Universidad de Antioquia

Instituto de Biologa
Gentica de la Conservacin
Parcial 2
2015-1
Por:

Alejandra Mara Moreno Sierra - 1.020.393.841

Punto 1.
La polica decomis un cargamento ilegal de huesos presuntamente de tigres en un
aeropuerto. Un anlisis de microsatlites revel los siguientes genotipos (tres loci)
para uno de los huesos confiscados. Locus A (110/120); locus B (131/131); locus C
(200/200).
Las frecuencias allicas en las dos poblaciones de referencia son las siguientes:

Alelo
India
China

Locus A
110
120
0.4
0.6
0.6
0.4

Locus B
131
133
0.9
0.1
0.4
0.6

Locus C
200
208
0.7
0.3
0.5
0.5

Al computar las frecuencias esperadas del genotipo multilocus del cargamento de

huesos en las poblaciones candidatas de India y China, se obtuvieron los siguientes
resultados:
Para India:

: 2 = 2(0.4 0.6) = 0.48

: 2 = (0.9)2 = 0.81
: 2 = (0.7)2 = 0.49

Para China:
: 2 = 2(0.6 0.4) = 0.48
: 2 = (0.4)2 = 0.16
: 2 = (0.5)2 = 0.25
Ahora la probabilidad de hallar otro individuo con el mismo fenotipo para cada una de
las poblaciones, se halla de la siguiente manera:
Para India: 0.48 0.81 0.49 = 0.19
Para China: 0.48 0.16 0.25 = 0.019

Esto quiere decir que en India hay un 19% de probabilidad de encontrar un individuo
diferente con el mismo genotipo que el del individuo de referencia; y, en China slo
habra una probabilidad de 1.9%, esto puede verse reflejado en el hecho de que hay
una mayor homocigotos para los locus B y C en India que en China. De acuerdo con
estas probabilidades encontradas, podra decirse que los huesos de los tigres
encontrados tienen una mayor probabilidad de provenir de India que de China, dada
la concordancia en los genotipos.
Punto 2.
El efecto fundador puede llevar a cuellos de botella en los cuales se ver afectada la
diversidad gentica, dado que la poblacin fundadora es de menor tamao que la
poblacin de la cual proviene. Esta baja diversidad puede llevar a depresin por
endogamia y la disminucin en la habilidad de que la poblacin fundadora evolucione
en su nuevo ambiente.
El hecho de que especies invasoras que se enfrentan a este tipo de efectos provocados
por los cuellos de botella lleguen a ser exitosas se debe a que en algunas ocasiones
stas especies pueden tener una diversidad ms amplia que la encontrada en especies
nativas del ambiente colonizado puesto que estas pueden provenir de una mezcla de
diferentes poblaciones de origen. Es decir, que la asociacin entre un mayor nmero
de individuos introducidos y el nmero de eventos de liberacin y la probabilidad de
convertirse en una especie invasiva sugiere que stas no son tan genticamente
pauprrimas como se espera. Adicionalmente, algunas plantas pueden contrarrestar
estos efectos debido a su reproduccin, la cual pude ser asexual por apomixis o
reproduccin vegetativa, y en ambos casos la depresin por endogamia son evitados
porque la progenie es idntica genticamente a las plantas parentales. Adems,
muchas plantas son polipoloides y pueden autofecundarse y la variacin gentica es
mantenida a travs de la fijacin de la heterocigosis. [1].
Cuando una especie es introducida a un nuevo ambiente, sta debe enfrentarse con la
adaptacin local. En algunos casos las especies invasoras logran desplazar y
reemplazar a las especies nativas. Existen varias explicaciones acerca de cmo las
especies invasoras logran establecerse, desplazar y reemplazar a las nativas, una de
ellas es que estas especies pueden ser intrnsecamente mejores competidores, puesto
que evolucionaron en ambientes ms competitivos. Tambin puede presentarse que
en ste nuevo ambiente no hallan depredadores de estas especies como ocurre por
ejemplo con el pez Len en las costas colombianas, permitiendo la reproduccin y con
ello el desplazamiento de las especies nativas. Adicionalmente, las adaptaciones de las
especies nativas generalmente son ocasionadas por eventos que ejercen una gran
fuerza de seleccin sobre ellas, sin embargo, estos pueden ser a largo plazo mientras
que las especies invasoras pueden ser capaces de superar a las especies nativas
dependiendo de su capacidad de adaptacin la cual puede estar dada en pocas
generaciones. [1].

Punto 3.
Algunos estudios indican que los clones pueden ser fisiolgicamente normales y
aparentemente saludables, hay otras observaciones y reportes en la literatura de
fenotipos anormales asociados que vienen a aparecer durante las fases juveniles y
adultas de la vida. La incidencia de estas anormalidades puede variar dependiendo de
la especie particular, el genotipo o tipo de clula, o de acuerdo a aspectos especficos
de la transferencia nuclear y los protocolos de cultivo utilizados. [2].
El sndrome de la descendencia clonada es un continuo, en que los fenotipos letales y
anormales pueden ocurrir en cualquier fase del desarrollo, dependiendo al grado de
desregulacin de genes clave, debido presuntamente a errores fundamentales en la
reprogramacin epigentica. Incluso clones aparentemente normales pueden tener
regulacin anormal de muchos genes que son tambin sutiles del resultado de un
fenotipo obvio. [2].
El acortamiento en los telmeros evidenciados en la clonacin de la oveja Dolly,
debido al envejecimiento de las clulas somticas que se van a acortando a medida
que stas se reproducen, pueden llevar a un envejecimiento prematuro y muerte del
clon, sin embargo, otros estudios han sido contradictorios con respecto a la longitud
de los telmeros en los clones, con informes de la restauracin a la normalidad en el
ganado y ratn. En la clonacin de ratones se ha encontrado su vida recortada un 50%
debido a neumona y fallas hepticas. [2].
La evidencia de un sistema inmune comprometido es un fenotipo observado en el clon
de algunas especies. Indicadores directos de una respuesta inmune reducida son la
aplasia tmica que se ha documentado en el ganado bovino clonado y niveles ms
bajos de produccin de anticuerpos en ratones clonados y de citoquinas en cerdos
clonados Esto puede aumentar su susceptibilidad a la infeccin y la enfermedad. La
incidencia de enteritis, infecciones umbilicales y respiratorias se ven aumentadas en
ganado clonado. [2].
Otras anomalas observadas incluyen defectos en los sistemas cardiovascular,
musculo esqueltico y neurolgico, as como la susceptibilidad a las infecciones
pulmonares y trastornos digestivos. La hidronefrosis es particularmente comn en el
ganado ovino, con los niveles de urea en suero elevadas correspondientes a algunos
clones sobrevivientes. [2].
Punto 4.
Protocolo.
o Coleccin de muestras.

El oso de anteojos est clasificado como carnvoro, sin embargo presenta una dieta
omnvora, predominando hierbas y frutos. Dentro de su dieta se encuentran
bromelias, frutos de ericceas, pseudobulbos de orqudeas, maz, frutos de achupayas,
sauce, tuna, entre otras. [3].
Sus heces fecales pueden ser evaluadas por medio de observacin intensiva y
realizando comparaciones hechas con fotografas recopiladas en Figuero y Stucchi1
[4], adems de las fotografas reportadas por Caselli [3], en las cuales se pueden
identificar heces lquidas, semilquidas, pastoza y en bloques. Esto con el fin de
asegurar que las muestras de heces fecales tomadas son de osos de anteojos y no de
otros mamferos mayores que se puedan encontrar en el rea geogrfica de estudio,
adicionalmente con el fin de garantizar una mayor fidelidad en las recolecciones se
debe tener en cuenta las especies que pueden ser encontradas en el lugar y qu tan
parecida podran ser las muestras fecales de stas con respecto al del oso de anteojos.
Durante la coleccin de heces se deben tener en cuenta que las heces deben ser lo ms
frescas posibles y que slo se busca la parte exterior de stas puesto que fue la ltima
que estuvo en contacto con la pared intestinal.
o Conservacin y transporte de las muestras fecales.
Existen varias formas para inactivar enzimas, pero stas son usualmente costosas o
requieren de reactivos que generalmente no estn disponibles para muchos bilogos y
veterinarios de campo. Sin embargo, prevenir la actividad de las ADNasas es mucho
ms fcil y se consigue generalmente al deshidratar la muestra. Dos formas de hacerlo
son:
1. Deshidratacin de la muestra con silica gel u otro desecante.
2. Deshidratacin de la muestra con etanol (70 100%). A menor concentracin ms
fcil su transporte, porque es menos inflamable. Sin embargo, a menor concentracin,
mayor ser la degradacin del ADN. Por eso no se recomiendan concentraciones
inferiores al 70%. [4].
Es importante evitar la contaminacin de las muestras, por lo tanto lo mejor es no
tomar las muestras con las manos desnudas. En este caso puede valerse de esptulas
estriles y guantes, en caso tal de no tener estos instrumentos a la mano puede optar
por ayudarse con una pequea rama con el fin de ayudar a impulsar las heces dentro
de los tubos para su posterior transporte.
ste libro es mencionado en el artculo: Mrquez, Gisella & Pacheco, Victor. (2010). Nuevas evidencias
de la presencia del Oso Andino (Tremarctos ornatus) en las Yungas de Puno, el registro ms austral de
Per.
Revista
Peruana
de
Biologa.
17:3.
Lima-Per.
Disponible
en:
http://www.scielo.org.pe/scielo.php?pid=S1727-99332010000300014&script=sci_arttext.
Sin
embargo, no es posible su visualizacin directa pues exige la compra de ste.
1

Para estos casos puede hacer uso de tubos Falcon de 50 a 100mL, este material debe
estar esterilizado previamente. Una vez haya introducido las heces en el contenedor
correspondiente procede a cubrir la muestra con el etanol o con la slica;
adicionalmente, es importante mantener una cadena de fro de 4C hasta que se llegue
al laboratorio para el estudio de la muestra en donde deber almacenarse a -20C. [3].
Es importante que las muestras se encuentren etiquetadas con un nmero de
referencia, la fecha de coleccin, la localidad y la especie. Tambin pueden tomarse
datos adicionales como la ubicacin exacta por medio del GPS y el nombre del
recolector, as como otras notas que considere de importancia.
o Extraccin de ADN.

Tomar de 1 a 1.5 g de heces y depositarlas en un tubo de centrfuga de 15 mL.

LLevarlas a vrtex y lavarlas utilizando 5 mL de etanol, centrifugar a 4000xg
por 2 minutos. Descartar el sobrenadante.
Se repite el lavado utilizando 5 mL de TE (10 mM Tris, 1mM EDTA, pH8).
Adicionar al tubo de centrfuga 3 mL de TNE (10 mmol/L Tris-Cl, 0.5% SDS, 1
mmol/L CaCl2) y 50 L de proteinasa K (20mg/mL) para la digestin
enzimtica y fue llevar a incubacin a 55C por 1-2 h.
Centrifugar nuevamente a 4000xg por 1 minuto.
Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrfuga con 3g de almidn de
papa, llevar a vortex por 1 minuto e incubar por un minuto a temperatura
ambiente. Centrifugar nuevamente a 8000xg por 3 minutos con el fin de
precipitar el almidn.
Pipetear 600L de sobrenadante a un nuevo tubo de centrfuga de 2mL,
adicionar 150 L de solucin de NaCl (3.5 mol/L) y 250 L de solucin de CTAB
(0.7 M NaCl, 10% cetil trimetil- bromuro de amonio CTAB) seguido de
incubacin a 70C por 10 min.
Extraer la mezcla utilizando dos veces un volumen igual de
fenol:cloroformo:alcohol isoamlico (25:24:1).
Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo y adicionar un volumen igual de
buffer (4M hidroclorato de guanidina, 1M de acetato de potasio, pH 5.5),
mezclar y aplicar a una columna de centrifugacin y centrifugar a 6000xg por
30 segundos.
Lavar el filtrado por centrifugacin (8000 xg, 1 min) dos veces, usando 750L
de etanol al 75%. El DNA se eluye con 200 L TE y 50 L/mL de RNasa.2 [5].

Este protocolo de extraccin de ADN fue tomado de la consulta realizada previamente para la
purificacin de heces, se decidi utilizar este mismo protocolo puesto que ste fue probado en varios
mamferos consiguiendo una mejor calidad del material gentico de las heces estudiadas
2

o Amplifiacin del ADN por PCR.

De acuerdo con el protocolo utilizado por Caselli (2012), se pueden amplificar dos
genes: el gen amelogenina y el gen SRY, utilizando los primers SE47 y SE48 para los
segmentos del gen amelogenina presente en los cromosomas sexuales X e Y. Para el
gen SRY se pueden emplear los primers SRYB3 y SRYB5 presente en los cromosomas
Y. Para realizar la amplificacin se pueden utilizar diferentes kits como el Kit
Multiplex (Qiagen).[3].
o Electroforesis.
Los productos de la PCR se diluyen con buffer loading a razn de 5:1 y se depositan en
un volumen final de 20l en un gel de agarosa al 3% a 100 voltios hasta el final del
corrido. Se puede utilizar un marcador de 100bp para corroborar los tamaos de los
alelos.
Utilizar un sistema de electroforesis horizontal para la verificacin de la amplificacin
de los productos de la PCR.
o Sexaje.
La electroforesis deber mostrar las bandas correspondientes al genotipo encontrado
para cada una de las muestras estudiadas. Los resultados para el gen amelogenina
deber mostrar dos bandas de 245 pb para el genotipo hembra correspondientes a los
cromosomas XX, mientras que en los machos se encontrarn dos bandas una de 245
pb y otra de 191 pb correspondientes a los cromosomas X e Y respectivamente.
Con respecto al gen SRY slo mostrar una banda de aproximadamente 163 pb
correspondiente al cromosoma Y que slo se posee por el macho, sin embargo, este
marcador es poco informativo pudiendo dar falsos positivos.[3].
o Identificacin de especies.
Una vez realizada la identificacin entre machos y hembras, estos datos pueden ser
utilizados para identificar la distribucin geogrfica de estos en el lugar de estudio,
teniendo en cuenta los datos colectados inicialmente del sitio de coleccin de
muestras y de esta manera conocer ms acerca de ciertos hbitos relacionados con la
ecologa del animal como hbitos reproductivos, entre otros.

Bibliografa
[1]. Allendorf FW y Luikart GH. Conservation and the Genetics of Populations.
Blackwell Publishing. 2007.
[2]. Wells, D.N. (2005). Aminal cloning: problems and prospects. Scientific and
Technical Review of the Office International des Epizooties. 24:1. Paris. Pg. 251-264.
Consultado el 08 de agosto de 2015. [Internet]. Disponible en:
http://vet.hcmuaf.edu.vn/data/file/application%20of%20biotechnology%20of%20a
nimal%20health%20and%20production%20/Animal%20cloning%20problems%20a
nd%20prospects.pdf
[3]. Caselli, Cristina Sofa. (2012). Sexaje molecular a partir de heces en osos de
anteojos (Tremarctos ornatus). Tesis para optar el Ttulo profesional de Mdico
Veterinario. Univesidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima-Per. Consultado el 08
de
agosto
de
2015.
[Internet].
Disponible
en:
http://cybertesis.unmsm.edu.pe/bitstream/cybertesis/3754/1/Caselli_sc.pdf
[4]. Figueroa J. & M. Stucchi. (2009). El oso andino: alcances sobre su historia
natural. Asociacin para la Investigacin y Conservacin de la Biodiversidad-AICB.
Primera edicin. Lima-Per. Pg. 13-18.
[5] ZHANG. Bao-Wei, LI. Ming, MA. Li-Chao, WEI. Fu-Wen. (2006). A Widely Applicable
Protocol for DNA Isolation from Fecal Samples. Biochemical Genetics, Vol. 44, 11-12.
[Internet]. Consultado el 11 de julio de 2015. Disponible en:
http://download.bioon.com/view/upload/month_0808/20080803_b522fd29733287
cdd0d12UxVmnKRNZ9k.attach.pdf