Qu tipo de HPLC es el que debo utilizar?

De acuerdo al tipo de objetivo cromatogrfico, existen diferentes escalas de

equipos de HPLC, cuyo funcionamiento es igual, pero ofrecen resultados
diferentes segn la cantidad de analito que se desee procesar.

Escala analtica, que define la informacin del compuesto (identificacin y

concentracin)

Escala semi preparativa, brinda informacin del compuesto y permite

purificar pequeas cantidades (inferior a 0.5g).

Escala preparativa, brinda informacin del compuesto y permite purificar

cantidades mayores (superior a 0.5g).

Escala de proceso (industrial), maneja cantidades de manufactura

(produccin), de gramos hasta kilogramos de analito separado.

Para trabajar a estos niveles es necesario modificar algunas caractersticas

del equipo de HPLC, entre ellas los volmenes de solvente utilizado y tipo de
material de empaque (selectividad del sistema). Pero, para soportar las
cantidades especficas de cada mtodo, es necesario tener una columna
apta para cada escala, por lo cual se debe modificar el tipo de volumen de
la columna (que implicacambiar de columna, ver tabla 1).

Para esto existen diferentes tipos de columnas, de diferentes dimetros,

largos, materiales de empaque y tipo de material de construccin; capaces
de resistir altas presiones y ser totalmente inerte a reaccionar con los
componentes de la muestra. Entre estos se encuentran: los construidos en
plstico, en vidrio o en acero inoxidable.

Tabla 1. Escala cromatogrfica vs dimetro de columna y tamao de

partcula.
Dimetro de la columna
Escala

Analtica
Semipreparativa
Preparativa
Proceso

1 8 mm

10 - 40
mm

50 100
mm

Tamao de
partcula
> 100 mm

(micrones)
1.7 10

5 - 15
X

15 100
X

100 +

A partir de esto se desprenden varias definiciones acerca de la capacidad

del equipo para separar los componentes de la muestra, a esto se le llama
Resolucin y la conforman dos habilidades: La separacin mecnica
(Eficiencia) y la separacin qumica (Selectividad).

La Eficiencia del equipo depende principalmente de las caractersticas de la

columna (dimetro, longitud y tamao de partcula del material de
empaque). Pero, la modificacin de las caractersticas de la columna
repercuten sobre el tiempo de corrida, la cantidad de solvente implicado y la
presin necesaria para realizar el muestreo.

Por ejemplo: Una columna el doble de larga puede mejorar la separacin de

dos picos, pero duplicara el tiempo de corrida y la presin necesaria para
hacer fluir el solvente, tambin al doble.

Si por el contrario, se utiliza la misma columna inicial pero rellena con un

tamao de partcula dos (2) veces menor, es posible obtener picos en mejor
resolucin con el mismo tiempo de retencin pero con un aumento en la
presin hasta veinticinco (25) veces mayor.

Por otro lado, mejorar la Selectividad es el mtodo ms efectivo para lograr

una mejor separacin sin tener que modificar la columna o sus

caractersticas. Esto se realiza mediante una correcta seleccin del solvente

(puro o mezcla), con su respectivo gradiente; de modo que la interaccin de
la muestra, con la fase estacionaria y la fase mvil, sea selectiva para cada
tipo de componentes, logrando la separacin de la muestra.