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conocida
como PCR por
sus
siglas
en
ingls
(polymerase chain reaction),
es
una
tcnica
de biologa
molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis,1 .Su objetivo es
obtener un gran nmero de copias de un fragmento
de ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora basta partir
de una nica copia de ese fragmento original, o molde.
Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad
es que tras la amplificacin resulta mucho ms fcil identificar con
una
muy
alta
probabilidad, virus o bacterias causantes
de
una enfermedad, identificar personas (cadveres) o hacer
investigacin cientfica sobre el ADN amplificado. Estos usos
derivados de la amplificacin han hecho que se convierta en una
tcnica muy extendida, sobre todo en el mbito de la investigacin
forense, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario
para llevar a cabo dicha tcnica.
Fundamento e importancia
Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN
polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean
ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las
hebras de ADN recin formadas entre s tras cada fase
dereplicacin y, a continuacin, dejar que las hebras de ADN
vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente. La reaccin
en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary
Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California, en la
dcada de 1980.
Inicialmente la tcnica era lenta, ya que las polimerasas
se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era
necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que
las
temperaturas
del
ciclo
(95 C
en
las
fases
de desnaturalizacin del
ADN)
suponen
la
inmediata
desnaturalizacin de toda protena, se emplean ADN polimerasas
termoestables, extradas de microorganismos adaptados a vivir a
esas temperaturas, restrictivas para la mayora de los seres vivos.
Dichos microorganismos, generalmentearqueas, son: Thermus
aquaticus (polimerasa
Taq), Pyrococcus
furiosus (Pfu), Thermococcus
litoralis (Vent)
y Thermus
thermophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de
polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer
correccin de errores (Pfu, Vent).
Termociclador: aparato en el que se efecta la PCR convencional.
Tipos de PCR
PCR anidada
Tcnica muy sensible de PCR en la que el producto de una
amplificacin es utilizado como molde para realizar una segunda
amplificacin con cebadores que se ubican dentro de la primera
secuencia amplificada, es decir, cuando tenemos el primer
amplicn se pueden unir los cebadores y se hace de nuevo una
amplificacin dentro del amplicn inicial. Este tipo de PCR tiene
la ventaja de brindar alta sensibilidad y especificidad. La
especificidad aumenta porque como es amplificacin de un
amplicn obtenido previamente, los cebadores slo van a hibridar
en un sitio dentro de la molcula y el resultado ser una nica
banda. As, evitamos posibles hibridaciones inespecficas de los
cebadores. La desventaja de esta tcnica es que no nos permite
cuantificar la muestra.
PCR de extensin solapada (Mutagnesis)
Se introducen cambios de secuencia dentro de fragmentos
(clonados) de ADN. Se requieren 2 cebadores (primmers)
mutagnicos y otros 2. Se amplifica un fragmento 5' y un
fragmento 3' que se solapan portando ambos la mutacin. Se usan
los productos en otra reaccin para producir el ADN mutado de
longitud completa
PCR in situ
La PCR in situ consiste en una reaccin de PCR en
secciones histolgicas o clulas, donde los productos generados
pueden visualizarse en el sitio de amplificacin. Es realizada sobre
preparaciones fijas en un portaobjetos. En la tcnica de PCR in
situ se realiza una primera amplificacin de ADN blanco y luego
deteccin mediante hibridacin in situ convencional con sondas de
ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades
pequesimas de genoma. Esta tecnologa es de gran alcance en la
capacidad de amplificar especficamente una poblacin de
secuencias de menor representacin.
PCR mltiple
PCR en la cual se amplifica simultneamente ms de una
secuencia. Para ello, se combinan dos o ms pares de cebadores en
Historia
Electroforesis de protenas SDS-PAGE resolviendo la polimerasa
Taq.
En 1971, un artculo publicado por Kleppe et al. en Journal of
Molecular Biology describi por primera vez un mtodo que usaba
enzimas para replicar una secuencia pequea de ADN con
cebadores in vitro.11 Sin embargo, este temprano ejemplo del
principio bsico de la PCR no recibi mucha atencin, y la invencin
de la reaccin en cadena de la polimerasa en 1983 es
generalmente atribuida a Kary Mullis.12 13 Mullis gan el Premio
Nobel por su trabajo en PCR.
Algo muy a tener en cuenta en la PCR es que la ADN polimerasa
que se use sea capaz de soportar las altas temperaturas de >90 C
necesarias para la separacin de las dos hebras de ADN de la doble
hlice tras cada ciclo de replicacin. Las ADN polimerasas que se
utilizaron originariamente para los experimentos in vitro previos a
la PCR no eran capaces de soportar estas altas temperaturas, por
lo que los primeros procedimientos para replicar el ADN eran muy