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THESE DE DOCTORAT
Prsente par :
ABDELLAH ZINEDINE
Spcialit: Biologie
Option : Microbiologie
Prsident
Examinateur
Rapporteur
Rapporteur
DEDICACES
A MES PARENTS
A MA FEMME
REMERCIEMENTS
RESUME
Dans ce travail nous avons tudi la contamination des aliments commercialiss
au Maroc par les mycotoxines. Pour cela, un total de 60 chantillons de crales, 55
chantillons d'pices, 24 chantillons de fruits secs et 25 chantillons d'olives noires
ont t prlevs dans diffrents points de vente des villes de Rabat et Sal. La
dtermination des mycotoxines a t faite par HPLC. Les rsultats ont montr que
respectivement 40%, 40% et 55% des chantillons analyss de mas, de bl et dorge
sont contamins par lochratoxine A (OTA). Les chantillons de mas ont t analyss
pour la co-occurrence naturelle des toxines de Fusarium. Les pourcentages de
contamination des chantillons de mas par la fumonisine B1 (FB1) et la zaralnone
(ZEN) sont respectivement de lordre de 50 et 15 %. Les rsultats obtenus ont montr
que les taux de certaines mycotoxines notamment l'OTA et la FB1 ont dpass les
limites maximales fixes par la rglementation europenne. Dans les pices, les
rsultats ont montr que les taux des aflatoxines totales dans le piment et le gingembre
varient respectivement de 1,30 9,68 g/kg et de 0,03 9,10 g/kg. Dans les fruits
secs et les olives noires, l'analyse a montr que 66,6 % et 36% sont respectivement
contamins par l'OTA. Dans le but de rechercher de nouvelles souches capables de
rduire ou dgrader les mycotoxines, quatre ferments panaires traditionnels collects
de diffrentes rgions du Maroc ont t essays pour rduire les aflatoxines. Les
Rsultats ont montr une rduction de 92% pour l'AFG1 et 79,16 % pour l'AFB1 par
le ferment L1. La capacit des bactries lactiques rduire l'AFB1 in vitro a t
galement tudie. Les souches tester ont t cultives en prsence de lAFB1. Les
Rsultats ont montr que les souches de Lactobacillus peuvent rduire plus d'AFB1
que les souches de Pediococcus et Leuconostoc et que la rduction varie entre 1,80
44,89% d'AFB1 selon les souches tudies. Ces rsultats suggrent que les souches de
bactries lactiques peuvent tre exploites dans des approches biologiques pour la
dtoxification des aliments contamins par les aflatoxines.
Mots-Cls: Mycotoxines. Occurrence. Aliments. Rduction. Bactries lactiques.
Fermentation panaire. Maroc.
SUMMARY
PUBLICATIONS
ARTICLES
1- A. Zinedine, S. Elakhdari, A. Chaoui, M. Faid, R. Belhcen, et M. Benlemlih.
Aflatoxins Reduction in Sourdough Bread Fermentation. Alimentaria (2004) N 353:
97-100.
2- A. Zinedine, M. Faid et M. Benlemlih. Activit anti-aflatoxinognique des
bactries lactiques isoles des ferments panaires traditionnels marocains. Rev. Md.
Pharm. Afr (2004). V 18: 77-83.
3- A. Zinedine, A.M. Betbeder, M. Faid and M. Benlemlih, L. Idrissi and E.E.
Creppy. Ochratoxin A determination in dried fruits and black olives from Morocco.
Alimentaria (2004) N 359: 73-76
4- A. Zinedine, M. Faid and M. Benlemlih. In vitro reduction of aflatoxin B1 by
strains of lactic acid bacteria isolated from sourdough bread. Int. J. Agr. Biol, (2005)
Vol. 7, N1: 67-70.
5- A. Zinedine, C. Brera, S. Elakhdari, C. Catano, F.R. Debegnac, S. Angelini, M.
Faid, M. Benlemlih and M. Miraglia. The natural occurrence of mycotoxins in cereals
and spices commercialized in Morocco. Int. J. Food Control (2004) (Soumis)
COMMUNICATIONS ORALES
1- A. Zinedine, Faid M. et Benlemlih M. (2002): Mycotoxins reduction by acid lactic
bacteria of sourdough bread. 1er Congrs National de Biochimie. Socit Marocaine de
Biochimie. 9-11 Mai 2002. Facult des Sciences An-Chock Casablanca. Maroc.
Tableaux
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
Titres
Effets mutagnes, tratognes et cancrignes des mycotoxines
Activit de leau (aw) ncessaire pour le dveloppement de quelques
moisissures
Proprits physico-chimiques des aflatoxines
Principales mycotoxines produites par les espces de Fusarium
Limites maximales pour les mycotoxines dans les aliments dans certains
pays europens et les USA
Estimation du dgt conomique des aflatoxines.
Principales diffrences entre le pain au levain et le pain la levure
Coefficients molaires et longueurs dondes de lAFB1 et lAFG1
Analyse statistique des mthodes analytiques des mycotoxines
Cooccurrence naturelle de lOTA, la FB1 et la ZEN dans les
chantillons du mas analyss
Concentrations de lOTA dans les chantillons de bl et dorge analyss
Occurrence des aflatoxines dans les chantillons du piment et de
gingembre analyss
Occurrence des aflatoxines dans les chantillons du poivre et du cumin
analyss
Concentrations de l'OTA dans les olives noires analyss
Concentrations de l'OTA dans les fruits secs analyss
Caractristiques physico-chimiques des ferments panaires
Dnombrement des levures et des bactries lactiques dans les ferments
panaires traditionnels en ufc 106/g
Pourcentage des genres de bactries lactiques dans les ferments panaires
traditionnels analyss
Distribution des espces de bactries lactiques dans les ferments
traditionnels panaires tudis
pH et nombre des bactries lactiques en culture mixte avec A. parasiticus
NRRL2999
Pourcentages de rduction de la production de lAFB1 par A.
parasiticus NRRL2999
Pourcentage de rduction in vitro de l'AFB1 par les bactries lactiques
Figure
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
Titre
Biosynthse de quelques mycotoxines dans les aliments.
Structures chimiques des aflatoxines
Principales voies de biotransformation de l'AFB1 dans lorganisme
Structure de l'ochratoxine A
Structure de la ZEN et de ses drivs
Structure de la FB1
Structure de la patuline
Schma montrant les principales tapes utilises pour lanalyse des
mycotoxines par HPLC
Pourcentage de rduction des aflatoxines par les ferments panaires
traditionnels
Effet de la temprature sur la rduction de l'AFB1 par les bactries
lactiques
Effet du pH sur la rduction de l'AFB1 par les bactries lactiques
Chromatogramme montrant les quatre pics des standards des
aflatoxines
Chromatogramme des aflatoxines dans les chantillons d'pices
Chromatogrammes des aflatoxines dans les chantillons des pices
(suite)
Chromatogrammes de l'OTA dans les chantillons des crales
analyses
Chromatogrammes de la ZEN dans un chantillon de mas analys
Chromatogrammes de trois injections diffrentes du standard de la FB1
Chromatogrammes de la FB1 dans trois chantillons de mas (4, 5 et
20)
Chromatogrammes de la FB1 dans deux chantillons de mas (M1 et
M2)
Chromatogramme de la FB1 dans un chantillon de mas (M4)
Chromatogramme de la FB1 dans un chantillon de mas (M20)
ABREVIATIONS
- A:
Aspergillus
- AF:
Aflatoxine
- AFB1:
Aflatoxine B1
- AFB2:
Aflatoxine B2
- AFG1:
Aflatoxine G1
- AFG2:
Aflatoxine G2
- AFM1:
Aflatoxine M1
- AFM2:
Aflatoxine M2
- AFT:
Aflatoxines totales
- Aw :
Activit de leau
- DON :
Doxynivalnol
- F:
Fusarium
- FB1 :
Fumonisine B1
- Hr :
Humidit relative
-L:
Lactobacillus
- Lc :
Lactococcus
- Ln :
Leuconostoc
- OTA :
Ochratoxine A
- P:
Penicillium
- ppm:
- ppb:
- Pc :
Pediococcus
- Rc :
Pourcentage de recouvrement
- ZEN :
Zaralnone
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
INTRODUCTION GENERALE
mycotoxines sont trs toxiques pour l'homme et les animaux. Leur prsence est
fortement dpendante de nombreux facteurs.
Les mycotoxines (du grec myks signifiant moisissure) sont des mtabolites
toxiques dont lingestion provoque une intoxication chez le consommateur condition
que leur concentration soit suffisamment leve pour produire un effet. Ce sont des
produits contaminant les denres alimentaires dorigine animale ou vgtale,
notamment les aliments de base : crales et olagineux, elles sont rpandues tous les
stades de la chane alimentaire.
Les troubles causes par ces substances se manifestent par des syndromes
varis, il peut y avoir un effet spcifique toxique sur un organe bien dtermin,
cependant la plupart provoquent des lsions graves d'un seul tissu ou de plusieurs
tissus, mais c'est surtout le foie qui est le plus touch. D'autres effets peuvent
apparatre tels les gastro-entrites, les hmorragies et les paralysies etc. Les
mycotoxines sont gnralement classes en trois groupes selon leurs effets toxiques
(voir tableau 1) :
- Les mycotoxines mutagnes
- Les mycotoxines cancrognes
- Les mycotoxines tratognes
De ce fait la consommation d'aliments pollus par les mycotoxines pose un
problme majeur de la sant publique.
Champignons
Mycotoxines
Mutagnicit Tratognicit
Cancrognicit
produites
A. flavus
A. parasiticus
Aflatoxines
P. urticae
Patuline
P. rubrum
Rubratoxine
Penicillium sp
Acide pnicillique
Ac. mycophnolique
A. versicolor
Strigmatocystine
P. poae
Trichothcnes
P. veridicatum
Ochratoxine A
A. ochraceus
Ochratoxine A
P. islandicum
Lutoskirine
A : Aspergillus
P : Penicillium
+
+
Tantaoui-Elaraki et Bartine (1994) ont ensuite isol des souches dA. flavus
productrices dochratoxine A sur diverses pices distribues au Maroc.
Toutes les rcoltes poussant des climats chauds et humides et exposes aux
moisissures toxinognes peuvent tre contamines par les mycotoxines. C'est le cas
notamment du mas, des fruits coque, des arachides, des graines de coton, des noix,
des pistaches, des pices, du soja, du riz, des amandes, des fruits secs, du lait et ses
drivs et des crales et leurs drivs etc.
Certaines cultures sont moins favorables par rapport dautres pour la production
dune ou plusieurs mycotoxines par les champignons. Ceci est probablement d des
facteurs gntiques. D'autres cultures comme les crales offrent aux champignons de
trs bonnes conditions de dveloppement vu leur richesse en glucides reconnus comme
principales sources dnergie. Le bl, lorge, le seigle, lavoine, le sorgho, le millet et
le riz, apparaissent tre moins susceptibles la contamination fongique et la
production d'aflatoxine par rapport au mas.
Les moisissures responsables de laltration des graines sont rparties en deux
groupes cologiques :
- Les moisissures du champ : Alternaria et Fusarium
- Les moisissures de stockage : Aspergillus et Penicillium
Les mycotoxines peuvent tre dtectes dans les aliments la suite d'une
production par une souche toxinogne, ceci ncessite un substrat favorable et une
souche productrice de toxines ou bien la suite d'une contamination indirecte
provenant d'aliments contamins et intgrs dans l'alimentation du btail. La scrtion
par les moisissures de mtabolites toxiques dans les aliments dpend de plusieurs
moisissures
sont
des
organismes
htrotrophes,
se
dveloppant
exclusivement sur des substrats organiques contenus dans les produits alimentaires de
base (olagineux, crales, produits laitiers etc.). Les glucides sont des sources de
carbone les plus utiliss par les moisissures. La prsence de quelques substances dans
les aliments stimule la croissance des moisissures et la production des mycotoxines
comme le saccharose et les acides amins. La contamination dune denre alimentaire
par les moisissures dpend de la nature du substrat en particulier de la nature des
glucides disponibles.
Activit de leau (aw)
Law joue un rle primordial sur la croissance des moisissures en particulier sur la
germination des spores et la croissance du myclium. Lexigence et la tolrance des
moisissures vis vis de leau sont variables dune souche lautre. Les moisissures
sont classes en trois groupes :
Les espces hygrophiles dont les spores germent plus de 90% et leur
croissance optimale se situe 100 % dhumidit relative (Mucor sp.).
Les espces msophiles dont les spores germent entre 80 et 90% et leur
croissance optimale se situe entre 95 et 100% dhumidit relative (Alternaria
sp., Penicillium sp.).
Les espces xrophiles dont les spores germent moins de 80% et leur
croissance optimale se situe entre 95 et 100% dhumidit relative (Aspergillus
sp., Penicillium sp.).
est
biosynthtis
partir
de
la
phnylalanine
et
le
Moisissures
Aw
0,83-0.87
A. ochraceus
A. flavus
0,78
A. niger
0,88
P. cyclopium
0,87 - 0,90
Fusarium sp
0,80 - 0,92
Mtabolites II aires
(Ergotamine)
Glucose
Triose
Pyruvate
Actate
Polyctoacides
Acides gras
Mtabolites II aires
(Aflatoxines)
Mvalonate
Mtabolites II aires
(Tricothcnes)
Les aflatoxines sont des mtabolites secondaires synthtiss par des souches
d'Aspergillus flavus, A. parasiticus et A. nomius (Kurtzman et al., 1987). Elles sont
largement abondantes dans les olagineux, les rcoltes du coton et des crales
notamment le bl et le mas. Le stockage de ces aliments dans des conditions humides
ou chaudes peut augmenter la synthse d'aflatoxines. Selon Diener et al. (1987),
l'cologie des moisissures productrices des aflatoxines est trs complexe. En effet, A.
parasiticus est un champignon mieux adapt au sol et prominent chez l'arachide, alors
que A.flavus est adapt la vie arienne des plantes (fleures) et il est dominant en
particulier dans les cultures de mas. Une distinction biochimique entre les souches
productrices d'aflatoxines est que A. flavus produit seulement les aflatoxines B, alors
que A. nomius et A. parasiticus produisent les aflatoxines B et G (Creppy, 2002).
L'aflatoxine B1 (AFB1) est la mycotoxine la plus tudie. Cependant d'autres
aflatoxines sont produites par les moisissures toxinognes notamment B2, G1 et G2 et
les aflatoxines M. Les aflatoxines M1 et M2, drivs respectifs des aflatoxines B1 et
B2, apparaissent dans le lait et ses drivs. Ces toxines ont tenu leur appellation du fait
de leur dtection dans le lait "Milk" des vaches laitires nourries par une alimentation
contamine (Jaquet et al., 1982). Certaines souches de moisissures sont capables de
synthtiser les aflatoxines M directement dans une alimentation moisie (Bullerman,
1978). Il a t dmontr que l'aflatoxine M1 peut contaminer le lait maternel humain
(El-nezami et al., 1995; Galvano et al., 1996).
AFB1
AFB2
AFG1
AFG2
AFM1
AFM2
PM
Rf Chloroforme/
mthanol (97/3)
312
314
328
330
328
330
267
303- 306
257-259
237-240
299
293
0.56
0.53
0.48
0.46
0.40
0.30
A. ochraceus et certaines
espces voisines que par des espces du genre Penicillium. Elles ont t dtectes dans
le mas, lorge, le bl, lavoine, les haricots, les pois moisis et les fruits secs. On les
retrouve galement sur les graines mal stockes, elles contaminent entre autres les
crales, les boissons (vins, jus de fruits, bire etc.) et par le biais de la chane
alimentaire la viande de porc et de la volaille (Haumann, 1995).
La production des ochratoxines par les espces dAspergillus ne parait possible
que dans des conditions de forte humidit et de temprature leve (varga et al.,1996),
alors que certaines espces de Penicillium sont capables de produire des ochratoxines
mme des tempratures nexcdant pas 5C (OMS, 1980).
2- Ochratoxine A
Lochratoxine A (OTA, figure 4) est une mycotoxine dcouverte par Van der
Merve et al., (1965), elle est la principale toxine dangereuse dans son groupe. Elle est
produite par P. verrucosum et par A. ochraceus. Elle peut tre produite aussi par A.
niger. Ces trois espces diffrent dans leurs niches cologiques, dans les denres
affectes ainsi que dans la frquence de l'occurrence dans diffrentes rgions
gographiques (Creppy, 2002). En effet P. verrucosum croit seulement des
tempratures au dessous de 30C et une aw de 0,8 et contamine de ce fait les crales
et leurs drivs dans les rgions froides en particulier en Europe et au Canada (Creppy
et al., 1991, 1993). L'OTA est une mycotoxine principalement produite par les
moisissures au cours des priodes de stockage (Scudamore et al., 1999 ; Moss, 1986).
COOH
OH
CO
O
CH3
H
Cl
B - LA ZEARALENONE (ZEN)
1- Microorganismes producteurs et aliments contamins
La ZEN [6-(hydroxy-6-oxo-trans-1-undecenyl)--acide rsorcylique -lactone,
(figure 5)] est une mycotoxine produite principalement par les espces du genre
Fusarium (tableau 4). Cest un contaminant naturel de certaines crales, en particulier
du mas dans de nombreux pays dAfrique et dEurope, ainsi quaux Etats-Unis.
Quoique les Fusarium infectant les crales produisent la ZEN avant la rcolte,
des tudes ont montr que cette toxine peut tre produite de hautes concentrations
dans les graines de mas destines l'alimentation animale pendant le stockage. (Pittet,
1998).
CH3
OH
O
Y
OH
X
R
X=
Y=
R=
H:
Zaralnone
OH
H:
Hydroxy-8 zaralnone
CHO :
Formyl-5 zaralnone
OH
OH
H:
Dihydroxy-6,8 zaralnone
OH
H:
Zaralnols ( et )
2- Toxicit de la ZEN
La ZEN et ses mtabolites ( et zaralnols ; et zaralanols) sont classs
par l'IARC dans le groupe 3 (IARC, 1999). Selon Creppy (2002), la ZEN et ses
mtabolites ont montr une comptitivit pour fixer les rcepteurs de lstrogne. A
de hautes concentrations, la ZEN produit plusieurs altrations du systme immunitaire.
Elle produit galement des altrations du tractus de reproduction chez des models
exprimentaux (souris, rat, lapin). La ZEN a montr une action strogne
(Gonflement et rougissement de la vulve, prolapsus vaginal, accroissement de la taille
de lutrus, chaleurs anormales) chez divers animaux domestiques (Creppy, 2002).
Concernant sa gnotoxicit, la ZEN n'induit pas de mutations chez S.
typhimurium, cependant elle provoque des aberrations chromosomiques dans les
cellules ovariennes chez le hamster et elle induit la rparation SOS chez les bactries
(Ghdira-Chekir et al., 1999).
La ZEN a t rcemment value par le comit mixte d'experts FAO/OMS
(JECFA, 2000). Le comit a tabli la consommation journalire provisoire maximale
tolrable (PMTDI) pour la ZEN et ses mtabolites (incluant l' -zaralanol) 0,5g/kg
du poids corporel par jour.
C- LES FUMONISINES
1- Micro-organismes producteurs et aliments contamins
Les fumonisines sont un ensemble de toxines produites par les espces du genre
Fusarium comme F. verticillioides (ou F. moliniforme) et F. proliferatum (Bottalico,
1998 ; Pittet, 1998 ; Creppy, 2002). Les espces productrices de ces mycotoxines sont
regroupes dans le tableau 4.
OH
OH
CH3
CH3
CH3
OH
NH2
O
O
OH
O
Figure 7 : Structure de la patuline
E- LES TRICHOTHECENES
Cest une famille compose denviron 148 composs, tous produits par de
nombreuses espces fongiques dont celles des genres Fusarium,
Penicillium,
Espces de Fusarium
F. acuminatum
Mycotoxines produites
T-2, HT-2, DAS, MAS, MON, NEO
F. avenaceum
MON
F. chlamydosporum
MON
F. crookwllense
F. culmorum
F. equiseti
F. graminarum
F. heterosporum
ZEN, ZOH
F. moniliforme
FB1
F. oxysporum
MON
F. poae
F. proliferatum
F. sambucinum
F. semitectum
ZEN
F. sporotrichioides
F. suglutinans
F. tricinctum
MON
F.venenotum
DAS
Produits concentrs
La concentration en aflatoxines des produits ayant subi une opration
dlimination de leur eau de constitution, ou dune partie de celle-ci, peut tre
suprieure celle de la matire premire mise en uvre, dans la limite de la quantit
deau limine :
- Lait en poudre : AFM1 : 0,5g/kg
- LAIT EN POUDRE (ENFANTS) : AFM1 : 0,3G/KG
Drivs des crales
Les farines et sons qui proviennent directement des crales peuvent contenir
des proportions en AFB1 diffrentes de celles des matires premires dont ils sont
issus :
- Farine blanche de bl (farine fleur) : 3g/kg dAFB1
- Son du bl brut : 10 g/kg dAFB1
- Farine de bl complte : 5g/kg
Aliments de btail
- AFB1 : 50 g/kg : Aliments complets pour bovins, ovins et caprins (sauf
animaux laitiers, veaux et agneaux)
- AFB1 : 20 g/kg : Aliments pour porcins et volailles (sauf porcelest, poussins,
cannetons et dindes)
- AFB1 : 20 g/kg : Aliments suplments pour animaux laitiers
- AFB1 : 10 g/kg : Autres aliments complets pour animaux
b- A l'chelle internationale :
Plusieurs pays ont tabli ou propos des limites rglementaires concernant les
mycotoxines dans les aliments. Depuis 1974, certains pays de lUE ont arrt des taux
limites daflatoxines. En mars 1999, en collaboration avec lOMS, La FAO a parrain
la 3me confrence mondiale sur les mycotoxines. La confrence a t organise pour
sensibiliser les dcideurs aux risques sanitaires et aux effets conomiques potentiels de
Tableau 5: Limites maximales pour les mycotoxines dans les aliments dans
certains pays europens et les USA (Creppy, 2002).
Mycotoxine
Pays
Finlande
Allemagne
Pays-bas
Belgique
Portugal
AFB1
Autriche
Suisse
Espagne
Luxembourg
Irlande
Danemark
Grce
Sude
Norvge
Finlande
Allemagne
AF totales:
(AFB1,
AFB2,
AFG1, et
AFG2)
G. Bretagne
France
Italie
Autriche
Suisse
USA
Belgique
Bosnie
Sude
Autriche
Allemagne
Pays-bas
AFM1
Russie
Suisse
LM (g/kg ou g/l)
2
2
5
5
25
5
20
1
2
1
2
5
5
5
5
5
5
5
5
4
0,05
4
10
50
5 (B2+G1+G2)
0,02 (M1+B1+B2+G1+G2)
5 (B2+G1+G2)
0,01
20
5
1 (B1+G1)
5
0,05
0,05
0,05
0,05
0,02
0,02
0,5
0,02
0,05
0,25
Aliments
Tous
Tous
Tous
Tous
Arachide
Aliments pour enfants
Autres
Tous
Crales, noix
Tous
Mas, crales
Tous
Tous
Tous
Tous
Tous
Tous
Arachides, noix,
Tous
Tous
Enzymes et formulations
Noix, fruits secs
Tous
Arachides
Tous
Aliments pour enfants
Tous
Nourritures de bbs
Tous
Arachides
Crales
Fves, haricots
Drivs laitiers liquides
Lait
Lait
Lait
Beurre
Fromages
Aliments pour enfants
Lait et drivs
Fromages
Tableau 5 (Suite):
Mycotoxine
AFM1
Pays
Belgique
USA
Rp. Tchque
France
LM
(g/kg ou g/l)
0,05
0,5
0,1
0,5
Aliments
Lait
Lait
Lait pour enfants
Lait pour adultes
Lait pour enfants
Lait pour adultes
Bulgarie
0,03
0,05
0,5
USA
Russie
Autriche
1000
1000
750
Bl
Crales
Bl
Romaine
Rp.Tchque
Tous
Aliments pour enfants
Autriche
Suisse
Grce
France
Pays-bas
5
1
20
5
25
5
2
20
5
0
Suisse
1000
Mas
Zaralnone
(ZEN)
Roumanie
Autriche
France
Russie
30
60
200
1000
T2-toxine
Russie
100
Tous
Doxynivalnol
(DON)
Danemark
OchratoxineA
(OTA)
Fumonisines
(B1+B2)
LM : Limite maximale
AF : Aflatoxines
Crales
Porc
Crales
Crales
Tous
Tous
Crales
Secteur
Mas
Arachide
Mas et
Arachide
36,8
107,7
176,5
114,7
291,2
71,7
6,2
77,9
319,1
157,7
476,9
Dtrioration de laspect
Dgradation du
extrieur des graines.
70,9
produit commercialis Rancissure, perte du
pouvoir germinatif.
Intoxication humaine
Intoxication des
animaux domestiques
(volaille, porc, btail)
Total
I- Gnralits
Les dgts conomiques et les problmes de sant humaine et animale
engendrs par les mycotoxines, court ou long terme, ont pouss les scientifiques
chercher des mthodes efficaces pour rduire les taux de ces substances dans les
aliments ou bien empcher leur production par les moisissures toxinognes
Comme la prsence des moisissures dans les rcoltes est un phnomne naturel,
il serait impossible dliminer toute trace de mycotoxines des produits alimentaires.
Cependant il est possible de minimiser la contamination en prenant des prcautions au
niveau de lentreposage et la manutention des rcoltes aprs la moisson et en
inspectant rigoureusement les produits avant la mise sur le march. La rduction des
taux des mycotoxines relve la fois du rle des agriculteurs, des commerants et des
industriels.
Plusieurs procds ont t tudis afin de prvenir la contamination des
matires premires par les mycotoxines. Chaque essai doit non seulement rduire la
concentration des toxines mais aussi viter que les produits de dgradation ne soient
toxiques ou dtriorent la qualit nutritionnelle des aliments traits. Selon LopezGarcia et Park (1999) un systme de lutte intgr contre les mycotoxines doit se
concevoir trois niveaux de production:
1-Lutte avant rcolte
Sous des climats type tropicaux chauds et humides jugs risque, la prvention
aux champs consiste en lutilisation raisonne dinsecticides, et ce dans le but de
diminuer les lsions des plantes et rduire de ce fait les portes ouvertes
lenvahissement par les moisissures ou lutilisation de fongistatiques inhibant la
croissance des moisissures et empchant la toxinognse. La lutte contre les
infestations dinsectes peut donc aider viter la prolifration des spores et la
production ultrieure des mycotoxines. Cependant ces essais sont trs difficiles
mettre au point et restent peu concluants.
2-Lutte au moment de la rcolte
Le moment de la rcolte a une grande influence sur la production des
mycotoxines. Pendant cette priode, deux facteurs sont contrler : le lavage et le
schage. Ces deux pratiques jouent un rle important dans la prolifration fongique
pendant lentreposage.
3-Lutte et dcontamination aprs rcolte
Les procdures appliques au cours de la priode d'entreposage constituent une
barrire importante pour viter lexposition des consommateurs aux mycotoxines. Les
procds de dcontamination doivent tre efficaces sans rendre impropres la
consommation les denres traites, elles doivent tre simples mettre en uvre et peu
coteux puisque le traitement peut concerner des tonnages importants.
Selon Park (1993), les trois procds dlimination des aflatoxines (physiques,
chimiques ou biologiques) constituent les stratgies de lutte les plus courantes aprs
rcolte, les mthodes sont nombreuses et varient selon le type de mycotoxines, mais
selon Galvano et al, (2001), l'efficacit de chaque approche doit tre value selon des
critres spcifiques savoir :
- Inactiver, dtruire ou liminer la toxine dans l'aliment,
- Ne gnrer aucun rsidu toxique dans laliment,
- Ne pas altrer les proprits technologiques et nutritionnelles de l'aliment,
- Etre techniquement et conomiquement faisable.
Traitement thermique
Les mycotoxines sont en gnral thermostables et elles rsistent tous les procds
utiliss pour l'limination des micro-organismes (chauffage et strilisation). Peers et
Linsell (1975) observaient que les aflatoxines restent stables dans les arachides ou
dans le mas aprs un chauffage 200C pendant 30 minutes. Il est noter que les
traitements thermiques dpendent en grande partie d'autres facteurs tels la teneur de
l'aliment contamin en eau et de son pH (Rustom, 1997).
- Irradiation
Lirradiation a t considre pour longtemps comme une solution possible de lutte
contre les microorganismes. Des mthodes satisfaisantes pour l'limination des
mycotoxines ne sont pas encore mises au point. Cependant lirradiation peut tre
envisage pour lutter contre les moisissures toxinognes.
- Extraction
L'extraction des aflatoxines avec des solvants est un procd qui a t tudi pour
leur limination des arachides contamines. Cependant le matriel trait par cette
mthode ne peut tre destin qu'aux animaux. Le rapport solvant/aliment est un
lment crucial dans le procd. Quoique toutes les traces d'aflatoxines puissent tre
limines sans aucun risque de formation de produits toxiques, ce procd reste limit
d son cot trs lev (Rustom, 1997).
- Adsorption
Certains produits possdent des proprits d'adsorption. Ils ont fait l'objet d'tudes
pour valuer leur capacit liminer les mycotoxines des aliments contamins. Selon
Huwig et al. (2001), diffrents adsorbants ont t utiliss avec succs dans des
procds de dtoxification des aliments de btail contamins par les mycotoxines.
C'est le cas des argiles adsorbant les aflatoxines en particulier l'AFB1, le charbon actif
adsorbant la plupart des mycotoxines, et finalement certains polymres comme la
cholestyramine (rsine changeuse d'anions utilise pour l'adsorption des acides
biliaires dans le tractus gastro-intestinal) adsorbant l'OTA.
III-
Procds chimiques
- Bisulfites
Les bisulfites ont t ajouts aux aliments pour inhiber les activits de certaines
enzymes mais aussi pour retarder la croissance des micro-organismes. Doyle et Marth
(1978) ont constat que les bisulfites rduisent les taux des aflatoxines B1 et G1
d'environ 50 % aprs environ 5 jours de traitement et que cette dure peut tre rduite
une journe si la temprature atteint 55 C au cours du procd de traitement.
-
Les antioxydants
Procds biologiques
l'OTA, l'AFB1, la DON et la ZEN par la flore du tractus digestif des ruminants (porc,
bovins).
Grce aux informations recueillies dans le domaine de la biotechnologie sur les
microorganismes et l'accumulation des connaissances sur les capacits illimites du
catabolisme des populations microbiennes, plusieurs spcialistes se sont orients
rcemment vers une approche microbiologique pour la dtoxification des aliments
contamins par les mycotoxines. Cette approche consiste en une rduction ou une
dgradation des mycotoxines par des microorganismes spcialiss (Bata et Lastztity,
1999). Les procds biologiques ont plusieurs avantages:
-
des souches d'A. fumigatus de dgrader l'OTA dans les milieux de cultures liquides.
Par ailleurs, des souches d'A. niger CBS120.49 se sont montres capables de dgrader
l'OTA et lochratoxine (OT) dans les milieux liquides et solides en secrtant une
enzyme: la carboxypeptidase.
1-2 Dgradation de lAFB1 par Flavobacterium aurantiacum
La premire vidence de la capacit des bactries dgrader les molcules
daflatoxines a t dmontre par Ciegler et al. (1966 a et b). Ces auteurs ont tudi
leffet dun millier de micro-organismes comptant parmi elles des levures, des
moisissures et des bactries. Une seule souche a montr un effet de dgradation
irrversible sur lAFB1 dans des milieux solides et liquides. Il sagit de
Flavobacterium aurantiacum. Le pourcentage de dgradation totale tait de 100%
aprs 88h dincubation.
Lillehoj et al. (1967) ont montr que la temprature optimale de dgradation de
lAFB1 par F. aurantiacum est de 35C et le pH optimum de dgradation est de 6,75.
Lillehoj et al. (1971) ont rapport que lajout dune prculture de 2.1010 cellules /ml
dune prculture de F. aurantiacum de 48 h dgrade 40% de lAFM1 par simple
contact, alors que lincubation pendant 4 h dgrade compltement la toxine.
La dgradation des aflatoxines dans certains aliments par les micro-organismes
et en particulier par F. aurantiacum a t rapporte galement par Hao et Brackett
(1988) et Line et al (1994). Cependant le mcanisme de leur dgradation nest pas bien
connu aussi bien leur devenir. Line et Brackett (1995) ont montr que laddition dune
autre source nutritive (bouillon de trypticase) naffecte pas la dgradation des
aflatoxines indiquant que lAFB1 est probablement dgrade par une voie mtabolique
secondaire.
I- Introduction
Le pain, aliment de base aussi bien en ville qu la campagne, est obtenu par
une technologie alimentaire des plus anciennes inventes par lhomme. Ce sont les
Egyptiens qui furent les premiers observer accidentellement la fermentation panaire
aprs la leve de la pte abandonne au repos. Le pain a subi au cours de lhistoire des
modifications quant ses qualits organoleptiques que nutritionnelles grce au progrs
scientifique.
Au Maroc, la prparation du pain est essentiellement quotidienne et se fait
dune manire traditionnelle en milieu rural. La fermentation de la pte est le rsultat
de lassociation des levures et des bactries lactiques. Par contre en ville la
fermentation est devenue moderne, elle se base uniquement sur lutilisation de la
levure boulangre : Saccharomyces cerevisiae.
II Les agents de la fermentation
1- Les levures
Les levures, micro-organismes eucaryotiques unicellulaires largement rpandus
dans lenvironnement sont utiliss par lhomme depuis des millnaires. Le mot levure
drive du mot latin levare qui se dfinit par le principe qui fait lever le pain. Cest
avec les travaux de Pasteur que le rle des levures dans la fermentation alcoolique a
t mis en vidence. Gnralement on attribue aux levures boulangres des proprits
principales au cours de la fermentation savoir:
- La libration de gaz lors de la dgradation des glucides ce qui entrane une
augmentation du volume du pain.
- Le dveloppement de la texture et de la structure du pain ce qui se traduit par une
bonne maturation de la pte.
actique lors de la combinaison des quelques espces de bactries lactiques (L. brevis
et L. plantarum DC400) avec dautres espces de levures notamment S. cerevisiae et S.
exiguus.
Meignen et al. (2001) ont caractris un pain obtenu par une combinaison mixte
de L. brevis et S. cerevisiae. La fermentation combine a entran une rduction de la
production de lthanol mais une augmentation de la production du glycrol, de lacide
actique et de 15 substances darmes dont de forts pourcentages du 3-mthyle 1buthanal, du 3-mthyle 1-buthanol, du 2-mthyle 1-buthanol, dthyle lactate et du 2phnyle thyle alcool. La forte production de ces composs aromatiques est
probablement lie lactivit protolytique des bactries lactiques. Les acides amins
librs sont utiliss par S. cerevisiae pour la production des alcools, une corrlation
entre les concentrations des acides amins et les composs aromatiques a t tablie
(Spicher et Nierle, 1988).
Caractristiques
Pain au levain
Pain la levure
pH
3.8 - 4.6
5.3 - 5.8
0.25 - 0.30 %
0.10 - 0.40 %
0.005- 0.04 %
0.8 - 0.9 %
0.4 0.8 %
0.005 - 0.04 %
Conservation
microbiologique
Hydrolyse enzymatique
faible.
Aspects nutritionnels
phytique
OBJECTIFS DU TRAVAIL :
MATERIEL ET METHODES
Figure 8 : Schma montrant les principales tapes utilises pour lanalyse des
mycotoxines par HPLC.
EXTRACTION
Papier wattman
DLUTION / FILTRATION
Erlenmeyer
Seringue
ADSORPTION / ELUTION
Gel (tampon)
Colonne dimmuno-affinit
contenant un anticorps spcifique
INJECTION / DTECTION
HPLC
(Dtecteur de fluorescence)
- Analyse de la FB1
Lextraction de la FB1 a t faite selon une mthode AOAC dcrite par
Visconti et al. (2001). 25 g dchantillon broys ont t extraits par un mlange
mthanol- actonitrile-eau (25:25:50, v/v/v) en utilisant un blinder grande vitesse
pendant 4 minutes. Aprs filtration sur papier wattman n4, 10 ml du filtrat ont t
dilus avec 40 ml du PBS. Une colonne dimmuno-affinit (Fumoniprep, R-Biopharm
Rhne LTD, Glasgow, Royaume-Uni) contenant un anticorps monoclonal spcifique
des fumonisines (FB1, FB2 et FB3) a t conditionne par 5 ml du PBS. 10 ml du
filtrat dilu ont t appliqus la colonne. La colonne a t lave par 10 ml deau
bidistille et lair a t limin par une seringue jusquau sec. La FB1 a t lue par
application en premier de 1,5 ml du mthanol. Llut a t dilu avec 1,5 ml deau
bidistille et mix au vortex. La drivatisation pr-colonne des extraits a t faite avec
le mlange Ortho-Phtaldialdhyde (OPA) / 2-mercaptothanol (MCE). Le ractif
OPA/MCE est prpar chaque semaine en dissolvant 120 mg de lOPA dans 3 ml du
mthanol auquel on ajoute 15 ml du ttraborate de sodium (0.1M) et 150 ml du MCE.
Le ractif est photosensible et doit tre conserv labri de la lumire. 450 l du
ractif OPA/MCE sont additionns de 50 l de lextrait analyser, mixs au vortex.
Aprs 3 min, 100 l sont injects un HPLC. Le systme HPLC consiste en un
injecteur automatique, un dtecteur de fluorescence et une colonne C18 (150 x 4 mm,
5m). La phase mobile utilise tait le mlange mthanol- dihydrognophosphate de
sodium 0,1M (77 : 23, v/v) ajust un pH 3,35 avec 85% dacide phosphorique. Le
flux a t fix 1 ml.min-1. Le fluorimtre a t opr des longueurs dondes
dexcitation et dmission respectivement de 335 nm et 440 nm. Le temps de rtention
de la FB1 dans les conditions dcrites ci-dessus est 6 min.
- Analyse des aflatoxines
Les chantillons ont t analyss en utilisant une mthode dcrite par Roch et
al. (1994). 50g dchantillon ont t extraits par 250 ml du mlange actone: eau
(85:15 v/v) en utilisant un blinder grande vitesse pendant 3 minutes. Aprs filtration
sur papier wattman n4, 5 ml du filtrat sont dilus par 95 ml dune solution de tampon
phosphate (PBS, pH 7.3). Une colonne dimmuno-affinit (Aflaprep, R-Biopharm
II- Dtermination de l'OTA dans les fruits secs et les olives noires de table
1- Echantillonnage
24 chantillons de fruits secs (raisins noirs, raisins blancs, figues et pruneaux)
et 25 chantillons dolives noires de table ont t prlevs sur les points de vente des
villes de Rabat et de Sal. Les chantillons prlevs ont t transports au Laboratoire
de Toxicologie et dHygine Applique de lUniversit Victor Segalen Bordeaux 2,
France, pour analyse de l'OTA.
2- Mthodes de dosage de lOTA
2-1 Prparation des talons de l'OTA
Des solutions d'OTA (Sigma-Aldrich, USA) ont t prpares dans le mthanol,
les concentrations de l'OTA ont t vrifies par dtermination de la DO dans un
spectrophotomtre UV. La quantit ncessaire a t vapore au sec et ensuite dissoute
dans la phase mobile indique ci dessous dans les conditions chromatographiques.
2-2 Dtermination de l'OTA dans les fruits secs
L'analyse de l'OTA dans les fruits secs a t faite suivant la mthode dcrite par
Ospital et al. (1998). 10 g d'chantillon ont t extraits par une solution contenant 50
ml du chlorure de magnsium (MgCl2, 0,4M), 30 ml de tolune et 30 ml d'acide
chlorhydrique 2N par agitation pendant 1h. Les deux phases ont t spares par
centrifugation (3000 g pendant 5 min). La phase organique a t rcupre, filtre et
vapore sec l'aide d'un systme rotavapeur Heidolph WB 2000 (Prolabo, France).
L'extrait est dissous dans 1ml de chloroforme. Une cartouche (Sep-Pak Plus) a t
lave avec 10 ml de tolune et l'extrait a t appliqu la cartouche. Cette dernire est
ensuite lave avec 10 ml du mlange tolune/mthanol (97:3; v/v) et l'OTA a t
finalement lu par 10 ml du mlange tolune / acide actique (90:10; v/v) un flux de
1ml/min. L'lut a t vapore au sec et dissous dans 1 ml de la phase mobile.
x 100
C spk
x 100
Rc
Xm
Farine : 50g
Ferment panaire : 2 g
- Observation microscopique
Dans cette premire tape, ltude a consist en une coloration de Gram des
diffrentes souches isoles partir des cultures jeunes. Leur aspect morphologique a
t galement observ (forme, taille...).
- Recherche de la catalase
Chez les bactries doues dun mtabolisme oxydatif, le systme respiratoire
compte parmi dautres enzymes une catalase, celle-ci dcompose leau oxygne selon
la raction suivante :
Catalase
2 H2O2
2 H2O + O2
PM
Mthanol
Actonitrile
Benzne/actonitrile
Chloroforme
AFB1
312
/ : 360/21800
/ : 355/20600
/ : 348/19800
/ : 360/20600
AFG1
328
362/18000
360/17800
355/17100
360/19500
Europenne N L 327/54".
a- Extraction
50 g de la farine analyser sont mlangs avec 25 ml deau distille et extraits par
250 ml de chloroforme. Le tout est vigoureusement agit pendant 30 minutes laide
dun agitateur. Le mlange est ensuite filtr sur un papier filtre wattman n4 contenant
du sulfate de sodium anhydre. Lextrait chloroformique est conserv labri de la
lumire.
b- Purification de lextrait
Elle a t faite sur une colonne de gel de silice (Merk, Allemagne). La colonne
est constitue dun tube de verre de 2 cm de diamtre et de 40 cm de longueur quip
dun robinet et comportant sa partie suprieure une ampoule de 150 ml de volume.
La laine de verre est place la base, la colonne a t remplie de chloroforme sur une
hauteur de 20 cm. Ensuite, 5 g de sulfate de sodium anhydre ont t introduits dans la
colonne de faon obtenir une base pleine. Dautre part, 15 g de gel de silice 60
(Machery-Nagel, Allemagne) ont t mis dans du chloroforme et la suspension
translucide obtenue est verse dans la colonne en vitant demprisonner des bulles
dair. Aprs 1 h de repos, 15 g du sulfate de sodium anhydre ont t ajouts avec
prcaution. Le chloroforme est alors drain jusqu affleurement avec le sommet du
sulfate de sodium.
50 ml de lextrait chloroformique correspondant 10g de produit de dpart sont
concentrs jusqu un volume denviron 2-3 ml et dposs au sommet de la colonne, le
rcipient est rinc 3 fois par quelque ml de chloroforme qui sont galement introduit
dans la colonne. La colonne est dabord lave par 150 ml dhexane ou dther de
ptrole dpourvus de carbures benzniques, puis par 150 ml dther dithylique. Les
3- Effet du pH du milieu
Leffet du pH du milieu de culture MRS contamin avec 5 g/ml de lAFB1 est
tudi par ajustement du pH initial avant la fermentation des valeurs de pH (5,5), pH
(4,5) et pH (3,0) laide dune solution strile dacide lactique (1N). Le milieu a t
ensuite inocul avec les souches utilises. Lincubation est faite 30C pendant 24 h.
LAFB1 est ensuite analys par HPLC.
4-Effet de La temprature
Leffet de la temprature sur la rduction de lAFB1 par les isolats a t tudi
dans les mmes conditions dcrites auparavant sauf que lincubation des souches
tudies a t faite trois tempratures diffrentes, 15C, 25C et 37C.
5- Analyse statistique
Tous les essais dans cette tude ont t rpts 3 fois. L'analyse statistique des
donnes a t faite en utilisant le t-test de Student.
RESULTATS ET DISCUSSION
internationale
(70-120%).
Les
coefficients
de
variation
pour
la
Analyse de l'OTA
Les rsultats de la contamination des crales par les mycotoxines sont
regroups dans les tableaux 10 et 11. Comme il est indiqu, 40, 55 et 40 % des
chantillons totaux de mas, dorge et du bl analyss sont respectivement contamins
par lOTA. Dans les chantillons dorge, la concentration moyenne de lOTA est de
lordre de 0,09 g/kg, alors que l'incidence de lOTA varie entre 0,04 et 0,8 g/kg.
Dans les chantillons du bl, la concentration moyenne de lOTA est de lordre de 0,17
g/kg et les concentrations varient entre 0,04 et 1,73 g/kg.
Dans les chantillons de mas, la concentration moyenne de lOTA est de
lordre de 0,43 g/kg, alors que la concentration leve en OTA (7,22 g/kg) a t
enregistre dans lchantillon n4. L'incidence de l'OTA dans les chantillons analyss
varie entre 0,05 et 7,22 g/kg.
Mycotoxine
Taux de
fortification
Moyenne
Rc (%)
SD 1
CV (%) 2
Orge
OTA (g/kg)
0.11
0.22
0.12
96.56
101.7
94.16
0.005
0.032
0.021
4.50
15.78
17.8
Mas
OTA (g/kg)
0.25
0.7
0.27
0.1
87.5
98.14
83.7
82.3
0.01
0.125
0.025
0.011
3.41
16.6
11.3
9.10
Bl
OTA (g/kg)
0.16
1.7
0.8
85.5
92.3
94.4
0.013
0.04
0.012
9.28
2.66
1.52
Mas
ZEN (g/kg)
25
50
10
116.12
93.66
92.3
6.04
1.45
0.88
24.28
2.9
9.73
Mas
FB1 (mg/kg)
0.78
0.93
80.35
82.5
0.035
0.075
4.33
8.3
Poivre
Gingembre
Piment
Cumin
Poivre
Gingembre
Piment
Cumin
AFB1 (g/kg)
0.1
2
4
1
0.12
2.3
4.5
1.5
84.2
87.5
97.1
94.5
85.6
81.3
92.4
91.2
0.036
0.12
0.25
0.016
0.01
0.012
0.45
0.23
4.5
7.12
6.23
1.9
8.5
3.4
10.2
15.6
1
2
AFG1
(g/kg)
Dviation du Standard,
Coefficient de variation pour la reproductibilit.
Cette valeur (7,22 ppb) est nettement suprieure la valeur maximale limite fixe
par la rglementation des pays de lUnion Europenne concernant lOTA dans les
crales. En France, en Suisse et au Danemark, la limite maximale de lOTA dans les
crales recommande est tablie 5 g/kg (Creppy, 2002).
-
Concernant lanalyse des aflatoxines dans le bl, les rsultats ont montr que dans
tous les chantillons analyss, les aflatoxines ont t au dessous de la limite de
dtection (0,01 g/kg) dans les conditions chromatographiques dcrites auparavant.
-
Analyse de la ZEN
Analyse de la FB1
Comme dans le cas de la ZEN, l'analyse de la FB1 a t effectue dans les
Les rsultats ont montr que la FB1 contamine 50% des chantillons de mas
analyss, ce qui correspond un pourcentage total de contamination de 50%. Des taux
trs levs ont t trouvs dans l'chantillon 4 (5,96 mg/kg) et l'chantillon 10 (5,5
mg/kg). Les concentrations de la FB1 varient entre 0,01 et 5,96 mg/kg, alors que la
concentration moyenne est de lordre de 0,96 mg/kg.
Ces valeurs dpassent largement la limite maximale (1 mg/kg) de FB1
recommande par la rglementation Suisse dans le mas (Creppy, 2002). Peu de pays
ont fix une rglementation concernant les fumonisines dans les crales, cependant
selon Brera (Communication personnelle), la limite qu'on recommande actuellement et
qui est de 2 mg/kg, sera probablement fixe comme limite maximale rglementaire par
les pays de l'Union Europenne.
- Co-occurrence des toxines d'Aspergillus et de Fusarium
En ce qui concerne la co-occurrence des toxines de Fusarium avec les toxines
d'Aspergillus, 15 et 50 % des chantillons totaux de mas taient respectivement
contamins par la ZEN et la FB1. Tous les chantillons contamins par lOTA ont t
contamins par la FB1. Les concentrations les plus leves de lOTA (7,22 g/kg) et
de la FB1 (5,96 mg/kg) ont t enregistres dans lchantillon n4. Cependant dans
lchantillon n10 o la teneur leve en FB1 tait de l'ordre de 5,5 mg/kg, la cocontamination par lOTA tait relativement faible avec seulement une valeur de 0,11
g/kg. Ces rsultats suggrent que la co-occurrence de lOTA et la FB1 dans les
chantillons de mas analyss est due probablement deux processus de contamination
spars par les moisissures toxinognes dAspergillus et de Fusarium.
Dans cette tude, nous avons trouv galement qu'un seul chantillon de mas
(n7) a t contamin par les trois mycotoxines avec des valeurs basses pour la ZEN
(13,5 g/kg) et OTA (0,05 g/kg) et une valeur relativement leve en FB1 (1,51
mg/kg). Notre tude constitue le premier rapport sur la co-occurrence de l'OTA et les
toxines de Fusarium dans les crales au Maroc.
FB1
(mg/kg)
ZEN
(g/kg)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0.1
7.22
0.28
0.54
0.05
0.27
0.05
0.11
1.15
1.00
2.61
5.96
0.28
0.01
1.51
0.60
0.70
5.50
16.50
11.8
13.5
-
Moyenne (g/kg)
Echantillons Positifs
(%)
0.43
40
0.96
50
2.09
15
Echantillons de
mas
(n=20)
Bl (n=20)
OTA (g/kg)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Moyenne (g/kg)
chantillons positifs (%)
0,10
0,18
0,13
0,20
0,05
0,12
0,05
0,12
0,80
0,05
0,04
0,09
55
OTA (g/kg)
1
2
3
4
5
6
7
8
0,86
0,16
0,10
1,73
0,04
0,36
0,05
0,06
0,17
40
Le mas est considr parmi les cultures fragiles haut risque de contamination
par les moisissures toxinognes la diffrence des autres crales supposes plus
rsistantes la contamination par les moisissures et la production des mycotoxines
notamment lorge et le bl (Jelinek et al., 1989).
En effet, Scudamore et al. (1998), ont montr la co-occurrence de plusieurs
mycotoxines savoir la zaralnone, la toxine DON, le nivalnol, la FB1 et la FB2, la
moniliformine (toutes avec des taux levs en mg/kg) ainsi que dautres mycotoxines
avec
de
faibles
concentrations
notamment
les
trichothecnes
(15-actoxy
mg/kg. Les auteurs ont montr aussi la rduction de la FB1 par simple cuisson du pain
Balady 450 C, le taux de rduction a atteint 72,4%.
En Italie, Brera et al (2004) ont aussi tudi leffet dun processus industriel sur
le devenir de la FB1 dans le mas, les auteurs ont valu en premier le niveau de la
contamination de diffrents chantillons de mas destins lalimentation humaine et
animale par la FB1, les rsultats ont montr la contamination des chantillons de mas
analyss par des taux variables allant de 0,39 9,56 mg /kg. Dautres part, les auteurs
nont signal aucun effet du traitement thermique sur le niveau de contamination de la
farine de mas analyss.
Il est noter que lorsque deux ou plusieurs mycotoxines contaminent la fois le
mme aliment, les effets de ces toxines sur les consommateurs peuvent saccentuer vu
la possibilit de ractions entre les diffrentes substances toxiques. En effet selon une
recherche rcente, Creppy et al (2004) ont investigu les diffrents effets combins
(antagonisme ou synergie) rsultant de la contamination dun aliment par plus dune
mycotoxine. Les auteurs ont conclu lexistence dun effet de synergie entre lOTA et
la FB1 dans lapparition dune toxicit aigu in vivo.
Au Maroc, les crales occupent une importance primordiale, sociale, conomique
et nutritionnelle pour la population. Elles contribuent environ 12% du produit brut
gnr par l'agriculture. Les marocains dpensent environ 25 % de leur revenu sur ces
produits et on estime que le pays consomme en moyenne 6 millions de tonnes chaque
anne.
En 2010, la population marocaine aura besoin de 8,5 millions de tonnes de
crales pour satisfaire le march intrieur (INRA, 2002). A cause des priodes de
scheresse qua connu le Maroc ces deux dernires dcennies, la production cralire
a enregistr une diminution de 25 85 %, ce qui entrane un approvisionnement
dautres pays trangers pour satisfaire le march national.
aflatoxines dans les pices analyses avec des pourcentages variables : 94,62 %,
53,5%, 53,3%, et 17,82 % respectivement des chantillons du piment, du Gingembre,
du poivre, et du Cumin.
-
dans le
AFB1
AF (g/Kg)
AFB2
AFG1
AFG2
AFT*
1- Piment (n=14)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
3,90
3,55
1,50
2,00
2,80
4,00
1,60
1,40
3,00
4,70
5,40
0,50
3,45
2,55
0,20
0,14
0,10
0,08
0,20
0,18
0,10
0,12
0,18
0,17
0,18
0,12
0,10
1,70
2,15
0,54
0,70
2,20
2,30
1,22
0,50
4,00
3,40
4,00
0,80
2,70
4,00
0,05
0,10
0,03
0,02
0,11
0,12
0,03
0,05
0,07
0,10
0,04
0,11
5,85
5,94
2,17
2,80
5,31
6,60
2,95
2,02
7,23
8,34
9,68
1,30
6,31
6,76
100
92,8
100
85,7
94,6
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
2,50
0,60
0,05
0,18
0,03
3,50
0,03
0,15
0,06
0,16
0,20
0,05
0,30
0,06
0,40
0,02
0,02
0,05
0,01
2,70
0,80
0,02
0,10
4,80
0,12
0,04
-
0,20
0,06
0,40
0,01
-
5,70
1,52
0,07
0,28
0,03
9,10
0,03
0,30
0,06
0,24
0,25
0,06
85,7
50
50
28,5
53,5
2- Gingembre (n=12)
* AF : Aflatoxines totales
AFB1
AF (g/Kg)
AFB2
AFG1
AFG2
AFT *
1- poivre (n=15)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
0,06
0,30
0,04
0,04
0,03
0,04
0,13
-
0,01
0,03
0,01
-
0,05
0,15
0,02
0,06
0,03
0,05
0,10
0,20
0,02
0,05
0,12
0,05
0,40
0,07
0,06
0,14
0,06
0,12
0,24
0,10
0,08
0,13
0,17
0,33
0,55
0,09
0,17
0,17
0,11
0,26
0,44
0,15
0,13
0,04
0,13
0,25
46,6
20
73,3
73,3
53,3
0,07
0,08
0,03
0,01
0,02
0,03
0,01
0,01
0,05
-
0,05
-
0,07
0,18
0,03
0,01
0,02
0,03
0,01
0,01
57,1
7,1
7.1
17,8
2- Cumin (n=14)
1
2
3
4
5
6
7
8
chantillons positifs (%)
* AFT : Aflatoxines totales
Actuellement, seuls quelques pays ont tabli des normes rglementaires fixant
les niveaux maxima concernant les aflatoxines dans les pices. En Italie, la valeur
maximale autorise dans les pices est tablie 40 g/kg pour les aflatoxines totales et
20 g/kg pour l'AFB1. En Uruguay, la limite maximale d'aflatoxines tolrable dans les
pices est de l'ordre de 20 g/kg. Alors qu'en Turquie, la limite recommande d'AFB1
dans les pices est de l'ordre de 5 g/kg (Martins et al., 2001).
Dans la prsente tude que nous avons mene, l'incidence des aflatoxines dans
les chantillons de piment et de gingembre tait leve en comparaison avec les
chantillons de poivre et de cumin.
La recherche des aflatoxines dans plusieurs chantillons de poivre et de cumin
s'est rvle ngative ou a permis de dtecter des quantits faibles. Nos rsultats
concordent avec ceux rapports par Bartine et Tantaoui-Elaraki (1997) qui ont trouv
que la croissance des souches de moisissures toxinognes d'A. flavus tait trs faible
sur le curcumine, le poivre blanc et le poivre noir. Ces mmes auteurs ont signal aussi
que les aflatoxines n'ont pas t dtectes sur le poivre blanc et noir. Par ailleurs, des
quantits trs faibles d'aflatoxines ont t dtectes dans le curcumine aprs 10 jours
de croissance des souches toxinognes d'A. flavus 25C.
En gnral, certaines pices l'tat naturel constituent un milieu non favorable
pour la croissance des moisissures et la production de mycotoxines. Selon Juglal et al
(2002),
II- Dtermination de l'OTA dans les olives noires et les fruits secs
a- Olives noires
En ce qui concerne les chantillons d'olives tudies, les rsultats de l'analyse des
chantillons sont regroups dans le tableau 14. La concentration de l'OTA varie
considrablement d'un chantillon l'autre et se situe entre 0,62 to 4,8 g/kg avec une
moyenne de l'ordre de 1,43 g/kg. L'OTA a t dtecte dans 9 chantillons d'olives
noires ce qui correspond un pourcentage de contamination total de l'ordre de 36 %.
Dans tous les autres chantillons, l'OTA a t au dessous de la limite de dtection de
l'appareil (0,01g/kg). En comparaison avec les donnes dans d'autres pays voisins,
Maaroufi et al. (1995) ont rapport une contamination des olives en Tunisie par l'OTA
atteignant une concentration trs leve de l'ordre 46830 g/kg (l'quivalent de 46,8
ppm).
Au Maroc, la production des olives atteint 6,9 % de la production mondiale.
Jusqu' nos jours les agriculteurs marocains utilisent encore des mthodes
traditionnelles pour rcolter le fruit de l'olivier. La priode de stockage du fruit dure
assez longtemps des tempratures ambiantes (20-25C), ce qui engendre des pertes
conomiques normes rsultant de la dgradation de la qualit des olives fermentes.
Les olives noires de table sont prpares par un ancien processus qui consiste en un
salage et un schage. Les olives noires rcoltes sont dposes dans des sacs. Le salage
est effectu au fur et mesure du remplissage des sacs par les olives par l'ajout du sel
solide en surface. Les sacs seront dposs l'un sur l'autre, puis un matriel lourd
(pierre) est dpos la surface des sacs. Le liquide noir amer est vacu l'extrieur
des sacs par effet du poids et du salage.
Les micro-organismes impliqus dans les altrations postrcolte des fruits avant le
processus de fermentation ont t tudis par plusieurs auteurs. L'tude
microbiologique du fruit aprs rcolte a montr une charge microbienne faible
l'exception des levures et des moisissures (Asehraou et al., 1992). La microflore
14
C a
montr que cet acide amin est un prcurseur dans la biosynthse des molcules
d'ochratoxines (Harris et Mantle, 2001).
En comparaison avec dautres recherches sur la prvalence des mycotoxines dans
les fruits secs en Egypte, Zohri et Abdel-Gawad (1993) ont montr la contamination de
fruits analyss par les moisissures toxinognes appartenant aux genres Penicillium,
Aspergillus, Cladosporium, Alternaria et Pleospora. Les auteurs ont aussi montr la
contamination des chantillons dabricots (50-110 g/kg) et de figues (60-120 g/kg)
par lOTA, cependant les autres mycotoxines recherches (aflatoxines, citrinine,
patuline, strigmatocystine, diactoxyscirpnol, toxine T2 et zaralnone) nont pas t
dtectes.
Daprs Abarca et al (2003), les moisissures responsables de la production de
lOTA sur les fruits secs appartiennent essentiellement aux Aspergilli noirs comme A.
niger et A. carbonarius. Les souches de cette dernire espce ont fort pouvoir de
production de lOTA sur les raisins secs prlevs du march espagnol que les souches
dA. niger isoles.
En Grce, Stefanaki et al. (2003) ont analys lOTA dans les fruits secs de la vigne
servant pour la production du vin local, les rsultats ont montr une contamination
variable des deux varits (currants et sultanas) avec des concentrations moyennes
respectives de lOTA de lordre de 1,3 et 0,6 g/kg.
Selon Drusch et Ragab (2003), quoique les mycotoxines sont des contaminants
naturels des aliments, elles se trouvent avec de faibles frquences dans les fruits. Il a
t dmontr que la prsence des moisissures sur les fruits nest pas automatiquement
associe avec la contamination par les mycotoxines.
OTA (g/kg)
0,85
2,5
0,73
0,67
4,8
1,24
0,79
0,75
0,62
Moyenne
1,43
Prunes:
0,25
0,04
0,03
0,03
0,02
0,02
0,07
0,04
0,02
0,03
0,08
0,05
0,1
0,3
0,03
10
0,06
Moyenne
0.096
0,035
Les normes rglementaires europennes concernant l'OTA dans les fruits secs ont
t fixes 10 g/kg (Abarca et al, 2003). Tous les chantillons de fruits secs analyss
dans cette tude prsentent des concentrations de l'OTA infrieures 0,3 ppb et sont
de ce fait au dessous des limites fixes par les pays de l'Union Europenne. Nos
rsultats concordent parfaitement avec ceux de Filali et al. (2001) qui ont montr que
les jus de fruits et les boissons analyss originaires du Maroc sont peu contamins par
l' OTA la diffrence de certains pays du Maghreb Arabe notamment comme en
Tunisie o la contamination de certains aliments de base par l'OTA a atteint des
niveaux critiques en relation probablement avec les problmes de nphropathies.
Conclusion
Cette premire partie de notre travail a montr la contamination de quelques
denres alimentaires commercialises au Maroc (crales, fruits secs et pices) par les
mycotoxines en particulier par les aflatoxines, lOTA, la ZEN et la FB1. Les niveaux
de la contamination (dans le cas du mas) ont dpass les limites rglmentaires fixes
lchelle internationale.
Lconomie marocaine dpend en grande partie de lagriculture et, notamment,
du dveloppement des exportations des produits agroalimentaires vers les pays de
lUnion europenne. Le renforcement des normes nationales et internationales en
matire de qualit des produits agroalimentaires, la vigilance et lexigence de plus en
plus accrue du consommateur marocain et tranger en matire de qualit de ces
produits, la concurrence internationale qui se fait de plus en plus rude (laccord du
GATT et les accords de libre change de lOMC) ainsi que et les accords bilatraux de
cration de zones de libre change unissant le Maroc avec plusieurs pays en particulier
les Etats-Unis, font que le Maroc doit accorder un intrt grandissant la conformit
de ces produits aux standards internationaux de salubrit. Pour se faire, il est impratif
damliorer le systme de surveillance et de contrle qui permettra aux produits
marocains de rester comptitifs sur le march international.
pH
L1
3,71
85
L2
3,02
70
L3
3,25
130
L4
3,02
20
Ces rsultats montrent que les ferments traditionnels marocains que nous avons
tudis ont un caractre acide. Les niveaux dacidit atteints peuvent tre expliqus par
lexistence dacides organiques tels lacide lactique ou lacide actique dans le milieu
produits par les microorganismes responsables de la fermentation de la pte. Ces deux
acides rsultent de la dgradation directe des sucres de la farine et assurent un got
apprci tout en jouant un rle dans la conservation naturelle de la pte obtenue. Le pH
acide joue galement un rle dans lextensibilit de la pte et augmente lactivit des
phytases libres par les bactries lactiques au cours de la fermentation ce qui entrane
une augmentation de la disponibilit des minraux dans le pain.
Ce type de pain acide qui se produit encore au Maroc en milieu rural, mais qui
est malheureusement absent en milieu urbain, est prfr pour ses caractristiques
organoleptiques notamment son got acide et son arme caractristique. Selon Collar
et al. (1992), Les bactries lactiques montrent au cours de la fermentation panaire une
grande affinit aux acides amins qui sont rapidement mtaboliss galement par les
levures pour produire les substances aromatiques.
2-Pouvoir fermentaire
Le pouvoir fermentaire est directement li la production de gaz par les
microorganismes constituant les ferments en question au cours de la fermentation
panaire. Cette production de gaz est attribue en gnral aux levures mais aussi aux
bactries lactiques mtabolisme htrofermentaire.
Les rsultats que nous avons trouvs concordent avec ceux rapports par les
chercheurs qui ont dj investigu la fermentation traditionnelle marocaine. En
effet, les travaux de Tahri-Hassani (1996) ont montr que la charge moyenne des
levures dans les ferments tait de lordre de 14.107 ufc/g.
Les travaux effectus par Faid et al. (1994) sur les ferments prpars au
laboratoire ont montr que la numration les levures montre une variabilit dun
chantillon un autre. Le ferment prpar base du leben traditionnel marocain
contient une population leve en levures (environ 107 ufc/g la 4me gnration) en
comparaison aux autres ferments prpars base de produits vgtaux tels le jus de
citron ou lail.
Les levures identifies par Tahri-Hassani (1996) appartiennent 5 espces
dont deux majoritaires S. cerevisiae (35%) et Candida milleri (30%) et trois
minoritaires savoir C. tropicalis (19%), Pichia saitoi (10%) et Debaryomuyces
hansenii (6%)
En comparaison avec les travaux des chercheurs trangers sur la panification
traditionnelle, Sugihara (1985) a rapport que la population des levures dans le
levain de San Francisco atteint 2.5.107 ufc/g.
La charge importante des levures dans les ferments traditionnels tmoigne de
leur rle dans la leve de la pte au cours de la fermentation. En effet, laspect
spongieux du pain est attribu aux levures. Leur contribution la production des
caractristiques organoleptiques est dune grande importance.
b-Dnombrement des bactries lactiques (tableau 17)
Pour les cocci, le ferment L2 a montr une charge minimale de lordre de
24.107 ufc/g, alors que le ferment L1 a montr la charge maximale de 77. 107 ufc/g.
Pour les bacilles, le ferment L3 a montr une charge minimale de 45. 107 ufc/g, la
charge maximale est de lordre de 58. 107 ufc/g. La charge moyenne des ferments
analyss est respectivement de lordre de 39,5. 107 ufc/g pour les cocci et 51,7.107
ufc/g pour les lactobacilles.
Les rsultats rapports par Faid et al. (1994) concernant la numration des
bactries lactiques dans les ferments produits au laboratoire ont montr que le taux
de ces microorganismes tait infrieur celui des levures au cours de la premire
gnration. Cependant ils commencent dominer la flore totale ds la 4me
gnration except dans le ferment produit laide du leben traditionnel o les
levures sont dominantes pendant les quatre gnrations.
Pour les levains du pain de San Francisco, Sugihara (1985) a rapport des
charges des bactries lactiques relativement leves comprises entre 0,5 et 1,5 109
ufc/g. Dans les levains pour pain au seigle, Spicher (1983) a rapport des valeurs
comprises entre 2.107 et 2.108 ufc/g.
Ces rsultats montrent que la charge leve des ferments analyss en
bactries lactiques tmoigne du rle jou par cette microflore dans le processus de
fermentation panaire traditionnelle, et justifie en particulier les valeurs bas du pH
que nous avons trouvs dans les diffrents chantillons analyss.
Levures
Bacilles
Cocci
L1
15
480
770
L2
150
580
240
L3
230
450
260
L4
8,5
560
310
Contrle
0,4
0,01
0,02
- L. brevis
Les souches appartenant cette espce sont de mtabolisme htrofermentaire,
elles fermentent le maltose, le xylose, le galactose, larabinose et dsamine larginine.
Cette espce reprsentait 9% des isolats totaux tudis par Tahri-Hassani
(1996). Faid et al. (1994) ont isol cette espce avec des taux variables respectivement
de lordre de 15, 10 et 9 % dans les ferments traditionnels produits au laboratoire
partir du citron, "leben" et lail. Un procd de fermentation traditionnelle mixte du
pain a t optimis en Italie avec lassociation de S. cerevisiae et L. brevis (Meignen,
2001).
Tableau 18: Pourcentage des genres de bactries lactiques dans les ferments
panaires traditionnels analyss
Genre
Pourcentage
Leuconostoc
33
Lactobacillus (homofermentaire)
11
Lactobacillus (htrofermentaire)
38
Pediococcus
18
Nombre
Pourcentage
L. plantarum
L. brevis
10
L. casei
L. rhamnosus
16
L. lactis
12
Ln. mesenteroides
18
Ln. dextranicum
14
P. acidilactici
18
Total
50
100
- L. casei
Elle se prsente sous forme de btonnets courts gnralement en paires. Les
souches de cette espce utilisent le matlose, le galactose, le lactose et le cellibiose.
Cependant aucune souche nutilise le raffinose, larabinose, le xylose et le melibiose.
Cette espce reprsentait 8,7% des souches isoles par Faid et al. (1994) partir
d'un ferment produit laide dune farine fermente spontanment. Elle a t aussi
dcrite auparavant par Spicher (1983) comme espce naturelle de la fermentation du
pain au seigle en Allemagne.
- L. lactis
Cette espce est homofermentaire, son mtabolisme se caractrise par la
fermentation du maltose et de larabinose cependant elle nest pas capable de
dsaminer larginine.
Cette espce a t isole par Faid et al. (1994) dans le ferment produit par une
farine fermente spontanment un pourcentage de 8,7%. Cette espce est frquente
naturellement dans les produits laitiers et elle est mineure chez les vgtaux.
- L. plantarum
Cette espce homofermentaire ne dsamine pas larginine, elle fermente le
maltose, le galactose, le lactose et le cellibiose.
Cette espce existait dans tous les ferments tudis par Faid et al. (1994) des
proportions leves de lordre respectivement de 25 %, 13,3% et 31,8 % dans les
ferments base du citron, du leben traditionnel et de lail. Cette espce est dcrite par
plusieurs auteurs comme la plus active dans la fermentation panaire traditionnelle
(Lonner et Preve-Akesson, 1988).
- L. rhamnosus
Cette espce est particulirement caractrise par la fermentation du rhamnose,
elle a t considre pour longtemps comme une sous espce de L. casei. Vu la faible
proportion de cette espce dans les diffrents levains tudis, elle est difficile de lui
attribuer un rle technologique dans la fermentation panaire traditionnelle. Cependant
- Ln. mesenteroides
Cette espce se prsente sous forme de cocci en diplocoques ou en chanettes
mtabolisme htrofermentaire. Les souches de cette espce fermentent larabinose, le
maltose, le saccharose, le galactose, le ribose et le trhalose. Cette espce a t isole
par Azar et al. (1977) du levain Iranien de Shangak. Cette espce a t isole par Faid
et al. (1994) des levains panaires traditionnels marocains.
- Ln. dextranicum
Cette espce produit du CO2 et ne dsamine pas larginine, elle fermente le
maltose le galactose, le cellibiose, le mlizitose et ne croit pas 45C. Elle a t isole
par plusieurs auteurs notamment par Faid et al. (1994) et Tahri-Hassani (1996). Les
Leuconostocs sont moins acidifiantes que les lactobacilles et les pediocoques et jouent
un rle probablement dans les premires phases de la fermentation.
- P. acidilactici
Cette espce supporte des valeurs dacidit leves. De ce fait, elle domine les
phases finales des fermentations vgtales (olives, pain, ensilages). Cette espce ne
produit pas de CO2, ne dsamine pas larginine, elle fermente le maltose, le xylose, le
raffinose, le mellibiose larabinose et le cellibiose et elle croit 45 C. Elle a t isole
par Faid et al. (1994) des levains prpars au laboratoire et par Tahri-Hassani (1996)
des levains traditionnels marocains.
lacide lactique ne joue aucun rle dans le processus dlimination des aflatoxines au
cours de la fermentation panaire traditionnelle.
Plusieurs auteurs ont tudi leffet de lacide lactique sur les aflatoxines.
Cependant des rsultats variables ont t obtenus. Ciegler et al. (1966 b), en ajoutant
de lacide lactique une concentration de 10 % (v/p) pour dcontaminer les graines du
mas, ont constat une rduction considrable de laflatoxine. Cependant, CoallierAscah et Idziak (1985) nont par ailleurs constat aucun effet de lacide lactique ni sur
la biosynthse ni sur la biodgradation des aflatoxines.
Lessai non inocul par les ferments a permis de rduire faiblement le taux des
toxines. LAFG1et lAFB1 ont t rduites respectivement avec des pourcentages de
lordre de 1,6% et 1,16%. Ceci suggre que la rduction des taux daflatoxines aprs
fermentation est due essentiellement leffet des ferments panaires traditionnels.
Daprs plusieurs tudes antrieures (Faid et al., 1993, Faid et al., 1994 et TahriHassani, 1996), les ferments panaires traditionnels marocains sont une association
symbiotique entre levures et bactries lactiques. Jusqu' nos jours, aucune tude na
montr la capacit des levures en gnral et S. cerevisiae en particulier rduire les
aflatoxines. Par ailleurs, plusieurs tudes prliminaires ont montr la capacit des
bactries lactiques complexer ou dgrader les molcules de laflatoxine.
Ferment 1
Ferment 2
Ferment 3
Ferment 4
contrle
essai S. cerevisiae
100
90
80
% de rduction
70
60
50
40
30
20
10
0
AFB1
AFG1
Aflatoxines
Culture
L. brevis Lb1 + A. parasiticus NRRL 2999
L. casei Lc12 + A. parasiticus NRRL 2999
L. lactis Lb5 + A. parasiticus NRRL 2999
L. lactis Lb8 + A. parasiticus NRRL 2999
L. plantarum Lb7 + A. parasiticus NRRL 2999
L. plantarum Lb9 + A. parasiticus NRRL 2999
L. rhamnosus Lb21 + A. parasiticus NRRL 2999
L. rhamnosus Lb31 + A. parasiticus NRRL 2999
L. rhamnosus Lb50 + A. parasiticus NRRL 2999
Ln. mesenteroides Ln13 + A. parasiticus NRRL 2999
P. acidilactici P55 + A. parasiticus NRRL 2999
Bactries lactiques
en ufc/ml x 107
pH
7,8
25,8
5,8
10,8
3,2
9,7
4,6
7,4
9,8
6,25
15,8
3,6
3,7
4,5
3,4
4,2
4,3
3,7
3,9
4,1
4,5
3,6
Culture
% de rduction
3,41
1,24
80,5
60,24
5,5
5,45
60,2
69,25
58
3,21
2,15
et A. parasiticus
Bullerman (1995 a,b) ont confirm laction inhibitrice des espces des bactries
lactiques sur la germination des spores dA. flavus subsp. parasiticus et sur la
production daflatoxines.
Batish et al. (1989) ont test les activits antifongiques de 19 souches lactiques
contre A. parasiticus, A. fumigatus, Rhizopus stolonifer, et Rhizopus sp. Ils ont conclu
que Lc. lactis subsp diacetylactis DRC1 et S. thermophilus 489 avaient une action
inhibitrice importante de toutes les cultures fongiques. Dautres part, A. fumigatus tait
lespce la plus sensible.
Gizzarelli et al. (1993), en tudiant leffet des bactries lactiques sur la production
des aflatoxines par A. parasiticus, ont montr la prsence dune interaction
comptitive entre les deux groupes de micro-organismes dont le mode dpend des
conditions exprimentales et de la nature des micro-organismes comptitifs. Les
auteurs ont montr que les souches de Lc. lactis en culture mixte avec A. parasiticus
montrent une rduction de la production des aflatoxines B1 et G1 respectivement de
lordre de 88 % et 100 %, alors que les souches de Lc. cremoris montrent une
rduction de la production des AFB1 et AFG1 respectivement de lordre de 44% et
22%.
Cependant, selon les mmes auteurs, les souches de L. casei ont montr une
stimulation de la production par A. parasiticus des aflatoxines B1 et G1 de lordre de
527 % et 140% respectivement. Par ailleurs, les souches de L. fermentum et L. casei
nont pas prsent une interaction rgulire vis vis de la croissance dA. parasiticus
et la production des AFB1 et AFG1.
Dans le but de connatre le mcanisme daction par lequel les bactries lactiques
agissent sur les moisissures toxinognes en inhibant totalement ou en rduisant la
production des aflatoxines, plusieurs investigations ont t menes auparavant.
Certains auteurs pensent que leffet inhibiteur est probablement d la diminution du
pH, laccumulation de lacide lactique ou la production de substances actives.
Coallier-Ascah et Idziak (1985) ont suggr quune substance synthtise pendant
la phase exponentielle par Lc. lactis est responsable de linhibition de la production
daflatoxine par A . flavus. Une purification partielle de la dite substance indiquait
quil sagirait probablement dun compos thermostable de faible poids molculaire.
En outre Gourama et Bullerman (1997) ont montr que L. casai pseudoplantarum
371 inhibe totalement la biosynthse de lAFB1 et l AFG1 par A. flavus subsp.
parasiticus NRRL 2999 dans un milieu liquide et que cette activit inhibitrice disparat
compltement aprs traitement thermique 100C pendant 10 min ou sous laction
dune enzyme protolytique.
Dans une autre tude, Batish et al. (1991) ont dmontr que la culture de S. lactis
subsp. lactis 30C pendant 48 72 h produit le maximum dune substance inhibitrice
(polypeptide) contre A. fumigatus.
Karunaratne et al. (1990) ont tudi linhibition de la croissance des moisissures
et la production daflatoxine par Lactobacillus sp. Ces auteurs ont utilis trois espces
(L. acidophilus, L. bulgaricus et L. plantarum) et ont conclu une inhibition de la
croissance de toutes les moisissures utilises. Selon ces auteurs, cette inhibition est due
probablement laction du pH et la croissance des espces comptitives.
Lactobacillus brevis Lb 1
4.46 1.0c
22.28 1.3a,b
16.81 0.2d
20.26 0.4a,b
2.14 0.2c
5.21 0.7c
Lactobacillus rhamnosus Lb 44
25.27 1.5a,b
Lactobacillus rhamnosus Lb 21
23.01 1.3a,b
Lactobacillus rhamnosus Lb 31
31.12 0.9f
30.77 0.4f
Lactobacillus rhamnosus Lb 50
44.89 2.1e
Leuconostoc mesenteroides Ln 13
2.15 0.5c
Pediococcus acidilactici P5
1.80 0.1c
Les souches L. casei Lc12, L. lactis Lb5 et L. lactis Lb8 rduisent d'AFB1 des
taux moyens (16.81 20.26 %). Cependant d'autres souches utilises dans ce travail
comme les souches L. plantarum, P. acidilactici P55, Ln. mesenteroides Ln33 et L.
brevis Lb1 rduisent de faibles taux d'AFB1 (1.8 5.21%). Haskard et al. (2001) ont
rapport que des cellules viables de L. lactis subsp lactis et L. casei Shirota (YIT 901)
rduisent respectivement 59 % et 21.8% d'AFB1.
Selon Megalla et Mohran (1984), leffet de Lc. lactis ATTCC 11454 sur le devenir
de laflatoxine B1 dans un lait ferment, a montr la transformation de cette toxine
tudie en deux mtabolites, laflatoxicol (R0) moins toxique que laflatoxine B1 et
laflatoxine B2a qui est un produit non toxique.
b- Effet des facteurs externes
Dans le but d'tudier l'effet des facteurs externes sur la rduction des aflatoxines,
nous avons slectionn certaines souches qui ont donn une rduction notable de
l'AFB1 suprieure ou gale 10%. Les souches slectionnes appartiennent trois
espces savoir L. lactis, L. casei et L. rhamnosus il s'agit notamment de L. casei
Lc12, L. lactis Lb5, L. lactis Lb8, L. rhamnosus Lb21, L. rhamnosus Lb31, L.
rhamnosus Lb21, L. rhamnosus Lb103 et L. rhamnosus Lb50. Les souches
slectionnes ont t cultives en prsence de l'AFB1 mais des valeurs de
temprature et de pH variables.
b-1 Effet du pH
L'effet du pH sur la rduction de l'AFB1 a t reprsent dans la figure 11. Les
rsultats ont montr que les taux de rduction maximale de l'AFB1 enregistrs une
valeur de pH 5,5 sont nettement suprieures aux taux trouvs aux valeurs de pH 3 et
pH 4,5 pour toutes les souches de bactries lactiques tudies.
Chez les souches de l'espce L. rhamnosus, les pourcentages de rduction de
l'AFB1 pH 5,5 pour les souches L. rhamnosus Lb21, L. rhamnosus Lb31, L.
Figure 10: Effet de la temprature sur la rduction de l'AFB1 par les bactries
lactiques. Les barres d'erreurs reprsentent les dviations du standard.
50
45
40
35
30
15C
25
25C
20
37C
%
d
15
10
5
0
1
Souche
Figure 11: Effet du pH sur la rduction de l'AFB1 par les bactries lactiques. Les
barres d'erreurs reprsentent les dviations du standard.
50
% de r duction de l'AFB 1
45
40
35
30
pH5,5
25
pH4,5
20
pH3
15
10
5
0
1
Souche
Pierides et al. (2000) ont test l'interaction de six souches de bactries lactiques
(L. acidophilus LA1, L. gasseri ATCC 33323, L. rhamnosus GG, L. lactis
spp.cremoris ARH74, L.rhamnosus LC 705 et L. rhamnosus 1/3 ) avec les molcules
de lAFM1 dans le lait reconstitu. Les souches tudies ont t dabord testes dans
un tampon phosphate (PBS), ensuite dans le lait contamin. Les auteurs ont conclu que
la dgradation des aflatoxines est plus nette chez L. rhamnosus GG et L. rhamnosus Lc
705 que chez les autres souches utilises. Dautre part, llimination de lAFB1 tait
encore plus grande que celle de lAFM1. Ceci est probablement d au fait que lAFM1
est plus polaire que l'AFB1 et sa solubilit est grande dans les solutions aqueuses.
Kankaanp et al. (2000), en tudiant l'effet des deux souches probiotiques
L.rhamnosus Lc 705 et L. rhamnosus GG sur l'AFB1, ont suggr que les molcules
daflatoxine se fixent sur la paroi cellulaire des bactries lactiques. Haskard et al.
(2001) ont montr que la fixation de lAFB1 la surface de la paroi bactrienne est
rapide et rversible. LAFB1 peut tre libre aprs des lavages aqueux rpts de la
paroi cellulaire.
Ce phnomne de complexation et de libration des molcules d'aflatoxines par
les composants de la paroi cellulaire a t mis en vidence galement chez les
bifidobactries et les bactries lactiques par Peltonen et al. (2001). En effet, ces
auteurs ont tudi linteraction de 20 souches de bifidobactries et de bactries
lactiques (12 Lactobacillus, 5 Bifidobacterium et 3 Lactococcus) avec lAFB1. Aprs
incubation 37C pendant 24 h, les auteurs ont remarqu que 5,6 59,7 % du taux
dAFB1 est complex par les souches testes. Deux souches de L. amylovorus et une
souche de L. rhamnosus ont t capables de complexer plus de 50% dAFB1.
Quoique le mcanisme de rduction ou de dgradation de l'AFB1 par les
bactries lactiques soit encore mconnu, il a t suggr qu'au dbut de leur interaction
les molcules d'aflatoxines se complexent aux composs de la paroi cellulaire
bactrienne. Haskard et al. (2001) ont suggr que la fixation de l'AFB1 la paroi se
fait par des liaisons faibles non covalentes telle une complexation avec les sites
hydrophobes la surface de la paroi bactrienne.
Dans des travaux rcents, les interactions entre d'autres mycotoxines et des
souches lactiques ont t tudies par El-nezami et al. (2002). Les auteurs ont montr
que les souches de L. rhamnosus GG et L. rhamnosus Lc-705 sont capables de rduire
la ZEN et son driv l'-zaralenol aprs une raction instantane avec les bactries.
Turbic et al. (2002) ont montr que les souches L. rhamnosus rduisent l'AFB1
(77-99%) et l'OTA (36-76 %) avec des pourcentages variables. Paralllement, de
faibles quantits (9-28%) d'autres substances aromatiques comme la cafine, la
vitamine B12 et l'acide folique ont t rduites par les mmes souches. Les auteurs ont
suggr qu'un processus de dtoxification est probablement dclench par les souches
de L. rhamnosus quand elles entrent en contact des molcules des mycotoxines.
Les ractions mises en jeu au cours de la complxation (adsorption) et la
libration (dsorption) de l'AFB1 la surface des bactries ont t investigues par
Lee et al (2003). Les cellules viables ainsi que les cellules tues par traitement
thermique
de
Lactobacillus
rhamnosus
GG,
L.
rhamnosus
LC-705,
et
enzymatiques. Les auteurs ont not une diminution significative du taux d'adsorption
de la ZEN aprs prtraitement des cellules viables et les cellules tues par le mpriodate suggrant que la ZEN se fixe sur les composs carbohydrats de la paroi
cellulaire. Cependant le prtraitement avec la pronase E n'a montr aucun effet sur la
capacit d'adsorption de la ZEN par les cellules viables.
Dans une autre tude similaire, Lahtinen et al (2004) ont investigu les
ractions impliques dans l'adsorption de l'AFB1 la surface de Lactobacillus
rhamnosus GG. Dans le but de connatre exactement les composs qui peuvent tre
mis en jeu au cours de la complxation, les auteurs ont montr que l' AFB(1) se
complexe au peptidoglycanes de la paroi cellulaire de la bactrie tudie.
Conclusion
Cette tude dmontre la capacit de certaines souches de bactries lactiques
isoles des ferments panaires traditionnels marocains appartenant essentiellement aux
espces L. rhamnosus, L. lactis et L. casei rduire la concentration initiale de l'AFB1
dans le bouillon MRS. Les souches de L. rhamnosus rduisent les taux de l'AFB1 avec
des pourcentages levs en comparaison avec les autres souches Lactobacillus sp.
utilises dans ce travail. Les espces L. lactis et L. rhamnosus isoles des ferments
panaires traditionnels marocains ont montr galement un pouvoir de rduction de la
production de lAFB1 par A. parasiticus NRRL 2999.
Les bactries lactiques sont largement utilises au Maroc dans la fabrication
artisanale et la conservation de produits alimentaires comme le pain traditionnel et les
produits laitiers artisanaux (leben). De plus, divers procds biotechnologiques ont t
labors avec succs en utilisant des souches de bactries lactiques pour la
fermentation et la conservation de certains aliments comme les olives, le citron ou bien
pour la stabilisation des diffrents dchets manant de l'industrie agroalimentaire (Faid
et al, 1995,1997 ; Kherrati et al, 1998) pour produire un ingrdient riche en protines
pour l'alimentation animale.
le pH a montr que les bactries lactiques tudies rduisent l'AFB1 probablement par
voie enzymatique.
En perspectives il serait intressant d'largir la gamme des aliments analyser
(produits base de mas, produits destins aux enfants et aux bbs, fromages, lait en
poudre, lait pasteuris, caf, boissons) et de rechercher d'autres toxines (DON, T-2,
et HT-2) pour ractualiser les connaissances sur la contamination des aliments
marocains par les mycotoxines et dterminer la dose de prise journalire (daily intake)
pour chaque mycotoxine. Il est galement intressant d'tudier le degr d'exposition de
la population marocaine aux mycotoxines en analysant ces toxines dans les produits
biologiques en particulier dans le srum et dans le lait maternel d'une population cible.
Ltablissement dun bilan de connaissances sur la contamination des produits
agricoles marocains par les mycotoxines et le renforcement du contrle de ces produits
au niveau national, nous permettraient de rassembler des donnes pour linformation et
la sensibilisation des autorits nationales, ainsi que les producteurs (agriculteurs,
industriels) et les organisations civiles de dfense des droits des consommateurs.
Les rsultats obtenus constitueront un ensemble de donnes qui serviront dans le
lancement dun projet national pour la rglementation des mycotoxines dans les
aliments et la protection du consommateur marocain et tranger dventuels effets
toxiques chroniques associs aux mycotoxines.
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- Zohri
ANNEXES
1- Milieux de Culture
Milieu MRS (pH 6,5), Striliser 121 C pendant 15 minutes:
Peptone
10g
Extrait de viande
10g
Extrait de levure
5g
Glucose
20g
Tween 80
1 ml
Phosphate bipotassique
2g
Actatede sodium trihydrat
5g
Citrate d'ammonium
2g
Sulfate de magnsium
0,2g
Sulfate de manganse
0,05
Agar-agar
15g
Glose PDA (pH 4,5), Striliser 121 C pendant 15 minutes:
Infusion de pomme de terre
100g
Dextrose
20g
Agar-agar
15g
Eau distille
1l
Milieu Hypersaccharos (pH 6,8), Striliser 121 C pendant 15 minutes:
Extrait de viande
10g
Extrait de levure
3g
Bactocasitone
2,5g
Saccharose
150g
Phosphate dipotassique
2g
NaCl
1g
Sulphate de magnsium
0.2g
AgarAgar
15g
Eau distille
1l
Milieu de base des sucres (pH 6), Striliser 121 C pendant 15 minutes:
Peptone
10g
Extarit de levure
5g
Tween 80
1ml
Citrate d'ammonium
2g
Actate de Sodium
5g
Sulfate de magnsium
0,1g
Sufate de manganse
0.05g
Hydrognophosphate bissodique
2g
Pourpre de bromocrsol
0.15g
Eau distille
1l
2- Ractifs et solutions
Ractif de nessler
Solution A
Iodure mercurique
Iodure de potassium
Eau distille
Solution B
Potasse en pastilles
Eau distille
50g
36,5g
1l
150g
1l
100
mVolts
% Mobile Phase
400
200
0
0
5
Minutes
c:\gilson\unipoint\08ott03.001\08ott03.gdt : Spettrofluorimetro : stdFB1 0.133ug/ml: Inj. Number: 11
c:\gilson\unipoint\07ott03b.001\07ott03b.gdt : Spettrofluorimetro : std FB1 0.133ng/ml: Inj. Number: 1
c:\gilson\unipoint\07ott03b.001\07ott03b.gdt : Spettrofluorimetro : std FB1 0.133ng/ml: Inj. Number: 2
10
Figure 18: Chromatogramme de la FB1 dans trois chantillons de mas M4, M5 et M20
- En bleu: Standard de la FB1 (1ppm)
- En vert: Echantillons de mas M5 (2,61 ppm)
- En rouge: Echantillons de mas M4 (5,96 ppm)
- En Jaune: Echantillons de mas M20
100
400
200
50
mVolts
% Mobile Phase
Standard de la FB1
0
0
10
Minutes
c:\gilson\unipoint\07ott03.001\07ott03.gdt : Spettrofluorimetro : M4: Inj. Number: 2
c:\gilson\unipoint\07ott03.001\07ott03.gdt : Spettrofluorimetro : M5: Inj. Number: 3
c:\gilson\unipoint\08ott03.001\08ott03.gdt : Spettrofluorimetro : stdFB1 0.133ug/ml: Inj. Number: 1
c:\gilson\unipoint\08ott03.001\08ott03.gdt : Spettrofluorimetro : M20: Inj. Number: 9
100
400
200
50
mVolts
% Mobile Phase
Pics de la FB1
0
0
5
Minutes
10
100
400
50
mVolts
% Mobile Phase
Standard de la FB1
200
0
0
5
Minutes
10
100
400
50
mVolts
% Mobile Phase
Standard de la FB1
200
0
0
5
Minutes
10