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La reaccin en cadena de la polimerasa,

conocida
como PCR por
sus
siglas
en
ingls
(polymerase chain reaction),
es
una
tcnica
de biologa
molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis,1 .Su objetivo es
obtener un gran nmero de copias de un fragmento
de ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora basta partir
de una nica copia de ese fragmento original, o molde.
Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad
es que tras la amplificacin resulta mucho ms fcil identificar con
una
muy
alta
probabilidad, virus o bacterias causantes
de
una enfermedad, identificar personas (cadveres) o hacer
investigacin cientfica sobre el ADN amplificado. Estos usos
derivados de la amplificacin han hecho que se convierta en una
tcnica muy extendida, sobre todo en el mbito de la investigacin
forense, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario
para llevar a cabo dicha tcnica.
Fundamento e importancia
Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN
polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean
ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las
hebras de ADN recin formadas entre s tras cada fase
dereplicacin y, a continuacin, dejar que las hebras de ADN
vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente. La reaccin
en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary
Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California, en la
dcada de 1980.
Inicialmente la tcnica era lenta, ya que las polimerasas
se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era
necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que
las
temperaturas
del
ciclo
(95 C
en
las
fases
de desnaturalizacin del
ADN)
suponen
la
inmediata
desnaturalizacin de toda protena, se emplean ADN polimerasas
termoestables, extradas de microorganismos adaptados a vivir a
esas temperaturas, restrictivas para la mayora de los seres vivos.
Dichos microorganismos, generalmentearqueas, son: Thermus
aquaticus (polimerasa
Taq), Pyrococcus
furiosus (Pfu), Thermococcus
litoralis (Vent)
y Thermus
thermophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de
polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer
correccin de errores (Pfu, Vent).
Termociclador: aparato en el que se efecta la PCR convencional.

Hoy, todo el proceso de la PCR est automatizado mediante un


aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los
tubos de reaccin para controlar la temperatura necesaria para
cada etapa de la reaccin. Muchos termocicladores modernos
hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como
enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente elctrica. Los
tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece
una buena conductividad trmica, permitiendo que se alcance
rpidamente el equilibrio trmico. Casi todos los termocicladores
tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar
la condensacinsobre los tubos de reaccin. Los termocicladores
ms antiguos carecan de este sistema y solucionaban el problema
de la condensacin con una capa de aceite en la parte superior de
la mezcla de reaccin o con un poco decera dentro de los tubos.
Por lo general, la PCR es una tcnica comn y normalmente
indispensable en laboratorios de investigacin mdica y biolgica
para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen
la clonacin de ADN para lasecuenciacin, la filogenia basada en
ADN, el anlisis funcional de genes, el diagnstico de trastornos
hereditarios, la identificacin de huellas genticas (usada en
tcnicas forenses y test de paternidad) y la deteccin y diagnstico
de enfermedades infecciosas.
Reactivos
Tubos de PCR que albergan la mezcla en un volumen total de
100 L.
Para realizar la tcnica se necesitan: 2
Los4 desoxirribonucletidos-trifosfato (dNTP),sustratos
para polimerizar nuevo ADN.
Dos cebadores o
iniciadores
(en
ingls, primers), oligonucletidos que
son,
cada
uno,
complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias
cortas, de entre seis y cuarenta nucletidos, normalmente de
dieciocho a veintids, que permiten que la polimerasa inicie la
reaccin. Deben estar enfrentados y no a mucha distancia.
Delimitan la zona de ADN a amplificar, es decir, corresponden a los
nucletidos que definen los extremos de la secuencia que se desea
replicar.
Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado
comnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o algn
otro catin divalente.
Tambin
se
puede
2+
emplear manganeso (Mn ), para mutagnesis de ADN mediante

PCR, ya que altas concentraciones de Mn 2+ incrementan la tasa de


error durante la sntesis de ADN. Actan como cofactores de la
polimerasa.
Iones monovalentes, como el potasio.
Una solucin tampn o buffer que mantiene el pH adecuado
para el funcionamiento de la ADN polimerasa.
ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con
temperatura ptima alrededor de 70 C (la ms comn es
la polimerasa Taq).
ADN molde, que contiene la regin de ADN que se va a amplificar.
Termociclador, el aparato que mantiene la temperatura necesaria
en cada una de las etapas que conforman un ciclo.
Conceptos de la PCR[editar]
Sensibilidad: se refiere a la cantidad mnima de ADN necesaria
para que se produzca la amplificacin, es decir, para obtener una
banda. Se relaciona con los falsos negativos, ya que puede que una
muestra sea positivas pero sea dada como negativa porque no se
ha amplificado por no tener suficiente cantidad de ADN.
Especificidad: se refiere a la obtencin de un solo producto
amplificado. Viene determinada por los oligos y la especificidad con
la que se unen al ADN molde. De esta forma, si los oligos tienen
ms de un sitio al que se pueden unir aparecer ms de un
producto amplificado. Se relaciona con los falsos positivos, ya que
puede que una muestra sea negativa pero sea dada como positiva
porque se ha amplificado una regin de ADN no diana o que no se
buscaba amplificar.
Eficiencia: se refiere a la amplificacin mxima que se puede
obtener en un nmero determinado de ciclos.
Fidelidad: se refiere a los errores que comete el ADN polimerasa
durante la amplificacin. Este concepto es de especial importancia
en la secuenciacin, pero en otros casos no es tan importante. Una
buena fidelidad permite evitar falsos positivos y/o negativos.
Ciclo de amplificacin

Esquema general de la PCR.

Grado de amplificacin segn el nmero de ciclos empleados.


A: gel de agarosa (1: ladder, 2: producto especfico, 3: producto
inespecfico);
B concentracin de ADN respecto del tiempo; C logaritmo de la
concentracin de ADN respecto del tiempo.
El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35
cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele
consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas. La PCR comn se
realiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos
de ciclos a menudo estn precedidos por un choque trmico
(llamado "hold") a alta temperatura (> 90 C), y seguido por otro
hold al final del proceso para la extensin de producto final o el
breve almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado
en cada ciclo dependen de gran variedad de parmetros. stos
incluyen la enzima usada para la sntesis de ADN, la concentracin
de iones divalentes y de los dNTP en la reaccin, y la temperatura
de unin de los cebadores, as como la longitud del ADN que se
desea amplificar.
Actualmente, casi todos los termocicladores dan la opcin de
realizar la reaccin de PCR con la llamada " tapa caliente". Es decir,
que el sistema del termociclador aplicar calor a la parte de arriba
del vial que contiene la mezcla de PCR. Al comienzo, los
laboratorios que empezaron a usar los primeros aparatos que se
comercializaron y que no incluan este sistema tenan que poner
unas gotas de aceite dentro del vial. El objetivo de este
procedimiento, al igual que el de la tapa caliente, es evitar la
condensacin de la muestra, ya que en el eppendorf se encuentran
dos fases:lquido y gas. Al condensarse la muestra, perdemos
volumen de la mezcla. Sin embargo, calentando la tapa o poniendo
las gotas de aceite evitamos este proceso fsico, conservando casi
intacto el volumen de la muestra.
Inicio
Este paso consiste en llevar la reaccin hasta una temperatura de
94-96 C ( 98 C si se est usando una polimerasa termoestable
extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto slo es
necesario paraADN polimerasas que requieran activacin por calor.
Desnaturalizacin
En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos
cadenas de las cuales est constituido). Este paso puede realizarse
de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 C) de la
muestra la forma ms habitual. La temperatura a la cual se decide
realizar la desnaturalizacin depende, por ejemplo, de la

proporcin de G+C que tenga la cadena, como tambin del largo


de la misma. Otros mtodos, raramente empleados en la tcnica
de la PCR, seran la adicin de sales o agentes qumicos capaces de
realizar la desnaturalizacin.
Alineamiento o unin del cebador
A continuacin se producir la hibridacin del cebador, es decir, el
cebador se unir a su secuencia complementaria en el ADN molde.
Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 C durante 2040 segundos (segn el caso), permitiendo as el alineamiento.
Los puentes de hidrgeno estables entre las cadenas de ADN
(unin ADN-ADN) slo se forman cuando la secuencia del cebador
es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el
hbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar
ADN. Los cebadores actuarn como lmites de la regin de
la molcula que va a ser amplificada.
Extensin o elongacin de la cadena
Acta la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la
cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte
inicial necesario para la sntesis de nuevo ADN. La polimerasa
sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra
molde aadiendo los dNTP complementarios en direccin 5' 3',
uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del
final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La
temperatura para este paso depende del ADN polimerasa que
usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de mxima
actividad est en 75-80 C (comnmente 72 C). El tiempo de
extensin depende tanto del ADN polimerasa usada como de la
longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. Hay una
regla comnmente usada: en su temperatura ptima, la polimerasa
de ADN polimerizar mil bases en un minuto.
Elongacin final
Etapa nica que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 C
durante 5-15 minutos tras el ltimo ciclo de PCR. Con ella se
asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea
totalmente ampliado.
Conservacin
Este es un paso que se lleva a cabo a 4-15 C durante un tiempo
indefinido para conservar la reaccin a corto plazo.
La PCR normalmente se realiza con un volumen de reaccin de 15100 L, en pequeos tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan en el
termociclador.

Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN


previsto, se emplean tcnicas de electroforesis, que separan los
fragmentos de ADN generados de acuerdo a su carga, esto es,
longitud, y, en menor medida y dependiendo de la matriz
empleada, a su tamao: tpicamente se emplean la electroforesis
en gel de agarosa, para fragmentos grandes; en acrilamida, para
los ms pequeos; y, de forma ms rpida y aplicable a la PCR
asociada a marcaje fluorescente, la electroforesis capilar.3 El/los
tamao/s de los productos de la PCR vienen determinados por un
marcador de peso molecular de ADN, el cual contiene fragmentos
de ADN de tamao conocido, y que se corre en el gel junto con los
productos de PCR.
Optimizacin de la PCR[editar]
En la prctica, la PCR puede fallar por varias razones, entre ellas:
La PCR es una tcnica de gran sensibilidad, es decir, necesita una
mnima cantidad de ADN para obtener un gran nmero de copias.
Adems, puede ser muy propensa a errores si se lleva a cabo en
condiciones inadecuadas de esterilidad, que conduzcan a la
amplificacin de ADN no correspondiente a la muestra a analizar (y
por tanto a conclusiones inciertas). Se han de tomar una serie de
precauciones para evitar la contaminacin con ADN extrao.
Ejemplos en los que es especialmente importante evitar la
amplificacin son la deteccin de enfermedades (para no
diagnosticar errneamente a los pacientes) o el diagnstico de
identidad y parentesco.
Las tcnicas de diseo de cebadores son importantes en la
mejora de la obtencin de productos de PCR y en evitar la
formacin de productos falsos. Algunas consideraciones al
disear estos cebadores son:
Se recomienda usar primers de ms de 15 nucletidos (18-30 nn)
Normalmente, se suelen disear de 20 nucletidos. Los cebadores
muy cortos hacen que nuestra PCR no sea muy especfica, y los
que se excedan en longitud harn que perdamos rendimiento en la
reaccin.
Los primers no deben diferir en ms de 3 bases.
La proporcin entre bases pricas y pirimidnicas de los dos oligos
sea 1:1 (40-60% a lo sumo), y que empiecen y terminen con 1 2
bases pricas.
Se requiere una distribucin homognea de los cuatro nucletidos
en la secuencia, evitando los poliT/A/G/C.
La Tm (melting temperature) de los oligos no puede diferir en ms
de 5 C.

Los cebadores no deben incluir en su secuencia regiones que sean


complementarias entre s, o se formarn dmeros entre ellos.
Existe una gran variedad de polimerasas disponibles, pudiendo
elegir la que ms se ajuste a nuestras necesidades. Por ejemplo,
algunas tienen actividades inexistentes en otras o las realizan de
forma ms eficiente, o funcionan en intervalos de temperatura en
los cuales otras se desnaturalizan o pierden funcionalidad. Las ms
habituales son la taq y la pfu.
Los componentes del tampn de reaccin debern ajustarse a
las exigencias de nuestras enzimas.
El termociclador, por supuesto, debe ser capaz de reproducir
correctamente los ciclos de la PCR: para ello, diversas casas
comerciales nos ofrecern termocicladores elaborados con
materiales que hagan ms eficaces el desarrollo y el transcurso de
las etapas, adems de diversas facilidades de manejo. Dentro del
laboratorio, su manejo, mantenimiento y ubicacin ser clave.
Aparte de aspectos como la contaminacin y algn fallo en la
hibridacin de primers, puede haber otras complejidades que
afecten a la PCR, como son:
Degradacin del ADN: esto puede ocurrir cuando se manipula la
muestra en condiciones subptimas o cuando se hace
una autopsia, por ejemplo, y resulta en ausencia de amplificacin o
resultados parciales. Un caso particular es el "allele dropout", o
bien prdida de un alelo, que se puede llegar a confundir con
ser homocigtico para dicho alelo.
Inhibicin de la PCR: puede haber agentes que interfieran en el
correcto transcurso de la PCR. Requerir un procesamiento
adicional de la muestra para eliminar estos compuestos del medio
antes de preparar la mezcla de PCR. Tanto la sangre como
elsemen contienen este tipo de inhibidores, por lo que es necesario
una purificacin previa.
Modificacin del ADN: las sustancias como el formol (empleado
en conservacin de tejidos) o la luz ultravioleta modifican el ADN,
alterando as los resultados de la amplificacin.
Artefactos: pueden darse situaciones como las bandas "stutter" o
"shadow", que consisten en que la polimerasa amplifica una
repeticin de ms de un microsatlite o repeticin en tndem.
Alelo fuera de patrn: un alelo amplificado puede no coincidir
con el patrn de picos de la referencia. Esto es seal de que algo
ha ido mal durante la PCR.
Mezclas: es posible que dos muestran se mezclen de alguna forma
y el resultado sea una combinacin del patrn de picos que cabe

esperar tras la amplificacin de cada una de ellas por separado.


Esto y el caso anterior dificulta la interpretacin de los resultados.

Tipos de PCR
PCR anidada
Tcnica muy sensible de PCR en la que el producto de una
amplificacin es utilizado como molde para realizar una segunda
amplificacin con cebadores que se ubican dentro de la primera
secuencia amplificada, es decir, cuando tenemos el primer
amplicn se pueden unir los cebadores y se hace de nuevo una
amplificacin dentro del amplicn inicial. Este tipo de PCR tiene
la ventaja de brindar alta sensibilidad y especificidad. La
especificidad aumenta porque como es amplificacin de un
amplicn obtenido previamente, los cebadores slo van a hibridar
en un sitio dentro de la molcula y el resultado ser una nica
banda. As, evitamos posibles hibridaciones inespecficas de los
cebadores. La desventaja de esta tcnica es que no nos permite
cuantificar la muestra.
PCR de extensin solapada (Mutagnesis)
Se introducen cambios de secuencia dentro de fragmentos
(clonados) de ADN. Se requieren 2 cebadores (primmers)
mutagnicos y otros 2. Se amplifica un fragmento 5' y un
fragmento 3' que se solapan portando ambos la mutacin. Se usan
los productos en otra reaccin para producir el ADN mutado de
longitud completa
PCR in situ
La PCR in situ consiste en una reaccin de PCR en
secciones histolgicas o clulas, donde los productos generados
pueden visualizarse en el sitio de amplificacin. Es realizada sobre
preparaciones fijas en un portaobjetos. En la tcnica de PCR in
situ se realiza una primera amplificacin de ADN blanco y luego
deteccin mediante hibridacin in situ convencional con sondas de
ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades
pequesimas de genoma. Esta tecnologa es de gran alcance en la
capacidad de amplificar especficamente una poblacin de
secuencias de menor representacin.
PCR mltiple
PCR en la cual se amplifica simultneamente ms de una
secuencia. Para ello, se combinan dos o ms pares de cebadores en

un mismo tubo, junto con el resto de los reactivos de la reaccin en


cantidades suficientes, para amplificar simultneamente varios
segmentos de ADN. Ventajas: informacin sobre varios locus en
una sola reaccin, menor cantidad de molde para el anlisis, menor
cantidad
de reactivos,
rpida
construccin
de bases
de
datos. Desventajas: para llevarla a cabo adecuadamente y sin
errores, se requiere de una cuidadosa optimizacin del proceso.
PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)
Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde
inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa inversa (como
Tth) para realizar la sntesis de un ADN complementario al ARN
(ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR sera:
1.er paso: retrotranscripcin a partir del ARN.
2 paso: amplificacin a partir de la primera hebra de ADNc.
3.er paso: PCR estndar.
PCR en tiempo real o PCR cuantitativo (qPCR)
Artculo principal: PCR en tiempo real
Reaccin de PCR cuya principal caracterstica es que permite
cuantificar la cantidad de ADN o ARN presente en la muestra
original, o para identificar con una muy alta probabilidad, muestras
de ADN especficas a partir de su temperatura de fusin (tambin
denominado valor Tm, del ingls melting temperature).
Se puede dividir en las tcnicas basadas en fluorocromos no
especficos y en las tcnicas basadas en sondas especficas.
En las tcnicas basadas en fluorocromos el ADN, que ve
multiplicada su cantidad con cada ciclo, se une al fluorocromo
(generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que es
medida por el termociclador apto para PCR en tiempo real. Permite
cuantificar slo una secuencia por reaccin pero tiene
la ventaja de utilizar cebadores normales para su realizacin. Es
mucho ms econmica que la que usa sondas especficas.
Las
tcnicas
basadas
en
sondas
especficas
utilizan
una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona
intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse);
cuando la sonda est intacta, presenta una transferencia
energtica de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no
se produce cuando la sonda est daada y los dos fluorocromos
estn distantes, producto de la actividad 5'-3' exonucleasa de la
ADN polimerasa. Esto permite monitorizar el cambio del patrn
de fluorescenciay deducir el nivel de amplificacin del gen.
La mayora de estos inconvenientes se han solucionado con la
introduccin de la PCR realizada en tiempo real (Q-PCR), que

elimina cualquier proceso post-PCR puesto que monitoriza la


progresin de la amplificacin en el momento en que ocurre. A
diferencia de la PCR convencional (en punto final), que mide la
acumulacin del ADN al final de un nmero predeterminado de
ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el proceso de amplificacin
usando fluorescencia, de forma que su aumento es proporcional a
la cantidad de ADN formada. El proceso se puede automatizar
fcilmente usando un sistema que realice la amplificacin
(termociclador) y que a su vez sea capaz de leer fluorescencia.
Existe una amplia oferta de aparatos en el mercado. La mayora
pueden trabajar con las diversas opciones de marcado fluorescente
y son "abiertos", es decir, permiten programar las condiciones de
amplificacin y lectura de forma que su uso no queda limitado a
unos reactivos determinados.

Variaciones de la PCR bsica


PCR especfica de alelo: esta tcnica de diagnstico o clonacin
es usada para identificar o utilizar los polimorfismos de una sola
base (SNPs). Utiliza cebadores especficos para las secuencias
normal y mutante. El diseo ms habitual es un anlisis en dos
tubos con dos cebadores: uno normal y otro mutante en reacciones
separadas junto con los cebadores control.
PCR "assembly": consiste en la sntesis artificial de largas
secuencias de ADN, realizando para ello la PCR en un fondo de
oligonucletidos largos con secuencias solapantes cortas.
PCR asimtrica: usada para amplificar preferentemente una
cadena del ADN original con respecto a la otra.
PCR de colonia: mediante esta tcnica, colonias de
bacterias Escherichia coli pueden ser rpidamente examinadas
para construcciones viables de vectores de ADN.

Amplificacin dependiente de helicasa: esta tcnica es muy


parecida a la PCR convencional, pero en ella se emplea la
enzima helicasa y una temperatura constante en lugar de la
polimerasa de ADN y los ciclos repetidos de hibridacin-elongacin.
PCR hot-start: esta tcnica reduce la amplificacin inespecfica
durante las etapas iniciales de la PCR: mientras que la mquina
alcanza la temperatura de la primera etapa (unos 95) puede que
ocurra la unin de los cebadores y se produzca amplificacin, ya
que en el camino para alcanzar estos 95 se pasa por la
temperatura de anillamiento (que es ms baja).
Para evitar esto, la PCR hot-start se basa en que la reaccin
comience cuando la mquina ya est a 95, debido a que antes no
se encuentran presentes la polimerasa o el cloruro de magnesio, lo
que podemos conseguir mediante varias tcnicas:
- Aadir la polimerasa o el cloruro de magnesio tras el periodo de
calentamiento
- Separar por una capa de cera los distintos componentes de la
reaccin. La cera se funde al alcanzar los 95 y es entonces cuando
los componentes entran en contacto
- Anticuerpos anti-polimerasa que estn bloqueando a la
polimerasa. Al alcanzar los 95 estos anticuerpos se inactivan
debido a que se desnaturalizan y la polimerasa puede actuar
PCR especfica de intersecuencia (ISSR): se trata de un
mtodo de PCR para su uso en huella gentica, que amplifica
regiones entre repeticiones de secuencia simple para producir una
huella gentica nica de longitudes de fragmento amplificadas.
PCR inversa: es un mtodo usado para poder realizar la PCR
cuando slo es conocida una secuencia interna. Muy til en la
identificacin de secuencias que flanquean insertos genmicos.
PCR mediada por ligacin: este mtodo usa pequeos linkers de
ADN ligados al ADN de inters y mltiples cebadores hibridando
estos linkers.
PCR especfica de metilacin (MSP): se usa para
detectar metilaciones en islas CpG de ADN genmico.
Amplificacin Mltiple Dependiente de Sonda (Multiplex
Ligation-dependent Probe Amplification o MLPA): permite
amplificar varias secuencias objetivo con un nico par de
cebadores, evitando as las limitaciones de resolucin de la PCR
multiplex.
PCR cuantitativa: se usa para medir la cantidad de un producto
de PCR. En la tcnica clsica de PCR, se cuantifica por
aproximacin con diluciones y amplificacin de concentraciones

conocidas de la secuencia diana. Tambin se puede cuantificar


pormtodo competitivo: se trabaja con concentraciones
crecientes conocidas de un fragmento que puede ser amplificado
por los mismos oligos que la muestra de estudio, pero de menor
tamao que sta, de forma que con los resultados obtenidos se
puede estimar qu concentracin del competidor es equivalente a
la de la muestra de cantidad desconocida. La cuantificacin en PCR
est optimizada en la tcnica de PCR en tiempo real.
PCR-TAIL: la PCR termal de entrelazado asimtrico es usada para
aislar una secuencia desconocida que flanquea una secuencia
conocida.
PCR touchdown: se trata de una variante de la PCR que se
emplea cuando se desconoce la secuencia exacta de los extremos
de la secuencia a amplificar, de modo que se asume que puede
existir alguna base desapareada en el alineamiento cebadorsecuencia. Su finalidad es reducir el fondo no especfico bajando
gradualmente la temperatura de hibridacin a lo largo del progreso
de la PCR.
PAN-AC: este mtodo usa condiciones isotermas para la
amplificacin, y puede ser usado en clulas vivas.
Ciclo trmico rpido para PCR: 4 La amplificacin del DNA puede
llevarse a cabo rpidamente, como completar 30 ciclos en menos
de 30 minutos: ciclo trmico rpido. Normalmente se ha
considerado que las etapas de cada ciclo son tres reacciones que
ocurren en tres periodos separados y a tres temperaturas
diferentes. Este paradigma del equilibrio secuencial no tiene en
cuenta que la temperatura de la muestra no cambia
instantneamente, de hecho, durante una PCR la muestra est la
mayora del tiempo en temperaturas de transicin. El ciclo trmico
rpido
aprovecha
la
ventaja
de
la
instantnea desnaturalizacin e hibridacin, cuyas temperaturas
necesitan alcanzarse, pero no mantenerse. Adems, para
productos cortos, la extensin puede llevarse a cabo durante la
transicin a la temperatura de extensin, y por lo tanto, tampoco
es necesario mantenerla. Un ciclo rpido podra entonces
describirse como 94C, 0 seg; 55C, 0 seg y 72C, 0 seg. Como
vemos, este modelo no ayuda, porque nos lleva solo a
temperaturas extremas y no nos da informacin sobre lo que pasa
entre ellas. En cambio, en el paradigma cintico para PCR de ciclo
rpido se describe completamente el historial de temperaturas de
la muestra. Se considera que desnaturalizacin, hibridacin y
elongacin ocurren en un rango de temperaturas y adems pueden

solapar temporalmente. Hay termocicladores que permiten que un


ciclo se complete en 20-60 segundos, por lo que 30 ciclos tardan
de 10 a 30 minutos.
Aplicaciones[editar]
La tcnica de la PCR tiene multitud de aplicaciones: ya en ciencia
bsica, como herramienta de deteccin y/o generacin de acervos
de fragmentos de ADN de inters; ya en ciencia aplicada, como
elemento resolutivo en s mismo, por ejemplo en diagnstico
clnico.
Investigacin
La PCR convencional, se emplea como base para multitud de
tcnicas en el laboratorio debido a su robustez y rapidez. De este
modo, la PCR de punto final permite controlar y detectar los
fragmentos de ADN de inters.

Clonacin de un segmento de ADN mediante amplificacin con


cebadores
que
contienen
una
secuencia
apta
para
la recombinacin dirigida con un plsmido.
Una aplicacin de la PCR de extrema importancia es la clonacin de
secuencias de ADN en vectores, como pueden ser los plsmidos.
Para ello, se emplean cebadores que contienen en su extremo 5'
una corta secuencia que permite la interaccin posterior con otra
complementaria situada en el vector de clonacin a emplear. Por
ejemplo, se puede incluir una diana de restriccin en dichos
cebadores, de modo que, y si sta no exista previamente en el
fragmento y es nica en el vector, pueda efectuarse una ligacin
mediante la ligasa de T4 tras la digestin con la enzima de
restriccin apropiada de ambos elementos. Otro mtodo asimilable

a esta va es el empleo de la recombinacin dirigida; esto es, se


adapta al 5' de los cebadores una secuencia que faculta a
una recombinasa la recombinacin dirigida con un vector dado. 5
Medicina
En medicina, la PCR se emplea fundamentalmente como
herramienta de diagnosis (Coleman y Tsongalis, 2006):
Una de las principales aplicaciones de la PCR es hacer pruebas
genticas para detectar mutaciones en el ADN que provoquen
algn tipo de enfermedad.El diagnstico de enfermedades
hereditarias presentes en elgenoma es un proceso largo y
complicado que puede acortarse significativamente gracias a la
PCR. As, se pueden hacer anlisis del ADN de los futuros padres
para ver si son portadores, o analizar el ADN de sus hijos por si
estn afectados por una enfermedad hereditaria. Para el anlisis
prenatal, las muestras de ADN pueden obtenerse a partir de
la amniocentesis, de la muestra de las vellosidades corinicas o
incluso a partir de algunas clulas fetales que circulan por el
torrente sanguneo de la madre. El uso de la PCR tambin es
esencial para el diagnstico gentico preimplantacional donde se
pueden analizar las clulas del embrin para buscar posibles
mutaciones.
Permite el genotipar la especie o especies que provocan un
determinado cuadro infeccioso: para ello, se amplifica una zona del
genoma bacteriano cuyo producto de PCR posea unas
caractersticas de tamao o temperatura de fusin que permitan
identificarlo de forma inequvoca. En el caso de infecciones virales
que implican la integracin del genoma del patgeno en el ADN del
hospedador, como es el de la infeccin por VIH, la PCR cuantitativa
posibilita la determinacin de la carga viral existente y por tanto,
del estadio de la enfermedad. 6
La PCR tambin se puede usar en revisiones mdicas rutinarias,
como en los servicios de donantes de sangre, para test de rutina. A
travs de esta tcnica se pueden detectar infecciones en el
donante (como VIH oHepatitis B) mientras an estn en el periodo
de incubacin. Dada la sensibilidad de los test de PCR se pueden
tomar muestras colectivas o "pools" (por ejemplo, 96 pruebas
individuales). Si una de estas muestras colectivas da positivo, se
toman a partir de ella muestras progresivamente menores hasta
que se encuentre el causante.
Tambin se puede usar la PCR como parte de las pruebas
realizadas cuando se hace un trasplante de tejidos. En 2008 se

propuso usar esta tcnica para reemplazar las pruebas


tradicionales con anticuerpos. 7
A veces, mediante la PCR se pueden hacer terapias personalizadas
para pacientes con ciertos tipos de cncer que producen
mutaciones en los oncogenes a partir de la deteccin de estas
mutaciones.
Paleontologa, antropologa biolgica, y ciencias forenses
Los campos de la paleontologa, antropologa biolgica y la
medicina y antropologa forense se han visto enormemente
beneficiados por esta tcnica, puesto que todas ellas construyen
con frecuencia el conocimiento de sus correspondientes disciplinas
gracias a restos o huellas de seres vivos. Uno de los materiales
biolgicos que ms informacin puede proporcionar es el ADN.
La relativa estabilidad de ste permite que, aunque fragmentado,
se conserve durante largos perodos si las condiciones son
propicias.5 En ocasiones las muestras intactas con las que se puede
contar son extraordinariamente pequeas o estn deterioradas. La
PCR soluciona ambos problemas y proporciona cantidades tiles
para posteriores pasos de anlisis. En primer lugar aumenta la
cantidad de material recuperado a partir de muestras escasas,
puesto que como ya se dijo anteriormente, en teora basta una sola
molcula para que el proceso pueda tener lugar. Tambin debido a
la naturaleza de la tcnica y su propsito de amplificacin de
fragmentos pequeos, esta fragmentacin no impide que este ADN
pueda ser empleado como molde para una reaccin de PCR.
En paleontologa y Antropologa la PCR permite recuperar las
escasas cantidades de ADN que an no se han degradado. Algunos
lugares en que el ADN podra preservarse son la brea las cenizas
volcnicas, el mbar, hielos histricos polares o glaciares y
ambientes ridos, sedimentos, as como en los cristales
de apatita de restos de esqueleto,8 siendo posible de ese modo
caracterizar cadveres, fsiles u otros restos mediante genotipado
por
anlisis
de microsatlites o
incluso
genomas
de taxones extintos, amplificados de este modo, como pueden ser
los realizados mediante el ADN genmico del hombre de
Neanderthal.9 El propsito sera utilizar este ADN amplificado para
posteriormente realizar estudios filogenticos o etnogrficos o de
poblaciones mediante la comparacin de secuencias de ADN, o el
estudio de las causas de la separacin evolutiva de dos especies.
En las ciencias forenses se emplea para establecer la filiacin de
una persona o para obtener pruebas a partir de muestras mnimas

dejadas por el autor de un crimen como saliva, semen u otros


restos de tejidos (Butler, 2005).
Agronoma y diversidad
Tal y como la PCR multiplex permite producir huellas genticas de
individuos concretos, dentro del marco de la gentica forense,
existen mtodos basados en la PCR que permiten discernir entre
grupos infraespecficos de cultivos de inters agronmico; por
ejemplo, de cultivares.10 Para ello, se emplean oligonucletidos de
un tamao lo suficientemente pequeo como para que ceben de
forma relativamente inespecfica, aunque siempre de tal forma que
produzcan un patrn de bandas discreto e interpretable. De este
modo, la pauta obtenida tras la electroforesis de los fragmentos
tiende a agrupar a los individuos de mayor semejanza, que poseen
un comportamiento similar, de los que divergen...

Historia
Electroforesis de protenas SDS-PAGE resolviendo la polimerasa
Taq.
En 1971, un artculo publicado por Kleppe et al. en Journal of
Molecular Biology describi por primera vez un mtodo que usaba
enzimas para replicar una secuencia pequea de ADN con
cebadores in vitro.11 Sin embargo, este temprano ejemplo del
principio bsico de la PCR no recibi mucha atencin, y la invencin
de la reaccin en cadena de la polimerasa en 1983 es
generalmente atribuida a Kary Mullis.12 13 Mullis gan el Premio
Nobel por su trabajo en PCR.
Algo muy a tener en cuenta en la PCR es que la ADN polimerasa
que se use sea capaz de soportar las altas temperaturas de >90 C
necesarias para la separacin de las dos hebras de ADN de la doble
hlice tras cada ciclo de replicacin. Las ADN polimerasas que se
utilizaron originariamente para los experimentos in vitro previos a
la PCR no eran capaces de soportar estas altas temperaturas, por
lo que los primeros procedimientos para replicar el ADN eran muy

ineficientes, largos y requeran grandes cantidades de ADN


polimerasa.
El descubrimiento en 1968 de la polimerasa Taq, una polimerasa de
ADN extrada de la bacteria termfila Thermus aquaticus que
habita medios de muy alta temperatura (50-80 C), elimin los
grandes inconvenientes del mtodo de la PCR. Este ADN
polimerasa es estable a altas temperaturas, permaneciendo activa
hasta despus de la desnaturalizacin del ADN, eliminando la
necesidad de aadir a la reaccin nueva polimerasa tras cada ciclo.
Este descubrimiento permiti automatizar el proceso, antes tan
tedioso, acoplndolo al uso del termociclador.
Al mismo tiempo que desarrollaba la PCR en 1983, Mullis trabajaba
en Emeryville, California (EE UU), para una de las primeras
empresas biotecnolgicas,
Cetus
Corporation,
donde
era
responsable de sintetizar cadenas cortas de ADN. Mullis afirma que
concibi la idea para la PCR una noche mientras cruzaba la
Autopista de la Costa Pacfica (EE UU) en su coche.12 Estaba
imaginando una nueva forma de analizar mutaciones en el ADN
cuando se percat de que, en lugar de eso, haba inventado un
mtodo para amplificar regiones especficas de ADN mediante
ciclos de duplicacin repetidos usando ADN polimerasas. Mullis
atribuye la invencin de esta tcnica a los efectos de la droga
psicodlica y alucingena LSD.14
En la revista Scientific American, Mullis resumi el procedimiento:
"Comenzando con una nica molcula del material gentico ADN,
la PCR puede generar 100 billones de molculas iguales en una
tarde. La reaccin es fcil de hacer, no requiere ms que un tubo
de pruebas, unos pocos reactivos simples y una fuente de
calor."15 Fue premiado con el Premio Nobel de Qumica en 1993 por
su invencin, y siete aos despus, l y sus colegas del Cetus
llevaron a la prctica su propuesta. Sin embargo, han aparecido
controversias y diferentes versiones sobre las contribuciones
intelectuales y prcticas de otros cientficos al trabajo de Mullis, y
sobre si l fue el inventor nico del principio de la PCR.

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