Instituto Politcnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas

Departamento de Bioqumica
Curso prctico de Mtodos de anlisis
Separacin e identificacin de aminocidos de jugos de frutos por
cromatografa bidimensional en capa fina
Simn Martnez Luis ngel
Gpo: 5QV1 Secc: 2
Introduccin
La cromatografa de capa fina es una de las tcnicas aplicadas en la separacin
e identificacin de aminocidos libres en frutos. Ventajas: procedimiento
sencillo, rpido, econmico, buena resolucin, las reacciones colorimtricas
reveladas son compactas y se pueden separar con facilidad de la cromatoplaca
para recuperar el analito en cantidades inferiores a los g; puede ser empleada
en laboratorios de baja complejidad como ensayo orientador, y la resolucin
puede aumentarse empleando tcnicas bidireccionales.
La capa fina es recomendada como procedimiento previo a las separaciones
por cromatografa lquida en columna, porque proporciona una idea rpida de
los aminocidos predominantes en la muestra, lo que permite estimar su
concentracin favoreciendo la instauracin de las condiciones ptimas para las
separaciones por columna. Los resultados obtenidos con la cromatografa de
capa fina aportan informacin al conjunto de caractersticas de jugos,
concentrados de naranjas, informacin que se puede evaluar con el objeto de
tipificar el carcter genuino de los productos y se puede usar como paso previo
a la cuantificacin por intercambio inico o por cromatografa lquida de alta
resolucin. Los autores recomiendan la tcnica unidireccional, ya que si la
resolucin es buena, adems del ahorro de tiempo y de solventes, se pueden
minimizar los efectos ambientales sobre el ensayo al correr simultneamente
sobre una placa la muestra y los patrones.
Objetivos
Conocer la tcnica de cromatografa bidireccional y sus ventajas
Separar e identificar los aminocidos presentes en muestras de frutas
utilizando cromatografa bidireccional, teniendo como base los Rf de
aminocidos tipo.
Comparar las ventajas y utilidad de la cromatografa bidireccional, con la
unidimensional
Resultados
Tabla 1.- Cromatogramas unidimensionales tipo desarrollados en las 2 fases
mviles.
Aminocid
1ra fase mvil
2da fase mvil
Frente
Frente
Rf
Frente
Frente del
Rf
o

del
soluto
Lys
Arg
His
Pro
Gly
Thr
Glu
Met
Tyr
Phe

1
1.2
0.7
2.3
2.1
2.8
2.8
4.4
4.7
4.9

del
disolvent
e
8.2
8.2
8.2
8.2
8.2
8.2
8.2
8.2
8.2
8.2

(orden
crecient
e)
0.12
0.14
0.08
0.28
0.25
0.54
0.34
0.53
0.57
0.59

del
soluto

disolvente

1.5
1.3
4.7
3.5
4
5
4.4
5.2
5.4
5.9

7.5
7.3
7.6
7.5
7.6
7.4
7.4
7.3
7.3
7.3

0.2
0.17
0.61
0.46
0.52
0.67
0.59
0.71
0.73
0.78

Tabla 2.- Cromatografa bidireccional tipo desarrollado en las dos fases mviles
Aminocido
ra
da
1 fase mvil
2 fase mvil
correspondie
No.
nte
Frente
Rf
Frente
manch
Frente
Frente
del
(orden
del
a
del
del
Rf
disolven crecient
disolven
soluto
soluto
te
e)
te
1
1.3
7.8
0.166
4.5
8.3
0.54
Lys
2
1.3
7.7
0.168
1.2
8.3
0.14
Arg
3
1.7
7.7
0.22
1
8.2
0.12
His
4
2.5
7.7
0.32
3.4
8.2
0.41
Pro
5
2.6
7.8
0.33
3.6
8.1
0.44
Ala
6
2.9
7.8
0.371
4.7
8.1
0.58
Glu
7
3
7.9
0.379
3.9
8.1
0.48
Thr
8
4.5
7.7
0.58
5.2
7.7
0.67
Tyr
9
4.8
7.8
0.61
4.6
7.7
0.59
Met
10
4.9
7.7
0.63
5.1
7.7
0.66
Phe
Tabla 3.- Cromatograma bidimensional problema (IV) desarrollado en las dos
fases mviles.
Rf creciente en la
Rf creciente en la
Aminocido
No de Mancha
1 fase mvil
2fase mvil
correspondiente
1
0.16
0.14
Lys
2
0.16
0.51
Thr
3
0.33
0.44
Pro
4
0.37
0.58
Glu
5
0.58
0.67
Phe
6
0.61
0.59
Tyr

III

II

IV

Figuras.- Cromatogramas unidireccionales (I, II) y cromatogramas

bidireccionales (III, IV)
Preguntas extras
1.- Aminocidos que contiene el jugo de naranja
cido aspartico
Fenilalanina
Lisina
cido glutamico
Glicina
Metionina
Alanina
Histidina
Prolina
Arginina
Isoleucina
Serina
Cisteina
Leusina
Tirosina

Treonina
Triptofano
Valina

2.- Reaccin de la ninhidrina con aminocidos

3.- Es posible cambiar el orden de las fases mviles?
S, no se afecta la composicin de las fases mviles y la distancia recorrida por
el aminocido depende del grupo R, la adsorcin, su solubilidad y afinidad por
las fases por lo que el orden de los eluyentes no afecta en el desarrollo del
cromatograma.
4.Indique
las
posibles
fuentes
de
error
de
esta
tcnica.
* Tocar directamente con las manos el cromatograma debido a que la piel
contiene grasas y aminocidos que se quedan en la fase estacionaria y corren
como
parte
del
problema.
* Marcar la lnea de aplicacin con pluma ya que los componentes de la tinta
pueden
correr
en
el
cromatograma.
* Aplicar demasiada muestra ya que la mancha se hace muy grande no
dejando que se eluya correctamente por el tamao adems no permite una
lectura
correcta.
*Que al realizar la cromatografa esta suba por capilaridad corriendo disparejo,
o poniendo de lado la placa.
Discusin
Con los datos de la tabla 1 se observan las caractersticas de cada uno de los
aminocidos a los diferentes eluyentes utilizados con respecto a las dos fases
utilizadas. Se realizo el llenado con los cromatogramas unidireccionales, puesto
que se observa mejor el comportamiento con las diferentes fases puesto que
comienzan separados y as las interacciones que tienen con los eluyentes se
aprecia mejor. La fase uno se realizo con butanol-cido actico- agua (3:1:1)
con esta fase los aminocidos que ms corrieron fueron Met, Tyr y Phe, estos
aminocidos son hidrofbicos por lo tanto son ms afines a la fase mvil por las
interacciones tipo Van Der Waals. Los siguientes que tienen afinidad con la fase
mvil y la estacionaria fueron los aminocidos Glu, Thr, Pro, que son
aminocidos intermedios (ni hidroflicos, ni hidrofbicos) Glu (es un aminocido
hidroflico). Por ltimo quienes tuvieron mayor afinidad por la fase estacionaria
fueron Lys, Arg e His estos ltimos aminocidos son hidroflicos y sus
interacciones son mayormente con el agua y sus interacciones son de tipo
puentes de hidrogeno.

Los Rf obtenidos en la cromatoplaca bidireccional no mostraron los resultados

claros y esperados, esto se pudo haber dado por diversos factores
(mencionados en la pregunta 4). Aun as se logro identificar a todos los
aminocidos probados y estudiados, para poder lograrlo primero se usaron los
Rf de referencia de los cromatogramas unidireccionales, cada uno segn las
caractersticas obtenidas en este, posteriormente se uso de referencia el
Cromatograma unidireccional II (con la segunda fase) se tomaron nuevamente
como referencia estos datos para lograr identificar los 10 aminocidos
probados, tal y como se muestra en la figura de la cromatoplaca III.
Para el problema se realizo el mismo procedimiento pero para identificar sus
aminocidos se usaron nuevamente como referencia los unidimensionales
puesto que tena muchos aminocidos en un solo punto y tena los pigmentos
propios que presenta la fruta.
Se identificaron los aminocidos Lys, Pro, Glu, Tyr, Thr y Phe. Esto indica que la
fruta presenta los diferentes tipos de aminocidos hidroflicos, hidrofbicos y
neutros. De estos aminocidos los esenciales son Fenilalanina, triptfano y
lisina, es una fruta que tiene tres de los 10 aminocidos esenciales, aunque no
se tena o ms bien no se realizo el reconocimiento de los 20 aminocidos para
poder confirmar el contenido de los aminocidos que debe tener como lo
muestra la referencia de la pregunta 1, adems de que esto tambin depende
de donde se siembra, el clima, la temperatura, los qumicos agrnomos que se
utilizan son diferentes en cada estado y lugar de cosecha.
Conclusin
Los aminocidos identificados en la naranja fueron Lisina, Treonina, Prolina, c.
Glutamico, Fenilalanina y Tirosina
Bibliografa
Jos Mara Teijn. Fundamentos de bioqumica estructural 2da edicin.
Editorial Tbar S.L. Espaa. 2006 pg. 67-68
Alicia Lamarque. Fundamentos teorico-practicos de qumica organica
Editorial brujas. Argentina 2008. pg 57-61