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UNIVERSITE SIDI MOHAMMED BEN ABDELLAH

FACULTE DES SCIENCES DHAR EL MAHREZ


FES
UFR DE BIOLOGIE CELLULAIRE ET MOLECULAIRE
APPLIQUEE A L'ENVIRONNEMENT ET LA SANTE

THESE DE DOCTORAT
Prsente par :

ABDELLAH ZINEDINE
Spcialit: Biologie
Option : Microbiologie

DETERMINATION DES MYCOTOXINES DANS LES ALIMENTS ET ETUDE DE


LA REDUCTION DES AFLATOXINES PAR LES BACTERIES LACTIQUES
ISOLEES DES FERMENTS PANAIRES TRADITIONNELS

Le 30 Octobre 2004 devant le jury:


Pr. MOHAMED BENLEMLIH

Facult des Sciences DEM, Fs.

Prsident

Pr. ABDESLAM ASSEHRAOU

Facult des Sciences, Oujda.

Examinateur

Pr. RAJAE BELKHOU

Ecole Suprieure de Technologie, Fs. Examinateur

Pr. MOHAMMED EL HASSOUNI

Facult des Sciences DEM, Fs

Rapporteur

Pr. MOHAMED FAID

I.A.V Hassan II, Rabat.

Rapporteur

DEDICACES

A MES PARENTS

A MA FEMME

A MES SURS ET FRERES

A TOUS MES AMIS.

REMERCIEMENTS

Au terme de ce travail je remercie:


Monsieur Mohammed EL KADIRI, Doyen de la Facult des Sciences Dhar ElMahrz de Fs, pour avoir accepter de m'inscrire au sein la Facult des Sciences Dhar
El-Mahrz pour continuer mes tudes doctorales.
Madame Rajae ELAOUAD, Directrice de l'Institut National d'Hygine, pour l'intrt
qu'elle donne la coopration internationale et la recherche scientifique au sein de
l'INH de Rabat.
Monsieur Mohamed BENLEMLIH, Professeur la facult des sciences DEM de
Fs. Quoique je dise, les mots ne sauraient exprimer ma profonde gratitude pour avoir
dirig cette thse. Ses encouragements et sa patience mont beaucoup aid surmonter
toutes les difficults. Je le remercie vivement davoir suivi et orienter ce travail.
Monsieur Mohamed FAID, Professeur, Chef du Laboratoire de Microbiologie
Alimentaire et Biotechnologie de lInstitut Agronomique et Vtrinaire Hassan II,
Rabat, pour son encadrement, sa disponibilit, ses conseils et ses encouragements.
Quoique je dise, les mots ne sauraient exprimer ma profonde gratitude pour m'avoir
encadr pendant toutes mes tudes suprieures.
Monsieur Larbi IDRISSI, Chef du Dpartement de Toxicologie de lInstitut National
dHygine de Rabat pour ses encouragements et ses remarques prcieuses. Quil
trouve ici lexpression de mes meilleures considrations.
Mr Mohammed El HASSOUNI, Professeur la Facult des Sciences DEM de Fs,
pour sa disponibilit et pour avoir accepter de juger cette thse.
Mme Rajae BELKHOU, Professeur lEcole Suprieure de Technologie de Fs pour
sa disponibilit et sa gentillesse et pour avoir accepter de juger cette thse.
Monsieur Abdeslam ASSEHRAOU, Professeur la Facult des Sciences d'Oujda,
pour sa fraternit, sa disponibilit et pour avoir accepter de juger cette thse.
Mr Abdelaziz BENJOUAD, Professeur la Facult des Sciences Rabat-Agdal, pour
sa disponibilit, ses remarques prcieuses, son aide et pour avoir corrig cette thse,
quil trouve ici lexpression de mon profond respect.

Monsieur Edmond E. CREPPY, Directeur du Laboratoire de Toxicologie et


dHygine Applique Universit Victor Segalen Bordeaux 2, France, pour son entire
collaboration et pour mavoir accueilli au sein de son laboratoire.
Madame Anne-Marie BETBEDER, Mlle Isabelle BAUDRIMONT, Mr Arnaud
COURTOIS et toute lquipe du Laboratoire de Toxicologie de l'Universit Bordeaux
2 pour leur gentillesse et leur soutien au cours de mon sjour Bordeaux.
Monsieur Paolo AURELI, Directeur du "Laboratorio Alimenti" de l"Istituto
Superiore di Sanit" (ISS) de Rome, Italie, pour son entire collaboration et pour avoir
accepter de m'accueillir au sein de son laboratoire.
Madame Marina MIRAGLIA, Directrice du Dpartement de Chimie des Crales de
lISS, Rome, Italie, pour mavoir accueilli au sein de son quipe de recherche, ses
encouragements et sa disponibilit.
Monsieur Carlo BRERA, Chercheur, Responsable de lUnit des Mycotoxines l'ISS
pour avoir la gentillesse de diriger ma formation sur les mycotoxines, son entire
collaboration, sa disponibilit et ses remarques prcieuses.
Madame Roberta ONORI Chercheur l'ISS, Carla CATANO, Francesca
DEBEGNAC, Simona ANGELINI et tout le personnel du Dpartement de Chimie
des Crales de lISS pour leur gentillesse et leur soutien au cours de mon sjour
Rome.
Monsieur Jose-Miguel SORIANO, Chercheur au Laboratoire de Toxicologie et
Bromatologie de l'Universit de Valence (Espagne) pour sa collaboration, sa
gentillesse, sa disponibilit et son amiti.
Tout mes collgues de l'Institut National d'Hygine de Rabat, en particulier le
personnel du Dpartement de Toxicologie et Hydrologie. Et mes collgues
chercheurs du Laboratoire de Microbiologie Alimentaire et Biotechnologie de lIAV
Hassan II de Rabat.

RESUME
Dans ce travail nous avons tudi la contamination des aliments commercialiss
au Maroc par les mycotoxines. Pour cela, un total de 60 chantillons de crales, 55
chantillons d'pices, 24 chantillons de fruits secs et 25 chantillons d'olives noires
ont t prlevs dans diffrents points de vente des villes de Rabat et Sal. La
dtermination des mycotoxines a t faite par HPLC. Les rsultats ont montr que
respectivement 40%, 40% et 55% des chantillons analyss de mas, de bl et dorge
sont contamins par lochratoxine A (OTA). Les chantillons de mas ont t analyss
pour la co-occurrence naturelle des toxines de Fusarium. Les pourcentages de
contamination des chantillons de mas par la fumonisine B1 (FB1) et la zaralnone
(ZEN) sont respectivement de lordre de 50 et 15 %. Les rsultats obtenus ont montr
que les taux de certaines mycotoxines notamment l'OTA et la FB1 ont dpass les
limites maximales fixes par la rglementation europenne. Dans les pices, les
rsultats ont montr que les taux des aflatoxines totales dans le piment et le gingembre
varient respectivement de 1,30 9,68 g/kg et de 0,03 9,10 g/kg. Dans les fruits
secs et les olives noires, l'analyse a montr que 66,6 % et 36% sont respectivement
contamins par l'OTA. Dans le but de rechercher de nouvelles souches capables de
rduire ou dgrader les mycotoxines, quatre ferments panaires traditionnels collects
de diffrentes rgions du Maroc ont t essays pour rduire les aflatoxines. Les
Rsultats ont montr une rduction de 92% pour l'AFG1 et 79,16 % pour l'AFB1 par
le ferment L1. La capacit des bactries lactiques rduire l'AFB1 in vitro a t
galement tudie. Les souches tester ont t cultives en prsence de lAFB1. Les
Rsultats ont montr que les souches de Lactobacillus peuvent rduire plus d'AFB1
que les souches de Pediococcus et Leuconostoc et que la rduction varie entre 1,80
44,89% d'AFB1 selon les souches tudies. Ces rsultats suggrent que les souches de
bactries lactiques peuvent tre exploites dans des approches biologiques pour la
dtoxification des aliments contamins par les aflatoxines.
Mots-Cls: Mycotoxines. Occurrence. Aliments. Rduction. Bactries lactiques.
Fermentation panaire. Maroc.

SUMMARY

In this work, the contamination of Moroccan foodstuffs with mycotoxins was


studied. A total of 60 samples of cereals, 55 samples of spices, 24 samples of dried
fruits and 25 samples of black olives were purchased from popular markets of Rabat
and Sal and analyzed for mycotoxins by HPLC with fluorimertic detection. Results
showed that 40, 40 and 55% of samples of corn, wheat and barley were respectively
contaminated with ochratoxin A (OTA). Samples of corn were assayed for the cooccurrence of fuminisine B1 (FB1) and zearalenone (ZEN). The incidence of FB1 and
ZEN in corn samples were respectively 50 and 15 %. In spices, AF analysis showed
that total AF in paprika and ginger ranged respectively from 1.30 to 9.68 g/kg and
from 0.03 to 9.10 g/kg. This is the first report on the natural co-occurrence of OTA,
FB1and ZEN in cereals from Morocco. Concerning OTA analysis in samples of dried
fruits and black olives, results showed that 66.6% and 36% were respectively
contaminated by OTA. Black olives samples were more contaminated by OTA, the
overall median concentration was 1.43 g/kg (range 0.62 to 4.8 g/kg). In the 2nd part
of this study we were interested to a biological process to remove mycotoxins. 4
traditional sourdough ferments were assayed against aflatoxins. Results showed a
reduction of mycotoxins with percentages of 92 % for AFG1 and 79.16 % for AFB1
by the ferment L1. The ability of some strains of lactic acid bacteria isolated from
Moroccan traditional sourdough ferments to reduce AFB was also studied in vitro.
Results showed that Lactobacillus strains could remove more AFB1 than Pediococcus
and Leuconostoc strains and the reduction of the initial amount of AFB1 ranged from
1.80 to 44.89 % AFB1 for all strains studied. These findings suggest that sourdough
strains lactic acid bacteria can be exploited for an approach of detoxification of
aflatoxins from contaminated foods.
Keywords: Mycotoxins. Occurrence. Foodstuffs. Reduction. Lactic acid bacteria.
Sourdough bread. Morocco.

PUBLICATIONS

ARTICLES
1- A. Zinedine, S. Elakhdari, A. Chaoui, M. Faid, R. Belhcen, et M. Benlemlih.
Aflatoxins Reduction in Sourdough Bread Fermentation. Alimentaria (2004) N 353:
97-100.
2- A. Zinedine, M. Faid et M. Benlemlih. Activit anti-aflatoxinognique des
bactries lactiques isoles des ferments panaires traditionnels marocains. Rev. Md.
Pharm. Afr (2004). V 18: 77-83.
3- A. Zinedine, A.M. Betbeder, M. Faid and M. Benlemlih, L. Idrissi and E.E.
Creppy. Ochratoxin A determination in dried fruits and black olives from Morocco.
Alimentaria (2004) N 359: 73-76
4- A. Zinedine, M. Faid and M. Benlemlih. In vitro reduction of aflatoxin B1 by
strains of lactic acid bacteria isolated from sourdough bread. Int. J. Agr. Biol, (2005)
Vol. 7, N1: 67-70.
5- A. Zinedine, C. Brera, S. Elakhdari, C. Catano, F.R. Debegnac, S. Angelini, M.
Faid, M. Benlemlih and M. Miraglia. The natural occurrence of mycotoxins in cereals
and spices commercialized in Morocco. Int. J. Food Control (2004) (Soumis)

COMMUNICATIONS ORALES
1- A. Zinedine, Faid M. et Benlemlih M. (2002): Mycotoxins reduction by acid lactic
bacteria of sourdough bread. 1er Congrs National de Biochimie. Socit Marocaine de
Biochimie. 9-11 Mai 2002. Facult des Sciences An-Chock Casablanca. Maroc.

LISTE DES TABLEAUX

Tableaux
1
2
3
4
5
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8
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20
21
22

Titres
Effets mutagnes, tratognes et cancrignes des mycotoxines
Activit de leau (aw) ncessaire pour le dveloppement de quelques
moisissures
Proprits physico-chimiques des aflatoxines
Principales mycotoxines produites par les espces de Fusarium
Limites maximales pour les mycotoxines dans les aliments dans certains
pays europens et les USA
Estimation du dgt conomique des aflatoxines.
Principales diffrences entre le pain au levain et le pain la levure
Coefficients molaires et longueurs dondes de lAFB1 et lAFG1
Analyse statistique des mthodes analytiques des mycotoxines
Cooccurrence naturelle de lOTA, la FB1 et la ZEN dans les
chantillons du mas analyss
Concentrations de lOTA dans les chantillons de bl et dorge analyss
Occurrence des aflatoxines dans les chantillons du piment et de
gingembre analyss
Occurrence des aflatoxines dans les chantillons du poivre et du cumin
analyss
Concentrations de l'OTA dans les olives noires analyss
Concentrations de l'OTA dans les fruits secs analyss
Caractristiques physico-chimiques des ferments panaires
Dnombrement des levures et des bactries lactiques dans les ferments
panaires traditionnels en ufc 106/g
Pourcentage des genres de bactries lactiques dans les ferments panaires
traditionnels analyss
Distribution des espces de bactries lactiques dans les ferments
traditionnels panaires tudis
pH et nombre des bactries lactiques en culture mixte avec A. parasiticus
NRRL2999
Pourcentages de rduction de la production de lAFB1 par A.
parasiticus NRRL2999
Pourcentage de rduction in vitro de l'AFB1 par les bactries lactiques

LISTE DES FIGURES

Figure
1
2
3
4
5
6
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9
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13
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15
16
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19
20
21

Titre
Biosynthse de quelques mycotoxines dans les aliments.
Structures chimiques des aflatoxines
Principales voies de biotransformation de l'AFB1 dans lorganisme
Structure de l'ochratoxine A
Structure de la ZEN et de ses drivs
Structure de la FB1
Structure de la patuline
Schma montrant les principales tapes utilises pour lanalyse des
mycotoxines par HPLC
Pourcentage de rduction des aflatoxines par les ferments panaires
traditionnels
Effet de la temprature sur la rduction de l'AFB1 par les bactries
lactiques
Effet du pH sur la rduction de l'AFB1 par les bactries lactiques
Chromatogramme montrant les quatre pics des standards des
aflatoxines
Chromatogramme des aflatoxines dans les chantillons d'pices
Chromatogrammes des aflatoxines dans les chantillons des pices
(suite)
Chromatogrammes de l'OTA dans les chantillons des crales
analyses
Chromatogrammes de la ZEN dans un chantillon de mas analys
Chromatogrammes de trois injections diffrentes du standard de la FB1
Chromatogrammes de la FB1 dans trois chantillons de mas (4, 5 et
20)
Chromatogrammes de la FB1 dans deux chantillons de mas (M1 et
M2)
Chromatogramme de la FB1 dans un chantillon de mas (M4)
Chromatogramme de la FB1 dans un chantillon de mas (M20)

ABREVIATIONS
- A:

Aspergillus

- AF:

Aflatoxine

- AFB1:

Aflatoxine B1

- AFB2:

Aflatoxine B2

- AFG1:

Aflatoxine G1

- AFG2:

Aflatoxine G2

- AFM1:

Aflatoxine M1

- AFM2:

Aflatoxine M2

- AFT:

Aflatoxines totales

- Aw :

Activit de leau

- DON :

Doxynivalnol

- F:

Fusarium

- FB1 :

Fumonisine B1

- Hr :

Humidit relative

-L:

Lactobacillus

- Lc :

Lactococcus

- Ln :

Leuconostoc

- OTA :

Ochratoxine A

- P:

Penicillium

- ppm:

Partie par million

- ppb:

Partie par billion

- Pc :

Pediococcus

- Rc :

Pourcentage de recouvrement

- ZEN :

Zaralnone

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

INTRODUCTION GENERALE

Les maladies d'origine alimentaire constituent l'heure actuelle l'un des


problmes de sant publique les plus rpandus l'chelle internationale. Leurs
rpercussions sur la sant et sur l'conomie mondiale sont de plus en plus largement
reconnues. Ces maladies sont causes par divers agents en particulier les
microorganismes pathognes.
En plus des virus et des bactries pathognes, les champignons toxinognes
constituent un danger rel pour la sant de l'homme et de l'animal par la scrtion de
substances hautement toxiques au cours de leur prolifration sur ou dans les aliments
d'origine vgtale ou animale. Ces substances qu'on regroupe sous le nom des
mycotoxines sont rpandues tous les stades de la chane alimentaire. Elles ont une
composition chimique trs variable, ce qui fait que leurs proprits physico-chimiques
et toxicologiques sont extrmement varies. La plupart sont hpatotoxiques,
nphrotoxiques, gnotoxiques ou immunosuppresseurs etc. Plus de 300 mycotoxines
sont actuellement identifies l'chelle internationale, elles sont produites par
quelques 200 varits de champignons toxiques.
Vu les problmes sanitaires et les pertes conomiques causs par la
contamination des cultures par les mycotoxines, un grand intrt est actuellement
attribu travers le monde ces substances pour que chaque pays ou chaque rgion se
doive adopter une lgislation spcifique pour chaque mycotoxine et chaque aliment
susceptible d'hberger des moisissures toxinognes dans le but de cerner les problmes
engendrs long terme par ces substances.

CHAPITRE I : MYCOTOXINES DANS LES PRODUITS ALIMENTAIRES


I- INTRODUCTION
Les champignons toxiques produisent un certain nombre de mtabolites
secondaires

nocifs en se dveloppant sur les aliments. Ces produits qualifis

mycotoxines sont trs toxiques pour l'homme et les animaux. Leur prsence est
fortement dpendante de nombreux facteurs.
Les mycotoxines (du grec myks signifiant moisissure) sont des mtabolites
toxiques dont lingestion provoque une intoxication chez le consommateur condition
que leur concentration soit suffisamment leve pour produire un effet. Ce sont des
produits contaminant les denres alimentaires dorigine animale ou vgtale,
notamment les aliments de base : crales et olagineux, elles sont rpandues tous les
stades de la chane alimentaire.
Les troubles causes par ces substances se manifestent par des syndromes
varis, il peut y avoir un effet spcifique toxique sur un organe bien dtermin,
cependant la plupart provoquent des lsions graves d'un seul tissu ou de plusieurs
tissus, mais c'est surtout le foie qui est le plus touch. D'autres effets peuvent
apparatre tels les gastro-entrites, les hmorragies et les paralysies etc. Les
mycotoxines sont gnralement classes en trois groupes selon leurs effets toxiques
(voir tableau 1) :
- Les mycotoxines mutagnes
- Les mycotoxines cancrognes
- Les mycotoxines tratognes
De ce fait la consommation d'aliments pollus par les mycotoxines pose un
problme majeur de la sant publique.

Tableau 1 : Effets mutagnes, tratognes et cancrignes des mycotoxines


(Drache, 1989)

Champignons

Mycotoxines

Mutagnicit Tratognicit

Cancrognicit

produites
A. flavus
A. parasiticus

Aflatoxines

P. urticae

Patuline

P. rubrum

Rubratoxine

Penicillium sp

Acide pnicillique

Ac. mycophnolique

A. versicolor

Strigmatocystine

P. poae

Trichothcnes

P. veridicatum

Ochratoxine A

A. ochraceus

Ochratoxine A

P. islandicum

Lutoskirine

A : Aspergillus
P : Penicillium

+
+

II- DECOUVERTE DES MYCOTOXINES

Ds le moyen ge, les chroniques dcrivent les effets mortels de l'ergot du


seigle dont l'agent causal Claviceps purpurea est responsable de l'laboration d'une
toxine mortelle : l'ergotamine. Ensuite des tudes permettaient d'isoler du mas
contamin par Penicillium l'acide pnicillique premire mycotoxine identifie.
En Angleterre (1960), l'ingestion dune farine d'arachide importe du Brsil et
contamine par Aspergillus flavus a entran la mort brutale d'une centaine de milliers
de dindonneaux aprs lapparition des premiers symptmes : perte de lapptit,
faiblesse des ailes et lthargie. Cet vnement dnomm autrefois tout simplement
Turkey-X- Disease a donn le dpart d'une srie d'tudes et de recherches physicochimiques et toxicologiques sur les substances actives labores par les moisissures.
Ainsi en 1960, le nom daflatoxine est attribu cette nouvelle matire toxique.
Au Maroc, bien que lon signale ds 1945 une intoxication de porcs par une
alimentation moisie daprs Ninard et Hinterman, cit par Lafont (1970), les premires
recherches scientifiques faisant mention de la contamination des denres alimentaires
par des champignons toxinognes n'ont vu le jour qu'au milieu des annes 70 o un
nombre de produits incluant des crales, des lgumineuses et des pices se sont
rvles susceptibles dhberger des spores dAspergillus toxinognes (TantaouiElaraki, 1977).
D'autres travaux ont montr la contamination des olives par Aspergillus flavus
et A. ochraceus producteurs respectifs daflatoxines et ochratoxines (Gourama et al.
1985), de mme quavec une multitude dautres espces fongiques qui se sont avres
capables de produire des mtabolites toxiques mis en vidence laide de tests
biologiques (Samane et al. 1991). Les investigations faites par Faid et TantaouiElaraki (1989) ont mis jour la toxinognse de deux moisissures les plus frquentes
sur fruits dagrumes Penicillium italicum et P. digitatum. Kichou et Wasler (1993) ont
signal la prsence de l'aflatoxine B1 dans l'alimentation destine la volaille.

Tantaoui-Elaraki et Bartine (1994) ont ensuite isol des souches dA. flavus
productrices dochratoxine A sur diverses pices distribues au Maroc.

III- CONDITIONS DE PRODUCTION DES MYCOTOXINES DANS LES


ALIMENTS

Toutes les rcoltes poussant des climats chauds et humides et exposes aux
moisissures toxinognes peuvent tre contamines par les mycotoxines. C'est le cas
notamment du mas, des fruits coque, des arachides, des graines de coton, des noix,
des pistaches, des pices, du soja, du riz, des amandes, des fruits secs, du lait et ses
drivs et des crales et leurs drivs etc.
Certaines cultures sont moins favorables par rapport dautres pour la production
dune ou plusieurs mycotoxines par les champignons. Ceci est probablement d des
facteurs gntiques. D'autres cultures comme les crales offrent aux champignons de
trs bonnes conditions de dveloppement vu leur richesse en glucides reconnus comme
principales sources dnergie. Le bl, lorge, le seigle, lavoine, le sorgho, le millet et
le riz, apparaissent tre moins susceptibles la contamination fongique et la
production d'aflatoxine par rapport au mas.
Les moisissures responsables de laltration des graines sont rparties en deux
groupes cologiques :
- Les moisissures du champ : Alternaria et Fusarium
- Les moisissures de stockage : Aspergillus et Penicillium
Les mycotoxines peuvent tre dtectes dans les aliments la suite d'une
production par une souche toxinogne, ceci ncessite un substrat favorable et une
souche productrice de toxines ou bien la suite d'une contamination indirecte
provenant d'aliments contamins et intgrs dans l'alimentation du btail. La scrtion
par les moisissures de mtabolites toxiques dans les aliments dpend de plusieurs

facteurs qui peuvent tre intrinsques (nature de la souche) ou bien extrinsques


(conditions de lenvironnement).
- Facteurs intrinsques : Concernant la nature de la souche, certaines
moisissures sont toxinognes mais dautres ne le sont pas. De plus au sein dune mme
espce toxinogne, certaines souches sont fortement productrices de toxines alors que
dautres le sont mais des degrs moindres. La toxinognse dune moisissure peut
dpendre du stade de dveloppement de la souche productrice.
- Facteurs extrinsques : Les facteurs de lenvironnement qui contrlent le
dveloppement de la toxinognse des moisissures sont nombreux savoir la teneur en
eau, lhumidit relative, le pH, la temprature ambiante, la composition du substrat en
lments nutritifs et sa richesse en graisses ou en azote et la comptition entre les
diffrents micro-organismes :
Substrat
Les

moisissures

sont

des

organismes

htrotrophes,

se

dveloppant

exclusivement sur des substrats organiques contenus dans les produits alimentaires de
base (olagineux, crales, produits laitiers etc.). Les glucides sont des sources de
carbone les plus utiliss par les moisissures. La prsence de quelques substances dans
les aliments stimule la croissance des moisissures et la production des mycotoxines
comme le saccharose et les acides amins. La contamination dune denre alimentaire
par les moisissures dpend de la nature du substrat en particulier de la nature des
glucides disponibles.
Activit de leau (aw)
Law joue un rle primordial sur la croissance des moisissures en particulier sur la
germination des spores et la croissance du myclium. Lexigence et la tolrance des
moisissures vis vis de leau sont variables dune souche lautre. Les moisissures
sont classes en trois groupes :

Les espces hygrophiles dont les spores germent plus de 90% et leur
croissance optimale se situe 100 % dhumidit relative (Mucor sp.).

Les espces msophiles dont les spores germent entre 80 et 90% et leur
croissance optimale se situe entre 95 et 100% dhumidit relative (Alternaria
sp., Penicillium sp.).

Les espces xrophiles dont les spores germent moins de 80% et leur
croissance optimale se situe entre 95 et 100% dhumidit relative (Aspergillus
sp., Penicillium sp.).

Le tableau n 2 rsume les valeurs limites ncessaires pour le dveloppement de


quelques types de moisissures. Concernant les Aspergillus, law optimale de leur
croissance se situe entre 0,72 et 0,80 selon les espces. Cependant la plupart des
Penicillium pousse mieux des aw comprises entre 0,8 et 0,90. Les espces du genre
Fusarium se dveloppent des aw entre 0,80 et 0,92.
Il est noter que law requise pour la production de mycotoxines est gnralement
plus faible que celle ncessaire pour la croissance des moisissures et la germination
des spores. En effet, la formation des aflatoxines par A. flavus ncessite une valeur
daw comprise entre 0,83 et 0,87 mais la croissance du micro-organisme producteur
peut avoir lieu des valeurs daw plus basses (Troller, 1980).
Temprature (T) et pH
La temprature agit sur la croissance des moisissures et la production des
mycotoxines. La temprature optimale pour la croissance des moisissures se situe entre
20 et 30 C, cependant elles peuvent crotre dans un vaste intervalle de T allant de 4
40 C. Des espces thermophiles d A. fumigatus peuvent crotre mme des
tempratures avoisinant 55C. Les spores des moisissures sont galement
thermorsistantes. La majorit des spores supportent les tempratures normales de
strilisation (120C pendant 20 min). En gnral, la temprature optimale pour la
production des mycotoxines est infrieure celle requise pour la croissance du microorganisme producteur. Le pH du milieu est un facteur important dans la croissance des

moisissures et la production des mycotoxines. La plupart des moisissures croissent


dans des pH acides et peuvent tolrer des valeurs de pH trs basses.
Endommagement des graines
Les graines casses ou fissures constituent des foyers favorables pour le
dveloppement des moisissures qui aprs leur envahissement librent les toxines. Leur
altration par les insectes et les acariens fournit galement les conditions favorables
pour la croissance et le dveloppement des moisissures.
IV- BIOSYNTHESE DES MYCOTOXINES
Les mycotoxines sont des mtabolites secondaires synthtiss pendant la phase
stationnaire aprs les stades de multiplication et de croissance. Elles sont classes en
polyactoacides, terpnes et mtabolites azots selon leur origine biologique. D'aprs
Steyn (1998), les aflatoxines sont formes partir des polyactoacides selon un
processus complexe, l'ergotamine est forme partir des peptides et des acides amins.
L'ochratoxine

est

biosynthtis

partir

de

la

phnylalanine

et

le

dihydroisocoumarine. Les thrichothcnes sont produites partir du mvalonate


(Figure 1).

Tableau 2: Activit de leau (aw) ncessaire pour le dveloppement de


quelques moisissures (OMS, 1990)

Moisissures

Aw
0,83-0.87

A. ochraceus
A. flavus

0,78

A. niger

0,88

P. cyclopium

0,87 - 0,90

Fusarium sp

0,80 - 0,92

Figure 1 : Biosynthse de quelques mycotoxines dans les aliments


(Leyral et vierling, 2001)

Acides amins aromatiques

Mtabolites II aires
(Ergotamine)

Glucose

Triose

Pyruvate

Actate
Polyctoacides

Acides gras
Mtabolites II aires
(Aflatoxines)

Mvalonate

Mtabolites II aires
(Tricothcnes)

V- LES MYCOTOXINES EN ALIMENTATION HUMAINE ET ANIMALE


La production des mycotoxines peut avoir lieu dans les champs avant, au
moment ou bien aprs rcolte (stockage). Les espces du genre Fusarium (F.
moniliforme, F. roseus, F. tricinctum et F. nivale) constituent les principales
moisissures productrices de toxines avant la rcolte. Tandis que les espces des genres
Aspergillus et Penicillium telles que A. flavus et A. parasiticus sont des contaminants
au moment du stockage. Alors que les espces d' A. clavatus et d' A. fumigatus sont
deux espces qui nattaquent que les graines endommages et ncessitent une grande
rtention des graines en humidit.
Lalimentation animale est essentiellement constitue de tourteaux olagineux,
de crales, de fourrages ensils, etc., tous substrats particulirement propices au
dveloppement des moisissures. En levages industriels, les animaux reoivent une
ration quilibre et relativement identique chaque jour, ce qui favoriserait chez des
animaux, gntiquement trs proches, des intoxications chroniques si lalimentation
renferme des mycotoxines.
En alimentation humaine, le problme se pose diffremment. Les habitudes
alimentaires varient dun point lautre du globe mais, part quelques pays o svie la
famine, la grande diversification de notre alimentation nous empche labsorption
rgulire de doses suffisantes de mycotoxines pour tre rellement dangereuses court
terme, mais qui peuvent ltre long terme.

VI- LES AFLATOXINES

Les aflatoxines sont des mtabolites secondaires synthtiss par des souches
d'Aspergillus flavus, A. parasiticus et A. nomius (Kurtzman et al., 1987). Elles sont
largement abondantes dans les olagineux, les rcoltes du coton et des crales
notamment le bl et le mas. Le stockage de ces aliments dans des conditions humides
ou chaudes peut augmenter la synthse d'aflatoxines. Selon Diener et al. (1987),

l'cologie des moisissures productrices des aflatoxines est trs complexe. En effet, A.
parasiticus est un champignon mieux adapt au sol et prominent chez l'arachide, alors
que A.flavus est adapt la vie arienne des plantes (fleures) et il est dominant en
particulier dans les cultures de mas. Une distinction biochimique entre les souches
productrices d'aflatoxines est que A. flavus produit seulement les aflatoxines B, alors
que A. nomius et A. parasiticus produisent les aflatoxines B et G (Creppy, 2002).
L'aflatoxine B1 (AFB1) est la mycotoxine la plus tudie. Cependant d'autres
aflatoxines sont produites par les moisissures toxinognes notamment B2, G1 et G2 et
les aflatoxines M. Les aflatoxines M1 et M2, drivs respectifs des aflatoxines B1 et
B2, apparaissent dans le lait et ses drivs. Ces toxines ont tenu leur appellation du fait
de leur dtection dans le lait "Milk" des vaches laitires nourries par une alimentation
contamine (Jaquet et al., 1982). Certaines souches de moisissures sont capables de
synthtiser les aflatoxines M directement dans une alimentation moisie (Bullerman,
1978). Il a t dmontr que l'aflatoxine M1 peut contaminer le lait maternel humain
(El-nezami et al., 1995; Galvano et al., 1996).

1- Proprits physico-chimiques et biologiques des aflatoxines

1- 1 Structures des aflatoxines


Les aflatoxines sont des composs organiques de nature non protique (figure
2). Leurs proprits physico-chimiques (PM, Point de fusion, et rapport de front: Rf)
sont reprsentes dans le tableau 3. LAFB1 est un compos thermorsistant stable
mme des tempratures de 250 C pendant 30 minutes ltat cristallis.
Laflatoxine en prsence des rayons UV met une fluorescence bleue (AFB1 et
AFB2) ou verte (AFG1 et AFG2). Par contre lAFM1 met une fluorescence bleue
violette.

Tableau 3 : Proprits physico-chimiques des aflatoxines, Le Rf est calcul


sur gel de silice 60 (0.25 mm)
Aflatoxines

AFB1
AFB2
AFG1
AFG2
AFM1
AFM2

PM

Point de fusion (C)

Rf Chloroforme/
mthanol (97/3)

312
314
328
330
328
330

267
303- 306
257-259
237-240
299
293

0.56
0.53
0.48
0.46
0.40
0.30

Figure 2 : Structures chimiques de quelques aflatoxines

1-2 Toxicit des aflatoxines


La dcouverte des aflatoxines a excit lintrt des scientifiques lgard de la
toxicit de ces substances. Les premires observations ont rvl qu fortes
concentrations, les aflatoxines sont des poisons violents, et quadministres petites
doses des animaux du laboratoire, elles produisent un cancer du foie. Selon lAgence
Internationale de Recherche sur le Cancer, lAFB1 est un cancrogne probable class
dans le groupe 1 (IARC, 1993a).
- Toxicit aigu
La toxicit aigu se caractrise par la dose ltale DL50 qui correspond la
concentration capable dentraner la mort de la moiti de la population teste.
Concernant les aflatoxines, ce type de toxicit est moins frquent chez lhomme que
chez les animaux. Chez le caneton, la DL50 des AFB1, AFB2, AFG1 et AFG2 est
respectivement de l'ordre de 0,36, 0,78, 1,70 et 3,44 mg/kg (Hussein et Brasel, 2001).
- Toxicit chronique
La toxicit chronique des aflatoxines survient aprs lingestion rpte de doses
trs faibles. Ce type de toxicit peut apparatre aussi bien chez lhomme que chez
lanimal. Des tudes pidmiologiques menes dans le Sud-est asiatique et en Afrique
ont dmontr que les cancers hpatiques sont beaucoup plus frquents chez certains
groupes de la population humaine dont le rgime alimentaire est lev en aflatoxines.
D'aprs Hussein et Brasel (2001), plus de 250 milles dcs annuels sont recenss en
Chine et en Afrique subsaharienne et qui sont causs par des carcinomes
hpatocellulaires attribus aux facteurs de risques comme l'ingestion journalire leve
en aflatoxines qui atteint 1,4 g/kg et l'incidence du virus de l'hpatite B (VHB). Selon
Herrman et Walker (1999), la virulence des aflatoxines chez des individus porteurs du
VHB est nettement plus leve que chez ceux qui ne le sont pas. LAFB1 et le VHB
peuvent agir en synergie, linfection par le VHB induit les enzymes activatrices de
laflatoxine en augmentant son pouvoir cancrogne potentiel (Chen et al., 2001).

1-3 Effets antibactriens


L AFB1 est considre par plusieurs auteurs comme un antibiotique vu ses
proprits dinhibition de la croissance bactrienne. L AFB1 bloque la multiplication
cellulaire chez les espces sensibles des concentrations ltales. Alors qu des
concentrations subltales, elle produit des aberrations morphologique et physiologique.
Les aflatoxines inhibent la croissance des bactries par inhibition de la synthse ou
blocage de la rplication de lADN et par blocage de la synthse protique.
Chez Escherchia coli, larrt de la synthse de l'ADN et de la synthse
protique sous leffet de lAFB1 ont t mis en vidence. Alors que chez Bacillus
megaterium des dformations cellulaires se manifestent sous laction des aflatoxines,
ces modifications rsultent de larrt de la division cellulaire (Zuckerman et al., 1968,
cit par Khaddor, 1992).
1-4 Effets mutagnes
Leffet mutagne de lAFB1 sur les bactries a t dmontr par plusieurs
auteurs. La molcule de lAFB1 peut sintercaler entre les bases azotes de la molcule
de lADN et se stabiliser la suite dune liaison covalente lADN. Ce processus sest
manifest in vitro chez Bacillus subtilis (Maher et Summers, 1970). Dautres auteurs
ont suggr que leffet mutagne de lAFB1 provoque un changement des paires de
base chez Salmonella typhimurium (Garner et Wright, 1973). Aufray et Boutibonnes
(1985) ont not la formation de formes filamenteuses chez Bacillus thuringiensis aprs
un traitement par lAFB1.
Chez la cellule humaine, lAFB1 nest pas ractive ou mutagne par elle mme,
mais elle peut tre active en un poxyde trs lectrophile qui peut former des adduits
lADN. Ces adduits gnrent une mutation qui se situe sur le codon 249 et qui pourra
tre le point de dpart dun processus de cancrogense hpatique. Des rsultats in
vivo ont montr que lAFB1 provoque trs frquemment cette mutation (Aguilar et al.
1993).

2- Mtabolisme des aflatoxines dans lorganisme


Une fois dans lorganisme, lAFB1 subit plusieurs ractions dlimination
plusieurs niveaux. Ainsi dans la cellule hpatique laflatoxine est mtabolise par un
arsenal enzymatique qui facilite son limination par augmentation de ses proprits
hydrophiles (Fremy, 1982).
Il existe deux mthodes dlimination de l'AFB1. Le processus dhydroxylation
constitue la voie principale qui conduit la formation du driv hydroxyl de
laflatoxine B1 qui est laflatoxine M1 (Jaquet et al., 1982). Alors que par
oxydorduction, il y a formation de laflatoxicol qui est moins toxique et de pouvoir
mutagne faible (Fremy, 1982). Dautres aflatoxines peuvent tre formes partir de
B1, il sagit notamment des aflatoxines B2a, H1, P1 et Q1.
Les aflatoxines ingres sont rapidement absorbes par le tractus gastrointestinal o elles vont commencer tre mtabolises ou dtoxifies au dbut dans les
cellules mucosales. LAFB1 subit une bioconversion spcifique (figure 3) donnant
formation un mtabolite majeur rsultant dune poxidation par le Cytochrome
P450-dependant : cest lAFB1- 8,9-poxyde. Ce produit interagit avec lADN formant
des adduits (AFB-N7-Guanine) prsums impliqus dans lactivit carcinogne des
aflatoxines. La fixation de cet poxyde sur les protines joue probablement un rle
important dans la toxicit des aflatoxines (Richard, 1998).
Le complexe aflatoxine poxyde form peut ragir spontanment avec le
glutathion par une glutathion-S-tranfrase. Cette conjugaison est gnralement
considre comme une importante

voie de dtoxification ct des autres

mcanismes donnant naissance notamment laflatoxicol et aux autres drivs M1, P1


et Q1 (Fink-Gremmels, 1998). Llimination des aflatoxines de lorganisme inclut
lexcrtion urinaire (AFM1, AFP1, AFQ1, AFB1-N7- guanine), lexcrtion biliaire
(AFB1-glutathione) et lexcrtion laitire sous forme dAFM1 chez les femelles des
mammifres. Cette dernire constitue la principale voie dexposition des nourrissons
(Richard, 1998).

Figure 3 : Principales voies de biotransformation de l'AFB1 dans lorganisme


(Richard, 1998)

VII- AUTRES MYCOTOXINES


A- LES OCHRATOXINES
1- Microorganismes producteurs
Les ochratoxines sont produites aussi bien par

A. ochraceus et certaines

espces voisines que par des espces du genre Penicillium. Elles ont t dtectes dans
le mas, lorge, le bl, lavoine, les haricots, les pois moisis et les fruits secs. On les
retrouve galement sur les graines mal stockes, elles contaminent entre autres les
crales, les boissons (vins, jus de fruits, bire etc.) et par le biais de la chane
alimentaire la viande de porc et de la volaille (Haumann, 1995).
La production des ochratoxines par les espces dAspergillus ne parait possible
que dans des conditions de forte humidit et de temprature leve (varga et al.,1996),
alors que certaines espces de Penicillium sont capables de produire des ochratoxines
mme des tempratures nexcdant pas 5C (OMS, 1980).
2- Ochratoxine A
Lochratoxine A (OTA, figure 4) est une mycotoxine dcouverte par Van der
Merve et al., (1965), elle est la principale toxine dangereuse dans son groupe. Elle est
produite par P. verrucosum et par A. ochraceus. Elle peut tre produite aussi par A.
niger. Ces trois espces diffrent dans leurs niches cologiques, dans les denres
affectes ainsi que dans la frquence de l'occurrence dans diffrentes rgions
gographiques (Creppy, 2002). En effet P. verrucosum croit seulement des
tempratures au dessous de 30C et une aw de 0,8 et contamine de ce fait les crales
et leurs drivs dans les rgions froides en particulier en Europe et au Canada (Creppy
et al., 1991, 1993). L'OTA est une mycotoxine principalement produite par les
moisissures au cours des priodes de stockage (Scudamore et al., 1999 ; Moss, 1986).

COOH

OH

CO
O

C6H5 -CH2- CH - NH- CO

CH3
H
Cl

Figure 4: Structure de l'ochratoxine A


L'OTA est absorbe par le tractus gastro-intestinal. Sa distribution chez de
nombreuses espces se fait travers la circulation sanguine vers les reins ; des petites
concentrations se sont trouves galement dans le foie, le muscle et le tissu adipeux.
Le transfert de l'OTA dans le lait a t dmontr chez le rat, le lapin et l'Homme.
Cependant chez les ruminants, grce au mtabolisme de l'OTA par la microflore
digestive, une faible quantit d'OTA est transfre dans le lait (Creppy, 2002).
3- Toxicit de l'OTA
L' IARC (1993 b) a class l'OTA dans le groupe 2B comme un carcinogne
humain probable. La gnotoxicit de l'OTA a t dmontre par Creppy et al. (1985).
L'OTA provoque des lsions rnales importantes chez les animaux lors des
intoxications chroniques tandis que les intoxications aigus se caractrisent par des
hmorragies et des diarrhes. L'OTA a t trouve frquemment de hautes
concentrations dans des chantillons de sang obtenus chez des personnes, vivant dans
l'hmisphre Nord en particulier dans des pays du Balkan et affectes par une maladie
connue sous le nom de la nphropathie endmique du Balkan (Pfohl-Leszkwicz et al.,
2002). Des taux levs en OTA ont t retrouvs galement dans les aliments et les

srums de patients nphropathes en Afrique du Nord notamment en Tunisie et en


Algrie (Creppy, 1992 ; Maaroufi et al., 1995).
Dans le but dtablir une association gographique avec la nphropathie
endmique, Puntaric et al. (2001), ont montr que respectivement 75.8% et 33.3% des
chantillons du bl et du mas en Croatie taient contamins par de lOTA. Les
concentrations taient variables dun chantillon lautre et atteignent des taux levs
allant de 0.02 160 g/kg dans le bl et 0.02 40 g/kg dans le mas.
4- Occurrence de l'OTA dans les aliments au Maroc
Au Maroc, les investigations relatives aux mycotoxines en gnral et l'OTA
en particulier restent assez limites. Selon Le Tutour et al. (1983), l'analyse de 70
chantillons de bl prlevs dans diffrents points de vente par chromatographie sur
couche mince (CCM), a montr qu'un seul chantillon sest rvl contamin par
lOTA une concentration de 50g/kg. Plutard, dans un travail soutenu par la
Direction de la Rpression des Fraudes et la Protection des Vgtaux, 3 chantillons
dorge sur 75 chantillons analyss contenaient de lOTA (Tantaoui-Elaraki et al.,
1994).
Rcemment, des tudes prliminaires menes par Filali et al. (2001) ont montr
la contamination du vin rouge par de lOTA avec des concentrations allant de 0,028
3,24 g/l et la contamination dun jus de fruit par une concentration de 1,16 g/l
dOTA. L'analyse de l'OTA dans le srum a montr que la population marocaine est
expose l'OTA quoique la concentration moyenne (0,29 g/l) reste trs infrieure
celle trouve dans d'autres pays de l'Afrique du Nord en particulier la Tunisie (Filali et
al., 2002).

B - LA ZEARALENONE (ZEN)
1- Microorganismes producteurs et aliments contamins
La ZEN [6-(hydroxy-6-oxo-trans-1-undecenyl)--acide rsorcylique -lactone,
(figure 5)] est une mycotoxine produite principalement par les espces du genre
Fusarium (tableau 4). Cest un contaminant naturel de certaines crales, en particulier
du mas dans de nombreux pays dAfrique et dEurope, ainsi quaux Etats-Unis.
Quoique les Fusarium infectant les crales produisent la ZEN avant la rcolte,
des tudes ont montr que cette toxine peut tre produite de hautes concentrations
dans les graines de mas destines l'alimentation animale pendant le stockage. (Pittet,
1998).

CH3

OH
O

Y
OH

X
R

X=

Y=

R=

H:

Zaralnone

OH

H:

Hydroxy-8 zaralnone

CHO :

Formyl-5 zaralnone

OH

OH

H:

Dihydroxy-6,8 zaralnone

OH

H:

Zaralnols ( et )

Figure 5: Structure de la ZEN et quelques-uns de ses drivs

2- Toxicit de la ZEN
La ZEN et ses mtabolites ( et zaralnols ; et zaralanols) sont classs
par l'IARC dans le groupe 3 (IARC, 1999). Selon Creppy (2002), la ZEN et ses
mtabolites ont montr une comptitivit pour fixer les rcepteurs de lstrogne. A
de hautes concentrations, la ZEN produit plusieurs altrations du systme immunitaire.
Elle produit galement des altrations du tractus de reproduction chez des models
exprimentaux (souris, rat, lapin). La ZEN a montr une action strogne
(Gonflement et rougissement de la vulve, prolapsus vaginal, accroissement de la taille
de lutrus, chaleurs anormales) chez divers animaux domestiques (Creppy, 2002).
Concernant sa gnotoxicit, la ZEN n'induit pas de mutations chez S.
typhimurium, cependant elle provoque des aberrations chromosomiques dans les
cellules ovariennes chez le hamster et elle induit la rparation SOS chez les bactries
(Ghdira-Chekir et al., 1999).
La ZEN a t rcemment value par le comit mixte d'experts FAO/OMS
(JECFA, 2000). Le comit a tabli la consommation journalire provisoire maximale
tolrable (PMTDI) pour la ZEN et ses mtabolites (incluant l' -zaralanol) 0,5g/kg
du poids corporel par jour.

C- LES FUMONISINES
1- Micro-organismes producteurs et aliments contamins
Les fumonisines sont un ensemble de toxines produites par les espces du genre
Fusarium comme F. verticillioides (ou F. moliniforme) et F. proliferatum (Bottalico,
1998 ; Pittet, 1998 ; Creppy, 2002). Les espces productrices de ces mycotoxines sont
regroupes dans le tableau 4.

Les fumonisines contaminent frquemment le mas et les produits base de


mas, mais elles contaminent aussi l'asperge, le riz, l'orge, le bl, la bire, le th noir et
les plantes mdicinales (Scott et Lawrence, 1995; Kim et al, 2002).
2- Fumonisine B1
La fumonisine B1 (FB1), ou "le diester du 1,2,3 acide tricarboxylique propane"
est la principale toxine dans ce groupe (figure 6). La FB1 a t dtecte dans le mas et
ses produits de base des concentrations leves de lordre des mg/kg. Ces taux (ppm)
ont t galement reports dans des aliments destins la consommation humaine.
Selon Maragos et Richard (1994), la contamination du lait cru par la FB1 est possible,
cependant aucun rsidu de ces substances n'a t dtect dans le lait aprs
administration orale ou intraveineuse.

O2C (COOH) CH2 CHCH2 COOH

OH

OH
CH3

CH3

CH3

OH

NH2

O2C (COOH) CH2 CHCH2 COOH

Figure 6: Structure de la FB1


3- Toxicit des fumonisines
La FB1 peut causer des mycotoxicoses aigus chez les animaux de la ferme
comme la leukoencephalomalacie chez les quids et des oedmes pulmonaires chez le

porc, la FB1 est galement hpatotoxique et nphrotoxique pour le porc, le rat, la


souris et le lapin (Dutton, 1996). L'IARC a dclar les toxines produites par F.
moniliforme comme des cancrognes potentiels chez l'homme et les a classes dans le
groupe 2B (IARC, 1993 c).
La FB1 est phytotoxique, elle endommage les membranes cellulaires et rduit la
synthse de la chlorophylle. Elle perturbe la biosynthse des sphingolipides chez les
plantes (Creppy, 2002). Elle inhibe la croissance cellulaire et altre le mtabolisme
lipidique chez Saccharomyces cerevisiae (OMS, 2000). Chez lhomme, il ny a aucune
confirmation de la toxicit aigu des fumonisines, cependant une corrlation entre
lexposition aux fumonisines en Afrique du Sud et le cancer de lsophage a t
suggr (Norred et Voss, 1994).
D- LA PATULINE
La patuline est une mycotoxine produite par de nombreuses moisissures
appartenant aux genres Aspergillus et Penicillium dont A. clavatus, moisissure de la
mycoflore des graines, Penicillium expansum, agent de pourriture des pommes
entreposes. Elle peut tre produite galement par Byssochlamys nivea et B. fulva,
champignons prsents dans divers jus de fruits (Pittet, 1998). La patuline est un
contaminant naturel des pommes endommages et de leur jus, mais elle a t produite
au laboratoire par d'autres varits de moisissures sur les graines, sur des produits
rfrigrs comme la viande et les fromages (Scott, 1991).
Sur le plan biologique, cette mycotoxine apparat petites doses comme un
antibiotique large spectre daction, mais on la abandonne cause de sa toxicit. La
patuline provoque des lsions au niveau des poumons, des reins et de la rate et,
accessoirement, elle engendre des dgnrescences des neurones du cortex crbral,
do lapparition de divers symptmes nerveux (Haumann, 1995).

O
O

OH
O
Figure 7 : Structure de la patuline

E- LES TRICHOTHECENES
Cest une famille compose denviron 148 composs, tous produits par de
nombreuses espces fongiques dont celles des genres Fusarium,

Penicillium,

Cephalosporum, Myrothecium, Trichoderma et Stachybotrys (OMS, 1980). Les


mycotoxines les plus tudies dans ce groupe sont le doxynivalnol (DON), les
toxines T-2 et HT-2.
La toxine DON est une vomitoxine qui contamine les crales en particulier le
bl, l'orge, le mas, le seigle, l'avoine, et le riz (Creppy, 2002). L'occurrence de la
toxine DON est associe principalement avec F. graminarum et F. culmorum
(Bottalico, 1998). La DON peut provoquer des effets adverses aprs administration.
L'administration d'une dose aigu est caractrise par deux effets toxicologiques
savoir la perte de l'apptit et les vomissements.
Les toxines T-2 et HT-2 sont deux toxines produites sur les crales (bl, orge,
mas, riz, avoine) et les produits base de crales. Elles sont produites par de
nombreuses espces de Fusarium (Bottalico, 1998). La toxine T-2 est un inhibiteur
potentiel de la synthse protique. Alors que la toxine HT-2 a pour cible le systme
immunitaire.

Tableau 4: Principales mycotoxines produites par les diffrentes espces


de Fusarium (Bottalico, 1998)

Espces de Fusarium
F. acuminatum

Mycotoxines produites
T-2, HT-2, DAS, MAS, MON, NEO

F. avenaceum

MON

F. chlamydosporum

MON

F. crookwllense

NIV, FUS, ZEN, ZOH

F. culmorum

DON, ZEN, NIV, FUS, ZOH, AcDON

F. equiseti

DAS, ZEN, ZOH, NIV, DAcNIV, MAS, FUS

F. graminarum

DON, ZEN, NIV, FUS, AcDON, DAcDON, DAcNIV

F. heterosporum

ZEN, ZOH

F. moniliforme

FB1

F. oxysporum

MON

F. poae

DAS, MAS, NIV, FUS, T2, HT2, NEO

F. proliferatum

FB1, BEA, MON, FUP

F. sambucinum

DAS, T2, NEO, ZEN, MAS

F. semitectum

ZEN

F. sporotrichioides

T-2, HT-2, NEO, MAS ,DAS

F. suglutinans

BEA, MON, FUP

F. tricinctum

MON

F.venenotum

DAS

AcDON: Mono-actyldoxynivalnol; AcNIV: Mono-actylnivalnol; BEA:


Beauvricine; DAcDON: Di-actyldoxynivalnol; DAcNIV: Di-actylnivalnol;
DAS: Diactoxyscirpnol;
DON: Doxynivalnol (vomitoxine); FB1: Fumonisine
B1; FUP : Fusaprolifrine; FUS : Fusarnone-X; HT2 : HT2-toxine; MAS:
Monoactoxyscirpnol; MON: Moniliformine; NEO: Nosolaniol; NIV: Nivalnol;
T2 : T2-toxine; ZEN : Zaralnone; ZOH : Zaralnols (isomres et ).

VI- REGLEMENTATIONS DES MYCOTOXINES


a- A lchelle nationale:
Actuellement au Maroc, il nya pas des normes ou des limites rglmentaires
fixant les teneures maximales des mycotoxines dans lalimentation humaine et
animale. Un projet de normalisation de ces toxines a t prpar vers la fin des annes
90 par le comit interministriel pour le contrle alimentaire et la rpression des
fraudes (CIPCARF) mais il na pas encore t adopt. Ce projet prvoit la
normalisation des contaminants minraux et organiques dans les aliments et fixe les
concentrations maximales admissibles des mycotoxines dans certaines denres
destines lalimentation humaine et animales :
Matires premires : Pour les produits et matires servant lalimentation humaine,
en aucun cas la concentration maximale en mycotoxines ne doit dpasser les valeurs
suivantes :
- Crales et produits assimils :
- AFB1 : 5g/kg dans les crales
- Ochratoxines : 30g/kg dans les crales
- ZEN : 200 g/kg dans les crales
- Produits laitiers :
- AFM1 : 0,05 g/kg (lait de toute nature)
- AFM1 : 0,03 g/kg (lait pour enfants de moins de 3 ans)
- Fruits et jus de fruits
- Patuline : 50 g/kg (cidre et jus de pomme)
- Corps gras et olagineux
- AFB1 : 5g/kg (huiles vgtales vierges ou mlanges)
- AFB1 : 0,1g/kg (arachides, pistaches, amandes etc.)
- ZEN : 200 g/kg (huiles vgtales)
- Tous les autres aliments : 10 g /kg

Produits concentrs
La concentration en aflatoxines des produits ayant subi une opration
dlimination de leur eau de constitution, ou dune partie de celle-ci, peut tre
suprieure celle de la matire premire mise en uvre, dans la limite de la quantit
deau limine :
- Lait en poudre : AFM1 : 0,5g/kg
- LAIT EN POUDRE (ENFANTS) : AFM1 : 0,3G/KG
Drivs des crales
Les farines et sons qui proviennent directement des crales peuvent contenir
des proportions en AFB1 diffrentes de celles des matires premires dont ils sont
issus :
- Farine blanche de bl (farine fleur) : 3g/kg dAFB1
- Son du bl brut : 10 g/kg dAFB1
- Farine de bl complte : 5g/kg
Aliments de btail
- AFB1 : 50 g/kg : Aliments complets pour bovins, ovins et caprins (sauf
animaux laitiers, veaux et agneaux)
- AFB1 : 20 g/kg : Aliments pour porcins et volailles (sauf porcelest, poussins,
cannetons et dindes)
- AFB1 : 20 g/kg : Aliments suplments pour animaux laitiers
- AFB1 : 10 g/kg : Autres aliments complets pour animaux
b- A l'chelle internationale :
Plusieurs pays ont tabli ou propos des limites rglementaires concernant les
mycotoxines dans les aliments. Depuis 1974, certains pays de lUE ont arrt des taux
limites daflatoxines. En mars 1999, en collaboration avec lOMS, La FAO a parrain
la 3me confrence mondiale sur les mycotoxines. La confrence a t organise pour
sensibiliser les dcideurs aux risques sanitaires et aux effets conomiques potentiels de

la contamination des denres alimentaires et des produits dalimentation animale, et de


promouvoir lharmonisation des rglementations et les procdures de contrle et pour
recommander des stratgies permettant dvaluer, de prvenir et de lutter contre la
contamination par les mycotoxines.
La ncessit de fixer des teneurs maximales en mycotoxines pour les aliments
destins la consommation humaine et animale est gnralement reconnue. Les pays
de l'Union europenne ont dit un rglement pour limiter la prsence des aflatoxines
dans lalimentation humaine (CEE, 1998). La limite maximale admissible en
aflatoxine B1 (ou des aflatoxines totales B et G) ne doit pas dpasser 2g/Kg (ou
4g/Kg pour les aflatoxines totales) dans les arachides, fruits coque et fruits secs et
leur produits de transformation ainsi que dans les crales et leur drivs.
Selon ce mme rglement, la limite maximale pour laflatoxine M1 dans le lait
est quant elle fixe 0,05 g/l sachant que lon estime qu'au plus 1 3 % de
laflatoxine B1 absorbe par une vache laitire est excrte dans le lait sous forme
d aflatoxine M1 (Van Egmond, 1991).
En plus de ces limites communautaires, plusieurs pays du monde ont tabli
leurs limites propres eux concernant les mycotoxines dans les aliments. Le tableau
ci-dessous donne un aperu sur les limites fixes par certains pays europens et les
USA :

Tableau 5: Limites maximales pour les mycotoxines dans les aliments dans
certains pays europens et les USA (Creppy, 2002).
Mycotoxine

Pays
Finlande
Allemagne
Pays-bas
Belgique
Portugal

AFB1

Autriche
Suisse
Espagne
Luxembourg
Irlande
Danemark
Grce
Sude
Norvge
Finlande
Allemagne

AF totales:
(AFB1,
AFB2,
AFG1, et
AFG2)

G. Bretagne
France
Italie
Autriche
Suisse
USA
Belgique
Bosnie
Sude
Autriche
Allemagne
Pays-bas

AFM1
Russie
Suisse

LM (g/kg ou g/l)
2
2
5
5
25
5
20
1
2
1
2
5
5
5
5
5
5
5
5
4
0,05
4
10
50
5 (B2+G1+G2)
0,02 (M1+B1+B2+G1+G2)
5 (B2+G1+G2)
0,01
20
5
1 (B1+G1)
5
0,05
0,05
0,05
0,05
0,02
0,02
0,5
0,02
0,05
0,25

Aliments
Tous
Tous
Tous
Tous
Arachide
Aliments pour enfants
Autres
Tous
Crales, noix
Tous
Mas, crales
Tous
Tous
Tous
Tous
Tous
Tous
Arachides, noix,
Tous
Tous
Enzymes et formulations
Noix, fruits secs
Tous
Arachides
Tous
Aliments pour enfants
Tous
Nourritures de bbs
Tous
Arachides
Crales
Fves, haricots
Drivs laitiers liquides
Lait
Lait
Lait
Beurre
Fromages
Aliments pour enfants
Lait et drivs
Fromages

Tableau 5 (Suite):
Mycotoxine

AFM1

Pays
Belgique
USA
Rp. Tchque
France

LM
(g/kg ou g/l)
0,05
0,5
0,1
0,5

Aliments
Lait
Lait
Lait pour enfants
Lait pour adultes
Lait pour enfants
Lait pour adultes

Bulgarie

0,03
0,05
0,5

USA
Russie
Autriche

1000
1000
750

Bl
Crales
Bl

Romaine
Rp.Tchque

Tous
Aliments pour enfants

Autriche
Suisse
Grce
France
Pays-bas

5
1
20
5
25
5
2
20
5
0

Suisse

1000

Mas

Zaralnone
(ZEN)

Roumanie
Autriche
France
Russie

30
60
200
1000

Crales, huiles vgtales


Crales
Crales, huiles vgtales
Crales, huiles vgtales

T2-toxine

Russie

100

Tous

Doxynivalnol
(DON)

Danemark
OchratoxineA
(OTA)

Fumonisines
(B1+B2)

LM : Limite maximale
AF : Aflatoxines

Crales
Porc
Crales
Crales
Tous
Tous
Crales

VII - IMPACT ECONOMIQUE DES MYCOTOXINES


Malgr les nombreuses recherches qui ont t faites sur laspect toxicologique
et pathologique des mycotoxines chez les populations humaines et animales, sur leur
implication directe ou indirecte dans lapparition de certaines maladies telles les
cirrhoses, les cancers ou certaines maladies nutritionnelles comme le kwashiorkor
(Hendrickse, 1984) ou la maladie du kashin-Beck au Tibet en Inde (Jiambo et al.,
1995), Peu de travaux ont t entrepris dans le but dtudier l'impact financier et
conomique des mycotoxines sur des populations spcifiques aussi bien dans les pays
industrialiss que les pays dvelopps.
Les consquences conomiques engendres par les mycotoxines sont lourdes.
Dans les pays dAmrique du Nord, la productivit des animaux a connu des pertes
normes estimes des billions de dollars par anne (Miller, 1998). Limpact financier
des mycotoxines concerne non seulement les risques pour la sant de lhomme et les
animaux domestiques, mais aussi la dgradation de la qualit des produits agricoles
commercialiss tant pour le march intrieur que pour lexportation.
En sappuyant sur des donnes recueillies en Indonsie, aux Philippines et en
Thalande, Lubulwa et Davis (1994) ont essay de donner une estimation du dgt
conomique annuel, rparti sur diffrents secteurs, provoqu par diffrents
champignons et les aflatoxines (tableau 6). Ces auteurs ont estim que 20 29 % de la
production du mas et mme 22 45 % de la production darachide provenant de ces
trois pays dpassent une concentration en aflatoxines de 50 g/ kg et sont de ce fait
soumis des restrictions dexportations vers les pays disposant des rglementations
sur les limites des rsidus de mycotoxines.

Tableau 6: Estimation du dgt conomique en Millions de $ Australiens, caus


par diffrents champignons et les aflatoxines en Indonsie, aux Philippines et en
Thalande en 1991 (Lubulwa et Davis, 1994)

Secteur

Nature des dgts

Mas

Arachide

Mas et
Arachide

36,8

107,7

176,5

114,7

291,2

71,7

6,2

77,9

319,1

157,7

476,9

Dtrioration de laspect
Dgradation du
extrieur des graines.
70,9
produit commercialis Rancissure, perte du
pouvoir germinatif.
Intoxication humaine

Intoxication des
animaux domestiques
(volaille, porc, btail)

Total

Cancer du foie primaire


d laflatoxine
Diminution de
croissance, strilit,
effets mutagnes,
tratognes,
carcinognes

CHAPITRE II : PROCEDES DE PREVENTION ET DE REDUCTION DES


MYCOTOXINES DANS LES PRODUITS ALIMENTAIRES

I- Gnralits
Les dgts conomiques et les problmes de sant humaine et animale
engendrs par les mycotoxines, court ou long terme, ont pouss les scientifiques
chercher des mthodes efficaces pour rduire les taux de ces substances dans les
aliments ou bien empcher leur production par les moisissures toxinognes
Comme la prsence des moisissures dans les rcoltes est un phnomne naturel,
il serait impossible dliminer toute trace de mycotoxines des produits alimentaires.
Cependant il est possible de minimiser la contamination en prenant des prcautions au
niveau de lentreposage et la manutention des rcoltes aprs la moisson et en
inspectant rigoureusement les produits avant la mise sur le march. La rduction des
taux des mycotoxines relve la fois du rle des agriculteurs, des commerants et des
industriels.
Plusieurs procds ont t tudis afin de prvenir la contamination des
matires premires par les mycotoxines. Chaque essai doit non seulement rduire la
concentration des toxines mais aussi viter que les produits de dgradation ne soient
toxiques ou dtriorent la qualit nutritionnelle des aliments traits. Selon LopezGarcia et Park (1999) un systme de lutte intgr contre les mycotoxines doit se
concevoir trois niveaux de production:
1-Lutte avant rcolte
Sous des climats type tropicaux chauds et humides jugs risque, la prvention
aux champs consiste en lutilisation raisonne dinsecticides, et ce dans le but de
diminuer les lsions des plantes et rduire de ce fait les portes ouvertes
lenvahissement par les moisissures ou lutilisation de fongistatiques inhibant la
croissance des moisissures et empchant la toxinognse. La lutte contre les
infestations dinsectes peut donc aider viter la prolifration des spores et la

production ultrieure des mycotoxines. Cependant ces essais sont trs difficiles
mettre au point et restent peu concluants.
2-Lutte au moment de la rcolte
Le moment de la rcolte a une grande influence sur la production des
mycotoxines. Pendant cette priode, deux facteurs sont contrler : le lavage et le
schage. Ces deux pratiques jouent un rle important dans la prolifration fongique
pendant lentreposage.
3-Lutte et dcontamination aprs rcolte
Les procdures appliques au cours de la priode d'entreposage constituent une
barrire importante pour viter lexposition des consommateurs aux mycotoxines. Les
procds de dcontamination doivent tre efficaces sans rendre impropres la
consommation les denres traites, elles doivent tre simples mettre en uvre et peu
coteux puisque le traitement peut concerner des tonnages importants.
Selon Park (1993), les trois procds dlimination des aflatoxines (physiques,
chimiques ou biologiques) constituent les stratgies de lutte les plus courantes aprs
rcolte, les mthodes sont nombreuses et varient selon le type de mycotoxines, mais
selon Galvano et al, (2001), l'efficacit de chaque approche doit tre value selon des
critres spcifiques savoir :
- Inactiver, dtruire ou liminer la toxine dans l'aliment,
- Ne gnrer aucun rsidu toxique dans laliment,
- Ne pas altrer les proprits technologiques et nutritionnelles de l'aliment,
- Etre techniquement et conomiquement faisable.

II- Procds physiques


Les mthodes physiques sont nombreuses, elles sont bases en gnral sur le
lavage, le schage, le broyage, le tri manuel, la sparation mcanique, le traitement par
un choc thermique et la torrfaction.
-

Traitement thermique

Les mycotoxines sont en gnral thermostables et elles rsistent tous les procds
utiliss pour l'limination des micro-organismes (chauffage et strilisation). Peers et
Linsell (1975) observaient que les aflatoxines restent stables dans les arachides ou
dans le mas aprs un chauffage 200C pendant 30 minutes. Il est noter que les
traitements thermiques dpendent en grande partie d'autres facteurs tels la teneur de
l'aliment contamin en eau et de son pH (Rustom, 1997).
- Irradiation
Lirradiation a t considre pour longtemps comme une solution possible de lutte
contre les microorganismes. Des mthodes satisfaisantes pour l'limination des
mycotoxines ne sont pas encore mises au point. Cependant lirradiation peut tre
envisage pour lutter contre les moisissures toxinognes.
- Extraction
L'extraction des aflatoxines avec des solvants est un procd qui a t tudi pour
leur limination des arachides contamines. Cependant le matriel trait par cette
mthode ne peut tre destin qu'aux animaux. Le rapport solvant/aliment est un
lment crucial dans le procd. Quoique toutes les traces d'aflatoxines puissent tre
limines sans aucun risque de formation de produits toxiques, ce procd reste limit
d son cot trs lev (Rustom, 1997).
- Adsorption
Certains produits possdent des proprits d'adsorption. Ils ont fait l'objet d'tudes
pour valuer leur capacit liminer les mycotoxines des aliments contamins. Selon

Huwig et al. (2001), diffrents adsorbants ont t utiliss avec succs dans des
procds de dtoxification des aliments de btail contamins par les mycotoxines.
C'est le cas des argiles adsorbant les aflatoxines en particulier l'AFB1, le charbon actif
adsorbant la plupart des mycotoxines, et finalement certains polymres comme la
cholestyramine (rsine changeuse d'anions utilise pour l'adsorption des acides
biliaires dans le tractus gastro-intestinal) adsorbant l'OTA.
III-

Procds chimiques

De nombreuses tudes ont valu la capacit des substances chimiques


inactiver ou rduire certaines mycotoxines, cependant la plupart des tudes ont t
axes sur les aflatoxines dans lalimentation animale. D'autres recherches ont port sur
les proprits protectrices d'autres substances contre les effets des mycotoxines. Il est
noter qu'actuellement le rglement europen interdit de dcontaminer les aflatoxines
par des procds chimiques ou de mlanger des produits contamins avec d'autres
produits qui ne le sont pas dans lintention dabaisser la teneur jusqu la limite
maximale admissible.
- Traitement l'ammoniaque
Lammonisation (traitement des denres contamines par l'ammoniaque) est la
mthode chimique qui a fait lobjet des recherches les plus pousses. Selon Park
(1993), le traitement l'ammoniaque est une solution pratique et efficace pour la
dtoxication des aflatoxines dans les denres alimentaires et lalimentation du btail.
Quoique la dcontamination des aflatoxines par lhydroxyde dammonium a
montr une grande efficacit (plus de 99%) et a t utilise avec succs aux USA, en
France, au Sngal, au Brsil, au Mexique et en Afrique du Sud, la FDA "Food and
Drug Administration" nautorise pas ce type de traitement comme solution de
rduction des taux daflatoxines dans les aliments. L'inconvnient majeur de cette
technique est le refus des aliments traits par le btail.

- Bisulfites
Les bisulfites ont t ajouts aux aliments pour inhiber les activits de certaines
enzymes mais aussi pour retarder la croissance des micro-organismes. Doyle et Marth
(1978) ont constat que les bisulfites rduisent les taux des aflatoxines B1 et G1
d'environ 50 % aprs environ 5 jours de traitement et que cette dure peut tre rduite
une journe si la temprature atteint 55 C au cours du procd de traitement.
-

Les antioxydants

La recherche des proprits protectrices des substances anti-oxydantes contre les


effets nfastes des mycotoxines a t largement tudie. Les vitamines (A, D et E) et le
slnium ont donn des rsultats positifs en inhibant la complexation des mycotoxines
l'ADN. Des rsultats similaires ont t obtenus avec les riboflavines et des
carotnodes (Galvano et al., 2001).
IV-

Procds biologiques

Contrairement aux procds chimiques et physiques, les procds biologiques


restent encore moins tudis. Selon Lopez-Garcia et Park (1999), les mthodes
biologiques ayant des proprits de dcontamination efficaces sont en gnral le
rsultat de composs spcifiques produits par des micro-organismes slectionns.
L'existence d'activit de dgradation des mycotoxines dans les graines de crales
stocks pendant l'hiver a t rapporte par plusieurs chercheurs. La toxine DON, les
toxines T-2 et HT-2 peuvent tre dgrades par les enzymes du bl et du mas. Une
rduction du taux de la toxine DON a t observe dans le bl stock une
temprature de -18 C, la strilisation du bl par irradiation permet de prvenir cette
rduction (Karlovsky, 1999). Ruhland et al. (1996) ont rapport que les cellules du bl,
du mas, de la tomate et d'autres plantes transforment compltement l'OTA, la
transformation inclue une hydrolyse, une mthylation et une hydroxylation. Karlovsky
(1999) a aussi rapport la possibilit de dgradation des mycotoxines en particulier

l'OTA, l'AFB1, la DON et la ZEN par la flore du tractus digestif des ruminants (porc,
bovins).
Grce aux informations recueillies dans le domaine de la biotechnologie sur les
microorganismes et l'accumulation des connaissances sur les capacits illimites du
catabolisme des populations microbiennes, plusieurs spcialistes se sont orients
rcemment vers une approche microbiologique pour la dtoxification des aliments
contamins par les mycotoxines. Cette approche consiste en une rduction ou une
dgradation des mycotoxines par des microorganismes spcialiss (Bata et Lastztity,
1999). Les procds biologiques ont plusieurs avantages:
-

La destruction des toxines, leur rduction ou leur inactivation,

L'inactivation des spores et du myclium,

La conservation de la valeur nutritionnelle de l'aliment,

La conservation des proprits physiques du matriel cru,

Le cot faible du processus de dcontamination.

Selon Bhatnagar (1991), la dtoxification biologique des mycotoxines consiste en


une transformation ou une dgradation enzymatique des toxines en produits moins
toxiques. Une fois les microorganismes et les enzymes responsables de la
dtoxification sont dcouverts, les tudes doivent tre focalises sur le dveloppement
et l'optimisation des procdures sous diverses conditions.
1- Interactions entre les mycotoxines et les microorganismes
1-1 Dgradation des mycotoxines par les microorganismes producteurs.
Les moisissures toxinognes sont souvent capables de dgrader les mycotoxines
qu'ils produisent pour les utiliser comme source d'nergie lorsque les conditions
deviennent dfavorables. Hamid et Smith (1987) et Doyle et Marth (1978) ont rapport
la dgradation des aflatoxines par A. flavus. Varga et al. (2000) ont montr la capacit

des souches d'A. fumigatus de dgrader l'OTA dans les milieux de cultures liquides.
Par ailleurs, des souches d'A. niger CBS120.49 se sont montres capables de dgrader
l'OTA et lochratoxine (OT) dans les milieux liquides et solides en secrtant une
enzyme: la carboxypeptidase.
1-2 Dgradation de lAFB1 par Flavobacterium aurantiacum
La premire vidence de la capacit des bactries dgrader les molcules
daflatoxines a t dmontre par Ciegler et al. (1966 a et b). Ces auteurs ont tudi
leffet dun millier de micro-organismes comptant parmi elles des levures, des
moisissures et des bactries. Une seule souche a montr un effet de dgradation
irrversible sur lAFB1 dans des milieux solides et liquides. Il sagit de
Flavobacterium aurantiacum. Le pourcentage de dgradation totale tait de 100%
aprs 88h dincubation.
Lillehoj et al. (1967) ont montr que la temprature optimale de dgradation de
lAFB1 par F. aurantiacum est de 35C et le pH optimum de dgradation est de 6,75.
Lillehoj et al. (1971) ont rapport que lajout dune prculture de 2.1010 cellules /ml
dune prculture de F. aurantiacum de 48 h dgrade 40% de lAFM1 par simple
contact, alors que lincubation pendant 4 h dgrade compltement la toxine.
La dgradation des aflatoxines dans certains aliments par les micro-organismes
et en particulier par F. aurantiacum a t rapporte galement par Hao et Brackett
(1988) et Line et al (1994). Cependant le mcanisme de leur dgradation nest pas bien
connu aussi bien leur devenir. Line et Brackett (1995) ont montr que laddition dune
autre source nutritive (bouillon de trypticase) naffecte pas la dgradation des
aflatoxines indiquant que lAFB1 est probablement dgrade par une voie mtabolique
secondaire.

2- Interactions entre Les bactries lactiques et laflatoxine.


2-1- Effets de laflatoxine sur les bactries lactiques.
Leffet de lAFB1 sur les bactries lactiques au cours de la fermentation a t
tudi par plusieurs auteurs, en particulier leffet d'inhibition des enzymes. Ce
dernier dpend de la concentration de la toxine, de la nature des souches tudies, et de
la nature de lenzyme en question. Lactivit protolytique chez Lactococcus lactis est
inhibe par lAFB1, linhibition est proportionnelle la concentration de la toxine
initiale utilise (Mohran et al, 1984). Ces mmes auteurs ont conclu quil nya aucun
effet inhibiteur chez Lactococcus diacetylactis, Streptococcus thermophilus,
Lactobacillus bulgaricus et Lactobacillus casei.
Sutic et Banina (1990) ont montr quen prsence de lAFB1, des souches de L.
casei, L. plantarum et S. thermophilus, mtabolisme homofermentaire, ont
commenc produire normment de gaz dans des milieux liquides partir du
glucose, du lactose, du sucrose et du galactose. Ces rsultats suggrent que le
mtabolisme htrofermentaire survenu chez les espces tudies est essentiellement
d lAFB1.
Selon Khaddor (1992), lAFM1 utilise une concentration de 1 g/l na caus
aucun effet sur la croissance des bactries lactiques de la fermentation du "leben" et du
yaourt. Cependant une concentration de 5 g/l, il y a inhibition de la croissance et de
la production dacide lactique chez S. thermophilus. Alors que chez L. bulgaricus il y a
seulement diminution de la production dacide. Selon le mme auteur, les bactries
thermophiles sont plus sensibles leffet de lAFM1 que les bactries msophiles
cependant leur morphologie nest pas affecte.

2-2- Rduction des aflatoxines par les bactries lactiques.


Au cours de la fermentation lactique, plusieurs espces bactriennes ont montr des
capacits dgradatives des aflatoxines (Blanco Jose et al., 1988). Rasic et al. (1991)
ont observ une diminution des taux dAFB1 dans le yaourt et le lait acidifi. Les taux
de LAFB1 ajout au lait avant fermentation des concentrations allant de 600, 1000
et 1400 g/kg ont t rduit respectivement de 97, 91 et 90 % dans le yaourt pH 4.
Khaddor (1992), en tudiant la fermentation lactique du yaourt et du "leben" a
montr que les bactries lactiques dgradent lAFM1 mais des pourcentages
variables et il a conclue que les bactries msophiles sont plus efficaces que les
bactries thermophiles. Les souches acidifiantes (Lc. lactis et L. bulgaricus) se sont
montres capables de dgrader lAFM1 beaucoup plus que les souches aromatisantes.
Selon ce mme auteur, la nisine produite par les souches de Lc. Lactis ne semble
pas avoir un effet sur la dgradation de lAFM1 et il a suggr que leffet des bactries
lactiques sur les aflatoxines est probablement d une dgradation enzymatique plutt
qu une limination par acidification ou par une action des bactriocines telle la
nisine.

CHAPITRE III : FERMENTATION PANAIRE TRADITIONNELLE

I- Introduction
Le pain, aliment de base aussi bien en ville qu la campagne, est obtenu par
une technologie alimentaire des plus anciennes inventes par lhomme. Ce sont les
Egyptiens qui furent les premiers observer accidentellement la fermentation panaire
aprs la leve de la pte abandonne au repos. Le pain a subi au cours de lhistoire des
modifications quant ses qualits organoleptiques que nutritionnelles grce au progrs
scientifique.
Au Maroc, la prparation du pain est essentiellement quotidienne et se fait
dune manire traditionnelle en milieu rural. La fermentation de la pte est le rsultat
de lassociation des levures et des bactries lactiques. Par contre en ville la
fermentation est devenue moderne, elle se base uniquement sur lutilisation de la
levure boulangre : Saccharomyces cerevisiae.
II Les agents de la fermentation
1- Les levures
Les levures, micro-organismes eucaryotiques unicellulaires largement rpandus
dans lenvironnement sont utiliss par lhomme depuis des millnaires. Le mot levure
drive du mot latin levare qui se dfinit par le principe qui fait lever le pain. Cest
avec les travaux de Pasteur que le rle des levures dans la fermentation alcoolique a
t mis en vidence. Gnralement on attribue aux levures boulangres des proprits
principales au cours de la fermentation savoir:
- La libration de gaz lors de la dgradation des glucides ce qui entrane une
augmentation du volume du pain.
- Le dveloppement de la texture et de la structure du pain ce qui se traduit par une
bonne maturation de la pte.

- La libration de substances aromatiques outre le CO2 et lthanol, ce qui dveloppe la


flaveur caractristique du pain.
Lespce la plus connue dans la fermentation du pain industriel moderne est S.
cerevisiae. Cependant dautres espces peuvent jouer des rles plus ou moins
importants notamment Cryptococcus albidus, Debaryomyces hansenii, Kluyveromyces
marxianus, Zygosaccharomyces baillii et des souches du genre Candida.
2- Les bactries lactiques
Les bactries lactiques sont largement utilises en industrie agroalimentaire,
leur mtabolisme est toujours fermentaire, elles prsentent souvent plusieurs
auxotrophies pour les acides amins, les acides nucliques, les vitamines et certains
acides gras et elles possdent tous les atouts technologiques essentiels pour lobtention
dune bio-conservation optimale, dun arme et dune caractristique des produits
alimentaires ferments (Coffey et Daly, 1994). De plus les bactries lactiques sont
capables dhydrolyser les phytates et augmenter la biodisponibilit de certains
minraux comme le fer dans le pain ferment (Faid et Tahiri-Hassani, 1994).
Les travaux de Faid et al. (1993) sur la fermentation panaire traditionnelle
marocaine ont permis disoler plusieurs espces des genres Lactobacillus, Leuconostoc
et Pediococcus. Des espces du genre Lactobacillus ont t isoles lors de la
fermentation acide du seigle en Allemagne par Spicher et Schrder (1978) et et par
Baber et Beuguena (1988) en Espagne.
Dautres chercheurs ont isol des espces du genre Leuconostoc partir de la
fermentation du Dawadawa prpar base de crales dans certains pays
dAfrique (Anta et Ibrahim, 1986). Bcker et al. (1994) ont isol des souches
appartenant aux espces L. pontis, L. reuteri et L. sanfransisco et des souches de
l'espce Pediococcus pentosaceus dans les levains du riz et du bl.

Les bactries lactiques jouent plusieurs rles au cours de la fermentation dont le


principal est lacidification de la pte qui contribue au dveloppement dun got
typique du pain au levain. Les acides organiques (acide lactique ou acide actique)
produits lors du mtabolisme homofermentaire ou htrofermentaire peuvent atteindre
des concentrations maximales respectives de lordre de 0.97 % et 0.30 % (Spicher,
1983). Au cours du mtabolisme htrofermentaire il y a production de gaz sous forme
de CO2 en quantit plus ou moins importante mais qui restent infrieures celles
produites au cours de la fermentation de la levure.
Les bactries lactiques sont doues dactivits protolytiques varies et
complexes incluant des protases et des peptidases intracellulaires et extracellulaires
(Exterkate, 1983). Les protines et les acides amins librs dans la pte au cours de la
fermentation panaire jouent un rle dans lapparition darmes caractristiques. La
protolyse dpend du temps de la fermentation, de la temprature, des espces
bactriennes et de la richesse de la farine en protines (Spicher et Nierle, 1984).
III- Technologie panaire et levains traditionnels
1-Technologie panaire
La panification a pour objectif principal lobtention dune pte leve qui aprs
cuisson donne un produit appel : pain. Selon (Testard, 1985), la panification se
droule en plusieurs phases successives :
- Ptrissage : Cette tape dbute par un mlange de la farine, leau, le sel et les
ferments. Cette tape a pour rle la transformation de la farine en une pte homogne.
Les protines du gluten forment un rseau de films lastiques, extensibles et
impermables.
- Le Pointage : Cest la premire fermentation que subit une pte, la pte
acquiert la force, le gluten subit une modification physique devenant plus lastique et
moins extensible.

- La division et le faonnage : La pte est ensuite divise en ptons faonne et


laisse pour subir une deuxime fermentation ou Apprt.
- L'apprt : il dure 1 3 heures, il dpend de plusieurs paramtres savoir la
quantit de levain, la temprature, lhydratation de la pte et le mode de ptrissage.
-La cuisson : Elle se fait entre 250 C et 300C, elle dure entre 10 et 45 minutes,
la dure varie en fonction du volume des ptons.
- Le Ressuage : Cette dernire tape consiste en un refroidissement du pain pour
avoir une humidit bien quilibre et une bonne conservation.
2-Levains traditionnels
La prparation des levains traditionnels est pratique au Maroc en milieu rural
depuis des sicles et elle lest toujours dans certains pays occidentaux (Italie, USA,
Allemagne...) ainsi que dans les pays arabes. Mme si les mthodes de prparation
varient dune rgion lautre ou dun pays lautre, elles consistent en une culture
mixte de levures et de bactries lactiques. Plusieurs mthodes de prparation des
ferments traditionnels sont utilises, elles consistent en un mlange d'un matriel
tranger ("leben", jus de citron, eau de rinage du th, ail) avec de l'eau et de la
farine fermenter. Il est noter que tous les pains obtenus ont tous un mme got
acide.
Selon Tahri-Hassani (1996), la fermentation par les levains traditionnels
prpars partir du leben et du citron offre une meilleure biodisponibilit des
minraux et une amlioration des caractristiques organoleptiques ce qui permettrait
de rsoudre certains problmes nutritionnels. Faid et al. (1994) ont montr que L.
plantarum et L. brevis sont trs actives dans lacidification, et de bons rsultats de
fermentation de la farine ont t obtenus lors de lassociation de L. brevis avec C.
milleri ou S. cerevisiae.

3- Caractristiques du pain au levain


Le tableau 7 rsume les diffrentes caractristiques physico-chimiques du pain
au levain. Quant aux caractristiques aromatiques, lacide lactique et lacide actique
jouent un rle important dans le dveloppement des caractristiques organoleptiques
du pain. Lacide actique est le compos responsable de larme typique du pain au
levain alors que lacide lactique est responsable de la saveur acide.
De nombreux facteurs interviennent dans le got et larme du pain en
particulier le type de la farine et les espces microbiennes constituant le levain (Onno
et Roussel, 1994). Selon Spicher et Stephan (1982), plusieurs groupes de substances
jouent un rle dans larme du pain au levain et dont les origines sont les matires
premires, le mtabolisme fermentaire et les ractions de cuisson. Ces substances
sont : les acides organiques, les esters thyliques des acides organiques, les alcools, les
aldhydes, les ctones, les composs sulfurs, etc.
4 - Interactions levures - bactries lactiques
La fermentation panaire traditionnelle est toujours due linteraction des
levures et des bactries lactiques. La levure boulangre S. cerevisiae est toujours
contamine par une flore de bactries lactiques, celle-ci joue un rle acidifiant de la
pte si la fermentation est maintenue des tempratures relativement leves par
rapport celles des levures.
Les interactions ventuelles entre ces deux populations ont trois origines
possibles. Les modifications du milieu (abaissement du pH, production dacide
actique...), la comptition pour un substrat en concentration limitante et finalement
l'inhibition ou la stimulation de lactivit dune flore envers lautre (Onno et Roussel,
1994).
Gobetti et al. (1995) ont utilis deux associations de levures et bactries
lactiques pour produire un pain acide en Italie. Les auteurs ont not la production de
grandes quantits de composs volatils, dthylactate, dacide lactique et dacide

actique lors de la combinaison des quelques espces de bactries lactiques (L. brevis
et L. plantarum DC400) avec dautres espces de levures notamment S. cerevisiae et S.
exiguus.
Meignen et al. (2001) ont caractris un pain obtenu par une combinaison mixte
de L. brevis et S. cerevisiae. La fermentation combine a entran une rduction de la
production de lthanol mais une augmentation de la production du glycrol, de lacide
actique et de 15 substances darmes dont de forts pourcentages du 3-mthyle 1buthanal, du 3-mthyle 1-buthanol, du 2-mthyle 1-buthanol, dthyle lactate et du 2phnyle thyle alcool. La forte production de ces composs aromatiques est
probablement lie lactivit protolytique des bactries lactiques. Les acides amins
librs sont utiliss par S. cerevisiae pour la production des alcools, une corrlation
entre les concentrations des acides amins et les composs aromatiques a t tablie
(Spicher et Nierle, 1988).

Tableau 7: Principales diffrences entre le pain au levain et le pain la levure


selon Onno et Roussel (1994)

Caractristiques

Pain au levain

Pain la levure

pH

3.8 - 4.6

5.3 - 5.8

Acide actique (seigle)

0.25 - 0.30 %

Acide actique (bl)

0.10 - 0.40 %

0.005- 0.04 %

Acide lactique (seigle)

0.8 - 0.9 %

Acide lactique (bl)

0.4 0.8 %

0.005 - 0.04 %

Conservation

Bonne protection contre les

Sensible laction des

microbiologique

bactries et les fongiques

bactries et des moisissures

Hydrolyse enzymatique assez

Hydrolyse enzymatique

forte. Activit optimale des

faible.

phytates dgradant lacide

Activit rduite des phytates

Aspects nutritionnels

phytique

OBJECTIFS DU TRAVAIL :

Les principaux objectifs du prsent travail sont :

- Etude de la contamination de certaines denres alimentaires par les toxines de


Penicillium (aflatoxines et OTA), et les toxines de Fusarium (ZEN et FB1).

- Etude de la rduction des aflatoxines par voie microbiologique (cas des


bactries lactiques)

MATERIEL ET METHODES

CHAPITRE I : DETERMINATION DES MYCOTOXINES DANS LES DENREES


ALIMENTAIRES

I- Dtermination des mycotoxines dans les crales et les pices


-Principe
Le principe de la dtermination des mycotoxines est bas sur leur extraction des
aliments par des solvants organiques convenables et leur purification sur une colonne
dimmuno-affinit (figure 8).
Les colonnes dimmuno-affinit contiennent chacune un anticorps trs
spcifique pour chaque mycotoxine recherche et la purification de la mycotoxine
dpend de son affinit lanticorps en question. Il est important de noter que
lanticorps peut tre dnatur par une temprature leve et des changements de pH.
Le tampon doit tre toujours au dessus du gel et la colonne doit tre conserve entre 2
et 8C.
Llution de la toxine est effectu par un luant (solvant organique) dnaturant
la liaison anticops-antigne. Lidentification et la quantification de la toxine dans
llut se fait finalement par chromatographie liquide de haute performance (HPLC)
coupl un fluorimtre.
- Echantillonnage
Soixante (60) chantillons de crales dont le bl (n=20), lorge (n=20) et le
mas (n=20) et 55 chantillons dpices dont le piment rouge (n=14), le poivre (n=15),
le cumin (n=14) et le gingembre (n=12), commercialises au Maroc, ont t prlevs
sur les points de vente des villes de Rabat et Sal. Lchantillonnage a t effectu
chez diffrents fournisseurs de telle sorte que les chantillons prlevs soient de
diffrentes origines et ce dans le but davoir une htrognit des prlvements. Tous
ces chantillons ont t transports au Laboratorio alimenti de l'Institut Suprieur
de la Sant (ISS) Rome (Italie) pour l'analyse des mycotoxines.

Figure 8 : Schma montrant les principales tapes utilises pour lanalyse des
mycotoxines par HPLC.

EXTRACTION

Blinder grande vitesse

Papier wattman

DLUTION / FILTRATION
Erlenmeyer

Seringue

ADSORPTION / ELUTION
Gel (tampon)

Colonne dimmuno-affinit
contenant un anticorps spcifique

INJECTION / DTECTION

HPLC
(Dtecteur de fluorescence)

Selon les recommandations europennes rcentes reportes par Miraglia et Brera


(2000), lanalyse des mycotoxines dans les denres alimentaires doit tre cible par les
investigateurs vu lcologie des moisissures qui diffre dune moisissure une autre et
la nature chimique propre de chaque aliment, ainsi selon ces recommandations nous
avons procd aux analyses suivantes :
-

Dtermination de lOTA dans le mas, le bl et lorge.

Dtermination des aflatoxines dans le bl.

Dtermination de la ZEN et de la FB1 dans le mas.

Dtermination des aflatoxines dans les pices

Dtermination de lOTA dans les fruits secs et les olives noires.

I-1 Mycotoxines dans les crales


a- Prparation des standards des mycotoxines
La prparation des standards des mycotoxines a t effectue selon les procdures
dcrites dans le journal officiel AOAC international (2000). Les solutions dilues des
mycotoxines sont peu stables, se dgradent la lumire et doivent tre renouveles
rgulirement. Les mycotoxines sont des substances potentiellement toxiques pour
lhomme, la manipulation des standards doit tre effectue dans un laboratoire
spcialis quip du matriel de protection adquat (gants, hottes daspiration,
masques etc.).
b- Dtermination des mycotoxines dans les crales
- Analyse de lOTA
Les chantillons de crales ont t analyss suivant une mthode valide et
dcrite par Yazdanpanah et al. (2001) avec quelques modifications. 25 g dchantillon
ont t extraits grande vitesse par 100 ml du mlange eau- actonitrile (60:40, v/v) en
utilisant un blinder pendant 3 minutes, puis on effectue une filtration sur papier filtre
wattman n4. 4 ml du filtrat sont dilus par 44 ml dune solution de tampon phosphate
salin (PBS, pH 7,3 ; voir annexe). 46 ml du filtrat dilu ont t appliqus une colonne
dimmuno-affinit (Ochraprep, R-Biopharm Rhne LTD, Glasgow, Royaume-Uni)

contenant un anticorps spcifique de lOTA. La colonne a t lave par 10 ml deau


bidistille et lair a t limin par une seringue jusquau sec. LOTA a t lue par
application en premier de 1,5 ml de mthanol 2% acidifi avec lacide actique
glacial. Llut a t dilu avec 1,5 ml deau bidistille et mlang au vortex. 200 l de
llut dilu ont t injects un HPLC quip dun injecteur automatique et un
dtecteur de fluorescence. La colonne C18 Kromasil KR100 (150 x 4.6 mm, 5m) a
t utilise. La phase mobile utilise tait le mlange actonitrile-eau (2%) acidifi
avec lacide actique glacial (50 : 50, v/v). Le flux a t fix 1 ml.min-1. Le
fluorimtre a t opr des longueurs dondes dexcitation et dmission
respectivement de 333 et 460 nm. Le temps de rtention de l'OTA dans les conditions
dcrites ci-dessus est 5 min.
- Analyse de la ZEN
Les chantillons ont t analyss suivant une mthode valide au laboratoire
(ISS, Rome). 25g dchantillon broys ont t extraits par 125ml dactonitrile 75 %
dans leau bidistille en utilisant un blinder grande vitesse pendant 2 minutes. Aprs
filtration sur papier wattman n4, 20 ml du filtrat ont t dilus par 80 ml deau
bidistille. 25 ml du filtrat dilu ont t appliqus une colonne dimmuno-affinit
(Easi-Extract Zaralenone, R-Biopharm Rhne LTD, Glasgow, Royaume-Uni)
contenant un anticorps monoclonal spcifique de la ZEN. La colonne a t lave par
10 ml deau bidistille et lair a t limin par une seringue jusquau sec. La ZEN a
t lue par application de 1,5 ml de mthanol. Llut a t dilu avec 1,5 ml deau
bidistille et mlang au vortex. 100 l de llut dilu ont t injects un HPLC
(mme quipement que dans lOTA). La phase mobile utilise tait le mlange
actonitrile-eau-mthanol (46:46:8 v/v/v) un flux de 1 ml.min-1. Le fluorimtre a t
opr des longueurs dondes dexcitation et dmission respectivement de 274 nm et
440 nm. Le temps de rtention de la ZEN dans les conditions dcrites ci-dessus est 9.5
min.

- Analyse de la FB1
Lextraction de la FB1 a t faite selon une mthode AOAC dcrite par
Visconti et al. (2001). 25 g dchantillon broys ont t extraits par un mlange
mthanol- actonitrile-eau (25:25:50, v/v/v) en utilisant un blinder grande vitesse
pendant 4 minutes. Aprs filtration sur papier wattman n4, 10 ml du filtrat ont t
dilus avec 40 ml du PBS. Une colonne dimmuno-affinit (Fumoniprep, R-Biopharm
Rhne LTD, Glasgow, Royaume-Uni) contenant un anticorps monoclonal spcifique
des fumonisines (FB1, FB2 et FB3) a t conditionne par 5 ml du PBS. 10 ml du
filtrat dilu ont t appliqus la colonne. La colonne a t lave par 10 ml deau
bidistille et lair a t limin par une seringue jusquau sec. La FB1 a t lue par
application en premier de 1,5 ml du mthanol. Llut a t dilu avec 1,5 ml deau
bidistille et mix au vortex. La drivatisation pr-colonne des extraits a t faite avec
le mlange Ortho-Phtaldialdhyde (OPA) / 2-mercaptothanol (MCE). Le ractif
OPA/MCE est prpar chaque semaine en dissolvant 120 mg de lOPA dans 3 ml du
mthanol auquel on ajoute 15 ml du ttraborate de sodium (0.1M) et 150 ml du MCE.
Le ractif est photosensible et doit tre conserv labri de la lumire. 450 l du
ractif OPA/MCE sont additionns de 50 l de lextrait analyser, mixs au vortex.
Aprs 3 min, 100 l sont injects un HPLC. Le systme HPLC consiste en un
injecteur automatique, un dtecteur de fluorescence et une colonne C18 (150 x 4 mm,
5m). La phase mobile utilise tait le mlange mthanol- dihydrognophosphate de
sodium 0,1M (77 : 23, v/v) ajust un pH 3,35 avec 85% dacide phosphorique. Le
flux a t fix 1 ml.min-1. Le fluorimtre a t opr des longueurs dondes
dexcitation et dmission respectivement de 335 nm et 440 nm. Le temps de rtention
de la FB1 dans les conditions dcrites ci-dessus est 6 min.
- Analyse des aflatoxines
Les chantillons ont t analyss en utilisant une mthode dcrite par Roch et
al. (1994). 50g dchantillon ont t extraits par 250 ml du mlange actone: eau
(85:15 v/v) en utilisant un blinder grande vitesse pendant 3 minutes. Aprs filtration
sur papier wattman n4, 5 ml du filtrat sont dilus par 95 ml dune solution de tampon
phosphate (PBS, pH 7.3). Une colonne dimmuno-affinit (Aflaprep, R-Biopharm

Rhne LTD, Glasgow, Royaume-Uni) contenant un anticorps spcifique des


aflatoxines (AFB1, AFB2, AFG1 et AFG2) est conditionne par 10 ml du tampon
PBS. 50 ml du filtrat dilu ont t appliqus la colonne un flux de 3 ml.min-1, la
colonne a t lave par 20 ml deau bidistille et lair dans la colonne a t limin par
une seringue jusquau sec. Les aflatoxines ont t lues par application en premier de
500 l du mthanol. Ensuite, 1250 l du mthanol ont t appliqus la colonne et
collects par pression de lair travers la colonne. Aprs lution, llut a t dilu
avec 3250 l d'eau bidistille et mlang au vortex. 100 l de llut dilu a t
inject un HPLC (mme quipement que dans le cas de lOTA et la ZEN). La
drivatisation post-colonne a t effectue avec la pyridine hydrobromide perbromide
(PBPB) 0.005 % dans leau bidistille un flux de 0.4 ml.min-1. La colonne C18
Phenomenex (250 x 4.6 mm, 5m) a t utilise. La phase mobile utilise tait le
mlange actonitrile-eau-mthanol (17:54:29, v/v/v) un flux de 1 ml.min-1. Le
fluorimtre a t opr des longueurs dondes dexcitation et dmission
respectivement de 365 nm et 435 nm. Le temps de rtention de lAFB1 a t 7,8 min.
c- Dtermination des aflatoxines dans les pices
Les aflatoxines dans les pices ont t analyses en utilisant une mthode
officielle de lAOAC international reporte par Stroka et al. (2000). 50 g dchantillon
ont t additionns de 5g de NaCl et extraits par 300 ml du mlange mthanol / eau
(80:20 v/v) en utilisant un blinder grande vitesse pendant 3 minutes. Aprs filtration
sur papier wattman n4, 10 ml du filtrat sont dilus par 60 ml dune solution de
tampon phosphate (PBS, pH 7.3). Une colonne dimmuno-affinit (Aflaprep, RBiopharm Rhne LTD, Glasgow, Royaume-Uni) est conditionne par 10 ml du
tampon PBS. 66 ml du filtrat dilu ont t appliqus la colonne dimmuno-affinit
un flux de 3 ml.min-1. La colonne a t lave par 15 ml d'eau bidistille et lair dans la
colonne a t limin par une seringue jusquau sec. Les aflatoxines ont t lues par
application en premier de 1250 l de mthanol la colonne. Llut a t dilu avec
1750 l deau bidistille et mlang au vortex. 100 l de llut dilu ont t injects
un HPLC. Le systme HPLC utilis est le mme que celui que nous avons utilis pour
lanalyse des aflatoxines dans les crales.

II- Dtermination de l'OTA dans les fruits secs et les olives noires de table
1- Echantillonnage
24 chantillons de fruits secs (raisins noirs, raisins blancs, figues et pruneaux)
et 25 chantillons dolives noires de table ont t prlevs sur les points de vente des
villes de Rabat et de Sal. Les chantillons prlevs ont t transports au Laboratoire
de Toxicologie et dHygine Applique de lUniversit Victor Segalen Bordeaux 2,
France, pour analyse de l'OTA.
2- Mthodes de dosage de lOTA
2-1 Prparation des talons de l'OTA
Des solutions d'OTA (Sigma-Aldrich, USA) ont t prpares dans le mthanol,
les concentrations de l'OTA ont t vrifies par dtermination de la DO dans un
spectrophotomtre UV. La quantit ncessaire a t vapore au sec et ensuite dissoute
dans la phase mobile indique ci dessous dans les conditions chromatographiques.
2-2 Dtermination de l'OTA dans les fruits secs
L'analyse de l'OTA dans les fruits secs a t faite suivant la mthode dcrite par
Ospital et al. (1998). 10 g d'chantillon ont t extraits par une solution contenant 50
ml du chlorure de magnsium (MgCl2, 0,4M), 30 ml de tolune et 30 ml d'acide
chlorhydrique 2N par agitation pendant 1h. Les deux phases ont t spares par
centrifugation (3000 g pendant 5 min). La phase organique a t rcupre, filtre et
vapore sec l'aide d'un systme rotavapeur Heidolph WB 2000 (Prolabo, France).
L'extrait est dissous dans 1ml de chloroforme. Une cartouche (Sep-Pak Plus) a t
lave avec 10 ml de tolune et l'extrait a t appliqu la cartouche. Cette dernire est
ensuite lave avec 10 ml du mlange tolune/mthanol (97:3; v/v) et l'OTA a t
finalement lu par 10 ml du mlange tolune / acide actique (90:10; v/v) un flux de
1ml/min. L'lut a t vapore au sec et dissous dans 1 ml de la phase mobile.

2-3 Dtermination de l'OTA dans les olives noires.


L' OTA a t extraite des olives noires suivant la mthode dcrite par Maaroufi
et al. (1995). 10 g d'un chantillon broy ont t extraits par une solution contenant 50
ml de chloroforme et 10 ml d'acide chlorhydrique 0,1M pendant 1h dans un shaker
(Kunkel S250, IKA-Labortechnik, Allemagne). L'extrait a t filtr et le chloroforme
vapor avec un rotavapeur. La phase aqueuse a t dgraisse par le n-hexane qui va
tre limin par la suite. La phase aqueuse Iaire a t alcalinise avec 10 ml du
carbonate de sodium (NaHCO3, 0,1N) et extraite une 2me fois avec 50 ml de
chloroforme pendant 20 min. le chloroforme est ensuite limin et la phase aqueuse
IIaire acidifie avec l'HCl (0,1M) est extraite une 3me fois avec 50 ml de chloroforme
pendant 20 min. Le chloroforme a t vapor sec l'aide d'un rotavapeur. Le rsidu
sec obtenu est dissous dans 1 ml de la phase mobile.
2-4 Conditions chromatographiques
Le systme HPLC consiste en une pompe (Bischoff Model A 2200), un
autoinjecteur (Model 738, ICS: instrumentation, Consommable Service, France), un
moniteur de fluorescence (Shimadzu Model RF-551) et un logiciel (PIC3, ICS). La
colonne Spherisorb ODS 1 (250 x 4.6mm x 10 m) a t utilise. La phase mobile
dgaze et filtre travers un filtre Millipore (0.45m) consiste en 48% d'actonitrile
et 52% d'actate de sodium acide actique 4mM (19/1: v/v). Le dbit a t fix 1
ml/min. Le dtecteur de fluorescence a t manipul des longueurs d'excitation et
d'mission respectivement de l'ordre de 330 nm et 470 nm.
2-5 Confirmation de l'OTA
0,5 ml de l'extrait final ont t vapors au sec et additionns de 0,4 ml d'un
tampon Tris (0,04 M), NaCl (1M) ajust pH 7,5. A cette solution, on ajoute 100 l
de lenzyme carboxypeptidase (Sigma, Rf. C-0261, 100 U/ml) et l'ensemble est
incub 37C pendant 3 heures. 50 l de cette solution ont t analyss par HPLC
sous les conditions chromatographiques cites en haut.

II - Dcontamination des mycotoxines


La dcontamination des mycotoxines a t faite selon les procdures
internationales de l'IARC dcrite par Castegnaro et al. (1991). la fin des analyses,
tout le matriel utilis pour lextraction des mycotoxines doit tre dcontamin par une
solution dhypochlorite de sodium (eau de javel dilu au 1/2) pendant toute la nuit sous
une hotte de scurit chimique. Un lavage normal par un dtergent suivi par un rinage
avec de leau distille doivent tre effectus aprs dcontamination.
III - Contrle et assurance de qualit
Le contrle de qualit des mycotoxines a t ralis selon les recommandations
dcrites par Brera et Miraglia (1996). Pour chaque srie danalyse, des chantillons
analyser ont t fortifis (spike) avec des concentrations bien dtermines des
mycotoxines. Ensuite, une homognisation des chantillons est ralise et le solvant
est laiss vapor pendant toute la nuit. Les chantillons fortifis ont t analyss avec
chaque srie danalyse pour dterminer le pourcentage de recouvrement pour chaque
mycotoxine et chaque matrice.
Pourcentage de recouvrement (Rc)
Le pourcentage de recouvrement (Rc) dtermine lefficacit de la mthode
danalyse aprs fortification de certains chantillons analyser avec des quantits bien
connues des mycotoxines. Aprs dtermination des Rc, tous les rsultats analytiques
trouvs ont t corrigs en fonction des Rc obtenus. A lchelle internationale, il est
recommand que les Rc accepts doivent tre situs entre 70 et 120 %.
Cm (ch spk) Cm (ch)
Rc % =

x 100
C spk

- Cm (ch spk) : Concentration moyenne de la mycotoxine dans les


chantillons fortifis.

- Cm (ch) : Concentration moyenne de la mycotoxine dans les mmes


chantillons non fortifis.
- C spk : Quantit de mycotoxine ajoute aux chantillons fortifis.
Correction des rsultats
Cm (ch)
Cc (ch) =

x 100
Rc

- Cc (ch) : Concentration finale corrige de lchantillon.

Dviation du standard (SD) et Coefficient de variation (CV)


Pour chaque chantillon dune matrice donn, une srie de trois analyses est
effectue, le coefficient SD reprsente la variabilit qui peut avoir lieu entre lanalyse
simultane des mmes chantillons.
( Xi Xm)2
SD =
n-1
- Xi : Concentration de la mycotoxine pendant lanalyse i
- Xm : Moyenne des concentrations de la mycotoxine.
- n : Nombre danalyse effectue.
Le Coefficient de variation est :
SD
Cv = ------------- x100

Xm

CHAPITRE II: ETUDE DES FERMENTS PANAIRES TRADITIONNELS


1- Collection des ferments
Quatre ferments panaires traditionnels ont t collects de diffrentes rgions
rurales du Maroc et ont t transports au laboratoire pour analyses microbiologiques,
physico-chimiques et pour rechercher leur pouvoir de rduction des aflatoxines. Les
diffrents chantillons de levains traditionnels ont t maintenus en activit par
addition successive de la farine de bl et de leau distille strilise et sont incubs
30 C jusqu la leve de la pte.
2- Prparation du levain
La formule de base pour la prparation du levain est la suivante :
-

Farine : 50g

Eau distille chauffe 40C : 30 ml

Ferment panaire : 2 g

- Tous les ingrdients sont mlangs et la pte est bien ptrie


3- Etude physico-chimique des ferments panaires
3- 1- Analyse du pH
5 g de chaque ferment analyser sont mlangs avec 30 ml de leau distille
dans un erlenmeyer, puis sont homogniss. Le pH est mesur laide dun pH mtre
Type WTW, pH 521 (Allemagne)
3- 2- Pouvoir fermentaire
2 g du ferment tudier sont mlangs avec 50 g de la farine et 30ml de leau
distille chauffe 40C. La pte est introduite dans une prouvette gradue de 250 ml
et presse pour occuper un volume prcis. Les prouvettes sont places dans un bainmarie 30C. Laugmentation du volume traduisant lactivit des levains est note
aprs 6h de fermentation.

4- Etude microbiologique des ferments panaires traditionnels


4-1 Dnombrement des levures
Le dnombrement des levures a t fait sur milieu PDA (Potato Dextrose Agar,
voir annexe). L'incubation se fait 30C pendant 48 h.
4-2 Dnombrement des souches de bactries lactiques
Le dnombrement des lactobacilles a t effectu sur le milieu de Man Rogosa et
Sharpe (MRS, voir annexe), alors que le dnombrement des pdiocoques et des
leuconostocs est effectu sur le milieu hypersacharos (voir annexe). Des souches de
bactries lactiques ont t isoles et purifies par des repiquages successifs. Les
souches purifies sont conserves dans des tubes inclins de la glose MRS au
rfrigrateur 4 C.
a- Identification des souches lactiques
Lidentification des isolats est base sur des caractres culturaux, biochimiques et
nutritionnels selon la mthode dcrite par Sharpe (1979).

- Observation microscopique
Dans cette premire tape, ltude a consist en une coloration de Gram des
diffrentes souches isoles partir des cultures jeunes. Leur aspect morphologique a
t galement observ (forme, taille...).
- Recherche de la catalase
Chez les bactries doues dun mtabolisme oxydatif, le systme respiratoire
compte parmi dautres enzymes une catalase, celle-ci dcompose leau oxygne selon
la raction suivante :
Catalase
2 H2O2

2 H2O + O2

La mthode de recherche de la catalase consiste taler une colonie de la souche


tudier sur une lame de verre sur laquelle on ajoute une goutte de H2O2 11 volumes.
La prsence de l'enzyme se manifeste par un dgagement de bulles de gaz.
- Croissance diffrentes tempratures
Cette tape va nous permettre dtudier le pouvoir de croissance des souches
isoles des tempratures diffrentes et de ce fait distinguer les bactries msophiles
des thermophiles. Deux boites de ptri par souche contenant le milieu MRS sont
incubes lune 45 C et lautre 30C. Lexamen du pouvoir de croissance est
observ aprs 48 h.
- Production de gaz
Elle est tudie aprs culture de la souche dans des tubes contenant le milieu
MRS par piqre centrale en profondeur. Lincubation se fait 30 C pendant 48h. La
production de gaz se manifeste par un dtachement de la glose du fond du tube.
- Dsamination de larginine
Les souches sont ensemences dans des tubes contenant le bouillon MRS
additionn de 0.3 % darginine monohydrat. Lincubation se fait 30 C pendant
48h. La rvlation se fait par le ractif de Nessler (voir annexe). Lorsque la
dsamination de larginine a lieu, le milieu vire de la couleur rose la couleur brune.
- Fermentation des sucres
Des solutions de diffrents sucres 10 % (Maltose, Xylose, Galactose,
Raffinose, Lactose, Mlibiose, Arabinose et Cellobiose) sont strilises par filtration.
0,5 ml de chaque solution de sucre est additionn un milieu de base (voir annexe).
Puis on ensemence par des cultures bactriennes jeunes. La lecture est faite aprs
incubation pendant 48 h 30C par comparaison au tmoin glucose et au tmoin sans
sucre. La fermentation des sucres se traduit par une production dacide dans le milieu
qui vire du pourpre au jaune. Dans le cas de lesculine le milieu vire en noir (milieu
lesculine voir annexe).

CHAPITRE III : ETUDE DE LA REDUCTION DES AFLATOXINES


I- Activit anti-aflatoxinognique des bactries lactiques
a- Microorganismes
Les souches dAspergillus parasiticus NRRL2999, productrices d'AFB1, que
nous avons utilises dans cette tude font partie de la collection des micro-organismes
du Laboratoire de Microbiologie Alimentaire et Biotechnologie de lI.A.V Hassan II.
Les bactries lactiques tudies sont : L. brevis Lb1; L. casei Lc12; L. lactis (Lb5 et
Lb8); L. (Lb7 et Lb9); L. rhamnosus (Lb21, Lb31, et Lb50); Ln. mesenteroides Ln13;
et P. acidilactici P55.
b- Conditions de culture
Leffet anti-aflatoxinognique des bactries lactiques a t tudi sur A.
parasiticus NRRL 2999 dans le Bouillon Lab-Lemco-Tryptone (LTB, voir annexe)
selon la mthode dcrite par Coallier-Ascah et Idziak (1985). Des flacons de 100 ml
contenant 50 ml du bouillon LTB ont t prpars et striliss 120C pendant 15
min, le pH du milieu est ajust 6,8 avant strilisation. Chaque flacon inocul par les
spores dA. parasiticus a t ensemenc par 0,1 ml dune prculture denviron
103ufc/ml de la bactrie lactique tudier. Lincubation a t faite 28C pendant 8
jours. Un bouillon LTB tmoin inocul uniquement par les spores dA. parasiticus est
ralis et incub dans les mmes conditions.
c- Dnombrement des bactries lactiques
Le dnombrement des bactries lactiques a t effectu le 8me jour dans un
milieu glos MRS, lincubation est faite 30C pendant 48 h.
d- Mesure du pH
Le pH du bouillon LTB ensemenc avec la combinaison entre A. parasiticus et la
bactrie lactique tudier est mesur le 8me jour laide dun pH mtre Type Crison
Micro pH 2000.

e- Extraction et quantification de lAFB1


Lextraction de lAFB1 a t faite selon la mthode dcrite par Gizzarelli et al.
(1993). La quantification de lAFB1 a t faite par HPLC. Le pourcentage de
rduction de production de lAFB1 par A. parasiticus aprs 8 jours de croissance mixte
avec la bactrie tudier est dtermin par rapport la concentration de lAFB1
produite par A. parasiticus dans le bouillon LTB tmoin. Elle est calcule selon la
formule suivante :
% dAFB1 = 100 x [1 - (aire du pic AFB1de lextrait / aire du pic AFB1du tmoin)]
II- Rduction des aflatoxines par les ferments panaires traditionnels
1- Prparation des talons des aflatoxines
On pse environ une quantit m dAFB1 et d'AFG1 (Promochem, France) et on
la dissout dans 100 ml du mthanol pour avoir une concentration finale quon vrifie
l'aide d'un spectrophotomtre UV. Labsorption (DO) de laflatoxine est mesure la
longueur donde dabsorption maximale (Frayssinet et Fremy, 1991). La concentration
finale de laflatoxine est calcule selon la formule suivante :
Concentration (g/ml) = DO x PM x 1000 /
DO: Densit optique.
PM : Pois molculaire.
: Coefficient dextinction molaire.
Le tableau 8 ci-dessous donne les diffrents coefficients molaires et les
longueurs donde des deux aflatoxines tudies B1 et G1 dans les diffrents solvants
qui peuvent tre utiliss.

Tableau 8 : Coefficients molaires et longueurs dondes de lAFB1 et


lAFG1 (AOAC, 2000)

PM
Mthanol
Actonitrile
Benzne/actonitrile
Chloroforme

AFB1
312
/ : 360/21800
/ : 355/20600
/ : 348/19800
/ : 360/20600

AFG1
328
362/18000
360/17800
355/17100
360/19500

2- Fortification de la farine par les aflatoxines


Deux chantillons de farine ont t contamins artificiellement l'un par une
solution dAFB1 et lautre par une solution dAFG1 une concentration finale de 240
g/kg (d'AFB1 ou d'AFG1). Selon Jemmali et Lafont (1971), cette concentration en
aflatoxines est considre sans aucun effet sur les souches composant le levain
traditionnel du pain. Ensuite on procde lvaporation du mthanol sous la hotte et
lobscurit pendant toute la nuit. La farine ainsi contamine par lAFB1 ou lAFG1 est
ensemence avec les ferments rcolts et on procde lanalyse des aflatoxines par
HPLC aprs fermentation pendant 6 h 30C.
3 - Fermentation
Les farines contamines artificiellement par lAFB1 ou lAFG1 sont inocules
par les ferments traditionnels selon la technique de prparation du levain. La
fermentation dure 6 heures une temprature de 30C.
Trois essais de contrle ont t prpars en parallle, lun est ralis avec une
farine contamine avec les aflatoxines (lAFB1 ou l'AFG1) et fermente par la levure
S. cerevisiae. Le 2me essai tmoin a t ralis avec une farine contamine par les
aflatoxines mais non fermente, et finalement le 3me essai a t prpar par une farine
contamine par les aflatoxines, non fermente, mais acidifie par l'ajout de quelques
gouttes dacide lactique (1N) dans la pte (farine, sel et eau distille) pour obtenir un
pH de 3,5.

4- Analyses des aflatoxines


Les aflatoxines ont t extraites et purifies selon une mthode CEE (1992)
relatives aux vgtaux, publie dans le

"Journal Officiel de la Communaut

Europenne N L 327/54".
a- Extraction
50 g de la farine analyser sont mlangs avec 25 ml deau distille et extraits par
250 ml de chloroforme. Le tout est vigoureusement agit pendant 30 minutes laide
dun agitateur. Le mlange est ensuite filtr sur un papier filtre wattman n4 contenant
du sulfate de sodium anhydre. Lextrait chloroformique est conserv labri de la
lumire.
b- Purification de lextrait
Elle a t faite sur une colonne de gel de silice (Merk, Allemagne). La colonne
est constitue dun tube de verre de 2 cm de diamtre et de 40 cm de longueur quip
dun robinet et comportant sa partie suprieure une ampoule de 150 ml de volume.
La laine de verre est place la base, la colonne a t remplie de chloroforme sur une
hauteur de 20 cm. Ensuite, 5 g de sulfate de sodium anhydre ont t introduits dans la
colonne de faon obtenir une base pleine. Dautre part, 15 g de gel de silice 60
(Machery-Nagel, Allemagne) ont t mis dans du chloroforme et la suspension
translucide obtenue est verse dans la colonne en vitant demprisonner des bulles
dair. Aprs 1 h de repos, 15 g du sulfate de sodium anhydre ont t ajouts avec
prcaution. Le chloroforme est alors drain jusqu affleurement avec le sommet du
sulfate de sodium.
50 ml de lextrait chloroformique correspondant 10g de produit de dpart sont
concentrs jusqu un volume denviron 2-3 ml et dposs au sommet de la colonne, le
rcipient est rinc 3 fois par quelque ml de chloroforme qui sont galement introduit
dans la colonne. La colonne est dabord lave par 150 ml dhexane ou dther de
ptrole dpourvus de carbures benzniques, puis par 150 ml dther dithylique. Les

aflatoxines sont lues par 150 ml de chloroforme-mthanol (97-3 : v/v). Le produit


dlution est vapor sec au rotavapeur. La dtermination quantitative est ralise par
HPLC.
c- Dosage des aflatoxines par HPLC
Le rsidu sec obtenu est repris par 100 l de mthanol et mlang avec 50l de
lacide trifluoroactique (TFA) dans un vial. Le vial est agit doucement et laiss
reposer 5 min lobscurit. Puis, 10 l ont t injects dans un appareil HPLC menu
dun dtecteur fluorimtre. La colonne utilise est une colonne C18 (hypersil ODS) en
phase inverse. La phase mobile est compose de lactonitrile / le mthanol / leau
(15/15/70 : v/v/v). Le dbit de la phase mobile est rgl 1 ml /min. Lexcitation est
faite 360 nm et lmission est faite 420 nm.
III- Rduction in vitro de lAFB1 par les bactries lactiques
1- bactries lactiques utilises
Les souches de bactries lactiques utilises dans ce test sont : L. brevis Lb1; L.
casei Lc12; L. lactis (Lb5 et Lb8); L. plantarum (Lb7 et Lb9); L. rhamnosus (Lb44,
Lb21, Lb31, Lb103 et Lb50); Ln. mesenteroides Ln13 et P. acidilactici P55.
2-Protocole exprimental
Le pouvoir de rduction in vitro de l'AFB1 par les bactries lactiques isoles
des ferments traditionnels a t tudi dans le milieu liquide (MRS). Une solution
mre de laflatoxine B1 a servi pour contaminer artificiellement le milieu liquide
MRS, la concentration finale de lAFB1 dans le milieu MRS est de lordre de 5g/ml.
100 ml du milieu MRS contamin sont ensemencs avec 0,1 ml d'une prculture des
souches tudier (103 ufc/ml). Aprs croissance 30C pendant 24 h, la culture est
centrifuge 5000g pendant 15 minutes, le surnagent est rcupr et analys par
HPLC pour la dtection de lAFB1 comme il est indiqu auparavant. Le pourcentage
de rduction de l'AFB1 est dtermin selon la formule suivante:
AFB1 (%) = 100 x [1 (Aire du pic AFB1de lextrait / Aire du pic AFB1du tmoin)]

3- Effet du pH du milieu
Leffet du pH du milieu de culture MRS contamin avec 5 g/ml de lAFB1 est
tudi par ajustement du pH initial avant la fermentation des valeurs de pH (5,5), pH
(4,5) et pH (3,0) laide dune solution strile dacide lactique (1N). Le milieu a t
ensuite inocul avec les souches utilises. Lincubation est faite 30C pendant 24 h.
LAFB1 est ensuite analys par HPLC.
4-Effet de La temprature
Leffet de la temprature sur la rduction de lAFB1 par les isolats a t tudi
dans les mmes conditions dcrites auparavant sauf que lincubation des souches
tudies a t faite trois tempratures diffrentes, 15C, 25C et 37C.
5- Analyse statistique
Tous les essais dans cette tude ont t rpts 3 fois. L'analyse statistique des
donnes a t faite en utilisant le t-test de Student.

RESULTATS ET DISCUSSION

CHAPITRE I: DETERMINATION DES MYCOTOXINES DANS LES ALIMENTS


I- Dtermination des mycotoxines dans les crales et les pices
1- Performance des mthodes analytiques
Les analyses statistiques des mthodes analytiques utilises pour les analyses
des mycotoxines dans les crales et les pices sont reprsentes dans le tableau 9.
Les pourcentages de recouvrement pour lOTA, la ZEN et la FB1 dans les crales et
les aflatoxines dans les pices taient bonnes et se situent dans les limites acceptables
lchelle

internationale

(70-120%).

Les

coefficients

de

variation

pour

la

reproductibilit des chantillons fortifis varient entre 1,52 et 24,3%.


2- Les mycotoxines dans les crales
-

Analyse de l'OTA
Les rsultats de la contamination des crales par les mycotoxines sont

regroups dans les tableaux 10 et 11. Comme il est indiqu, 40, 55 et 40 % des
chantillons totaux de mas, dorge et du bl analyss sont respectivement contamins
par lOTA. Dans les chantillons dorge, la concentration moyenne de lOTA est de
lordre de 0,09 g/kg, alors que l'incidence de lOTA varie entre 0,04 et 0,8 g/kg.
Dans les chantillons du bl, la concentration moyenne de lOTA est de lordre de 0,17
g/kg et les concentrations varient entre 0,04 et 1,73 g/kg.
Dans les chantillons de mas, la concentration moyenne de lOTA est de
lordre de 0,43 g/kg, alors que la concentration leve en OTA (7,22 g/kg) a t
enregistre dans lchantillon n4. L'incidence de l'OTA dans les chantillons analyss
varie entre 0,05 et 7,22 g/kg.

Tableau 9 : Quelques performances des analyses statistiques des mthodes analytiques


de l' OTA, la ZEN et la FB1 dans les crales et
des aflatoxines dans les pices.
chantillon

Mycotoxine

Taux de
fortification

Moyenne
Rc (%)

SD 1

CV (%) 2

Orge

OTA (g/kg)

0.11
0.22
0.12

96.56
101.7
94.16

0.005
0.032
0.021

4.50
15.78
17.8

Mas

OTA (g/kg)

0.25
0.7
0.27
0.1

87.5
98.14
83.7
82.3

0.01
0.125
0.025
0.011

3.41
16.6
11.3
9.10

Bl

OTA (g/kg)

0.16
1.7
0.8

85.5
92.3
94.4

0.013
0.04
0.012

9.28
2.66
1.52

Mas

ZEN (g/kg)

25
50
10

116.12
93.66
92.3

6.04
1.45
0.88

24.28
2.9
9.73

Mas

FB1 (mg/kg)

0.78
0.93

80.35
82.5

0.035
0.075

4.33
8.3

Poivre
Gingembre
Piment
Cumin
Poivre
Gingembre
Piment
Cumin

AFB1 (g/kg)

0.1
2
4
1
0.12
2.3
4.5
1.5

84.2
87.5
97.1
94.5
85.6
81.3
92.4
91.2

0.036
0.12
0.25
0.016
0.01
0.012
0.45
0.23

4.5
7.12
6.23
1.9
8.5
3.4
10.2
15.6

1
2

AFG1
(g/kg)

Dviation du Standard,
Coefficient de variation pour la reproductibilit.

Cette valeur (7,22 ppb) est nettement suprieure la valeur maximale limite fixe
par la rglementation des pays de lUnion Europenne concernant lOTA dans les
crales. En France, en Suisse et au Danemark, la limite maximale de lOTA dans les
crales recommande est tablie 5 g/kg (Creppy, 2002).
-

Analyse des AF dans le bl

Concernant lanalyse des aflatoxines dans le bl, les rsultats ont montr que dans
tous les chantillons analyss, les aflatoxines ont t au dessous de la limite de
dtection (0,01 g/kg) dans les conditions chromatographiques dcrites auparavant.
-

Analyse de la ZEN

L'analyse de la ZEN a t effectue seulement dans les chantillons de mas. Selon


Brera (communication personnelle), la ZEN est une mycotoxine spcifique du mas et
des produits base de mas. Les rsultats de la prvalence de cette toxine ont montr
une contamination moins importante que celle de l'OTA. Seulement trois chantillons
ont t contamins par la ZEN soit un pourcentage faible de l'ordre de 15%. La
concentration moyenne de la ZEN est de l'ordre de 2.09 g/kg. Cette valeur est
largement au dessous de la limite maximale fixe par la lgislation franaise
(200g/kg) concernant la ZEN dans les crales et les huiles vgtales (Creppy, 2002).
-

Analyse de la FB1
Comme dans le cas de la ZEN, l'analyse de la FB1 a t effectue dans les

chantillons du mas. La FB1 est un contaminant naturel du mas et en particulier les


produits base de la farine du mas ingrdient majeur de plusieurs aliments
notamment les "cornflakes" et les farines destins aux nourrissants et aux jeunes
enfants.

Les rsultats ont montr que la FB1 contamine 50% des chantillons de mas
analyss, ce qui correspond un pourcentage total de contamination de 50%. Des taux
trs levs ont t trouvs dans l'chantillon 4 (5,96 mg/kg) et l'chantillon 10 (5,5
mg/kg). Les concentrations de la FB1 varient entre 0,01 et 5,96 mg/kg, alors que la
concentration moyenne est de lordre de 0,96 mg/kg.
Ces valeurs dpassent largement la limite maximale (1 mg/kg) de FB1
recommande par la rglementation Suisse dans le mas (Creppy, 2002). Peu de pays
ont fix une rglementation concernant les fumonisines dans les crales, cependant
selon Brera (Communication personnelle), la limite qu'on recommande actuellement et
qui est de 2 mg/kg, sera probablement fixe comme limite maximale rglementaire par
les pays de l'Union Europenne.
- Co-occurrence des toxines d'Aspergillus et de Fusarium
En ce qui concerne la co-occurrence des toxines de Fusarium avec les toxines
d'Aspergillus, 15 et 50 % des chantillons totaux de mas taient respectivement
contamins par la ZEN et la FB1. Tous les chantillons contamins par lOTA ont t
contamins par la FB1. Les concentrations les plus leves de lOTA (7,22 g/kg) et
de la FB1 (5,96 mg/kg) ont t enregistres dans lchantillon n4. Cependant dans
lchantillon n10 o la teneur leve en FB1 tait de l'ordre de 5,5 mg/kg, la cocontamination par lOTA tait relativement faible avec seulement une valeur de 0,11
g/kg. Ces rsultats suggrent que la co-occurrence de lOTA et la FB1 dans les
chantillons de mas analyss est due probablement deux processus de contamination
spars par les moisissures toxinognes dAspergillus et de Fusarium.
Dans cette tude, nous avons trouv galement qu'un seul chantillon de mas
(n7) a t contamin par les trois mycotoxines avec des valeurs basses pour la ZEN
(13,5 g/kg) et OTA (0,05 g/kg) et une valeur relativement leve en FB1 (1,51
mg/kg). Notre tude constitue le premier rapport sur la co-occurrence de l'OTA et les
toxines de Fusarium dans les crales au Maroc.

Tableau 10: Cooccurrence naturelle de lOTA, la FB1 et la ZEN dans les


chantillons du mas analyss.
OTA
(g/kg)

FB1
(mg/kg)

ZEN
(g/kg)

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

0.1
7.22
0.28
0.54
0.05
0.27
0.05
0.11

1.15
1.00
2.61
5.96
0.28
0.01
1.51
0.60
0.70
5.50

16.50
11.8
13.5
-

Moyenne (g/kg)
Echantillons Positifs
(%)

0.43
40

0.96
50

2.09
15

Echantillons de
mas
(n=20)

Tableau 11 : Concentrations de lOTA dans les chantillons de bl et


dorge analyss.
Orge (n=20)

Bl (n=20)
OTA (g/kg)

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Moyenne (g/kg)
chantillons positifs (%)

0,10
0,18
0,13
0,20
0,05
0,12
0,05
0,12
0,80
0,05
0,04
0,09
55

OTA (g/kg)
1
2
3
4
5
6
7
8

0,86
0,16
0,10
1,73
0,04
0,36
0,05
0,06

0,17
40

Le mas est considr parmi les cultures fragiles haut risque de contamination
par les moisissures toxinognes la diffrence des autres crales supposes plus
rsistantes la contamination par les moisissures et la production des mycotoxines
notamment lorge et le bl (Jelinek et al., 1989).
En effet, Scudamore et al. (1998), ont montr la co-occurrence de plusieurs
mycotoxines savoir la zaralnone, la toxine DON, le nivalnol, la FB1 et la FB2, la
moniliformine (toutes avec des taux levs en mg/kg) ainsi que dautres mycotoxines
avec

de

faibles

concentrations

notamment

les

trichothecnes

(15-actoxy

doxynivalnol), les toxines T2 et HT-2 dans des chantillons de mas provenant de


lAngleterre. Selon les mmes auteurs, les fumonisines contaminent tous les
chantillons de mas et leurs drivs, les taux de contaminations ont vari entre 8 et 32
mg/kg.
Park et al (2002), ont montr la co-occurrence de la FB1 avec lAFB1 dans les
chantillons de mas provenant de la Core du Sud, cependant les auteurs ont signal
labsence de toute trace dOTA dans les mmes chantillons analyss.
Au Brsil, la rgion du Sud est connue par la haute incidence du cancer de
lsophage ainsi que par la haute production et la consommation des produits base
de mas. Les chantillons du mas provenant de lEtat de Santa Catarina destin la
consommation humaine ont montr une contamination par les fumonisines B1, B2 et
B3 respectivement de lordre de 3,2 , 3,4 et 1,7 mg/kg. Fusarium verticillioides tait la
souche prdominante dans tous les chantillons analyss (Van der Westhuizen et al,
2003).
En Egypte, El-Sayed et al (2003) ont montr la contamination des chantillons de
mas et des produits base base du mas par plusieurs mycotoxines produites par
Fusarium en particulier les fumonisines. Les niveaux de la contamination par la FB1
taient faibles et variables dun chantillon lautre, ils se situaient entre 0,01 et 0,78

mg/kg. Les auteurs ont montr aussi la rduction de la FB1 par simple cuisson du pain
Balady 450 C, le taux de rduction a atteint 72,4%.
En Italie, Brera et al (2004) ont aussi tudi leffet dun processus industriel sur
le devenir de la FB1 dans le mas, les auteurs ont valu en premier le niveau de la
contamination de diffrents chantillons de mas destins lalimentation humaine et
animale par la FB1, les rsultats ont montr la contamination des chantillons de mas
analyss par des taux variables allant de 0,39 9,56 mg /kg. Dautres part, les auteurs
nont signal aucun effet du traitement thermique sur le niveau de contamination de la
farine de mas analyss.
Il est noter que lorsque deux ou plusieurs mycotoxines contaminent la fois le
mme aliment, les effets de ces toxines sur les consommateurs peuvent saccentuer vu
la possibilit de ractions entre les diffrentes substances toxiques. En effet selon une
recherche rcente, Creppy et al (2004) ont investigu les diffrents effets combins
(antagonisme ou synergie) rsultant de la contamination dun aliment par plus dune
mycotoxine. Les auteurs ont conclu lexistence dun effet de synergie entre lOTA et
la FB1 dans lapparition dune toxicit aigu in vivo.
Au Maroc, les crales occupent une importance primordiale, sociale, conomique
et nutritionnelle pour la population. Elles contribuent environ 12% du produit brut
gnr par l'agriculture. Les marocains dpensent environ 25 % de leur revenu sur ces
produits et on estime que le pays consomme en moyenne 6 millions de tonnes chaque
anne.
En 2010, la population marocaine aura besoin de 8,5 millions de tonnes de
crales pour satisfaire le march intrieur (INRA, 2002). A cause des priodes de
scheresse qua connu le Maroc ces deux dernires dcennies, la production cralire
a enregistr une diminution de 25 85 %, ce qui entrane un approvisionnement
dautres pays trangers pour satisfaire le march national.

Le Maroc importe les crales de plusieurs pays notamment de la France, du


Brsil, des Etats Unies, de la Russie et de l'Australie. Actuellement on estime
quenviron 25 % des crales produites actuellement lchelle internationale sont
contamines par des mycotoxines (Davegowda et al., 1998).
Le Maroc est un pays mditerranen caractris par un climat chaud et une
humidit leve favorisant la croissance des moisissures dans les zones ctires qui
abritent environ 70% de la population totale. Les rsultas que nous avons trouvs
concordent avec les travaux dj effectus sur lOTA notamment ceux de Maaroufi et
al. (1995), Miraglia et al. (1993, 1995), Miraglia et Brera (2000) et Beretta et al.
(2002) qui ont montr que les crales et leurs produits drivs originaires des pays de
la rgion mditerranenne peuvent tre contamins par les mycotoxines (OTA, ZEN et
FB1) vu le climat de la rgion caractris par une chaleur humide et une temprature
leve favorisant la croissance des moisissures toxinognes.

3- Les Aflatoxines dans les pices


L'incidence des aflatoxines dans les chantillons d'pices analyses est
reprsente

dans les tableaux 12 et 13. Les rsultats montrent la prsence des

aflatoxines dans les pices analyses avec des pourcentages variables : 94,62 %,
53,5%, 53,3%, et 17,82 % respectivement des chantillons du piment, du Gingembre,
du poivre, et du Cumin.
-

Les aflatoxines dans le piment et le gingembre


Les concentrations des aflatoxines totales varient respectivement de 1,3 9,68

g/kg et de 0,03 9,10 g/kg dans les chantillons de piment et de gingembre


analyss. Dans les chantillons de piment, les incidences des AFB1, AFB2, AFG1, et
AFG2 sont respectivement 100%, 92,8%, 100%, et 85,7 %. Alors que

dans le

gingembre, elles sont de 85,7 %, 50%, 50% et 28,5 %.


Tous les chantillons de piment et de gingembre sont contamins par lAFB1
avec des niveaux variant respectivement de 0,5 5,4 g/kg et de 0,03 3,5 g/kg. 13
chantillons de piment, soit 92,8 % des chantillons totaux, sont contamins avec un
taux d'AFB1variant entre 1 et 6 g/kg, et 2 chantillons de gingembre, soit 16,6 % des
chantillons totaux, sont contamins par un taux d'AFB1 variant entre 1et 4 g/kg.

Tableau 12 : Occurrence des aflatoxines dans les chantillons du piment et


de gingembre analyss.

AFB1

AF (g/Kg)
AFB2
AFG1

AFG2

AFT*

1- Piment (n=14)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14

3,90
3,55
1,50
2,00
2,80
4,00
1,60
1,40
3,00
4,70
5,40
0,50
3,45
2,55

0,20
0,14
0,10
0,08
0,20
0,18
0,10
0,12
0,18
0,17
0,18
0,12
0,10

1,70
2,15
0,54
0,70
2,20
2,30
1,22
0,50
4,00
3,40
4,00
0,80
2,70
4,00

0,05
0,10
0,03
0,02
0,11
0,12
0,03
0,05
0,07
0,10
0,04
0,11

5,85
5,94
2,17
2,80
5,31
6,60
2,95
2,02
7,23
8,34
9,68
1,30
6,31
6,76

chantillons positifs (%)

100

92,8

100

85,7

94,6

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

2,50
0,60
0,05
0,18
0,03
3,50
0,03
0,15
0,06
0,16
0,20
0,05

0,30
0,06
0,40
0,02
0,02
0,05
0,01

2,70
0,80
0,02
0,10
4,80
0,12
0,04
-

0,20
0,06
0,40
0,01
-

5,70
1,52
0,07
0,28
0,03
9,10
0,03
0,30
0,06
0,24
0,25
0,06

chantillons positifs (%)

85,7

50

50

28,5

53,5

2- Gingembre (n=12)

* AF : Aflatoxines totales

- Les aflatoxines dans le poivre et le cumin


Les taux des aflatoxines totales varient entre 0,04 et 0,55 g/kg et entre 0,01 et
0,18 g/kg respectivement dans les chantillons de poivre et de cumin. Les niveaux de
l'AFB1 varient entre 0,03 0,3 g/kg dans les chantillons de poivre, alors que dans
les chantillons du cumin, les taux d'AFB1 varient entre 0,01 et 0,08 g/kg.
Dans les chantillons de poivre, les incidences des AFB1, AFB2, AFG1, et
AFG2 taient respectivement de l'ordre de 46,6%, 20%, 73,3% et 73.3 %. Alors que
dans les chantillons du cumin les incidences des AFB1, AFB2, AFG1, et AFG2
taient respectivement de l'ordre de 57,1%, 7,1%, 7,1% et 0 %.
La contamination des pices par les mycotoxines a t rapporte dans des
travaux antrieurs effectus dans le monde particulirement en Egypte par Selim et al.
(1996), en Ethiopie par Fufa et Urga (1996), au Portugal par Martins et al. (2001) et en
Turquie par Karagz (2001).
En Sultanat dOman, lanalyse de 105 chantillons dpices (cumin, cannelle,
girofle, poivre noir, gingembre) a montr la contamination par Aspergillus flavus, A.
niger. Penicillium, Rhizopus, et Syncephalastrum racemosum. Cependant, les
aflatoxines nont pas t dtectes dans les pices analyses (Elshafie et al, 2002).
Thirumala-Devi et al (2003) ont montr la contamination de 126 chantillons
dpices les plus utilises en cuisine indienne par lOTA avec des concentrations
variant entre 15 et 102 g/kg.
Fufa et al (1996) ont not une forte contamination des pices provenant dAddis
Ababa (Ethiopie) par lAFB1. Les niveaux dAFB1 dans le Shiro et le poivre
variaient respectivement de 100 500 g/kg et de 250 525 g/kg.

Tableau 13 : Occurrence des aflatoxines dans les chantillons du poivre et


du cumin analyss.

AFB1

AF (g/Kg)
AFB2
AFG1

AFG2

AFT *

1- poivre (n=15)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

0,06
0,30
0,04
0,04
0,03
0,04
0,13
-

0,01
0,03
0,01
-

0,05
0,15
0,02
0,06
0,03
0,05
0,10
0,20
0,02
0,05
0,12

0,05
0,40
0,07
0,06
0,14
0,06
0,12
0,24
0,10
0,08
0,13

0,17
0,33
0,55
0,09
0,17
0,17
0,11
0,26
0,44
0,15
0,13
0,04
0,13
0,25

chantillons positifs (%)

46,6

20

73,3

73,3

53,3

0,07
0,08
0,03
0,01
0,02
0,03
0,01
0,01

0,05
-

0,05
-

0,07
0,18
0,03
0,01
0,02
0,03
0,01
0,01

57,1

7,1

7.1

17,8

2- Cumin (n=14)
1
2
3
4
5
6
7
8
chantillons positifs (%)
* AFT : Aflatoxines totales

En Egypte, Selim et al (1996) ont rapport la contamination par lAFB1 des


plantes mdicinales (49 g/kg) et des pices (25 g/kg) provenant du Caire et du Giza.
En outre, El-Kady et al (1995) en analysant 24 types dpices provenant dAssiut, ont
montr la contamination des chantillons de poivre, du carvi, du cumin, du fenouil, de
la menthe par les aflatoxines et la strigmatocystine, cependant lOTA et la ZEN nont
pas t dtects.
En France, Delcourt et al (1994) ont not la contamination des chantillons de
poivre noir et blanc d'une part par les moisissures toxinognes appartenant
essentiellement aux espces Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. niger et A. ochraceus
et d'autre part par lAFB1.
En Angleterre, la contamination de 157 chantillons des herbes et des pices
incluant le cari, le poivre, le piment, la "chilli" en poudre, le gingembre, la cannelle et
le coriandre par les aflatoxines a t tudie par MacDonald et Castle (1996), les
rsultats ont montr que 95% des chantillons analyss contenaient moins de 10 g /kg
d'aflatoxines totales. La valeur maximale en aflatoxines totales a t retrouve dans un
chantillon de la "chilli" en poudre avec 48 g/kg. Les mmes auteurs ont montr que
le taux des aflatoxines dans les pices n'a pas t rduit au cours de la cuisson par
diffrentes mthodes.
Au Brsil, selon Gatti et al (2003), lanalyse de 115 chantillons de poivre noir
a montr une grande incidence de contamination par les moisissures toxinognes avec
une prdominance des souches dAspergillus productrices daflatoxines. Cependant les
souches dAspergillus ochraceus productrices dOTA ont t isoles avec de faibles
pourcentages. Freire et al (2000), ont isol du poivre blanc et noir 42 souches
toxinognes appartenant essentiellement Aspergillus flavus et A. niger mais aussi
A. ochraceus, A. tamarii, A. versicolor, Emericella nidulans, Chaetomium globosum,
Penicillium brevicompactum, P. citrinum, P. islandicum et P. glabrum.

Actuellement, seuls quelques pays ont tabli des normes rglementaires fixant
les niveaux maxima concernant les aflatoxines dans les pices. En Italie, la valeur
maximale autorise dans les pices est tablie 40 g/kg pour les aflatoxines totales et
20 g/kg pour l'AFB1. En Uruguay, la limite maximale d'aflatoxines tolrable dans les
pices est de l'ordre de 20 g/kg. Alors qu'en Turquie, la limite recommande d'AFB1
dans les pices est de l'ordre de 5 g/kg (Martins et al., 2001).
Dans la prsente tude que nous avons mene, l'incidence des aflatoxines dans
les chantillons de piment et de gingembre tait leve en comparaison avec les
chantillons de poivre et de cumin.
La recherche des aflatoxines dans plusieurs chantillons de poivre et de cumin
s'est rvle ngative ou a permis de dtecter des quantits faibles. Nos rsultats
concordent avec ceux rapports par Bartine et Tantaoui-Elaraki (1997) qui ont trouv
que la croissance des souches de moisissures toxinognes d'A. flavus tait trs faible
sur le curcumine, le poivre blanc et le poivre noir. Ces mmes auteurs ont signal aussi
que les aflatoxines n'ont pas t dtectes sur le poivre blanc et noir. Par ailleurs, des
quantits trs faibles d'aflatoxines ont t dtectes dans le curcumine aprs 10 jours
de croissance des souches toxinognes d'A. flavus 25C.
En gnral, certaines pices l'tat naturel constituent un milieu non favorable
pour la croissance des moisissures et la production de mycotoxines. Selon Juglal et al
(2002),

les huiles essentielles du girofle et de la cannelle ont montr un effet

inhibiteur sur la croissance dAspergillus parasiticus et de Fusarium moniliforme.


Laddition des extraits du girofle dans les pices a montr une inhibition considrable
de la production des aflatoxines. Cependant nous avons not qu'au Maroc la plupart
des pices commercialises sont frauduleusement additionnes par d'autres produits
comme la farine du bl (luxe) dans le gingembre et le piment tout en insistant sur un
ajout volontaire d'un colorant artificiel pour procurer la couleur normal de l'pice.

Les pices sont dotes de proprits de prservation et elles sont utilises


galement comme antioxydants. Elles sont aussi utilises en mdecine traditionnelle,
ce qui fait que leur valeur marchande est assez leve dans le march international.
Les pices sont produites par les pays ayant un climat tropical ou subtropical
et dont la temprature, l'humidit et les prcipitations sont importantes. Aprs leur
rcolte, les pices sont souvent laisses sur le sol dans une aire ambiante pour
scher. Ce qui constitue dans la majorit des cas des conditions idales pour la
croissance des moisissures et la production de mycotoxines (Martins et al., 2001).
Les pices (poivre, piment, cumin, gingembre etc.) sont largement utilises dans
plusieurs pays du monde notamment en Afrique et en Asie. En cuisine marocaine, les
pices sont utilises notamment pour la prparation de plats chauds et dlicieux
comme les "Tagines et la Tangia", le "Couscous", ou encore "Rfissa" etc., et ce dans le
but dvelopper des gots particuliers ou une couleur adore. Vu leur proprit
antimicrobienne, certaines pices sont utilises aussi dans la conservation
traditionnelle de certains aliments comme le "Kaddid", le "Klia" etc.

II- Dtermination de l'OTA dans les olives noires et les fruits secs
a- Olives noires
En ce qui concerne les chantillons d'olives tudies, les rsultats de l'analyse des
chantillons sont regroups dans le tableau 14. La concentration de l'OTA varie
considrablement d'un chantillon l'autre et se situe entre 0,62 to 4,8 g/kg avec une
moyenne de l'ordre de 1,43 g/kg. L'OTA a t dtecte dans 9 chantillons d'olives
noires ce qui correspond un pourcentage de contamination total de l'ordre de 36 %.
Dans tous les autres chantillons, l'OTA a t au dessous de la limite de dtection de
l'appareil (0,01g/kg). En comparaison avec les donnes dans d'autres pays voisins,
Maaroufi et al. (1995) ont rapport une contamination des olives en Tunisie par l'OTA
atteignant une concentration trs leve de l'ordre 46830 g/kg (l'quivalent de 46,8
ppm).
Au Maroc, la production des olives atteint 6,9 % de la production mondiale.
Jusqu' nos jours les agriculteurs marocains utilisent encore des mthodes
traditionnelles pour rcolter le fruit de l'olivier. La priode de stockage du fruit dure
assez longtemps des tempratures ambiantes (20-25C), ce qui engendre des pertes
conomiques normes rsultant de la dgradation de la qualit des olives fermentes.
Les olives noires de table sont prpares par un ancien processus qui consiste en un
salage et un schage. Les olives noires rcoltes sont dposes dans des sacs. Le salage
est effectu au fur et mesure du remplissage des sacs par les olives par l'ajout du sel
solide en surface. Les sacs seront dposs l'un sur l'autre, puis un matriel lourd
(pierre) est dpos la surface des sacs. Le liquide noir amer est vacu l'extrieur
des sacs par effet du poids et du salage.
Les micro-organismes impliqus dans les altrations postrcolte des fruits avant le
processus de fermentation ont t tudis par plusieurs auteurs. L'tude
microbiologique du fruit aprs rcolte a montr une charge microbienne faible
l'exception des levures et des moisissures (Asehraou et al., 1992). La microflore

reprsentative tait un ensemble d'espces de moisissures qui peuvent tre associes


des problmes d'intoxications alimentaires dus aux mycotoxines.
L'occurrence des moisissures toxinognes dans les olives noires de table prpares
par un processus traditionnel de fermentation non contrle est trs possible. Les
olives noires sont considres parmi les cultures haut risque de contamination par les
mycotoxines. Gourama et al. (1985) ont isol partir des olives noires
commercialises au Maroc, des souches toxinognes d'A. flavus et d'A. ochraceus
capables de produire les aflatoxines et les ochratoxines. Un nouveau processus pour
contrler et acclrer la fermentation des olives noires de tables a t mis au point au
laboratoire par Asehraou et al. (1997) en utilisant un traitement immdiat des fruits
juste aprs leur rcolte. La croissance des moisissures ne peut pas atteindre des
niveaux levs pour produire les mycotoxines. Le point cl du nouveau processus est
l'acclration de la pntration du sel dans le fruit et l'inactivation des spores des
moisissures. Vu la simplicit du processus, il peut tre utilis par toutes les units de
production sans aucune charge ajoute.
b- Fruits secs
Les rsultats de l'analyse de 24 chantillons de fruits secs (11 raisins, 5 figues et 8
prunes) sont rsums dans le tableau 15.
L'OTA a t dtecte dans 10 chantillons de raisins secs, soit 92,5 % des
chantillons totaux, les concentrations de lOTA varient entre 0,02 et 0,25 g/kg avec
une valeur moyenne de 0,096g/kg. Dans les chantillons de prunes, l' OTA a t
dtecte dans 100 % des chantillons avec une concentration moyenne de l'ordre de
0,03 g/kg.
Alors que dans les chantillons de figues, lanalyse a montr que les concentrations
de l'OTA taient au dessous de la limite de dtection. Par ailleurs, nous avons mis en
vidence (dans tous les chromatogrammes des chantillons de figues analyss) la
prsence dun pic juste avant le pic d'identification de l'OTA. Selon Creppy

(communication personnelle). Ces pics pourraient correspondre des molcules


d'ochratoxines probablement encore non identifies. En effet, Les figues sont des fruits
riches en phnylalanine. Le marquage radioactif de la phnylalanine par le

14

C a

montr que cet acide amin est un prcurseur dans la biosynthse des molcules
d'ochratoxines (Harris et Mantle, 2001).
En comparaison avec dautres recherches sur la prvalence des mycotoxines dans
les fruits secs en Egypte, Zohri et Abdel-Gawad (1993) ont montr la contamination de
fruits analyss par les moisissures toxinognes appartenant aux genres Penicillium,
Aspergillus, Cladosporium, Alternaria et Pleospora. Les auteurs ont aussi montr la
contamination des chantillons dabricots (50-110 g/kg) et de figues (60-120 g/kg)
par lOTA, cependant les autres mycotoxines recherches (aflatoxines, citrinine,
patuline, strigmatocystine, diactoxyscirpnol, toxine T2 et zaralnone) nont pas t
dtectes.
Daprs Abarca et al (2003), les moisissures responsables de la production de
lOTA sur les fruits secs appartiennent essentiellement aux Aspergilli noirs comme A.
niger et A. carbonarius. Les souches de cette dernire espce ont fort pouvoir de
production de lOTA sur les raisins secs prlevs du march espagnol que les souches
dA. niger isoles.
En Grce, Stefanaki et al. (2003) ont analys lOTA dans les fruits secs de la vigne
servant pour la production du vin local, les rsultats ont montr une contamination
variable des deux varits (currants et sultanas) avec des concentrations moyennes
respectives de lOTA de lordre de 1,3 et 0,6 g/kg.
Selon Drusch et Ragab (2003), quoique les mycotoxines sont des contaminants
naturels des aliments, elles se trouvent avec de faibles frquences dans les fruits. Il a
t dmontr que la prsence des moisissures sur les fruits nest pas automatiquement
associe avec la contamination par les mycotoxines.

Tableau 14 : Concentrations de l'OTA dans les olives noires analyss


Echantillons

OTA (g/kg)

0,85

2,5

0,73

0,67

4,8

1,24

0,79

0,75

0,62

Moyenne

1,43

Tableau 15 : Concentrations de l'OTA dans les fruits secs analyss


OTA (g/kg)
Raisins:

Prunes:

0,25

0,04

0,03

0,03

0,02

0,02

0,07

0,04

0,02

0,03

0,08

0,05

0,1

0,3

0,03

10

0,06

Moyenne

0.096

0,035

Les normes rglementaires europennes concernant l'OTA dans les fruits secs ont
t fixes 10 g/kg (Abarca et al, 2003). Tous les chantillons de fruits secs analyss
dans cette tude prsentent des concentrations de l'OTA infrieures 0,3 ppb et sont
de ce fait au dessous des limites fixes par les pays de l'Union Europenne. Nos
rsultats concordent parfaitement avec ceux de Filali et al. (2001) qui ont montr que
les jus de fruits et les boissons analyss originaires du Maroc sont peu contamins par
l' OTA la diffrence de certains pays du Maghreb Arabe notamment comme en
Tunisie o la contamination de certains aliments de base par l'OTA a atteint des
niveaux critiques en relation probablement avec les problmes de nphropathies.
Conclusion
Cette premire partie de notre travail a montr la contamination de quelques
denres alimentaires commercialises au Maroc (crales, fruits secs et pices) par les
mycotoxines en particulier par les aflatoxines, lOTA, la ZEN et la FB1. Les niveaux
de la contamination (dans le cas du mas) ont dpass les limites rglmentaires fixes
lchelle internationale.
Lconomie marocaine dpend en grande partie de lagriculture et, notamment,
du dveloppement des exportations des produits agroalimentaires vers les pays de
lUnion europenne. Le renforcement des normes nationales et internationales en
matire de qualit des produits agroalimentaires, la vigilance et lexigence de plus en
plus accrue du consommateur marocain et tranger en matire de qualit de ces
produits, la concurrence internationale qui se fait de plus en plus rude (laccord du
GATT et les accords de libre change de lOMC) ainsi que et les accords bilatraux de
cration de zones de libre change unissant le Maroc avec plusieurs pays en particulier
les Etats-Unis, font que le Maroc doit accorder un intrt grandissant la conformit
de ces produits aux standards internationaux de salubrit. Pour se faire, il est impratif
damliorer le systme de surveillance et de contrle qui permettra aux produits
marocains de rester comptitifs sur le march international.

CHAPITRE II: REDUCTION DES AFLATOXINES PAR VOIE MICROBIOLOGIQUE


A- ETUDE DES FERMENTS PANAIRES TRADITIONNELS
I- Etude physico-chimique
Les ferments panaires que nous avons tudis ont t rcolts de diffrentes rgions
du milieu rural du Sud du Maroc. Ils servaient directement la fermentation de la
farine pour produire du pain acide traditionnel.
1- Mesure du pH
Les valeurs de pH relatives aux diffrents chantillons de levains varient entre
3,02 et 3,71 (tableau 16). Ces valeurs tmoignent de la forte acidit des chantillons
analyss qui sont naturellement ferments. Ces rsultats concordent avec ceux dcrits
par plusieurs auteurs ayant travaill sur la fermentation panaire traditionnelle
marocaine notamment Faid et al. (1993) et Tahri-Hassani (1996). Faid et al. (1994), en
prparant le pain au laboratoire par des mthodes traditionnelles, ont montr que le pH
du levain atteint une valeur de 3,20 pendant la quatrime gnration.
Les tudes de Sugihara (1985) sur le pain Sanfransisco (USA) ont montr que le
pH de la pte atteint une valeur de 3,9 en fin de la fermentation. Ce type de pain
amricain est ferment par une association entre des souches de levures et de bactries
lactiques de lespce L. sanfransisco connue par son pouvoir acidifiant important.
D'autre part, le pain allemand ferment par une combinaison de levures et de bactries
lactiques acidifiantes des espces L. brevis et L. plantarum a atteint une valeur de pH
3,6 (Spicher, 1983).

Tableau 16 : Caractristiques physico-chimiques des ferments panaires analyss


Ferment

pH

Pouvoir fermentaire (ml)

L1

3,71

85

L2

3,02

70

L3

3,25

130

L4

3,02

20

Ces rsultats montrent que les ferments traditionnels marocains que nous avons
tudis ont un caractre acide. Les niveaux dacidit atteints peuvent tre expliqus par
lexistence dacides organiques tels lacide lactique ou lacide actique dans le milieu
produits par les microorganismes responsables de la fermentation de la pte. Ces deux
acides rsultent de la dgradation directe des sucres de la farine et assurent un got
apprci tout en jouant un rle dans la conservation naturelle de la pte obtenue. Le pH
acide joue galement un rle dans lextensibilit de la pte et augmente lactivit des
phytases libres par les bactries lactiques au cours de la fermentation ce qui entrane
une augmentation de la disponibilit des minraux dans le pain.
Ce type de pain acide qui se produit encore au Maroc en milieu rural, mais qui
est malheureusement absent en milieu urbain, est prfr pour ses caractristiques
organoleptiques notamment son got acide et son arme caractristique. Selon Collar
et al. (1992), Les bactries lactiques montrent au cours de la fermentation panaire une
grande affinit aux acides amins qui sont rapidement mtaboliss galement par les
levures pour produire les substances aromatiques.
2-Pouvoir fermentaire
Le pouvoir fermentaire est directement li la production de gaz par les
microorganismes constituant les ferments en question au cours de la fermentation
panaire. Cette production de gaz est attribue en gnral aux levures mais aussi aux
bactries lactiques mtabolisme htrofermentaire.

Lanalyse du pouvoir fermentaire des ferments tudis a montr une variabilit


entre les chantillons analyss. Le tableau 16 montre que les ferments L1, L2, L3 et
L4 ont des pouvoirs fermentaires respectifs de lordre de 85, 70, 130 et 20 ml. Cette
variation peut tre explique probablement par la diffrence de la composition
microbiologique des ferments analyss.
Le pouvoir fermentaire dpend de lactivit des souches utilises. Lassociation
entre levures et bactries lactiques au cours de la fermentation mixte entrane une
modification des caractristiques physico-chimiques du pain en particulier le pouvoir
fermentaire. Ainsi selon Faid et al., (1993), lassociation entre S. cerevisiae et L.
plantarum a entran un pouvoir fermentaire de 122 ml alors que lassociation entre S.
cerevisiae et L. brevis a donn un pouvoir fermentaire de 48 ml.

II- Etude microbiologique


a- Dnombrement des levures
Les levures jouent un rle primordial dans la fermentation panaire
traditionnelle. Les niveaux de leur charge dans les ferments analyss sont prsents
dans le tableau 16. Le Dnombrement des levures a montr une variabilit entre les
chantillons analyss. Le ferment L3 est le plus charg en levures avec une valeur
maximale de 23.107 ufc/g, alors que le ferment L4 sest avr le moins charg en
levures avec une valeur minimale de 85. 105 ufc/g. la moyenne des valeurs des
quatre chantillons est d'environ 108 ufc/g.
Le ferment L4 que nous avons tudi a la particularit de contenir la plus
faible charge en levures (8.5. 106 ufc/g), galement son pouvoir fermentaire est
faible (20 ml). Il est fort probable que la charge de ce ferment en bactries lactiques
htrofermentaires produisant du gaz puisse tre aussi faible.

Les rsultats que nous avons trouvs concordent avec ceux rapports par les
chercheurs qui ont dj investigu la fermentation traditionnelle marocaine. En
effet, les travaux de Tahri-Hassani (1996) ont montr que la charge moyenne des
levures dans les ferments tait de lordre de 14.107 ufc/g.
Les travaux effectus par Faid et al. (1994) sur les ferments prpars au
laboratoire ont montr que la numration les levures montre une variabilit dun
chantillon un autre. Le ferment prpar base du leben traditionnel marocain
contient une population leve en levures (environ 107 ufc/g la 4me gnration) en
comparaison aux autres ferments prpars base de produits vgtaux tels le jus de
citron ou lail.
Les levures identifies par Tahri-Hassani (1996) appartiennent 5 espces
dont deux majoritaires S. cerevisiae (35%) et Candida milleri (30%) et trois
minoritaires savoir C. tropicalis (19%), Pichia saitoi (10%) et Debaryomuyces
hansenii (6%)
En comparaison avec les travaux des chercheurs trangers sur la panification
traditionnelle, Sugihara (1985) a rapport que la population des levures dans le
levain de San Francisco atteint 2.5.107 ufc/g.
La charge importante des levures dans les ferments traditionnels tmoigne de
leur rle dans la leve de la pte au cours de la fermentation. En effet, laspect
spongieux du pain est attribu aux levures. Leur contribution la production des
caractristiques organoleptiques est dune grande importance.
b-Dnombrement des bactries lactiques (tableau 17)
Pour les cocci, le ferment L2 a montr une charge minimale de lordre de
24.107 ufc/g, alors que le ferment L1 a montr la charge maximale de 77. 107 ufc/g.
Pour les bacilles, le ferment L3 a montr une charge minimale de 45. 107 ufc/g, la

charge maximale est de lordre de 58. 107 ufc/g. La charge moyenne des ferments
analyss est respectivement de lordre de 39,5. 107 ufc/g pour les cocci et 51,7.107
ufc/g pour les lactobacilles.
Les rsultats rapports par Faid et al. (1994) concernant la numration des
bactries lactiques dans les ferments produits au laboratoire ont montr que le taux
de ces microorganismes tait infrieur celui des levures au cours de la premire
gnration. Cependant ils commencent dominer la flore totale ds la 4me
gnration except dans le ferment produit laide du leben traditionnel o les
levures sont dominantes pendant les quatre gnrations.
Pour les levains du pain de San Francisco, Sugihara (1985) a rapport des
charges des bactries lactiques relativement leves comprises entre 0,5 et 1,5 109
ufc/g. Dans les levains pour pain au seigle, Spicher (1983) a rapport des valeurs
comprises entre 2.107 et 2.108 ufc/g.
Ces rsultats montrent que la charge leve des ferments analyss en
bactries lactiques tmoigne du rle jou par cette microflore dans le processus de
fermentation panaire traditionnelle, et justifie en particulier les valeurs bas du pH
que nous avons trouvs dans les diffrents chantillons analyss.

Tableau 17 : Dnombrement des levures et des bactries lactiques dans les


ferments panaires traditionnels en ufc 106/g.
Bactries Lactiques
Ferment

Levures

Bacilles

Cocci

L1

15

480

770

L2

150

580

240

L3

230

450

260

L4

8,5

560

310

Contrle

0,4

0,01

0,02

c- Identification des bactries lactiques


Les bactries lactiques isoles partir des ferments tudis ont t observes au
microscope pour dterminer le Gram et la forme des cellules, puis aprs, elles ont
subit la raction de la catalase. Les bacilles et les cocci Gram positifs et qui sont
dpourvus de catalase, ont t tudies pour la production de gaz, la croissance
diffrentes tempratures (15 et 45 C), et pour la dgradation de certains sucres selon
la mthode dcrite par Sharpe (1979).
La fermentation panaire traditionnelle en milieu rural se fait la temprature
ambiante (en gnral de lordre de 28C). La slection naturelle fait que la majorit
des ferments utiliss sont des ferments msophiles. De plus, toutes les souches isoles
de ces ferments taient capables de crotre 15 C.
La production du CO2 permet de diffrencier entre les lactobacilles
homofermentaires et htrofermentaires. Dans notre tude (tableau 18), 49% des
isolats totaux sont des lactobacilles dont 38% sont des homofermentaires et 11% sont
des htrofermentaires.

Les souches des leuconostocs et des pdiocoques reprsentent respectivement


33 % et 18 % de lensemble des isolats des quatre ferments tudis. Sur le plan
technologique, les espces htrofermentaires semblent tre intressantes que les
homofermentaires puisquelles produisent du CO2 et contribuent avec les levures la
leve de la pte.
Les travaux de Faid et al. (1994) ont montr que les lactobacilles dominent la
fermentation lactique dans les ferments produits au laboratoire avec des pourcentages
respectivement de lordre de 75%, 61 % et 67,8 % pour les ferments produits base
du citron, du "leben" et de lail. Alors que Les espces des genres Pediococcus et
Leuconostoc ne sont que faiblement reprsents avec des pourcentages respectifs de
lordre de 2 % et 8 %. Selon les mmes auteurs, les souches homofermentaires
dominant la fermentation panaire traditionnelle appartiennent lespce L. plantarum,
alors que les souches htrofermentaires appartiennent lespce L. brevis.
- Tests biochimiques et culturaux
Les tests biochimiques et culturaux nous ont permis didentifier 50 souches de
bactries lactiques isoles des diffrents ferments analyss. Parmi les isolats totaux
nous avons pu identifier 25 souches parmi le genre Lactobacillus, 16 souches parmi le
genre Leuconostoc et 9 souches parmi le genre Pediococcus (Tableau 19).

- L. brevis
Les souches appartenant cette espce sont de mtabolisme htrofermentaire,
elles fermentent le maltose, le xylose, le galactose, larabinose et dsamine larginine.
Cette espce reprsentait 9% des isolats totaux tudis par Tahri-Hassani
(1996). Faid et al. (1994) ont isol cette espce avec des taux variables respectivement
de lordre de 15, 10 et 9 % dans les ferments traditionnels produits au laboratoire
partir du citron, "leben" et lail. Un procd de fermentation traditionnelle mixte du
pain a t optimis en Italie avec lassociation de S. cerevisiae et L. brevis (Meignen,
2001).

Tableau 18: Pourcentage des genres de bactries lactiques dans les ferments
panaires traditionnels analyss
Genre

Pourcentage

Leuconostoc

33

Lactobacillus (homofermentaire)

11

Lactobacillus (htrofermentaire)

38

Pediococcus

18

Tableau 19 : Distribution des espces de bactries lactiques dans les ferments


traditionnels panaires tudis.
Espce

Nombre

Pourcentage

L. plantarum

L. brevis

10

L. casei

L. rhamnosus

16

L. lactis

12

Ln. mesenteroides

18

Ln. dextranicum

14

P. acidilactici

18

Total

50

100

- L. casei
Elle se prsente sous forme de btonnets courts gnralement en paires. Les
souches de cette espce utilisent le matlose, le galactose, le lactose et le cellibiose.
Cependant aucune souche nutilise le raffinose, larabinose, le xylose et le melibiose.
Cette espce reprsentait 8,7% des souches isoles par Faid et al. (1994) partir
d'un ferment produit laide dune farine fermente spontanment. Elle a t aussi
dcrite auparavant par Spicher (1983) comme espce naturelle de la fermentation du
pain au seigle en Allemagne.

- L. lactis
Cette espce est homofermentaire, son mtabolisme se caractrise par la
fermentation du maltose et de larabinose cependant elle nest pas capable de
dsaminer larginine.
Cette espce a t isole par Faid et al. (1994) dans le ferment produit par une
farine fermente spontanment un pourcentage de 8,7%. Cette espce est frquente
naturellement dans les produits laitiers et elle est mineure chez les vgtaux.

- L. plantarum
Cette espce homofermentaire ne dsamine pas larginine, elle fermente le
maltose, le galactose, le lactose et le cellibiose.
Cette espce existait dans tous les ferments tudis par Faid et al. (1994) des
proportions leves de lordre respectivement de 25 %, 13,3% et 31,8 % dans les
ferments base du citron, du leben traditionnel et de lail. Cette espce est dcrite par
plusieurs auteurs comme la plus active dans la fermentation panaire traditionnelle
(Lonner et Preve-Akesson, 1988).

- L. rhamnosus
Cette espce est particulirement caractrise par la fermentation du rhamnose,
elle a t considre pour longtemps comme une sous espce de L. casei. Vu la faible
proportion de cette espce dans les diffrents levains tudis, elle est difficile de lui
attribuer un rle technologique dans la fermentation panaire traditionnelle. Cependant

L. rhamnosus fait partie intgrante de la flore intestinale autochtone humaine et on la


trouve rarement chez les animaux (Baumgartner et al., 1998).

- Ln. mesenteroides
Cette espce se prsente sous forme de cocci en diplocoques ou en chanettes
mtabolisme htrofermentaire. Les souches de cette espce fermentent larabinose, le
maltose, le saccharose, le galactose, le ribose et le trhalose. Cette espce a t isole
par Azar et al. (1977) du levain Iranien de Shangak. Cette espce a t isole par Faid
et al. (1994) des levains panaires traditionnels marocains.

- Ln. dextranicum
Cette espce produit du CO2 et ne dsamine pas larginine, elle fermente le
maltose le galactose, le cellibiose, le mlizitose et ne croit pas 45C. Elle a t isole
par plusieurs auteurs notamment par Faid et al. (1994) et Tahri-Hassani (1996). Les
Leuconostocs sont moins acidifiantes que les lactobacilles et les pediocoques et jouent
un rle probablement dans les premires phases de la fermentation.

- P. acidilactici
Cette espce supporte des valeurs dacidit leves. De ce fait, elle domine les
phases finales des fermentations vgtales (olives, pain, ensilages). Cette espce ne
produit pas de CO2, ne dsamine pas larginine, elle fermente le maltose, le xylose, le
raffinose, le mellibiose larabinose et le cellibiose et elle croit 45 C. Elle a t isole
par Faid et al. (1994) des levains prpars au laboratoire et par Tahri-Hassani (1996)
des levains traditionnels marocains.

B- ETUDE DE LA REDUCTION DES AFLATOXINES


I- Effet des ferments panaires sur les aflatoxines
a- Fermentation de la farine contamine
La mthode de fermentation que nous avons adopte est celle effectue dans le
milieu rural au Maroc avec de lgres modifications savoir les proportions en sels, et
en inoculum selon le protocole introduit par Faid et al. (1994). La farine que nous
avons utilise dans l'essai de fermentation est analyse au pralable par HPLC pour la
recherche des traces daflatoxines.
b- Analyse des aflatoxines
La quantification des aflatoxines dans la farine fortifie aprs 6 h de
fermentation a t faite par HPLC. Les rductions les plus leves des taux initiaux
dAFB1 et dABG1 ont t obtenues avec le ferment (L4), elles sont respectivement de
lordre de 79.16 % et 91.66 % (figure 9).
Des rductions des taux dAFB1 et dAFG1 ont t observes galement avec les
ferments L2 et L1. Les pourcentages respectifs sont de lordre de 33.33% et 58.33 %
pour lAFB1, 50% et 70.8% pour lAFG1. Cependant le ferment (L3) a montr le
faible taux de rduction de lAFB1 (20.8%) et lAFG1 (41.6%).
En comparaison avec lessai la levure boulangre S. cerevisiae (6.25% pour
lAFB1 et 1.25% pour lAFG1), Les ferments traditionnels ont montr une rduction
leve des taux daflatoxines aprs 6 h. Ce qui suggre quun processus de
dtoxification est probablement mis en jeu au cours de la fermentation par des
microorganismes spcifiques autres que les levures et en particulier S. cerevisiae.
Quand lacide lactique a t ajout la farine non inocule, des rductions faibles
des taux de lAFB1 (1.2%) et de lAFG1 (2.7%) ont t observes. Ceci suggre que

lacide lactique ne joue aucun rle dans le processus dlimination des aflatoxines au
cours de la fermentation panaire traditionnelle.
Plusieurs auteurs ont tudi leffet de lacide lactique sur les aflatoxines.
Cependant des rsultats variables ont t obtenus. Ciegler et al. (1966 b), en ajoutant
de lacide lactique une concentration de 10 % (v/p) pour dcontaminer les graines du
mas, ont constat une rduction considrable de laflatoxine. Cependant, CoallierAscah et Idziak (1985) nont par ailleurs constat aucun effet de lacide lactique ni sur
la biosynthse ni sur la biodgradation des aflatoxines.
Lessai non inocul par les ferments a permis de rduire faiblement le taux des
toxines. LAFG1et lAFB1 ont t rduites respectivement avec des pourcentages de
lordre de 1,6% et 1,16%. Ceci suggre que la rduction des taux daflatoxines aprs
fermentation est due essentiellement leffet des ferments panaires traditionnels.
Daprs plusieurs tudes antrieures (Faid et al., 1993, Faid et al., 1994 et TahriHassani, 1996), les ferments panaires traditionnels marocains sont une association
symbiotique entre levures et bactries lactiques. Jusqu' nos jours, aucune tude na
montr la capacit des levures en gnral et S. cerevisiae en particulier rduire les
aflatoxines. Par ailleurs, plusieurs tudes prliminaires ont montr la capacit des
bactries lactiques complexer ou dgrader les molcules de laflatoxine.

Figure 9: Pourcentage de rduction des aflatoxines par les ferments


panaires traditionnels

Ferment 1

Ferment 2

Ferment 3

Ferment 4

contrle

essai S. cerevisiae

essai l'acide lactique

100
90
80

% de rduction

70
60
50
40
30
20
10
0
AFB1

AFG1
Aflatoxines

II- Activit anti-aflatoxinognique des bactries lactiques.


Les rsultats du dnombrement des souches de bactries lactiques et de la
mesure du pH pendant le 8me jour en croissance mixte avec A. parasiticus sont
reprsents dans le tableau 20. Le nombre des bactries lactiques en fin de croissance
et les valeurs du pH atteints dans le bouillon LTB varient dune souche lautre.
En ce qui concerne les combinaisons des bactries lactiques avec la moisissure
toxinogne, nous avons not que L. casei Lc12 a montr la meilleure croissance
(25,8.107 ufc/ml) en prsence d' A. parasiticus, alors que L plantarum Lb7 a montr la
faible croissance avec un nombre atteint de 3,2. 107 ufc/ml aprs huit jours de
croissance mixte. Quant aux valeurs du pH, le pH le plus bas (3,4) a t obtenu lors de
la combinaison de L. lactis Lb8 avec la moisissure, cependant le pH le plus haut (4,5)
a t obtenu avec les souches Ln. mesenteroides et L. lactis Lb5. Cette variabilit est
le rsultat dune comptitivit entre les bactries lactiques et la moisissure mais
galement le rsultat de la spcificit de chaque souche utilise.
Les pourcentages dinhibition de la production de lAFB1 par A. parasiticus
sont reprsents dans le tableau 21. Les rductions enregistres dans cette tude sont
variables dune bactrie lactique lautre. Elles sont comprises entre 1.24 et 80.5 %.
La rduction maximale de la biosynthse de lAFB1 a t enregistre par L.
lactis Lb5, le pourcentage dinhibition de la production atteint environ 80.5%. Cette
rduction est aussi importante dans le cas de croissance dA. parasiticus en prsence
de L. rhamnosus Lb31 (69.25 %), de L. lactis Lb8 (60.24 %), de L. rhamnosus Lb21
(60.2 %) et de L. rhamnosus Lb50 (58 %). Les souches L. brevis Lb1, L. casei Lc12,
L. plantarum Lb7, L. plantarum Lb9, Ln mesenteroides Ln13 et P. acidilactici P55
ont entran de faibles pourcentages de rduction de la production de lAFB1 allant
1.24 % 5.5 %.

Tableau 20: pH et nombre des bactries lactiques en culture mixte avec A.


parasiticus NRRL2999.

Culture
L. brevis Lb1 + A. parasiticus NRRL 2999
L. casei Lc12 + A. parasiticus NRRL 2999
L. lactis Lb5 + A. parasiticus NRRL 2999
L. lactis Lb8 + A. parasiticus NRRL 2999
L. plantarum Lb7 + A. parasiticus NRRL 2999
L. plantarum Lb9 + A. parasiticus NRRL 2999
L. rhamnosus Lb21 + A. parasiticus NRRL 2999
L. rhamnosus Lb31 + A. parasiticus NRRL 2999
L. rhamnosus Lb50 + A. parasiticus NRRL 2999
Ln. mesenteroides Ln13 + A. parasiticus NRRL 2999
P. acidilactici P55 + A. parasiticus NRRL 2999

Bactries lactiques
en ufc/ml x 107

pH

7,8
25,8
5,8
10,8
3,2
9,7
4,6
7,4
9,8
6,25
15,8

3,6
3,7
4,5
3,4
4,2
4,3
3,7
3,9
4,1
4,5
3,6

Tableau 21: Pourcentages de rduction de la production de lAFB1 par A.


parasiticus NRRL2999 aprs culture mixte avec les bactries lactiques

Culture

% de rduction

L. brevis Lb1 + A. parasiticus NRRL 2999


L. casei Lc12 + A. parasiticus NRRL 2999
L. lactis Lb5 + A. parasiticus NRRL 2999
L. lactis Lb8 + A. parasiticus NRRL 2999
L. plantarum Lb7 + A. parasiticus NRRL 2999
L. plantarum Lb9 + A. parasiticus NRRL 2999
L. rhamnosus Lb21 + A. parasiticus NRRL 2999
L. rhamnosus Lb31 + A. parasiticus NRRL 2999
L. rhamnosus Lb50 + A. parasiticus NRRL 2999
Ln. mesenteroides Ln13 + A. parasiticus NRRL 2999
P. acidilactici P55 + A. parasiticus NRRL 2999

3,41
1,24
80,5
60,24
5,5
5,45
60,2
69,25
58
3,21
2,15

Les proprits antifongiques et antiaflatoxinogniques des espces de bactries


lactiques du genre Lactobacillus sp ont t dcrites par plusieurs auteurs notamment
par Karunaratne et al. (1990). Wiseman et Marth (1981) en tudiant la croissance et la
production daflatoxines par A. parasiticus en prsence de Lc. lactis subsp. lactis, ont
not la prsence d'une comptition rciproque entre les deux microorganismes.
Elgendy et Marth (1981) ont rapport quune combinaison en culture mixte simultane
entre L. casei

et A. parasiticus

rduit la production de lAFB1. Gourama et

Bullerman (1995 a,b) ont confirm laction inhibitrice des espces des bactries
lactiques sur la germination des spores dA. flavus subsp. parasiticus et sur la
production daflatoxines.
Batish et al. (1989) ont test les activits antifongiques de 19 souches lactiques
contre A. parasiticus, A. fumigatus, Rhizopus stolonifer, et Rhizopus sp. Ils ont conclu
que Lc. lactis subsp diacetylactis DRC1 et S. thermophilus 489 avaient une action
inhibitrice importante de toutes les cultures fongiques. Dautres part, A. fumigatus tait
lespce la plus sensible.
Gizzarelli et al. (1993), en tudiant leffet des bactries lactiques sur la production
des aflatoxines par A. parasiticus, ont montr la prsence dune interaction
comptitive entre les deux groupes de micro-organismes dont le mode dpend des
conditions exprimentales et de la nature des micro-organismes comptitifs. Les
auteurs ont montr que les souches de Lc. lactis en culture mixte avec A. parasiticus
montrent une rduction de la production des aflatoxines B1 et G1 respectivement de
lordre de 88 % et 100 %, alors que les souches de Lc. cremoris montrent une
rduction de la production des AFB1 et AFG1 respectivement de lordre de 44% et
22%.
Cependant, selon les mmes auteurs, les souches de L. casei ont montr une
stimulation de la production par A. parasiticus des aflatoxines B1 et G1 de lordre de
527 % et 140% respectivement. Par ailleurs, les souches de L. fermentum et L. casei

nont pas prsent une interaction rgulire vis vis de la croissance dA. parasiticus
et la production des AFB1 et AFG1.
Dans le but de connatre le mcanisme daction par lequel les bactries lactiques
agissent sur les moisissures toxinognes en inhibant totalement ou en rduisant la
production des aflatoxines, plusieurs investigations ont t menes auparavant.
Certains auteurs pensent que leffet inhibiteur est probablement d la diminution du
pH, laccumulation de lacide lactique ou la production de substances actives.
Coallier-Ascah et Idziak (1985) ont suggr quune substance synthtise pendant
la phase exponentielle par Lc. lactis est responsable de linhibition de la production
daflatoxine par A . flavus. Une purification partielle de la dite substance indiquait
quil sagirait probablement dun compos thermostable de faible poids molculaire.
En outre Gourama et Bullerman (1997) ont montr que L. casai pseudoplantarum
371 inhibe totalement la biosynthse de lAFB1 et l AFG1 par A. flavus subsp.
parasiticus NRRL 2999 dans un milieu liquide et que cette activit inhibitrice disparat
compltement aprs traitement thermique 100C pendant 10 min ou sous laction
dune enzyme protolytique.
Dans une autre tude, Batish et al. (1991) ont dmontr que la culture de S. lactis
subsp. lactis 30C pendant 48 72 h produit le maximum dune substance inhibitrice
(polypeptide) contre A. fumigatus.
Karunaratne et al. (1990) ont tudi linhibition de la croissance des moisissures
et la production daflatoxine par Lactobacillus sp. Ces auteurs ont utilis trois espces
(L. acidophilus, L. bulgaricus et L. plantarum) et ont conclu une inhibition de la
croissance de toutes les moisissures utilises. Selon ces auteurs, cette inhibition est due
probablement laction du pH et la croissance des espces comptitives.

Laction de lacide lactique sur linhibition de la production daflatoxines par les


moisissures a galement fait lobjet de plusieurs recherches. En effet Coallier-Ascah et
Idziak (1985) ont suggr que cet acide nest pas un facteur inhibiteur de la
biosynthse des aflatoxines.
Dautres recherches menes par ElGazzar et al. (1987) ont montr que
lacide lactique un pH de 4,5 na pas deffet sur la croissance des moisissures.
Cependant une augmentation de la concentration de lacide lactique entrane une
diminution de la production dAFG1.

III- Rduction in vitro de l' AFB1 par les bactries lactiques


a- Essai de fermentation
Plusieurs stratgies ont t reportes dans la littrature pour l'limination ou
l'inactivation des mycotoxines dans les aliments contamins (Galvano et al., 2001).
Plusieurs spcialistes sont aujourd'hui pour l'opinion que la meilleure approche pour la
dcontamination des mycotoxines soit une rduction ou une dgradation par des
microorganismes spcialiss (Bata et Lastztity, 1999).
L'essai de rduction de l'AFB1 par les souches de bactries lactiques isoles des
ferments panaires est reprsent dans le tableau 22. Les pourcentages de rduction
aprs fermentation varient de 1.8% environ 45%.
Les souches de L. rhamnosus rduisent l'AFB1 avec des pourcentages variant
entre 23,01 44,89 %. Les souches L. lactis Lb5 et Lb8 rduisent 16,81 et 20,26%
dAFB1 respectivement. Alors que la souche L. casei Lc12 rduit environ 22,28 %
dAFB1, et la souche L. brevis Lb1 rduit environ 4,46 % d'AFB1. Les souches L.
plantarum Lb7 et Lb9 rduisent respectivement 2,14 et 5,21% d'AFB1. Alors que les
souches Ln. mesenteroides Ln13 et P. acidilactici P55 rduisent respectivement 2,15
% et 1.80 % d'AFB1.
La souche L. rhamnosus Lb50 rduit plus d'AFB1 que les autres souches isoles
des ferments panaires testes au cours de cette tude. Ces rsultats sont en accord avec
les travaux raliss antrieurement sur les interactions entre les bactries lactiques et
les aflatoxines et notamment ceux ayant utilis L. rhamnosus GG et Lc705 (El- nezami
et al., 1998 a,b) et L rhamnosus Lc1/3 (Peltonen et al., 2001).

Tableau 22: Pourcentage de rduction in vitro de l'AFB1 par les bactries


lactiques (pH 6.5 30C).
Souche

% de rduction de lAFB1 SD*

Lactobacillus brevis Lb 1

4.46 1.0c

Lactobacillus casei Lc12

22.28 1.3a,b

Lactobacillus lactis Lb5

16.81 0.2d

Lactobacillus lactis Lb8

20.26 0.4a,b

Lactobacillus plantarum Lb7

2.14 0.2c

Lactobacillus plantarum Lb9

5.21 0.7c

Lactobacillus rhamnosus Lb 44

25.27 1.5a,b

Lactobacillus rhamnosus Lb 21

23.01 1.3a,b

Lactobacillus rhamnosus Lb 31

31.12 0.9f

Lactobacillus rhamnosus Lb 103

30.77 0.4f

Lactobacillus rhamnosus Lb 50

44.89 2.1e

Leuconostoc mesenteroides Ln 13

2.15 0.5c

Pediococcus acidilactici P5

1.80 0.1c

* Chaque valeur est la moyenne de trois essais d'analyses rptes SD (dviation


standard). Les rsultats portant la mme lettre ne montrent aucune diffrence
significative p < 0,05.

Les souches L. casei Lc12, L. lactis Lb5 et L. lactis Lb8 rduisent d'AFB1 des
taux moyens (16.81 20.26 %). Cependant d'autres souches utilises dans ce travail
comme les souches L. plantarum, P. acidilactici P55, Ln. mesenteroides Ln33 et L.
brevis Lb1 rduisent de faibles taux d'AFB1 (1.8 5.21%). Haskard et al. (2001) ont
rapport que des cellules viables de L. lactis subsp lactis et L. casei Shirota (YIT 901)
rduisent respectivement 59 % et 21.8% d'AFB1.
Selon Megalla et Mohran (1984), leffet de Lc. lactis ATTCC 11454 sur le devenir
de laflatoxine B1 dans un lait ferment, a montr la transformation de cette toxine
tudie en deux mtabolites, laflatoxicol (R0) moins toxique que laflatoxine B1 et
laflatoxine B2a qui est un produit non toxique.
b- Effet des facteurs externes
Dans le but d'tudier l'effet des facteurs externes sur la rduction des aflatoxines,
nous avons slectionn certaines souches qui ont donn une rduction notable de
l'AFB1 suprieure ou gale 10%. Les souches slectionnes appartiennent trois
espces savoir L. lactis, L. casei et L. rhamnosus il s'agit notamment de L. casei
Lc12, L. lactis Lb5, L. lactis Lb8, L. rhamnosus Lb21, L. rhamnosus Lb31, L.
rhamnosus Lb21, L. rhamnosus Lb103 et L. rhamnosus Lb50. Les souches
slectionnes ont t cultives en prsence de l'AFB1 mais des valeurs de
temprature et de pH variables.
b-1 Effet du pH
L'effet du pH sur la rduction de l'AFB1 a t reprsent dans la figure 11. Les
rsultats ont montr que les taux de rduction maximale de l'AFB1 enregistrs une
valeur de pH 5,5 sont nettement suprieures aux taux trouvs aux valeurs de pH 3 et
pH 4,5 pour toutes les souches de bactries lactiques tudies.
Chez les souches de l'espce L. rhamnosus, les pourcentages de rduction de
l'AFB1 pH 5,5 pour les souches L. rhamnosus Lb21, L. rhamnosus Lb31, L.

rhamnosus Lb21, L. rhamnosus Lb103 et L. rhamnosus Lb50 taient respectivement


de l'ordre de 21%, 19%, 28%, 29% et 43 %.
Chez les espces du genre L. lactis, les pourcentages de rduction de l'AFB1 pH
5,5 taient respectivement de l'ordre de 17% et 15% pour les souches L. lactis Lb5 et
L. lactis Lb8. Alors que chez L. casei Lc12, le taux de rduction est de l'ordre de 20%
Le maximum de rduction de l'AFB1 pH 5,5 a t enregistr par la souche L.
rhamnosus Lb50 (43%). Cependant avec la mme souche nous avons enregistr de
faibles pourcentages de rduction de l'AFB1 aux pH 3 (3.4%) et pH 4,5 (4,5%).
b-2 Effet de la temprature
L'effet de la temprature sur la rduction de l'AFB1 a t reprsent dans la figure
10. Les rsultats ont montr que, comme dans le cas du pH, les taux de rduction
maximale de l'AFB1 enregistrs une temprature de 25C sont nettement suprieurs
aux taux trouvs des temprature de 15 et 37C pour toutes les souches de bactries
lactiques tudies.
Chez les souches de l'espce L. rhamnosus, les pourcentages de rduction de
l'AFB1 25C pour les souches L. rhamnosus Lb21, L. rhamnosus Lb31, L.
rhamnosus Lb21, L. rhamnosus Lb103 et L. rhamnosus Lb50 taient respectivement
de l'ordre de 25%, 23%, 31%, 31% et 45 %.
Chez les espces du genre L. lactis, les pourcentages de rductions de l'AFB1
25C taient respectivement de l'ordre de 17 et 20 % pour les souches L. lactis Lb5 et
L. lactis Lb8. Alors que chez L. casei Lc12, le taux de rduction est de l'ordre de 22%
Le maximum de rduction de l'AFB1 25C a t enregistr par la souche L.
rhamnosus Lb50 (45%). Cependant avec la mme souche nous avons enregistr des
taux faibles de rduction de l'AFB1 des tempratures de 15 C (5,5%) et 37C
(25%).

Figure 10: Effet de la temprature sur la rduction de l'AFB1 par les bactries
lactiques. Les barres d'erreurs reprsentent les dviations du standard.
50

45
40
35
30

15C

25

25C

20

37C

%
d

15
10
5
0
1

Souche

Figure 11: Effet du pH sur la rduction de l'AFB1 par les bactries lactiques. Les
barres d'erreurs reprsentent les dviations du standard.
50

% de r duction de l'AFB 1

45
40
35
30

pH5,5

25

pH4,5

20

pH3

15
10
5
0
1

Souche

1: L. casei Lc12; 2: L .lactis Lb5; 3: L. lactis Lb8; 4: L. rhamnosus Lb21; 5: L.


rhamnosus Lb31; 6: L. rhamnosus Lb21; 7: L. rhamnosus Lb103; 8: L. rhamnosus
Lb50.

Nos rsultats concernant les effets du pH et de la temprature sur la rduction de


l'AFB1 par les souches de bactries lactiques tudies, suggrent une relation de
dpendance entre le processus microbiologique tudi (rduction de l'AFB1) et
certains facteurs extrinsques savoir le pH du milieu et la temprature d'incubation.
Cette relation serait probablement typique d'une action enzymatique.
Smiley et Draughon (2000) ont dj mis en vidence une voie de dgradation
enzymatique de l'AFB1 par F. aurantiacum. Dans le but de dterminer le mcanisme
de dgradation de lAFB1 par F. aurantiacum, ces auteurs ont montr que lextrait
protique de cette bactrie a une action sur lAFB1. Le traitement de cet extrait par la
DNase I et la protinase K et leffet combin de diffrents pH sur laction dgradative
de lextrait protique a permis aux auteurs de suggrer que la dgradation de lAFB1
est due une enzyme dont le pH optimum est de 7.
Dans le but de suggrer une voie biochimique possible par laquelle F.
aurantiacum dgrade lAFB1, Dsouza et Brackett (2000) ont montr une
augmentation du pourcentage de dgradation aprs lajout de certains cations (Ca2+ et
Mg2+). Ces cations sont des cofacteurs importants de plusieurs dshydrognases et
dcarboxylases qui interviennent au cours de la glycolyse et du cycle de Krebs.
Lion Mg2+ est connu par son rle stabilisateur des membranes, maintient
lintgrit structurale des protines et des acides nucliques, stabilise les ribosomes,
agit comme cofacteur avec lATP et active des enzymes (Heaton, 1990). Alors que le
Ca2+ joue un rle important dans la structure et le fonctionnement de plusieurs
enzymes. Le Ca2+ est aussi un cofacteur de la -carboxyglutamate dcarboxylase. La
dcontamination chimique de laflatoxine ncessite une dcarboxylation et une
rduction avec libration de produits non toxiques.
Il est possible selon Dsouza et Brackett (2000) que la rduction du groupe
furanne ait lieu pendant la dgradation de lAFB1 par F. aurantiacum. Un autre

mcanisme de dgradation peut avoir lieu avec production de composs dcarboxyls


moins toxiques et qui sont solubles dans l'eau et dans le chloroforme avec production
de CO2 (Line et al., 1994).
Dsouza et Brackett (2001) ont investigu leffet de substances inhibitrices du
systme enzymatique mis en jeu dans la dgradation de lAFB1 par F. aurantiacum, ce
qui aiderait probablement dans son identification, sa purification et sa caractrisation.
Dautres enzymes peuvent intervenir dans ce mcanisme notamment les cytochromes
P450 monooxygnase et les peroxydases (Hamid et Smith, 1987 ; Doyle et al, 1982).
D'autres recherches menes auparavant ont montr que les bactries lactiques du
yaourt sont capables de transformer l'AFB1 en aflatoxine B2a non toxique (Megalla et
Hafez, 1982). Hafez et Megalla (1982) ont montr galement que lensilage a un
potentiel de dtoxification de lAFB1. Rasic et al., (1991) ont montr aussi que la
fermentation du lait contamin artificiellement par les bactries lactiques rduit la
quantit initiale de l'AFB1.
Selon El-nezami et al. (1998 a), les souches de bactries lactiques sont capables
de dgrader lAFB1 dans les milieux liquides contamins. En effet, L. rhamnosus GG
et L. rhamnosus Lc 705 rduisaient des taux levs dAFB1 (80%) par un processus
rapide.
El-nezami et al. (2000) ont montr que L. rhamnosus GG et L. rhamnosus Lc
705 forment des complexes avec lAFB1, ceci a pour consquence une rduction de
labsorption de lAFB1 travers la muqueuse duodnale. Ces auteurs suggrent que la
fixation de lAFB1 par les bactries lactiques est une voie prometteuse pour rduire la
biodisponibilit de lAFB1 en particulier dans les aliments contamins.

Pierides et al. (2000) ont test l'interaction de six souches de bactries lactiques
(L. acidophilus LA1, L. gasseri ATCC 33323, L. rhamnosus GG, L. lactis
spp.cremoris ARH74, L.rhamnosus LC 705 et L. rhamnosus 1/3 ) avec les molcules
de lAFM1 dans le lait reconstitu. Les souches tudies ont t dabord testes dans
un tampon phosphate (PBS), ensuite dans le lait contamin. Les auteurs ont conclu que
la dgradation des aflatoxines est plus nette chez L. rhamnosus GG et L. rhamnosus Lc
705 que chez les autres souches utilises. Dautre part, llimination de lAFB1 tait
encore plus grande que celle de lAFM1. Ceci est probablement d au fait que lAFM1
est plus polaire que l'AFB1 et sa solubilit est grande dans les solutions aqueuses.
Kankaanp et al. (2000), en tudiant l'effet des deux souches probiotiques
L.rhamnosus Lc 705 et L. rhamnosus GG sur l'AFB1, ont suggr que les molcules
daflatoxine se fixent sur la paroi cellulaire des bactries lactiques. Haskard et al.
(2001) ont montr que la fixation de lAFB1 la surface de la paroi bactrienne est
rapide et rversible. LAFB1 peut tre libre aprs des lavages aqueux rpts de la
paroi cellulaire.
Ce phnomne de complexation et de libration des molcules d'aflatoxines par
les composants de la paroi cellulaire a t mis en vidence galement chez les
bifidobactries et les bactries lactiques par Peltonen et al. (2001). En effet, ces
auteurs ont tudi linteraction de 20 souches de bifidobactries et de bactries
lactiques (12 Lactobacillus, 5 Bifidobacterium et 3 Lactococcus) avec lAFB1. Aprs
incubation 37C pendant 24 h, les auteurs ont remarqu que 5,6 59,7 % du taux
dAFB1 est complex par les souches testes. Deux souches de L. amylovorus et une
souche de L. rhamnosus ont t capables de complexer plus de 50% dAFB1.
Quoique le mcanisme de rduction ou de dgradation de l'AFB1 par les
bactries lactiques soit encore mconnu, il a t suggr qu'au dbut de leur interaction
les molcules d'aflatoxines se complexent aux composs de la paroi cellulaire
bactrienne. Haskard et al. (2001) ont suggr que la fixation de l'AFB1 la paroi se

fait par des liaisons faibles non covalentes telle une complexation avec les sites
hydrophobes la surface de la paroi bactrienne.
Dans des travaux rcents, les interactions entre d'autres mycotoxines et des
souches lactiques ont t tudies par El-nezami et al. (2002). Les auteurs ont montr
que les souches de L. rhamnosus GG et L. rhamnosus Lc-705 sont capables de rduire
la ZEN et son driv l'-zaralenol aprs une raction instantane avec les bactries.
Turbic et al. (2002) ont montr que les souches L. rhamnosus rduisent l'AFB1
(77-99%) et l'OTA (36-76 %) avec des pourcentages variables. Paralllement, de
faibles quantits (9-28%) d'autres substances aromatiques comme la cafine, la
vitamine B12 et l'acide folique ont t rduites par les mmes souches. Les auteurs ont
suggr qu'un processus de dtoxification est probablement dclench par les souches
de L. rhamnosus quand elles entrent en contact des molcules des mycotoxines.
Les ractions mises en jeu au cours de la complxation (adsorption) et la
libration (dsorption) de l'AFB1 la surface des bactries ont t investigues par
Lee et al (2003). Les cellules viables ainsi que les cellules tues par traitement
thermique

de

Lactobacillus

rhamnosus

GG,

L.

rhamnosus

LC-705,

et

Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii JS ont t incubes dans une


solution PBS contenant des concentrations variables de l'AFB1 (0.0017 13.3 g/ml).
Les auteurs ont montr l'existence d'une relation linaire entre le taux d'adsorption
spcifique de l'AFB1 et la concentration d'AFB1 utilises pour toutes les bactries
tudies et que le traitement thermique des cellules altre les proprits d'adsorption de
la surface de la paroi bactrienne.
Dans une rcente tude, El-nezami et al (2004) ont montr que les cellules
viables de Lactobacillus rhamnosus GG ainsi que les cellules tues par traitement
thermique ou par acidit ont une grande capacit d'adsorption de la ZEN. Dans le but
d'identifier le type des interactions chimiques mises en jeu dans ce phnomne, les
cellules de cette souche ont t le sujet d'un ensemble de traitements chimiques et

enzymatiques. Les auteurs ont not une diminution significative du taux d'adsorption
de la ZEN aprs prtraitement des cellules viables et les cellules tues par le mpriodate suggrant que la ZEN se fixe sur les composs carbohydrats de la paroi
cellulaire. Cependant le prtraitement avec la pronase E n'a montr aucun effet sur la
capacit d'adsorption de la ZEN par les cellules viables.
Dans une autre tude similaire, Lahtinen et al (2004) ont investigu les
ractions impliques dans l'adsorption de l'AFB1 la surface de Lactobacillus
rhamnosus GG. Dans le but de connatre exactement les composs qui peuvent tre
mis en jeu au cours de la complxation, les auteurs ont montr que l' AFB(1) se
complexe au peptidoglycanes de la paroi cellulaire de la bactrie tudie.
Conclusion
Cette tude dmontre la capacit de certaines souches de bactries lactiques
isoles des ferments panaires traditionnels marocains appartenant essentiellement aux
espces L. rhamnosus, L. lactis et L. casei rduire la concentration initiale de l'AFB1
dans le bouillon MRS. Les souches de L. rhamnosus rduisent les taux de l'AFB1 avec
des pourcentages levs en comparaison avec les autres souches Lactobacillus sp.
utilises dans ce travail. Les espces L. lactis et L. rhamnosus isoles des ferments
panaires traditionnels marocains ont montr galement un pouvoir de rduction de la
production de lAFB1 par A. parasiticus NRRL 2999.
Les bactries lactiques sont largement utilises au Maroc dans la fabrication
artisanale et la conservation de produits alimentaires comme le pain traditionnel et les
produits laitiers artisanaux (leben). De plus, divers procds biotechnologiques ont t
labors avec succs en utilisant des souches de bactries lactiques pour la
fermentation et la conservation de certains aliments comme les olives, le citron ou bien
pour la stabilisation des diffrents dchets manant de l'industrie agroalimentaire (Faid
et al, 1995,1997 ; Kherrati et al, 1998) pour produire un ingrdient riche en protines
pour l'alimentation animale.

Vu les effets bnfiques des bactries lactiques, micro-organismes classs


actuellement parmi les probiotiques, notamment les effets bnfiques des lactobacilles
sur la sant humaine (Goldin et Gorbach, 1984) en gard leurs proprits
nutritionnelles, leurs proprits de conservation par la scrtion de bactriocines, leurs
stimulation du systme immunitaire et leurs effets sur la stabilisation de la flore
intestinale et leurs effets antitumoraux (Isolauri et al, 1998), leurs capacits de
dgradation de composs toxiques comme la linamarine du manioc (Giraud et
Raimbault, 1994) etc.
Ces micro-organismes bnfiques doivent tre intgres dans des procds de
dtoxification des aliments susceptibles dtre contamins par les mycotoxines et
rduire la biodisponibilit de ces toxines dans la dite de la population marocaine
gnralement inconsciente des problmes de sant engendrs long terme par ces
toxines.

CONCLUSION GENERALE ET PESPECTIVES


Dans ce travail nous avons valu la contamination par certaines mycotoxines
de certains aliments commercialiss au Maroc. Les rsultats montrent que certaines
denres analyses sont contamines:
- D'une part par les mycotoxines produites par les moisissures dites du champ
appartenant essentiellement au genre Fusarium, responsables de la production des
mycotoxines avant rcolte, il s'agit notamment de la ZEN et de la FB1.
- D'autre part par les mycotoxines produites par les espces de moisissures
toxinognes dites de stockage appartenant aux genres Aspergillus et Penicillium et qui
sont responsables de la scrtion des toxines pendant l'entreposage (aprs rcolte). Il
s'agit en particulier des aflatoxines et de l'OTA.
La quantification des taux des mycotoxines par HPLC nous a permis de
constater que la contamination de certains aliments dpasse les normes rglementaires
fixes par la lgislation europenne en particulier l'OTA et la FB1. En ce qui concerne
la co-occurrence des mycotoxines, nous avons trouv que certains chantillons
analyss du mas sont contamins par plus d'une mycotoxine, et nous avons montr
que la contamination par l'OTA et la FB1 rsulte de deux processus de contaminations
spars par les souches dAspergillus et/ou Penicillium dune part et les souches de
Fusarium dautre part.
Dans le but de rechercher de nouveaux procds pour la dtoxification des
aliments contamins par les mycotoxines, nous avons tudi l'effet des ferments
panaires et des souches slectionnes sur les aflatoxines. Les rsultats ont montr que
certaines souches de bactries lactiques appartenant aux espces L. rhamnosus, L.
casei et L. lactis sont capables de rduire l'AFB1 in vitro. Ces rsultats suggrent que
ces souches peuvent tre utilises dans des processus biologiques de dtoxification des
mycotoxines. L'tude de l'effet de certains facteurs extrieurs comme la temprature et

le pH a montr que les bactries lactiques tudies rduisent l'AFB1 probablement par
voie enzymatique.
En perspectives il serait intressant d'largir la gamme des aliments analyser
(produits base de mas, produits destins aux enfants et aux bbs, fromages, lait en
poudre, lait pasteuris, caf, boissons) et de rechercher d'autres toxines (DON, T-2,
et HT-2) pour ractualiser les connaissances sur la contamination des aliments
marocains par les mycotoxines et dterminer la dose de prise journalire (daily intake)
pour chaque mycotoxine. Il est galement intressant d'tudier le degr d'exposition de
la population marocaine aux mycotoxines en analysant ces toxines dans les produits
biologiques en particulier dans le srum et dans le lait maternel d'une population cible.
Ltablissement dun bilan de connaissances sur la contamination des produits
agricoles marocains par les mycotoxines et le renforcement du contrle de ces produits
au niveau national, nous permettraient de rassembler des donnes pour linformation et
la sensibilisation des autorits nationales, ainsi que les producteurs (agriculteurs,
industriels) et les organisations civiles de dfense des droits des consommateurs.
Les rsultats obtenus constitueront un ensemble de donnes qui serviront dans le
lancement dun projet national pour la rglementation des mycotoxines dans les
aliments et la protection du consommateur marocain et tranger dventuels effets
toxiques chroniques associs aux mycotoxines.

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- Varga J, Kriswtina R. et Tren J (2000) Degradation of Ochratoxin A by
Aspergillus species. Int J Food Microbiol, 59: 1-7.
- Visconti A, Solfrizzo M et De Girolamo A (2001) Determination of fumonisins B1
and B2 in corn and cornflakes by liquid chromatography with immunoaffinity column
cleanup: Collaborative study. J AOAC Int, 84(6): 1828-1837.
- Wiseman DW et Marth EH (1981) Growth and aflatoxin production by A.
parasiticus when in the presence of S. lactis. Mycopathologia, 73: 4-7.
- Yazdanpanah H, Miraglia M, Calfapietra FR et Brera C (2001) Natural
occurrence of Aflatoxins and Ochratoxin A in corn and barley from Mazandaran and
Golestan in north provinces of Iran. Mycotoxin Research, 17: 21-30.
- Zohri

AA et Abdel-Gawad KM (1993) Survey of mycoflora and mycotoxins of


some dried fruits in Egypt. J Basic Microbiol, 33(4): 279-288.

ANNEXES

1- Milieux de Culture
Milieu MRS (pH 6,5), Striliser 121 C pendant 15 minutes:
Peptone
10g
Extrait de viande
10g
Extrait de levure
5g
Glucose
20g
Tween 80
1 ml
Phosphate bipotassique
2g
Actatede sodium trihydrat
5g
Citrate d'ammonium
2g
Sulfate de magnsium
0,2g
Sulfate de manganse
0,05
Agar-agar
15g
Glose PDA (pH 4,5), Striliser 121 C pendant 15 minutes:
Infusion de pomme de terre
100g
Dextrose
20g
Agar-agar
15g
Eau distille
1l
Milieu Hypersaccharos (pH 6,8), Striliser 121 C pendant 15 minutes:
Extrait de viande
10g
Extrait de levure
3g
Bactocasitone
2,5g
Saccharose
150g
Phosphate dipotassique
2g
NaCl
1g
Sulphate de magnsium
0.2g
AgarAgar
15g
Eau distille
1l
Milieu de base des sucres (pH 6), Striliser 121 C pendant 15 minutes:
Peptone
10g
Extarit de levure
5g
Tween 80
1ml
Citrate d'ammonium
2g
Actate de Sodium
5g
Sulfate de magnsium
0,1g
Sufate de manganse
0.05g
Hydrognophosphate bissodique
2g
Pourpre de bromocrsol
0.15g
Eau distille
1l

Milieu l'esculine (pH 7,4), Striliser 121 C pendant 15 minutes:


Peptone trypsique de casine
10g
Extrait de levure
5g
Actate de sodium
5g
Tween 80
1ml
Sulfate de manganse
0.05 g
Sulfate de mangnsium
0.2g
Esculine
5g
Citrate de fer ammoniacal
0.5g
Eau distille
1l
Bouillon Lab-Lemco-Tryptone (pH 6,8) : Striliser 121 C pendant 15 minutes:
Glucose
1g
Extrait de levure
1g
Tryptone
1g
Extrait de viande
1g
NaCl
0,5g
0,2g
Na2HPO4
Eau distille
100 ml

2- Ractifs et solutions
Ractif de nessler
Solution A
Iodure mercurique
Iodure de potassium
Eau distille
Solution B
Potasse en pastilles
Eau distille

50g
36,5g
1l
150g
1l

Triturer les deux sels de


la solution A au mortier en
ajoutant de l'eau distille puis
mlanger les deux solutions
A et B en partie gales.

Solution Tampon Phosphate (PBS, pH 7,3)


NaCl
8 g/l
1,5 g/l
Na2HPO4
KH2PO4
0,2 g/l
KCl
0,2 g/l
Solution PBPB (Pyridine hydrobromide perbromide)
PBPB
50 mg
Eau bidistille
1l
Ce ractif est sensible la lumire, il faut le conserver l'obscurit et renouveler sa
prparation tous les 10 jours.

Figure 12 : Chromatogramme des quatre standards des aflatoxines B1 (3,77ppb),


B2 (1,15 ppb), G1 (3,96ppb) et G2 (1,25 ppb)

Figure 13: Chromatogramme des aflatoxines B1, B2, G1 et G2 dans les


chantillons d'pices analyses.
-

En rouge: Chromatogramme de l'chantillon n11du piment


En bleu: Chromatogramme de l'chantillon n 6 du gingembre
En jaune: Chromatogramme de l'chantillon n2 du poivre
En vert: Chromatogramme du mlange des standards des aflatoxines

Figure 14 : Chromatogrammes des aflatoxines B1, B2, G1 et G2 dans les


chantillons des pices analyses.
-

En bleu: Chromatogramme de l'chantillon n11du piment


En rouge: Chromatogramme de l'chantillon n 6 du gingembre
En vert: Chromatogramme de l'chantillon n2 du poivre

Figure 15: Chromatogramme de l'OTA dans les chantillons des crales


analyses.
-

En bleu: Chromatogramme de l'chantillon n4 du mas (7,22 ppb)


En rouge: Chromatogramme de l'chantillon n 10 du bl (1,73 ppb)
En vert: Chromatogramme du standard de l'OTA (0,78 ppb)

Figure 16: Chromatogramme de la ZEN dans un chantillon de mas M16.


-

En rouge: Chromatogramme d'un chantillon du mas (13,5 ppb)


En bleu: Chromatogramme du standard de la ZEN (200 ppb)

Figure 17: Chromatogramme de trois injections diffrentes du standard de la FB1

100

Standards FB1 (1ppm)


50

mVolts

% Mobile Phase

400

200

0
0

5
Minutes
c:\gilson\unipoint\08ott03.001\08ott03.gdt : Spettrofluorimetro : stdFB1 0.133ug/ml: Inj. Number: 11
c:\gilson\unipoint\07ott03b.001\07ott03b.gdt : Spettrofluorimetro : std FB1 0.133ng/ml: Inj. Number: 1
c:\gilson\unipoint\07ott03b.001\07ott03b.gdt : Spettrofluorimetro : std FB1 0.133ng/ml: Inj. Number: 2

10

Figure 18: Chromatogramme de la FB1 dans trois chantillons de mas M4, M5 et M20
- En bleu: Standard de la FB1 (1ppm)
- En vert: Echantillons de mas M5 (2,61 ppm)
- En rouge: Echantillons de mas M4 (5,96 ppm)
- En Jaune: Echantillons de mas M20

100

400

200
50

mVolts

% Mobile Phase

Standard de la FB1

0
0

10

Minutes
c:\gilson\unipoint\07ott03.001\07ott03.gdt : Spettrofluorimetro : M4: Inj. Number: 2
c:\gilson\unipoint\07ott03.001\07ott03.gdt : Spettrofluorimetro : M5: Inj. Number: 3
c:\gilson\unipoint\08ott03.001\08ott03.gdt : Spettrofluorimetro : stdFB1 0.133ug/ml: Inj. Number: 1
c:\gilson\unipoint\08ott03.001\08ott03.gdt : Spettrofluorimetro : M20: Inj. Number: 9

Figure 19: Chromatogramme de la FB1 dans deux chantillons de mas M1 et M2


- En bleu: Standard de la FB1 (1 ppm)
- En vert: Echantillons de mas M1 (1,15 ppm)
- En rouge Echantillons de mas M2 fortifi avec la FB1 (1,5 ppm)

100

400

200
50

mVolts

% Mobile Phase

Pics de la FB1

0
0

5
Minutes

c:\gilson\unipoint\08ott03.001\08ott03.gdt : Spettrofluorimetro : M1: Inj. Number: 2


c:\gilson\unipoint\08ott03.001\08ott03.gdt : Spettrofluorimetro : spkM2: Inj. Number: 4
c:\gilson\unipoint\08ott03.001\08ott03.gdt : Spettrofluorimetro : stdFB1 0.133ug/ml: Inj. Number: 1

10

Figure 20: Chromatogramme de la FB1 dans un chantillon de mas M4


- En vert : Standard de la FB1 (1 ppm)
- En rouge: Echantillons de mas M4 (5,96 ppm)

100

400

50

mVolts

% Mobile Phase

Standard de la FB1
200

0
0

5
Minutes

c:\gilson\unipoint\07ott03.001\07ott03.gdt : Spettrofluorimetro : M4: Inj. Number: 2


c:\gilson\unipoint\07ott03b.001\07ott03b.gdt : Spettrofluorimetro : std FB1 0.133ng/ml: Inj. Number: 1

10

Figure 21: Chromatogramme de la FB1 dans un chantillon de mas M20


- En vert : Standard de la FB1
- En rouge: Echantillons de mas M20 (5,5 ppm)

100

400

50

mVolts

% Mobile Phase

Standard de la FB1
200

0
0

5
Minutes

c:\gilson\unipoint\08ott03.001\08ott03.gdt : Spettrofluorimetro : M20: Inj. Number: 9


c:\gilson\unipoint\08ott03.001\08ott03.gdt : Spettrofluorimetro : stdFB1 0.133ug/ml: Inj. Number: 10

10