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FACULDADE ASSIS GURGACZ

BRUNA BRASIL RODRIGUES FURTADO
JOSICLEIA GARBIN LOCATELLI
LUCIMARA BOLSONI BOEIRA
LUS FERNANDO NAVA FERRO
PATRCIA CRISTINA RAUBER
SHEILA DANUZA OENNING

RELATRIO DE FITOQUMICA: PESQUISA DE FLAVANIDES EM Malva

sylvestris

CASCAVEL
2008

BRUNA BRASIL RODRIGUES FURTADO

JOSICLEIA GARBIN LOCATELLI
LUCIMARA BOLSONI BOEIRA
LUS FERNANDO NAVA FERRO
PATRCIA CRISTINA RAUBER
SHEILA DANUZA OENNING

RELATRIO DE FITOQUMICA: PESQUISA DE FLAVANIDES EM Malva

sylvestris
Relatrio apresentado como requisito de
avaliao parcial da disciplina de Anlise
Instrumental e Orgnica do curso de Farmcia da
Faculdade Assis Gurgacz.
Professora Orientadora: Jane de Jesus da
Silveira Moreira

CASCAVEL
2008

1. INTRODUO

Como derivados das vias biossintticas do acetato e chiquimato, os flavanides

compreendem uma srie de compostos secundrios que ocorrem exclusivamente em
plantas superiores, sendo responsveis, na planta, pela colorao das flores.
O termo flavanide deriva do latim flavus, que significa amarelo, em virtude da
cor que conferem as flores. As antocianinas (uma das classes de compostos
flavanides), por exemplo, so correntes vegetais com ampla distribuio nas plantas.
Os flavonides concentram-se mais na parte area das plantas, ocorrendo em menor
proporo nas razes e nos rizomas. A grande vantagem dos flavanides ou
bioflavanides sua baixssima toxicidade. So essenciais para a completa absoro
de vitamina C, ocorrendo normalmente onde haja esta vitamina. Na figura 01 observase o esqueleto bsico dos flavanides:

Figura 01: Esqueleto bsico de compostos flavanides (Retirado de:

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-40422003000400014&lng=en&nrm=iso)

Nos ltimos anos, um grade interesse tem sido voltado para o papel das ERRO
(Espcies Radicalares Reativas de Oxignio) na etiologia de vrias doenas. As
propriedades antioxidantes que os flavanides tm, assim atrado a ateno para a

nutrio preventiva, pois eles protegem os constituintes alimentares contra o dano

oxidativo, podendo tambm contribuir para a preveno de importantes patologias,
como doenas cardiovasculares, envelhecimento, cnceres, e outras. Existem vrios
relatos de que os flavonides exibem uma grande variedade de efeitos biolgicos,
incluindo ao antibacteriana, antiviral, antiinflamatria, antialrgica e vasodilatadora.
Alem disto, eles inibem in vitro a peroxidao lipdica, a agregao plaquetria, a
permeabilidade e a fragilidade capilar, e a atividade de enzimas, como a ciclooxigenase e a lipoxigenase. Os flavonides exercem esses efeitos como antioxidantes
seqestradores de ERRO, quelantes de ctions divalentes, proteo ao DNA e tambm
como scavengers de peroxinitrilo (ONOO). Estudos clnicos

e epidemiolgicos tem

demonstrado uma significativa correlao inversa entre o consumo de flavanides e a

mortalidade por doenas cardiovasculares
Os flavanides, biossintetizados a partir da via dos fenilpropanides, constituem
uma importante classe de polifenis, presentes em relativa abundncia entre os
metablitos secundrios de vegetais e tambm mais conveniente empregar-se uma
definio que leva em conta tambm a origem biogentica. Os flavanides representam
um dos grupos fenlicos mais importantes e diversificados entre os produtos de origem
natural. Essa classe de compostos amplamente distribuda no reino vegetal. Quase
ausente em algas, alguns representantes foram identificados em brifitas, existindo
somente um relato de ocorrncia em fungos. Em pteridfitas tambm foram
encontrados, mas sua variabilidade estrutural pequena. Todavia, esto presentes em
abundncia nas angiospermas, apresentando nesse grupo enorme diversidade
estrutural.

Podem-se encontrar flavanides em diversas formas estruturais. Entretanto, a

maioria dos representantes dessa classe possui 15 tomos de carbono em seu ncleo
fundamental, constitudos de duas fenilas ligadas por uma cadeia de 03 tomos entre
elas. Nos compostos tricclicos, as unidades so chamadas ncleos A, B e C e os
tomos de carbono recebe a numerao com nmeros ordinrios para os ncleos A e C
e os mesmos nmeros seguidos de uma linha () para o ncleo B.
So conhecidos at o presente mais de 4.200 flavanides diferentes, sendo que
o nmero de novas estruturas identificadas praticamente dobrou nos ltimos 20 anos.
Levando-se em considerao sua distribuio nas angiospermas, o presente
trabalho destina-se a apresentar os resultados obtidos da pesquisa de flavanides na
planta herbcea da famlia das angiospermas conhecida popularmente como malva
(Malva sylvestris), da famlia das Malvaceaes, que possui ampla distribuio e
adaptao no globo terrestre. Os empregos teraputicos da malva, contudo, esto
relacionados a outras substncias de seu metabolismo, como as mucilagens (agentes
poliurnicos), que apresentam leve efeito laxativo e protetor de mucosas inflamadas.
Da seu to aclamado uso no tratamento de afeces bucais, como aftas, sob as mais
diversas preparaes. Contudo, desejou-se verificar realmente a presena de
compostos flavanides nesta planta atravs de metodologias de fitoqumica clssica
para a extrao, identificao e caracterizao da atividade biolgica (como
antioxidante) desses compostos retirados de Malva sylvestris (figura 02).

Figura 02: Espcie vegetal de Malva sylvestris (Retirado de:

http://www.marysplantfarm.com/_photos/perennials/malva%20sylvestris%20zebrinus.jpg).

2. METODOLOGIA

Para a extrao de flavanides a partir de Malva sylvestris foi realizada infuso a

frio (macerao) durante 07 dias com soluo hidroalcolica na proporo de 80% de
etanol para 20% de gua.
Para identificar a presena de flavanides foi realizada a reao de Shinoda que
consiste na reao entre a amostra na qual se pesquisa, 50 mg de limalha de magnsio
e 0,5 mL de HCl fumegante, obtendo assim uma reao exotrmica.
Para a determinao da atividade antioxidante de extrato de Malva sylvestris foi
realizado mtodo espectrofotomtrico com o radical livre DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil).

3. PROCEDIMENTO

Inicialmente adquiriram-se folhas secas de Malva sylvestris em loja especializada

em produtos naturais do comrcio local do municpio de Cascavel (PR). Estas folhas j
estavam previamente secas e limpas para o consumo, devidamente embaladas.
Levou-se o pacote de folhas de Malva sylvestris para o laboratrio de Qumica da
Faculdade Assis Gurgacz, realizando o procedimento necessrio para a obteno de
flavanides que, iniciou-se com a moagem total da droga vegetal seca em liquidificador
at obter-se 30 gramas da mesma. Em seguida, transferiram-se essas 30 gramas de
droga vegetal moda para um balo de fundo chato de 500 mL, previamente aferido
(peso do balo vazio: 295,28 gramas) e, pesado novamente aps a adio da planta
moda (peso do balo com a planta: 327,25 gramas). Feita a adio da planta ao balo,
preparou-se 400 mL de soluo extratora para a realizao da infuso a frio
(macerao) da planta. Essa soluo extratora foi feita com 80% de etanol (equivalente
a 320 mL) e 20% de H2O (80 mL); a composio extratora feita com dois solventes
com grande polaridade em funo de que flavanides so compostos fenlicos de alta
polaridade.
Aps a preparao da soluo extratora, transferiu-se a mesma para o balo que
continha planta moda e envolveu-se esse balo em papel alumnio, para proteger o
contedo do mesmo da luz durante 07 dias, que foi o tempo necessrio para a
realizao da infuso a frio. Entretanto, aps 30 minutos de macerao, retirou-se 02
mL do extrato para realizar identificao prvia de flavanides, guardando novamente
sob proteo da luz o balo com a planta em infuso a frio. A identificao de
flavanides consistiu em diluir esses 02 mL de extrato com 04 mL de gua e, a partir

dessa soluo diluda, foi retirado 0,5 mL e colocado em tubo de ensaio, adicionando
em seguida 0,5 mg de magnsio (Mg) em raspas a esse tubo e aps, adicionou-se a
esse tubo 0,5 mL de HCl fumegante gota a gota pela parede do tubo, observando a
variao de cor. Notou-se uma suave mudana da colorao da soluo para um tom
rose bem suave, indicando presena de flavanides.
Aps 07 dias de infuso, realizou-se a filtrao gravimtrica do extrato. Desse
filtrado, seria necessrio retirar 04 mL para serem colocados em tubo de centrfuga,
contudo, como esse extrato estava bastante concentrado de clorofila retirou-se apenas
01 mL e diluiu-se em 09 mL de gua destilada, para que dessa soluo diluda, fosse
retirado 04 mL para da realizar a centrifugao durante 20 minutos. Do sobrenadante
da soluo centrifugada, retirou-se 0,5 mL para proceder novamente a identificao de
flavonides, conforme descrito no pargrafo anterior. A cor observada foi semelhante ao
teste feito anteriormente, ou seja, houve uma mudana para uma cor rose suave bem
clara, sendo positiva para a presena de flavanides.
Com o restante do sobrenadante da frao centrifugada fez-se cromatografia de
camada delgada (CCD) com 03 mL de fase mvel contendo as seguintes fraes: 15%
de hexano (0,45 mL), 25% de metanol (0,75 mL), 30% de acetato de etila e 30% de
clorofrmio (0,9 mL). Obteve-se a placa representada na figura 01:

Figura 01: Placa de CCD com o extrato bruto (sem adio de solventes orgnicos) diludo centrifugado

Como se pode observar na figura 01, a fase mvel utilizada no foi adequada
para a separao de possveis flavanides presentes no extrato bruto (sem adio de
outros solventes aps a filtrao gravimtrica) diludo centrifugado, pois os solventes
utilizados possuam um carter bastante apolar e o extrato permaneceu no ponto onde
foi aplicado, no havendo, portanto, corrida de quaisquer compostos polares presentes.
Com o restante do filtrado do infuso de 07 dias, transferiu-se para um balo de
fundo redondo que foi em seguida levado a rota-evaporador at total evaporao do
solvente. O resduo que ficou no balo foi diludo com 100 mL de gua destilada. Dessa
soluo aquosa foram retirados 30 mL e extraiu-se 03 vezes com os seguintes
solventes: ter etlico, acetato de etila e hexano, usando sempre de 10 a 15 ml de
solvente por vez. Essa extrao foi realizada da seguinte forma:

10

Transferiram-se para um funil de separao os 30 mL da soluo aquosa

e adicionou-se 10 mL de ter etlico e agitou-se suavemente o funil at a
retirada total dos gases formado; essa primeira fase orgnica foi
descartada, porque o ter etlico ficou com uma colorao verde bastante
acentuada (excesso de clorofila), o que no seria necessrio para a
extrao de flavanides. Em seguida fez-se a extrao com ter etlico por
mais 03 vezes, novamente com 10 mL de solvente, sempre se agitando
suavemente at a retirada dos gases formados. A fase aquosa de cada
uma das trs extraes no foi descartada como costumeiramente, mas
guardada para a extrao com acetato de etila. A fase orgnica com ter
etlico foi guardada em um bquer devidamente identificado e guardada
com a proteo de uma folha de papel alumnio;

Com a fase aquosa que restante da extrao com ter etlico, se fez 03
extraes com acetato de etila, sempre no volume de 10 mL por extrao,
agitando-se suavemente at a retirada total dos gases formados. A fase
orgnica dessa extrao foi guardada em bquer devidamente identificado
e com folha de papel alumnio e a fase aquosa foi guardada para a
prxima extrao.

Com a fase aquosa da extrao com acetato de etila, procedeu-se a

extrao com hexano durante 03 vezes, sempre com 10 mL de solvente,
agitando suavemente. A fase orgnica foi guardada em bquer
identificado e com papel alumnio para minimizar a evaporao do
solvente e a fase aquosa foi descartada.

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Com esses trs extratos prontos (cada um com aproximadamente 30 mL de

volume total), retirou-se de cada um deles 0,5 mL e transferiu para tubos de ensaios
individuais para cada extrato e os mesmos foram levados a banho-maria at completa
evaporao do solvente. Paralelamente, a secagem dos solventes realizou-se a CCD
dos trs extratos, com a mesma fase mvel utilizada para a realizao da CCD do
extrato bruto.
Aps a evaporao total do solvente, reconstituiu-se o resduo do tubo com 0,5
mL de gua e procedeu-se com o teste para a deteco de flavanides. O teste
apresentou resultado positivo somente para a soluo reconstituda do extrato de
acetato de etila. A CCD apresentou um resultado, no mnimo curioso, levando-se em
considerao o resultado do teste qualitativo para flavanides, como pode ser
visualizado na figura 02.

Figura 02: Placas de CCD da esquerda para a direita, extratos de: ter, acetato de etila e hexano.

12

O extrato etreo apresentou quatro manchas distintas com boa resoluo,

enquanto que o extrato acetilado apresentou duas manchas bem suaves (uma quase
imperceptvel na fotografia) e o extrato de hexano tambm apresentou uma mancha
bem marcante. Provavelmente a frao etrea conseguiu isolar outros compostos
polares que no fossem flavanides, explicando o porqu da apresentao das 04
manchas. Fez se o fator de resoluo de cada uma das manchas:
ter

Acetato de etila

Hexano

Rf1- 0,98

Rf1-0,96

Rf1-0,71

Rf2-0,85

Rf2-0,84

Rf3-0,80
Rf4-0,75

Com o extrato que apresentou resultado positivo para o teste qualitativo (extrato
de acetato de etila), retirou-se 01 mL e fez-se a secagem total do solvente,
reconstituindo-se aps isso, com 04 mL de gua. Com essa soluo fez-se a leitura
espectrofotomtrica de 200 nm at 400 nm. Obtiveram-se as absorbncias descritas No
grfico 01.

Grfico 01: Curva de calibrao do extrato de Malva sylvestris com acetato de etila

13

Atravs da observao do grfico pode presumir-se que h uma quantidade e

variedade de flavanides muito grande no extrato de Malva sylvestris com acetato de
etila, em diversos comprimentos de onda ().
Feito a curva de calibrao do extrato de malva com acetato de etila, era
necessrio avaliar a atividade antioxidante do mesmo. Para tanto se utilizou o reativo
de DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazil), que uma espcie radical livre que deve ser
reduzida (atravs da doao de um hidrognio) pela substncia antioxidante, ou seja, a
espcie flavanide da Malva sylvestris (BONANI, et al 2006). Inicialmente fez-se a
curva de calibrao de solues de DPPH sob o comprimento de onda () de 515 nm,

ABS

como mostra o grfico 02.

1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
15

20
25
30
35
CONCENTRAO (mg/mL)

Grfico 02: Curva de calibrao com solues de DPPH a 515 nm.

Em seguida, preparou-se 02 mL de extrato nas concentraes de 250 g/mL,

150 g/mL e 25 g/mL para a realizao da determinao da atividade antioxidante do
extrato de malva nessas concentraes.
Para tanto, inicialmente pesou-se um tubo de ensaio vazio (23,1843 g) e
colocou-se o extrato de malva com acetato de etila dentro desse tubo e levou-se a

14

banho-maria at completa evaporao do solvente, para posterior re-diluio. Quando

houve a evaporao e secagem total do tubo, pesou-se o mesmo para verificar a
quantidade de resduo presente. O peso do tubo com resduo foi de 23, 2007 g;
subtraindo-se o peso do tubo vazio (23,1843 g), obteve-se de resduo 0,01640 g de
resduo, ou 16,4 mg. Ressuspendeu-se esse resduo com 05 mL de metanol. A partir
dessa soluo, calculou-se a quantidade necessria da mesma para a preparao de
soluo de 02 mL contendo 250 g/mL de extrato a partir do seguinte clculo
(lembrando que cada 01 mg equivale a 1000 g, e 16,4 mg de resduo equivale a
portanto 16.400 g):

M1V1 = M2V2
16.4000.V1 = 250.2
V1 = 0,030 mL

Completou-se o volume com 1,97 mL de gua destilada e assim obteve-se 02 mL

de soluo contendo o extrato obtido na concentrao de 250 g/mL.
A partir dessa soluo, foi realizado o primeiro teste de avaliao da atividade
antioxidante de flavanides presentes na malva. Para tanto, montou-se um dois tubos,
cada um contendo 0,3 mL dessa soluo, porm, um deles foi completado com 2,7 mL
de metanol (tubo branco dessa soluo) e o outro tubo foi completado com 2,7 mL de
soluo de DPPH a 40 g/mL, que uma substncia radical livre e conforme seu perfil
de absorbncia espectrofotomtrico decrescesse, indicaria a complexao dessa
substncia com substncias antioxidantes (flavanides) presentes no extrato. Aps a
adio de DPPH ao tubo contou-se 1 minuto e fez se a leitura no espectrofotmetro UV-

15

VIS em 515 nm, tanto do branco quanto da amostra. O contedo desses dois
preparados no foi descartado, sendo observada a absorbncia novamente dos
mesmos aps 10, 20, 30 e 60 minutos. Os resultados obtidos podem ser observados no
grfico 03, sendo que a absorbncia do branco est em rosa e a absorbncia da
soluo com DPPH est em amarelo.

Grfico 03: Perfil espectrofotomtrico de absoro da soluo de Malva sylvestris 250 g/mL, em 515 nm.

Pode se observar que no houve uma variao significativa entre as trs leituras
intermedirias, mas houve uma reduo final de 0,917 de absorbncia inicial (1 minuto)
at 0,845 de absorbncia final (60 minutos).
Com esse resultado fez se o mesmo procedimento para a concentrao de 150
g/mL, ou seja, fez se um clculo para obter o valor de extrato ressuspendido a ser
utilizado na preparao dessa soluo e tambm fez se um tubo branco e um tubo com
DPPH, utilizando 0,3 da soluo feita com mais 2,7 mL de metanol para o tubo branco
e, 0,3 da soluo com 150 g/mL mais 2,7 mL de DPPH para avaliar a atividade
antioxidante. Obteve-se o grfico a seguir (srie rosa indica absorbncia do tubo branco
e srie amarela indica absorbncia da amostra):

16

Grfico 03: Perfil espectrofotomtrico de absoro da soluo de Malva sylvestris 150 g/mL, em 515 nm.

Observa-se que a variao foi nfima, ou seja, no houve atividade antioxidante

significativa nessa concentrao. Com isso no se fez a soluo de Malva sylvestris na
concentrao de 25 g/mL.

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4. CONCLUSO

Ao finalizar o presente trabalho pode-se afirmar que a malva possui flavanides,

porm, com baixa atividade biolgica antioxidante (conforme verificado pela reao com
DPPH) e com pouca concentrao (observado pela intensidade da reao de Shinoda).
No entanto, apresenta uma variedade de compostos polares como pde ser visualizado
nas placas de cromatografia de camada delgada com ter, acetato de etila e hexano.
Quanto realizao da atividade, a mesma foi muito exaustiva e minuciosa,
exigindo muito tempo e vidrarias. Isso sem dvida alguma acaba refletindo na pesquisa
cientfica do pas, pois os pesquisadores muitas vezes no possuem recursos
financeiros para estudos de bioprospeco e muitas vezes, nem disponibilidade grande
para tal atividade possuem, devido a demais atividades que devem realizar em funo
de seu prprio sustento. H, portanto, uma necessidade na modernizao das tcnicas
de fitoqumica, ao mesmo tempo em que deve se buscar desenvolver mtodos
alternativos econmicos para instituies de fomento e pesquisadores da mesma forma
em que esses mtodos devem minimizar resduos de grande impacto ambiental.

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5. BIBLIOGRAFIA

1. BONANI, V. F. L.; HESS, S. C.; PERES, M. T. L. P.; FARIAS, C. C.; FEDL, L. E.

S.; PERUZZO, G. M. PROSPECO DE AGENTES ANTIOXIDANTES DE
VEGETAIS DE MATO GROSSO DO SUL. In: Anais da 58 Reunio Anual da
SBPC

Florianpolis,

SC

Julho/2006.

Retirado

de

http://www.sbpcnet.org.br/livro/58ra/SENIOR/RESUMOS/resumo_3291.html.

2. SILVA, Tania Maria Sarmento da et al . Ocorrncia de flavonas, flavonis e

seus glicosdeos em espcies do gnero Solanum (Solanaceae). Qumica
Nova

So

Paulo,

v.

26,

n.

4, 2003

Disponvel

em:

<http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S010040422003000400014&lng=en&nrm=iso>.

3. SIMES, CLUDIA MARIA OLIVEIRA et al. Farmacognosia: da planta ao

medicamento. 5 Ed. Editora UFSC/UFRGS, Porto Alegre/Florianpolis, 2003.