ANTIOXIDANTES.

Los sistemas antioxidantes se pueden medir de diferentes formas especficas y el

sistema amortiguador antioxidante global se puede evaluar con las pruebas de
capacidad antioxidante total. Dentro de las pruebas para evaluar o determinar la
capacidad antioxidante podemos encontrar:
ENSAYOS BASADOS EN LA TRANSFERENCIA DE TOMOS DE HIDRGENO
(HAT).
Monitorean una reaccin cintica competitiva, generalmente estn compuestos de
un generador de radical libre sinttico, una prueba molecular oxidable y un
antioxidante. Podemos encontrar en estos ensayos los siguientes mtodos:

Capacidad de absorcin del radical oxgeno (ORAC)

Parmetro antioxidante de captura de radicales (TRAP)
Inhibicin de la oxidacin del cido linoleico
Inhibicin de la oxidacin de los lpidos de baja densidad (LDL)
Capacidad de absorcin de radicales de oxgeno (ORAC).
El mtodo ORAC consiste en medir la disminucin en la fluorescencia de una
protena como resultado de la prdida de su conformacin cuando sufre dao
oxidativo causado por una fuente de radicales perxido (ROO). El mtodo mide la
capacidad de los antioxidantes en la muestra para proteger la protena del dao
oxidativo. La protena usada es la fluorescena.
El mecanismo de la reaccin se basa en la transferencia de un tomo de
hidrogeno del antioxidante al radical libre. Por esto, se utiliza el radical iniciador, el
AAPH, para generar el radical peroxil ROO. Un mol de AAPH, pierde un mol de
nitrgeno, para generar dos moles de radical AAPH a una rata constante. En una
solucin saturada de aire, el radical AAPH reacciona rpidamente con el oxgeno
para dar un radical peroxil ms estable, ROO. La prdida de fluorescencia de la
FL es el indicador de la extensin de la oxidacin con el radical peroxil. En
presencia de un antioxidante, RRO capta, preferiblemente, un tomo de

hidrgeno del antioxidante estable. Como consecuencia, la disminucin de la

fluorescencia de la FL por accin del radical peroxil es disminuida o inhibida.
El mtodo permite determinar los moles equivalentes de Trolox en un rango de 5 a
200 ug/ml, en donde el analito utilizado como referencia tiene un comportamiento
lineal. Si las muestras lo requieren debern ser diluidas para alcanzar una
concentracin que se encuentre en el rango establecido.
Parmetro antioxidante de captura de radicales (TRAP).
Este

ensayo

emplea

radicales

peroxilo

que

se

generan

mediante

descomposicin trmica de un compuesto hidrosoluble: ABAP

la

Una vez

adicionado a la muestra a estudio (plasma originariamente), la oxidacin de las

molculas es monitorizada, mediante la determinacin de oxgeno consumido.
El periodo de induccin, en el que la oxidacin se inhibe mediante la accin de los
compuestos antioxidantes en la muestra, se compara con el generado por el
Trolox en iguales condiciones.
ENSAYOS BASADOS EN LA TRANSFERENCIA DE ELECTRONES (ET)
Involucran una reaccin redox con el oxidante como un indicador del punto final de
reaccin. Dentro de estos ensayos podemos encontrar:

Acido 2,2-azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico (ABTS ++)

1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH+)
Poder de reduccin antioxidante del hierro (FRAP)
N,N- dimetil-p-fenilendiamina (DMPD)
Capacidad de reduccin antioxidante del cobre (CUPRAC)

Voltametra Cclica Kohen

Este ensayo evala el poder reductor total de molculas de bajo peso molecular.
Una vez procesada la muestra se introduce en una celda donde se sitan 3
electrodos: electrodo de trabajo, electrodo de referencia, y un electrodo auxiliar.
Se aplica un potencial constante (100 mV/seg) al electrodo de trabajo, bien hacia
el potencial positivo (con lo que evaluaremos agentes reductores) o hacia el

potencial negativo (con lo que evaluaremos agentes oxidantes). Durante este

proceso se monitoriza una curva de corriente (voltamograma cclico).
Desventaja: no todos los antioxidantes donan sus electrones a cualquier electrodo
de trabajo seleccionado. Se necesitan varios electrodos para determinar
antioxidantes concretos: glutatin no se detectara con este electrodo Au/Hg.
El compuesto de referencia empleado suele ser el cido ascrbico.

Ensayo del DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazilo)

Este mtodo fue propuesto por Blois (1958) en el cual se demostr por primera
vez la capacidad del radical libre DPPH + para aceptar un tomo de hidrgeno (H +)
proveniente de una molcula de cistena.
El procedimiento consiste en emplear un tiempo de reaccin de 20-30 min en vez
de un tiempo de reaccin total de 120 minutos requerido para alcanzar el estado
estacionario y completar la reaccin redox (Ojha et al., 2012).
La mayora de los estudios expresan los resultados como el valor de la
concentracin mxima de la media inhibitoria (IC50), definido como la cantidad de
antioxidante necesario para disminuir la concentracin inicial de DPPH al 50%.

Ensayo ABTS++ (Acido 2,2-azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6- sulfonico)

El ensayo original de ABTS++ estaba basado en la activacin de la metilmioglobina

con perxido de hidrgeno en presencia de ABTS para producir un radical catin,
en presencia o ausencia de antioxidantes.
Un formato ms apropiado para el ensayo consiste en la tcnica de decoloracin,
en la cual el radical es generado directamente en una forma estable antes de la
reaccin con los antioxidantes (Re et al., 1999).
La tcnica mejorada para la generacin del radical catin ABTS ++, implica la
produccin directa del cromforo ABTS ++ verde-azul a travs de la reaccin entre
ABTS y el persulfato de potasio (K 2S2O8). Este presenta tres mximos de
absorcin a las longitudes de onda de 645 nm, 734 nm y 815 nm. La adicin de los
antioxidantes al radical pre-formado lo reduce a ABTS. De esta manera el grado
de decoloracin como porcentaje de inhibicin del radical catin ABTS ++ est
determinado en funcin de la concentracin y el tiempo; as como del valor
correspondiente usando el Trolox como estndar, bajo las mismas condiciones.
Mtodo teac (trolox equivalent antioxidant capacity)
El mtodo TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity), es un mtodo que sirve
para cuantificar la capacidad antirradicalaria de los compuestos antioxidantes, es
decir, sirve para cuantificar la captura de los radicales libres.
El mtodo TEAC, se genera un radical libre positivo, estable, llamado ABTS (Acido
2,2 -azinobis-(3-etilbenzotioazoln-6- sulfnico) mediante una reaccin entre ste y
el persulfato de potasio.
A ste, se le aade el antioxidante que queremos estudiar, y comprobamos la
disminucin de la absorvencia de la muestra, ya que el ABTS posee un grupo
cromforo que observa la luz a 734 nm.
Poder de reduccin antioxidante del hierro (FRAP)
Determina la capacidad de la muestra para reducir un complejo de frrico con la
molcula tripiridil s-triazina (TPTZ) a su forma ferrosa (pH bajo). De este modo se
genera una coloracin azul, de intensa proporcionalidad a la capacidad reductora

de la muestra (se genera un complejo ferroso-TPTZ) que puede cuantificarse por

colorimetra (593nm) en base a un patrn de sulfato ferroso.
El ensayo FRAP es sencillo y fcilmente automatizable. Es rpido, generalmente
la reaccin se completa entre 4 y 8 minutos. Sin embargo, en el caso de algunos
polifenoles se han descrito reacciones ms lentas, llegando incluso a requerir 30
minutos hasta completar la reduccin del complejo. La reaccin no es especfica, y
por tanto, cualquier reaccin con un potencial redox menos positivo originar la
reduccin del complejo Fe 3+-TPTZ.
N,N- dimetil-p-fenilendiamina (DMPD)
Este mtodo se basa en la reduccin del radical catin DMPD por los
antioxidantes de la muestra. La generacin de este radical requiere un pH
adecuado (5.25) y la adicin de una solucin de cloruro frrico. La absorbancia
del radical se determina a 505 nm y los compuestos antioxidantes, una vez
adicionados, son capaces de transferir un tomo de H+, provocando su
decoloracin (proporcional a su concentracin). Slo puede disolverse en medio
acuoso.

Bibliografa.