
devem ser retiradas e importante marcar a
distncia percorrida pela fase mvel,
possibilitando o clculo dos valores de Rf.
Cuba no saturada
72
12

Processos Quimicos
73
75
DESENVOLVIMENTO
DA CROMATOGRAFIA
77
74
76
78
13

Processos Quimicos
REVELAO DOS CROMATOGRAMAS
Fsicos
Aps a eluio, as cromatoplacas so

secas e reveladas, tornando visvel as
substncias incolores existentes na
amostra. Os mtodos podem ser:
Fsicos
Qumicos
Biolgicos
Muitos compostos se tornam fluorescentes quando

excitados por luz UV, ou utiliza-se o adsorvente
contendo uma substncia fluorescente
79
80
Fsicos
Fsicos
81
82
Qumicos
Utiliza-se agentes cromognicos
(vanilina, tricloreto de Antimmio) que,
em contato com as substncias da
amostra, tornam-nas coloridas e,
portanto, visveis.
O mais utilizado o iodo, que torna as
manchas marrons.
83
84
14

Processos Quimicos
DOS CROMATOGRAMAS
REVELAO PELO
MTODO QUMICO
Biolgicos
Utiliza-se reaes enzimticas
ou bacterianas para tornar
a mancha visvel.
Placa de slica, eluda com
diclorometano:metanol (97:3). A
placa foi borrifada com soluo
esporos de fungos e, onde
apareceram manchas brancas
porque houve inibio dos fungos
pelas substncias contidas nos
extratos de uma planta.
Aplicadores de vidro
85
86
REVELAO COM APLICADOR COMERCIAL
Revelando o cromatograma
Modo de dirigir o jato

ao longo da placa
cromatogrfica
87
FORMAS DE DESENVOLVIMENTO
Desenhando as cromatoplacas
A tcnica bsica mais utilizada o

desenvolvimento ascendente
(unidimensional).
DOCUMENTAO DOS CROMATOGRAMAS
Os resultados obtidos aps a revelao das

cromatoplacas, podem ser documentados:
O objetivo do desenvolvimento
sempre a melhor separao das
substncias da amostra.
Existem tambm desenvolvimento

bidimensional.
88
Delineando as cromatoplacas sobre papel de seda

Fotografando as cromatoplacas
Xerocando as cromatoplacas
89
90
15

Processos Quimicos
Fator de Reteno (R.f.)
ANLISE QUALITATIVA
Leva em considerao a Cor e o Fator de Reteno :
91
Ws1
Ws2
dr1
onde dr a
distncia
percorrida pela
amostra e dm
a distncia
percorrida
pela fase
mvel
Linha de chegada da FM
dr2
O mtodo quantitativo ser

citado posteriormente.
R.f.=dr/dm
dm
Comparaes feitas do Rf obtido

com a amostra e o Rf de padres
considerado como o mtodo qualitativo.
Ponto de partida da amostra

Profundidade da FM92
CLCULO DA RESOLUO
Resoluo
Uma outra medida de separao de dois
componentes consecutivos a resoluo;
Usada em cromatografia calculada a partir da
distncia que separa as manchas dividido pela
mdia das larguras de suas respectivas bases:
Rs = 2(dr1 dr2)
(Ws1 + Ws2)
Rs = 2(dr1 dr2) / (Ws1 + Ws2)

93
PARMETROS UTILIZADOS NA CCD
ANLISE QUANTITATIVA
A CCD pode ser utilizada para quantificao.
Fator de Reteno (Rf):

Rf = dr / dm
Retira-se da cromatoplaca a rea que

contenha a substncia desejada que extrada
e quantificada posteriormente.
Resoluo (Rs):
Rs = 2(dr1 dr2) / (Ws1 + Ws2)
Frequentemente, utiliza-se a densitometria, e

medidas de fluorescncia.
95
94
96
16

Processos Quimicos
ANLISE QUANTITATIVA
Densitometria
Densitometria
ANLISE QUANTITATIVA
97
98
Exerccios
Calcule o Rf de cada substncia e a Resoluo
ANLISE QUANTITATIVA
Densitometria
1cm
10cm
0,5cm
8cm

99
100
Profundidade da FM
Exerccios
Calcule o Rf de cada substncia e a Resoluo
0,6cm
15cm
0,3cm
0,7cm
9cm
12cm
0,5cm
101
Profundidade da FM
17

Fundamentos Da Cromatografia

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Pequena quantidade de amostra

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Uma amostra a ser analisada

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Separao de misturas por interao

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A Fase Estacionria colocada em um

A Introduo da amostra feita

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PROCEDIMENTO SIMPLES DE SEPARAO

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Tcnica simples e econmica de separao dos

Diferentes solubilidades relativas dos

Componentes menos solveis na fase

A celulose do papel constituda por 2.000

n-pentano, ciloexano, tetracloreto de carbono,

Analise Instrumental Prof Eduardo Louzada

benzeno, tricloroetileno, clorofrmio, ter

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Comparao da intensidade das cores das manchas

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A Cromatografia em Camada Delgada

Seu desenvolvimento por Eluio e o

- No estudo preliminar de um sistema ou de uma

- No estudo preliminar de um sistema ou de uma

Os farmacuticos aprendem muito sobre a

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Consiste num mtodo cromatogrfico

A medicina legal investiga casos de

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- Especialmente na Qumica Orgnica temos estas

- No isolamento de produtos de reao

estabelecer a identidade de dois ou mais

Na CCD, a fase lquida se move atravs da

Como h uma interao preferencial do

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PREPARAO DA SUSPENSO DO ADSORVENTE

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Apesar do custo mais

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A ativao consiste em aquecer as placas

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Adsorventes como slica, alumina so ativadas

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