Universidad de Chile

Facultad de Ciencias Agronmicas

Escuela Ciclo Bsico
Laboratorio de Bioqumica

Gua de Laboratorio

Profesor Coordinador : Sr. Alejandro Riquelme E

Profesores colaboradores:

Sr. Manuel Pinto C

Srta. Maritza Berti

2002

PROGRAMA CURSO ELECTIVO

TECNICAS BIOQUMICAS DE USO EN AGRONOMA

2002
ANTECEDENTES GENERALES
Profesor Responsable: Sr. Alejandro Riquelme E.
Colaboradores: Sr.
Srta.

Manuel Pinto C.
Maritza Berti D.

Semestre:
primer semestre
Duracin: 5 semanas
Tipo de asignatura: Electiva
Requisito: Bioqumica General
N horas prcticas: 4 horas semanales
(la parte terica ser entregada en una gua de laboratorio)
Nmero de Unidades Docentes: 3
Horario de clases: Mircoles de 16 a 19 h

Objetivo General del Curso: Mejorar la comprensin de las materias tratadas en el

curso terico de Bioqumica General. Entregar conocimientos de tcnicas bioqumicas
en anlisis modernos de uso comn en agronoma.
Objetivos especficos: Lograr que los alumnos puedan:
-Conocer las principales tcnicas analticas usadas en los laboratorios de bioqumica
(espectroscopia, potenciometra : pH y conductividad, etc).
- Comprender los conceptos de cintica enzimtica .
- Aprender a determinar los parmetros de fotosntesis y respiracin en vegetales
superiores
- Aislar el DNA de diferentes fuentes vegetales y animales.
Unidades didcticas: 4 horas semanales de trabajo prctico durante 4 semanas
0,5 h semanales de prueba de laboratorio
2 horas examen

Practico Uno ( 4 horas)

Introduccin (Prof. Alejandro Riquelme)

Reglamentos y cuidados dentro del laboratorio. Conceptos de bioseguridad.

Revisin de los conceptos bsicos de pH y preparacin de tampones.
Instrucciones para el manejo de los espectrofotmetros y aplicacin de la ley de
Beer.
Indicaciones para el uso apropiado de las centrifugas analticas.

A partir de la segunda semana, el curso se dividir en tres grupos que desarrollar en

forma paralela cada uno de los siguientes prcticos:
Prctico Dos (4 horas)
Enzimologia (Prof. Maritza Berti)
-

Extraccin de -amilsas de semillas de cebada.

Cintica enzimtica de las enzimas extradas
Efecto de la temperatura y pH en la actividad cataltica.

Prctico Tres (4 horas)

Bioenergtica (Prof. Manuel Pinto)
-

Bioenergtica de la germinacin de semillas.

Determinacin de la respiracin en semillas mediante tcnicas polarimtricas de
deteccin de O2
Determinacin de la tasa fotosinttica en vegetales mediante tcnicas de anlisis
de intercambio de gases (anlisis infrarrojo de CO 2 ).
Balance energtico a nivel de hoja y cloroplastos mediante el uso de tcnicas de
deteccin de la fluorescencia emitida por la clorofila a.

Prctico Cuatro (4 horas) :

Biologa Molecular (Prof. Alejandro Riquelme)
- Extraccin de ADN desde tejidos vegetales y animales.
- Visualizacin y cuantificacin del ADN extrado (electroforesis).
El material experimental que se usar ser fundamentalmente semillas y plntulas de
trigo.

Diagrama del Programa 2002

Prctico 1
Introduccin

8 de Mayo
Un solo grupo de 15 alumnos

Determinacin de pH
Espectroscopia
Centrifugacin
15 de Mayo
Prctico 2
Enzimologa

Grupo I

22 de
Mayo
Grupo II

29 de
Mayo
Grupo III

Grupo II

Grupo III

Grupo I

Grupo III

Grupo I

Grupo II

Cintica enzimtica de (-amilasa de

semillas de cebada.)
Prctico 3
Bioenergtica
Determinacin de parmetros fotosintticos
y de respiracin.
Prctico 4
Biologa Molecular
Aislamiento y visualizacin de ADN

Mtodo: Trabajo prctico de laboratorio

Evaluacin: Se tomarn pruebas escritas semanalmente del prctico

pasado, con un total de tres pruebas y al final del curso se realizar
un examen escrito que incluir a todos los prcticos.

Calendario de Pruebas y Examen

Prueba
1
2
3
Examen Final

Fecha

Ponderacin

15 de Mayo
22 de Mayo
29 de Mayo

(25%)
(25%)
(25%)

05 de Junio

(25%)

ASISTENCIA: SE REQUIERE EL 100 % DE ASISTENCIA

Bibliografa:
Hall D.O, Scurlock JMO, Bolhar- Northenkampf HR, Leegood RC and Long SP. 1993
Photosynthesis and Production in a Changing Environment: E field and Laboratory
Manual. Chapman & Hall, London, 464 p.
Holmes D.J. y Peck H 1994 Resolucin de Problemas de Bioqumica Analtica Ed. Acribia SA.
Zaragosa Espaa 162 p
Mathews C y van Holde K E. 1998. Bioqumica. Segunda Edicin.
Interamericana de Espaa. Madrid. Espaa. 1275 p

McGraw-Hill-

Riquelme A, Pinto M y Berti M 2001. Gua de laboratorio: Tcnicas bioqumicas de uso en

agronoma. 54p
Stryer L. 1981. Biochemistry. Segunda Edicin. WH Freeman and Company. San Francisco.
USA. 947p

INSTRUCCIONES GENERALES DE LABORATORIO

5

Leer esto antes de hacer cualquier trabajo en el laboratorio.

Seguridad General en el Laboratorio--Estar seguro de conocer las vas de
evacuacin y la ubicacin de los extinguidores dentro del laboratorio. Su vida puede
depender de eso.
Guantes--En el caso de algunos de los experimentos ser necesario que utilicen
guantes para prevenir alguna lesin a la piel por el contacto de alguna sustancia txica.
Tanto en el manual como los asistentes le harn saber cuales de las sustancias
qumicas son txicas.
Uso de los Reactivos--Siempre leer cuidadosamente las etiquetas ante de usar
algn reactivo, y verificar que le han dado el material correcto. Si usted no lee
cuidadosamente la etiqueta, usted puede tener un reactivo equivocado, y tal vez deba
repetir parte o todo el experimento. NO TOCAR la punta de las pipetas dentro de los
envases stocks. Si usted desea usar algn reactivo, colocar un poco en un vaso
precipitado o matraz limpio y entonces pipetear. Por favor cuidar de no contaminar o
ensuciar los reactivos. La mayora de las botellas de los reactivos tendrn una
indicacin de la cantidad a tomar.
Agua--Cuando un procedimiento experimental requiere de la adicin de agua, queda
por entendido que se tata de agua destilada. El agua destilada ser suministrada desde
un bidn debidamente marcado. Chequear la limpieza del material de vidrio que se le
har entrega. En caso que sea necesario limpiar el material solo con agua destilada.
Cuaderno de Laboratorio--Cada persona debe tener su propio cuaderno de
laboratorio aun cuando trabaje con un grupo. El propsito de un cuaderno de laboratorio
es dar la experiencia en el registro de datos experimentales en una forma organizada.
De tal forma que sea posible que alguien no familiarizado con los experimentos pueda
claramente entender los procedimientos usados y los datos obtenidos. El cuaderno de
laboratorio deber traerlo a cada sesin y anotar los datos de cada experiencia. En
algunos casos, algn compaero de tu grupo podra anotar los datos en su cuaderno
indicando claramente quien obtuvo los datos. Por ltimo el correcto uso del cuaderno de
laboratorio ser chequeado durante el semestre.
Cada experimento en el cuaderno ser anotado con lpiz a pasta (no a mina) como
sigue:
1. Fecha, Titulo y nombre de los integrantes del grupo (si as corresponde).
2. Procedimiento Usado y anotar las modificaciones hechas al procedimiento del
manual.
3. Los datos sern colectados mientras se realiza el experimento. Los datos que han
sido anotados en papeles sueltos y pasados al cuaderno en forma posterior es una
practica inaceptable.
4. Cualquier material como fotos, placas TLC, etc. sern marcados con la fecha, su
nombre, numero de expediente y pagina de su cuaderno. Entonces ser pegado en su
cuaderno.

Nota: Dentro del laboratorio no se permite ni comer ni beber.

Introduccin
Tcnicas de Analticas Cuantitativas
Pipetas:
1. Pipetas Pasteur
Llenar hasta los dos tercios del volumen como mximo
Remover la ultima gota desde la punta
2. Pipetas Graduadas
-Con graduacin milimtrica sin marcacin del final, llenar hasta la marca mas
alta
Remover hasta la ultima gota.
-Con graduacin milimtrica con marcacin del volumen final, llenar hasta la
marca mas alta.
Detenerse en la marca inferior. No remover el liquido hasta ultima gota
3. Pipetas Volumtricas
Mejor precisin.
Posee un solo volumen, con solo dos marcas, superior e inferior.
No remover la ultima gota, se debe llegar hasta la marca inferior.
4. Sistemas para pipetear
Existen un sistema de "pera de goma" que se coloca en la boca superior de la
pipeta y permite succionar el liquido, tambin existen sistemas similares a las
jeringas que por medio de un vstago se succiona el liquido y tambin hay
sistemas elctricos y automticos de bombeo.
5. Micropipetas
Son pipetas automticas que sirven para tomar volmenes muy pequeos
(0,1-1000 L)
Mediante un sistema de pistn se hace vaco para succionar la muestra.
Se emplean puntas desechables para la toma de muestras

Nunca pipetear con la boca

Procedimiento General para pipetear

No tocar el fondo del frasco contenedor
Drenar la pipeta contra las paredes internas del contenedor
Frascos volumtricos
Usados para hacer soluciones de volumen conocido
Las ultimas gotas llenado deben ser dadas con la pizeta
Mezcle antes de tomar una alcuota
Transferencia Cuantitativa
Disolver el slido en un pequeo contenedor (frasco) y verter en un frasco
volumtrico, sin botar.
Enjuague el pequeo contenedor y el liquido nuevamente virtalo en el frasco
volumtrico, repetir 4 a 5 veces.
Diluir hasta la lnea, use la pizeta para las ultimas gotas.

Clculos de Concentracin
Molar = moles / litro = M (molaridad)
mol = numero de Avogadro = 6,023 x 10

23

tomos o molculas

Nomenclatura

Prefijo

Abreviatur Factor

megakilo-

a
M
K

milimicronanopico-

n
p

10 6
10 3
10 0
10-3
10-6
10-9
10-12

1 molar = 1M = 1 mol /litro = 1 mmol / ml

1 micromolar = 1 M = 1 micromol / litro = 1 nmol / ml

Otras Concentraciones
8

mg / ml, w/v, v/v, w/v

1 : 100 (porcentaje)
1 : 1.000.000 = ppm

1 g en 100 ml o gramos totales

1 g en 1 x 10 6 ml o gramos totales
1 mg en 1000 ml o g
1 g en 1 ml.

Problemas:
1. Dado un compuesto X que posee la siguiente masa molecular
que 1 mmol = 37 mg y se realiza una solucin 0,02 mg / ml.
Cual es la molaridad?

1 mol = 37 g ,

as

2. Dada una solucin de concentracin 5 mg / ml y se toma una alcuota de 2 ml y se

diluye a 10 ml.
Cual es la molaridad?

Experimento 1A.
Calibracin de Micropipetas
9

Principio de la calibracin de las micropipetas

El volumen tomado por una micropipeta es determinado por el peso de la cantidad
tomada dividida por la densidad del agua a temperatura ambiente. Esto recibe el
nombre de calibracin gravimtrica.
Mucho de los experimentos involucran el pipeteo de soluciones fras, sin embargo las
puntas plsticas de las micropipetas fueron hechas para ser usadas en soluciones mas
temperadas (20-25 C). Hay problemas de contraccin de las puntas plsticas en
soluciones fras de este modo las micropipetas toman un volumen menor al indicado
por la visor digital. Esto se soluciona si las micropipetas estn debidamente calibradas.
Procedimiento Experimental para el uso y calibracin de micropipetas
Uso de micropipetas.
Existen un set de tres micropipetas disponibles. En el costado esta indicado los rangos
de volmenes sobre los cuales pueden ser usados: 5-50, 50-200 y 200-1000 l.
Para la calibracin a baja temperatura, se llenara un probeta con 500 ml de hielo.
Procedimiento
1. Colocar el volumen deseado dentro del rango de la pipeta usada ( 100 l en la
micropipeta 50-200) sosteniendo con una mano el cuerpo de la micropipeta y
ajustar el volumen de acuerdo al indicador anlogo.
2. Coloque una nueva punta plstica desechable a la micropipeta. Presione
firmemente con un pequeo giro para asegurar que este bien sujeta.
3. Presione el botn de la micropipeta con el pulgar hasta sentir el primer tope y
mantenga estable la presin.
4. Mantenga verticalmente la micropipeta, sumerja la punta en la muestra liquida a
una profundidad de 1,5 mm.
5. Libere el botn lentamente permitiendo que la solucin entre en la punta de
plstico.
6. Para verter la muestra, coloque el extremo de la punta contra las paredes
internas recipiente receptor y presione lentamente el botn hasta el primer tope.
Espere 1 segundo para drenar la solucin y presione mas fuerte hasta llegar al
segundo tope, sacando todo el liquido residual desde la punta.
7. Con la punta ya seca soltar el botn dejando que vuelva a su posicin original.

Tcnicas para mejorar la exactitud de la micropipeta

-

Algunas soluciones (tales como suero, soluciones conteniendo protenas,

10

o solventes orgnicos) dejan una pelcula en la punta de la micropipeta.

Esto puede ser un problema en que algo de tu muestra queda en la punta.
Esto se soluciona rellenando una segunda vez la punta con la muestra
antes de colocarlo en el recipiente receptor.
-

Las soluciones o sustancias con densidades muy diferentes al agua no se

pipetean bien porque ellas son conducidas o muy lentas o muy rpidas.
La nica forma de compensar esto es calibrando la micropipeta, por
ejemplo usando una solucin mas densa que el agua

Soluciones fras causan que las puntas plsticas se contraigan y tambin

usted necesita calibrar la micropipeta para este efecto. Esto es lo que
usted har en el laboratorio.

Si una burbuja de aire esta dentro de la punta durante la toma de la

muestra, devuelva la muestra al
recipiente original, verifique la
profundidad de la inmersin de la punta y pipete mas lentamente. Si
vuelve a aparecer la burbuja, descarte la punta y use una nueva.

Calibracin de Micropipetas
El volumen tomado por la micropipeta es determinado por el peso de la cantidad
tomada y dividida por la densidad del agua.
-Colocar la micropipeta en 100 l, llenar la punta de la micropipeta con agua a
temperatura ambiente y depositarlo en un pequeo recipiente (puede ser un tubo
Eppendorf). Colocarlo en una balanza analtica y anotar el peso. Repetir esto 10
veces.
-Calcular el volumen tomado y tabular los resultados (Estar seguro de anotar la
temperatura del agua).
Repetir el procedimiento usando esta vez agua con hielo (Recuerde anotar la nueva
temperatura usando un termmetro).
Determine el volumen
soluciones.

promedio y calcule la desviacin estndar para ambas

11

Laboratorio 1B.
Anlisis Espectrofotomtrico de Clorofila
Informacin General:
La clorofila extrada con acetona al 80% v/v de hojas verdes son verdes. El extracto de
clorofila puede variar en la profundidad o intensidad del verde dependiendo del material
vegetal desde el cual fue extrado. Anlisis cuidadoso basado en la inspeccin visual
es un mejor medida cualitativa y permite realizar algunas mediciones cuantitativas o
capacita para distinguir entre las variaciones de la molcula de clorofila.
Para entender mas acerca de la clorofila extrada, un espectrofotmetro es necesario
para realizar anlisis electrnico de los posibles extractos y darnos un mayor
informacin cuantitativa basado en la luz absorbida a longitudes de onda especificas.
En Angiospermas (la mayora de las plantas terrestres) hay tpicamente dos tipos de
molculas de Clorofila (Chl), llamadas, clorofila a (Chl a) and clorofila b (Chl b). Estos
pigmentos absorben fotones de luz en la regin del espectro azul y rojo, pero las
longitudes de onda especificas que ellos absorben son diferentes. Ser determinada la
absorbancia de fotones a 663 nm y 645 nm, especifico para Chl a y Chl b,
respectivamente. Debido que el espectro de absorcin
(figura que integra las
longitudes de onda de la luz absorbida) de estas dos molculas de Chl se sobreponen,
usted usar una ecuacin simultanea para determinar la cantidad de ambos pigmentos.
La ecuacin para esto es conocida como ecuacin de Arnon. La ecuacin de Arnon
dar la informacin cuantitativa acerca de la Chl a y Chl b.
Materiales:
Los materiales necesarios para este procedimiento incluye un mortero y vstago, papel
filtro, embudo y un espectrofotmetro. Hay varios modelos de espectrofotmetros
disponibles. Las instrucciones sobre el correcto uso de ellos son dadas en el apndice
de este manual.
Mtodo.
Los estudiantes trabajarn en pares y coordinaran su actividad con un segundo par de
estudiantes. Habr una variedad de plantas disponibles en el laboratorio. Planear su
trabajo para que usted y su compaero estn trabajando con plantas diferentes al otro
grupo. Usted y su compaero tomarn muestras de diferentes plantas y determinar la
cantidad de Chl en las hojas. Cuando usted haya terminado su trabajo compartir su
informacin con el otro par de estudiantes.
En esta experiencia de laboratorio usted usar cubetas para contener los extractos
basados en acetona durante la medicin de absorcin. La acetona daa algunos
materiales plsticos. por eso el uso de cubetas de vidrio es recomendable. Vidrio Pirex
funciona bien para las determinaciones con luz de longitud de onda en el visible.
Algunas cubetas son hechas de cuarzo y son como el vidrio pero son mucho mas caras
y requieren gran cuidado.

12

Usted tomar una pequea cantidad de la hoja; en la realidad usted necesita solamente
una pequea cantidad de tejido as que la planta no es destruida. La muestra ser
pesada as que la cantidad de Chl puede ser determinada en base del peso fresco de
la hoja. La muestra de hoja ser homogeneizada en acetona al 80%; este es un
solvente que extrae las molculas hidrofobicas de Chl desde su medioambiente en la
membrana y la hace soluble. La muestra estar turbia debido a las protenas
desnaturadas y las fibras de paredes celulares, as que ser filtrada para producir una
solucin limpia pticamente.
Protocolo:
1. Tomar aproximadamente 50 a 100 mg de tejido foliar de una planta con una
tijera. No use los tallos o venas gruesas por que ellas son muy duras para moler.
Determine el peso exacto con una balanza analtica. Los ayudantes de
laboratorio demostrarn el uso correcto de las balanzas. Todos sus datos
debern ser anotados en un cuaderno, no confe en su memoria!
2. Colocar el tejido en un mortero y agregar 10 ml de acetona al 80 %
(acetona : agua 80:20 v/v). Moler el tejido con un vstago. Usted debe moler
completamente el tejido. Un poco de arena de cuarzo puede ayudar a una buena
molienda de los tejidos.
3. Colocar un embudo en un tubo de ensayo y colocar un papel filtro en el cono.
Pasar el homogenato a travs del papel filtro. Lo retenido es eliminado y el
filtrado es colectado en el tubo de ensayo. El filtrado puede ser llamado un
extracto.
4. Si usted necesita mas informacin sobre el uso de un espectrofotmetro en
particular, usted deber consultar el apndice del manual o preguntar al profesor
o al ayudante.
5. Obtenga una cubeta limpia y llene dos tercios con acetona 80% acetona; este es
llamado el blanco. Poner la cubeta en el espectrofotmetro y fije la longitud de
onda en 663 nm. El haz de luz pasa a travs del compartimiento de la muestra
en una direccin particular, de esta forma los lados transparentes deben estar
orientados de acuerdo a esto. Usted limpiara con un papel suave (tis) los lados
transparentes de la cubeta, para asegurarse que ellos estn secos antes de
insertarlos en compartimiento de la muestra. Presione apropiadamente los
botones para que el espectrofotmetro se ajuste a 0 de absorbancia con la
cubeta blanco colocada. Sacar la cubeta blanco y colocarla en un lugar seguro
para ser usada mas tarde.
6. Agitar el filtrado en el tubo de ensayo y usarlo para llenar hasta los dos tercios la
segunda cubeta y limpiar con el papel tis, si es necesario. Colocar esta cubeta
muestra en el espectrofotmetro. La lectura ser dada como A663. Escribir este
nmero. Sacar la cubeta muestra y guardarla para los siguientes pasos.
7. Cambiar la longitud de onda a 645 nm. Reinserte la cubeta blanco y coloque
nuevamente el cero en el espectrofotmetro en la nueva longitud de onda. Sacra
la cubeta blanco e inserte la cubeta muestra. Lea la A645.
8. Enjuague las cubetas con agua destilada y squelas colocndolas invertidas
sobre una toalla Nova y djelas en un lugar seguro. No las deje en el borde de
los mesones!

13

Clculos:
La ecuacin de Arnon es til para convertir las mediciones de absorbancia a mg de
Chl / g de hoja.
((12,7 x A663) - (2,6 x A645)) x mL de acetona
Chl a (mg / g de hoja) =
mg de hoja
((22,9 x A645) - 4,68 x A663)) x mL de acetona
Chl b (mg / g de hoja) =
mg de hoja
Total Chl = Chl a + Chl b
Estas ecuaciones fueron publicadas por D.I. Arnon (1949) Plant Physiol. 24: 1.
Anlisis:
Usted ahora tiene la capacidad para informar el contenido de Chl de las plantas
escogidas. Usted ser capaz de determinar el contenido de Chl de casi todas las
plantas. Si usted no esta conforme con lo realizado, y si aun hay tiempo usted podra
repetir el experimento para obtener mejores datos
1. Convenza al instructor que usted ha determinado cuidadosamente el contenido
de Chl total por gramo de hoja para las dos plantas suministradas.
2. Comparta sus resultados con el otro par de estudiantes en su equipo. Escriba un
resumen o haga una tabla de las cuatro plantas estudiadas por su equipo.
3. Las plantas normales tienen una razn de Chl a /Chl b de aproximadamente 3.
Algunos mutantes son deficientes en Chl b y tienen valores de Chl a / Chl b
mayores de 3. Tambin hay algunas condiciones tanto biticas (enfermedades)
como abiticas (estrs ambientales) que afectan esta relacin obteniendo
valores de Chl a /Chl b menores de 3. Que es lo que piensas con respecto a las
plantas que usted analiz?
Preguntas Especificas:
[P1.] Por que las plantas tienen Clorofila?
[P2.] Por que fue necesario moler las hojas con acetona al 80% en vez de agua?
[P3.] Cual es el propsito de la cubeta blanco?
[P4.] Cual es la relacin entre la concentracin de la molcula absorbedora y el
valor de absorbancia?
[P5.] Que colores son las longitudes de onda medidas para clorofila? Por que
no usar la luz verde (550 nm) para medir clorofila?

14

APENDICE 1:
A. Gua general para todos los espectrofotmetros.
1. Un adecuado tiempo de calentamiento aumentar el rendimiento del
instrumento. Espectrofotmetros mas viejos pueden requerir seleccionar la
lmpara y espejos apropiados para la longitud de onda usada. Los
espectrofotmetros mas nuevos tienden a ser mas automticos.
2. Los instrumentos de doble haz son usualmente menos susceptibles a trabajar
sobre tiempo como los instrumentos de un solo haz. Nunca coloque una cubeta
en el haz de referencia de un instrumento de doble haz a menos que lo hayas
definido como necesario y entiendes los posibles artefactos.
3. Aumentando el ancho de la ranura dars lecturas mas estables para muestras
con alta absorbancia. Una ancha ranura subestimar la absorbancia de
compuestos con
picos
de absorcin angostos. Los mas baratos
espectrofotmetros tienen un solo y fijo ancho de ranura.
4. Estar seguro que tu estas usando cubetas de cuarzo cuando estas trabajando
con longitudes de onda en el UV.
5. Los mas viejos espectrofotmetros son inexactos sobre 1.0 de absorbancia, los
mas nuevos espectrofotmetros son exactos por lo menos para 2 unidades de
absorbancia.
6. Manteniendo la misma orientacin de una cubeta usada para mltiples lecturas
mejorar la precisin y exactitud.
7. No tocar las superficies pticas de la cubeta. Guardar apropiadamente en su
caja.
8. Enjuagar las cubetas inmediatamente despus de usar con agua destilada o
desionizada y secar con un papel suave.
9. Si las cubetas estn sucias, tratar de limpiarlas con detergente y agua. Si es
necesario, use cido ntrico al 50% (Con mucho cuidado!).
10. No llenar las cubetas ni dentro ni sobre el equipo.
11. Estar seguro del uso correcto o el blanco apropiado para hacer el cero en el
instrumento.
Bausch & Lomb Spectronic 21
Es un buen ejemplo de los espectrofotmetro con un solo haz de luz.
1. Encender el instrumento POWER ON y permitir que se caliente por 20 minutos
aproximadamente.
2. Cambiar la longitud de onda a 663 nm girando la perilla que se encuentra en al
parte superior del equipo. (Recuerde que cuando quiera usar longitudes menores
que 340 nm debe cambiar el espejo y encender la lmpara de Deuterio
presionando por unos segundos el botn correspondiente).
3. Seleccionar el modo de medicin mediante la perilla que se encuentra en la
parte frontal superior derecha seleccionando en el modo Absorbancia.
4. Colocar una mezcla de acetona / agua (80:20 v/v) en una cubeta de vidrio
(cubeta blanco), limpiar con un papel suave, y colocar el blanco en el equipo

15

levantando la puerta de entrada.

5. Cierre el compartimiento y regule con la perilla INCREASE hasta llegar a cero en
la pantalla. Este es su blanco.
6. Siguiendo las instrucciones del manual obtenga las lecturas de los extractos
foliares, colocando cada vez las muestras en el soporte del equipo.
Unicam UV2.
Unicam UV2 es un interesante ejemplo de un moderno espectrofotmetro. Estos
instrumentos cuestan aproximadamente U$ 5,500 y son suficientemente sofisticados
para muchos tipos de anlisis de rutina. Ellos emplean un monocromador que produce
un ancho de banda de 2 nm en el rango espectral. Estos instrumentos estn equipados
con lmparas de deuterio y son capaces de determinaciones en el rango del UV. La
mayora de las funciones son controladas por claves multifuncionales, as que deben
ser muy cuidadosos de cuales botones estn presionando.

Instrucciones:
1. Encienda colocando en ON el interruptor. El interruptor esta en el costado
posterior izquierdo. Espere que se complete el AUTO TEST.
2. Colocar el cursor en la palabra FIJA. En la pantalla aparecer una serie de
parmetros que se pueden modificar. El MODO aparecer como prefijado en
ABS (Absorbancia). Existen otras posibilidades como %T (Transmitancia) y CON
(multiplica por un factor).
3. Modificar la longitud de onda. Colocando el cursor en la palabra LONGITUD DE
ONDA. Presione el botn EDIT y coloque el nuevo valor para finalizar presione
ENTER.
4. Ambas lmparas, (Deuterio para luz UV; Tungsteno para luz visible), estn
ahora encendidas. Si usted esta usando una longitud de onda de 350 nm o
menor, debe asegurarse que esta encendida la lmpara de Deuterio. El paso de
una lmpara a otra se hace en forma automtica.
5. Abrir la puerta del compartimiento; insertar la cubeta con la solucin blanco en el
espectrofotmetro y cerrar la puerta.
6. Presionar el botn de ZERO/BASE
7. Abrir el compartimiento y sacar el blanco
8. Insertar la muestra y cerrar la puerta del compartimiento.
9. Presionar el botn RUN y leer los datos.

B. Espectrofotometra

16

Espectrofotometra es definida como la medida de absorbancia o transmitancia de luz

Espectro Electromagntico
rayos X

UV

400nm

800nm

IR

Visible

= c/v

E = hv = hc/

Una molcula o tomo absorbe luz si la energa de la luz es aproximadamente igual a la

diferencia de energa entre sus niveles externos de electrones.

Principios:
Ley de Beer-Lambert
Anlisis cualitativo, porque los compuestos absorben luz en longitudes de onda
caractersticas (nm, )
Absorbancia

longitud de onda

Anlisis cuantitativo, la concentracin de los compuestos puede ser medida

espectrofometricamente. El diagrama siguiente muestra lo que pasa cada vez que la luz
incide sobre una solucin.

17

b
It

I0

Se establece que :

log It/I0= - a b c
Donde :
Io = Intensidad incidente
It = Intensidad transmitida
b = longitud del paso de luz
c = concentracin del compuesto
a = absortividad caracterstica del compuesto
Para eliminar los nmeros negativos, la ecuacin anterior puede ser transformada como

- log It / Io = a b c

log

I o / It = a b c

Si A = - log It / Io, donde A es llamada absorbancia, entonces:

A= a b c

Ley de Beer-Lambert

Unidades:
"A" no debe tener unidades
"b" usualmente es 1 cm
"c" puede tener unidades de mg/ml, g/l, mol/l, etc.
"a" debe tener unidades reciprocas de "b c"
ejemplo: c tiene unidades de mg/ml
b = 1 cm
a debe tener unidades de (mg/ml) -1 (cm) -1
a b c = (mg/ml) -1 (cm) -1 (mg/ml) cm = sin unidades
Coeficiente Absortividad

18

Como encontrar el valor de "a" ?

Por la medicin de un estndar (concentracin conocida del compuesto absorbedor)
ejemplo 1.
c = 1 x 10 -4 mg/ml
(solucin preparada)
b = 1 cm
(cubeta normal)
A = 0,2
(absorbancia medida)
a=?
Usando la ecuacin
A= a b c
a = A (b c) -1
a = 0,2 ( 1 cm 1 x 10 -4 mg/ml) -1
a = 2 x 10 3 = 2000 ml ( mg cm) -1
ejemplo 2.
El mismo compuesto anterior pero ahora con una concentracin
desconocida
b = 1 cm
A = 0,3
(medido)
c=?
c = A (a b) -1
c = 0,3 ( 2 x 10 3 ml ( mg cm) -1 ( 1 cm) -1 )
c = 1,5 x 10 -4 mg /ml
Curva Estndar
Muchas veces para determinar el coeficiente a no basta con una sola medicin
sino que debe realizarse una curva estndar.
Si usted ve la formula general de la ecuacin de la recta:
y = mx + b es posible observar que la formula de Beer-Lambert encaja en este
tipo de ecuacin:
A = (a b) c + 0
Donde "A" o absorbancia es graficada contra "c" o concentracin, resultando
una lnea recta
(A)bsorbancia

pendiente = a b

(c)oncentracin

19

Blancos para los anlisis espectrofotometricos

El blanco perfecto, se colocan todas los compuestos y solventes excepto el compuesto
absorbedor de luz que nos interesa medir.
Desviaciones a la Ley de Beer
Fuente de luz no monocromtica
Fuentes no homogneas
Absorcin no lineal
Soluciones muy concentradas no obedecen la ley de Beer

Laboratorio 1C.
Anlisis de Titulacin de un aminocido

20

Introduccin:
Los aminocidos son ejemplos comunes de una biomolcula simple que tiene dos o
mas grupos titulables. Al igual que el buffer HEPES tiene dos grupos titulables. Esto es
importante para comprender muchos procesos bioqumicos de molculas ionizables. La
ionizacin de cada grupo sigue la ecuacin de Henderson-Hasselbalch. Por ejemplo,
glicina tiene dos grupos ionizables: un grupo carboxilo y un grupo amino, con valores
de pKa de 2,4 y 9,6 respectivamente. En agua a pH 6, la glicina existe como un ion
dipolar, o zwitterion, en el cual el grupo carboxilo esta desprotonado (-COO-) y el grupo
amino esta protonado para dar un ion amonio (-NH 3+).
Adicionando cido a una solucin de glicina, la solucin bajar de pH rpidamente
primero y luego mas lentamente debido a la accin ejercida por el grupo carboxilo. A pH
2,4 el pKa es alcanzado, una mitad del cido ha sido consumido, y el grupo carboxilo
esta medio ionizado y en este punto es mas efectivo como buffer. La adicin de mas
cido resultara en la titulacin de los grupos carboxilos remanentes. La titulacin de los
grupos de ion amonio (amino) con base sigue una curva similar en la regin alcalina.
Especficamente , la concentracin de las especies protonadas y desprotonadas de
cada ion en algn pH pueden ser calculadas por la ecuacin de HendersonHasselbalch. La interseccin entre la titulacin del grupo carboxilo y el grupo amino esta
el punto en el cual la glicina no tiene carga neta, y este punto es llamado punto
isolectrico o pI.
Curva de titulacin de glicina
14

pKa2= 9,6

pH

pI = 6
pKa1= 2,4

Moles de equivalentes de cido o base adicionados

El pH de un sistema biolgico es de vital importancia. Cambios en el pH pueden

afectar la velocidad de reaccin de algunas enzimas. Cambios extremos en el pH
pueden desnaturar protenas y resultando enzimas inactivas. cidos fuertes no son
comnmente encontrados en los sistemas biolgicos (HCl en el estomago de los
animales es la excepcin). Los cidos dbiles son comnmente encontrados en los
sistemas biolgicos.

21

Materiales:
En cualquier laboratorio hoy en da, un pH-metro es usado para determinar el pH de
una solucin. El profesor y los ayudantes demostrar el uso correcto de un pH-metro.
Cada grupo calibrar su pH-metro de acuerdo a las instrucciones dadas por los
ayudantes.

Parte Experimental
Este ejercicio los introducir a las propiedades cido / base de los aminocidos. El
aminocido usado aqu ser la glicina.
El plan general es subir el pH de una solucin de glicina (0,4 M) a aproximadamente 1,5
por la adicin de 1,0 M de HCl, y entonces agregar alcuotas de 2,0 ml de 1,0 M de
KOH a la solucin de glicina para proceder a la curva de titulacin.
Protocolo.
1. Comenzar el experimento con la adicin del HCl 1.0 M a 40-mL de solucin de
Glicina agitando constantemente hasta obtener un pH de aproximadamente 1,5.
Si el equipamiento del laboratorio lo permite, colocar una barra magntica dentro del
vaso que contiene la muestra y colocarlo en una agitador magntico.
2. Colocar en una tabla de datos en tu cuaderno de laboratorio con el siguiente
encabezado.
mL de KOH pH de la solucin de
Glicina
0
*
1
*
2
*
etc.
*

Usando una pipeta o micropipeta, agregar alicuotas de 1 o 2 ml de KOH a la

muestra, agitando constantemente la solucin, medir y anotar el pH. La solucin
titulante es 1.0 M KOH (que es preferible a NaOH debido que el ion sodio
interfiere con algunos electrodos a pH altos). Repetir este procedimiento de
titulacin hasta que el pH sea superior a 12. Limpiar bien el electrodo despus
de este experimento y comenzar a preparar la siguiente titulacin de KOH con
el vaso que contiene 40 ml de agua destilada.
3.

Agregar los 40 ml de agua y colocarlo en las mismas condiciones anteriores.

Igual que en caso anterior, con el objeto de acidificar la muestra, agregamos HCl
1,0 M hasta llegar a pH cercano a 1,5. Volver a hacer una tabla similar a la
usada anteriormente.
ml de KOH

pH del agua

22

0
1
2
etc.

*
*
*
*

Usando una pipeta, agregar alicuotas de 1 -2 mL de KOH a la muestra, agitando

la solucin, medir y anotar el pH obtenido. Continuar agregando las alicuotas de
KOH hasta llegar a pH mayores de 12.
Limpiar el rea de trabajo.
Anlisis:
Coloque los datos en una tabla ampliada. Encabezada de la siguiente manera:
ml KOH pH Gly pH H2O

mmol KOH

pH/ mmol Gly

pH/ mmol H2O

Determinar los milimoles (mmoles) multiplicando el volumen de KOH en ml por 1 de la

molaridad de la solucin de KOH.
Realizar los grficos de pH versus ml de KOH para cada solucin. Realizar los grficos
de pH/ mmol versus pH para las dos soluciones.

Preguntas:
1) Cul es el rango de pH en el cual cada solucin es amortiguado?
2) Diga las diferencias significativas entre las dos curvas de valoracin
3) Dibujar las 4 posibles formas inicas de glicina
4) Identificar cuales de estas formas son predominantes a pH 1, pH 6, y pH 11, y que
no existen en el agua.
5) Identificar los dos pKa's de la glicina.
6) Escriba las ecuaciones mostrando como la glicina puede tamponar las soluciones en
su pKa por consumo de pequeas cantidades agregadas de iones hidrogeno o
hidrxido.

Apndice 2.
I. Consideraciones tericas
En este experimento se desarrollar bajo el fenmeno de disociacin cido - base. La
definicin general de un cido es una molcula que puede disociarse y liberar iones
hidrogeno. De la misma forma , una base es una molcula que puede aceptar iones
hidrogeno. La siguiente ecuacin muestra la disociacin del cido dbil, cido actico:

23

CH3COOH
CH3COO- + H+
La disociacin de un cido dbil tal como el cido actico obedece la ley de accin de
masas que es descrita por la ecuacin:
CH3COO- H+
K =
CH3COOH
donde K es la constante de disociacin y los trminos entre parntesis cuadrado
representan la concentracin de las molculas indicadas en moles por litro. La cantidad
de iones hidrogeno que son liberados cuando un cido o base dbil es disuelto en una
solucin puede ser descrito por la siguiente ecuacin:

[H+] = KC
donde C es la concentracin del cido dbil en sus formas protonada y desprotonada.
Que es,
C = [CH3COO-] + [CH3COOH]
A. Derivacin de la ecuacin Henderson-Hasselbalch.
La ecuacin de Henderson-Hasselbalch es usada para describir la accin de un
"buffer" cuando un cido o una base fuerte es adicionada a un cido o base dbil.
Rearreglando la ecuacin de accin de masas dada anteriormente:
1

CH3COO-

CH3COOH

=
H+

Porque pH = log (1 / H+ )= -log [H+] y pK = log (1/K) = - log K, podemos derivar la

siguiente ecuacin:
pH = pKa + log CH3COO-
CH3COOH
Si generalizamos la ecuacin de la disociacin de todos los cidos (HA H+ + A-),
obtenemos la ecuacin de Henderson-Hasselbalch :
pH = pKa + log A-
HA

B. Agentes Amortiguadores o tamponantes (tambin llamados " buffers").

Los agentes amortiguadores son molculas que impiden que un sistema cambie mucho
su pH. Las molculas que puede aceptar o liberar un ion hidrogeno es un buffer; en
otras palabras, los cidos o base dbiles pueden servir como un buffer. Los agentes
amortiguadores mas comunes usados en investigaciones bioqumicas son HEPES (pK a
= 7,55 a 20C) y Tris (pKa = 8,30 a 20C). Los buffers tienen su mas alta capacidad
amortiguadora cerca de su pKa .

24

Un examen de la ecuacin de Henderson-Hasselbalch permite entender el termino pK a.

Cuando la [A-] = [HA], el termino log [A-] / [HA] llega a ser igual a log 1 que es cero.
Bajo estas condiciones el pH = pK a. Adems, podemos definir pK a como el pH en el
cual las concentraciones de las formas protonadas y desprotonadas son iguales. El
pKa tambin es igual al pH en el cual el grupo ionizable esta en su mejor capacidad
amortiguadora; que es, cuando el cambio de pH cambia levemente con los cambios en
[A-] o [HA].
Nota: Todos los valores de pKa son derivados con una unidad de concentracin (aprox.
1.0 molar). Los valores de pKa de muchos iones importantes en sistemas bioqumicos
cambian con la temperatura, fuerza inica y cuando se diluyen a concentraciones muy
bajas. El smbolo pKa' designa los valores de pKa en sistemas de iones diluidos.

Amortiguadores
PIPES, sal sdica
Imidazol-HCl
MOPS
HEPES
Tris

Peso Formula

pKa a 20 C

pKa/C

A250 of 0.1M

335.3
104.5
209.3
238.3
121.1

6.81 0.15
7.04 0.15
7.20 0.15
7.55 0.15
8.30 0.15

-0.009
-0.017
-0.006
-0.014
-0.031

<0.05
<0.005
<0.01
<0.005
<0.01

Cuando escojas un agente amortiguador , usted podra considerar lo siguiente (Good et

al., 1966, Biochemistry 5, 467):
1. El pKa ser cercano al pH (0.5 pH) que se desea para la reaccin a analizar.
Cuando el pH = pKa, la capacidad amortiguadora de un buffer es mas alta y los
protones liberados durante la reaccin no alteran substancialmente el pH.
2. El agente amortiguador ser muy soluble en agua e insoluble en solventes
organices. Esto permite la preparacin de soluciones concentradas en stock. Y
esto previene la interaccin del buffer con membranas o con el interior de una
protena. Tris tiene una tendencia a interactuar con membranas.
3. Los agentes amortiguadores estarn disponibles como zwitterion porque iones
asociados tales como cloruro o sodio pueden afectar negativamente su sistema..
Pero adems su sistema puede ser positivamente afectado por estos iones.
4. Los pKa de los buffers sern influenciados al mnimo por la concentracin del
buffer, temperatura y composicin inica del medio. Tris es mas sensitivo a la
temperatura que los otros buffers listados anteriormente; compare la columna
marcada pKa/C.
5. El buffer no interactuar fuertemente con metales u otros iones. El fosfato es

25

usado frecuentemente como buffer pero interacta con muchos metales,

precipita en la presencia de Ca 2+ y no es tan til buffer como los listados
anteriormente.
6. El buffer no absorber la luz UV, ya que muchos ensayos bioqumicos utilizan
esa longitud de onda . Ser mejor si la molcula no absorbe sobre los 240 nm
pero todos ellos lo hacen.

II. pH-Metro
1. El pH Metro, posee la precisin de un mili voltmetro, mide potenciales de
electrodo y los transforma a unidades de pH y corresponde a la siguiente
equivalencia:
59mv => 1 pH
2. El electrodo para medir pH (figura 1)
1) Es un bulbo de vidrio sensible al pH (permeable a los H +), que detecta
el voltage producido entre las soluciones que se encuentran en la parte
externa e interna del bulbo de vidrio.
cable

solucin saturada de KCl

Figura 1. Electrodo
para medir pH
bulbo sensible al pH

LABORATORIO N2
CINTICA ENZIMTICA
Srta. Maritza Berti

26

INTRODUCCIN.
Funcin y clasificacin de las enzimas
Las enzimas son protenas que tienen la funcin de catalizar todas las
reacciones qumicas que ocurren dentro de los organismos vivos. Estas se designan y
se clasifican de acuerdo con el tipo de reaccin que catalizan. Los seis grupos
principales son: Transferasas, Hidrolasas, Liasas, Isomerasas, y Ligasas (Sintetasas).
Cada enzima se designa con un nombre sistemtico y por un nmero que la
identifica de acuerdo a los grupos y subgrupos. Tambin tienen un nombre mas comn
que muchas veces resulta ms prctico y ms conveniente de usar que el nombre
sistemtico.

Medicin de la actividad enzimtica

Debido a las bajas concentraciones de enzima que se requieren para catalizar
una reaccin dada, normalmente la presencia de una enzima se detecta siguiendo la
desaparicin del sustrato o la aparicin de un producto que pueda ser identificado por
alguna tcnica analtica. Si se confecciona una curva de progreso de la cantidad de
sustancia transformada en funcin del tiempo (figura 2), se puede observar que al
comienzo la reaccin es lineal, pero pronto comienza a disminuir debido, por una parte
a la disminucin del sustrato y por otra parte a la presencia del producto lo que hace
que la reaccin inversa ocupe un papel cada vez ms importante hasta llegar a un
equilibrio. Finalmente la reaccin puede ser inhibida por los productos formados o
puede inactivarse bajo las condiciones experimentales. Todos estos efectos juntos
hacen que sea casi imposible derivar una ecuacin estandar que se ajuste a la curva de
progreso. Por lo tanto la actividad enzimtica se determina considerando la velocidad
inicial de la reaccin (v = a/b) ya que en tales condiciones los efectos discutidos son
ms pequeos.
La actividad enzimtica se expresa frecuentemente en trmino de unidades (U).
Una unidad es la cantidad de enzima que cataliza la conversin de un micromol de
sustrato (o producto) por minuto bajo condiciones definidas. Otra manera de expresar
la actividad enzimtica es mediante la unidad SI que es la katals (kat) y representa la
transformacin de 1 mol de sustrato por segundo. Como esta unidad es grande lo ms
comn es usar la unidad nanokatals (nkat).

Sustancia
transformada, s

27

b
a
Tiempo, t

Figura 2: Curva tpica de progreso

1 U = 1 mol min-1
1 katal = 1 mol s-1
1 U = kat/60 = 16,67 nkat.
La pureza de la enzima se expresa en trminos de actividad especfica que se
define como el nmero de unidades enzimticas por milgramo de protena. La actividad
especfica en unidades SI se expresa como katals por kilogramo de protena

Ecuacin de Michaelis - Menten

La curva presentada en la figura 3 corresponde a una cintica enzimtica tpica
que fue derivada por primera vez por Michaelis - Menten obtenindose la siguiente
ecuacin:
v=

V s__
s + Km

V = Velocidad mxima
Km = Concentracin de sustrato correspondiente a la
mitad de la velocidad mxima

Actividad
enzimtica, v

Vmax

Vmax

28

Km

Concentracin de sustrato, s

Figura 3: Curva de Michaelis-Menten

Determinacin de las constantes de Km y Vmax

Las constantes Km y Vmax pueden determinarse ms convenientemente
utilizando una transformacin lineal de la ecuacin de Michaelis que se obtiene
tomando los recprocos
1 = 1 + Km x 1
v V
V
s
y graficando 1/v versus 1/s siendo la pendiente K m / V. Sin embargo la pendiente de
esta curva depende mucho de las velocidades medidas a bajas concentraciones de
sustrato que son las menos exactas, por tal razn se prefiere utilizar una forma alterna
que consiste en multiplicar la ecuacin de los recprocos por s (figura 4).
_s_ = s_ + Km
v
V
V
Cuando s = 0, _s_ = Km
v
V

y cuando

_s_ = 0,
v

= - Km

s_
v

Km
V

Pendiente

1_

V
29

- Km

Figura 4: Recta correspondiente a los recprocos de la ecuacin de MichaelisMenten multiplicados por s, para la determinacin de las constantes Km y Vm.

Efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad enzimtica

Las enzimas son bastante sensibles a las condiciones experimentales de
temperatura y pH. La velocidad de una reaccin catalizada por una enzima, al igual que
la mayora de las reacciones qumicas, aumenta con la temperatura. Esto se debe
principalmente al efecto sobre las constantes de velocidad de las diversas reacciones
parciales que componen la reaccin total y a la afinidad de la enzima por los
cofactores, activadores etc. A elevadas temperaturas, la protena de la enzima se
desnaturaliza dando como resultado una prdida de actividad. La temperatura a la cual
una enzima alcanza su mxima actividad se denomina Temperatura ptima. Cada
enzima difiere en cuanto a la temperatura ptima que necesita para actuar y esta se
puede determinar llevando a cabo la actividad enzimtica a diferentes temperaturas y
luego realizando una curva de actividad versus temperatura, obtenindose
normalmente una curva como la mostrada en la figura 5. En la prctica la mayora de
las enzimas son completamente inactivadas por encima de los 70C.
Con respecto al pH las enzimas son activas en un rango limitado de pH y un
grfico de la actividad en funcin del pH, da una curva en forma de campana parecida a
la que se muestra en la figura 5. El pH al cual se obtiene la actividad mxima se conoce
como el pH ptimo y es caracterstico de la enzima, siempre y cuando esta sea estable
en las condiciones experimentales usadas.

Sustrato
transformado
en el tiempo

30

T
Temperatura
Figura 5: Temperatura ptima (T) de una enzima

Los cambios de actividad con el pH se deben a cambios en el estado de

ionizacin de la protena enzimtica y de los otros componentes de la mezcla de
reaccin. Michaelis y Davidson sugirieron en 1911 que de las diferentes formas de
ionizacin de la protena slo una es activa. A valores de pH por encima o por debajo
del pH ptimo disminuye la cantidad de esta forma y por lo tanto se produce una
disminucin en la actividad enzimtica.

Modelo enzimtico
La enzima que se utilizar en todos los ensayos de este prctico es la a-amilasa
de cebada. Esta enzima cataliza la hidrlisis de los enlaces a 1-4 del almidn
produciendo azcares reductores que pueden detectarse mediante el reactivo 3,5 dinitrosaliclato el cual se reduce a cido 3-amino-5-dinitro saliclico produciendo una
coloracin que se mide a 540 nm. Otra forma de detectar la actividad a-amilasa es a
travs del reactivo de Iodo I 3, obtenido haciendo una mezcla entre ioduro de potasio e I 2
(lugol) el cual forma un complejo con el almidn dando un color azul detectado a 620
nm. En este caso se mide la disminucin de la absorbancia ya que a medida que la
enzima acta la concentracin de almidn va disminuyendo. En este prctico se usar
este ltimo mtodo debido a su mayor simplicidad.

MATERIALES Y MTODOS
Extraccin de a- amilasas
Pesar 5 semillas de cebada previamente peladas. Homogenizar el tejido en un
mortero con 1,5 mL de buffer de extraccin (Acetato de sodio 0,01 M pH 5,0 + CaCl 2
0,1 M) y luego centrifugar en un tubo eppendorf a 15.000 rpm por 10 min. Trasvasijar

31

el sobrenadante a un nuevo tubo y calentar a 60C por 5 min. Centrifugar a 15.000

rpm por 5 min. y trasvasijar nuevamente a otro tubo y dejar el tubo en hielo.

Medicin de la actividad enzimtica

Colocar en un tubo de 5 mL 590 L del medio de reaccin (en este caso es el
mismo que se usa como buffer de extraccin) y agregar 10 L de la enzima extrada.
Incubar a 37C y comenzar la reaccin agregando 600 L de una solucin de almidn
(0.15% + CaCl2 0,002M y KH2PO4 0.04 M). Dejar actuar durante 10 min y luego parar
la reaccin con 600 L del reactivo de iodo (0,06% en HCl 0,05 N). Diluir cada tubo con
3 mL de agua destilada. El blanco consiste en 1200 uL de agua + reactivo de Iodo. El
tubo correspondiente al tiempo 0 contiene 600 L del buffer de reaccin, reactivo de
Iodo y la solucin de almidn.
Medir la absorbancia a 620 nm y restar esta absorbancia al tiempo 0. El
resultado de la resta es la absorbancia correspondiente a la cantidad de almidn
degradado por la enzima. La actividad de la enzima expresada en g de almidn
consumido min-1 gpf-1 (en el caso del almidn no se puede hablar de molaridad por ser
un polmero) se obtiene mediante la siguiente ecuacin:
g de almidn = (A620 nm - 0,0359) x
1___ x __volumen total__
min x gpf
0,00125
10 min
0,010 mL x gpf

NOTA: Los valores de las constantes fueron obtenidos de una curva de calibracin de
Absorbancia versus grs de almidn donde p=0,00125 y a = 0,0359. (gpf= gramos de
peso fresco).

Determinacin de la concentracin de protenas

La concentracin de protenas se puede determinar de varias formas. Un mtodo
simple es el mtodo de Bradford que consiste en mezclar una dilucin adecuada de
enzima en 800 L de agua y agregar 200 L del reactivo de Bradford concentrado
(solucin de azul de coomassie 0,25mg/mL en etanol al 25% y cido orto-fosfrico al
43%). El azul de coomassie se une a residuos bsicos y aromticos, especialmente

32

arginina, y esta reaccin se detecta a 595 nm. Para la determinacin de la

concentracin de protenas se utiliza la siguiente ecuacin, obtenida de la
correspondiente curva de calibracin (realizada con albmina de bovino como protena
estndar):
mg de protena = (A595 nm - 0,00823) x volmen total
gpf
0,0559
0,020 mL

x _10_ x __1__
gpf
1000

Cintica enzimtica y clculo de Vmax y Km

Preparar una batera de 10 tubos cada uno conteniendo 590 L de buffer de
reaccin . Incubar en un bao a 37C y en otro tubo dejar incubando tambin la
enzima. Colocar 10 L de enzima en el primer tubo y partir la reaccin agregando 600
L de la solucin de almidn stock (0,15%) 10 veces diluida. Parar la reaccin con el
reactivo de Iodo despus de un minuto. Repetir la operacin con los siguientes tubos
usando soluciones de almidn cada vez ms concentradas (1/9, 1/8, 1/7, 1/6, 1/5, 1/4,
1/3, 1/2, 1/1). Preparar un tubo blanco para cada concentracin de almidn y otro de
tiempo 0 como descrito anteriormente y medir la absorbancia a 620 nm. Obtener las
diferencias de cada valor con el tiempo 0 y hacer una curva de ug de almidn
consumido por min versus concentracin de sustrato. A partir de este grfico y despus
de hacer las derivaciones correspondientes, calcular V max y Km .

Determinacin del pH ptimo

Preparar una batera de 10 tubos y agregar en cada uno 590 L del buffer de
reaccin ajustado a diferentes pHs ( 3,0 - 4,0 - 5,0 - 6,0 - 7,0 - 8,0 - 9,0 - 10 - 11).
Agregar a cada uno 10L de enzima . Incubar a 37C por 1 minuto y partir la reaccin
con la solucin de almidn stock sin diluir (0,15%). Parar la reaccin a los 10 min con el
reactivo de Iodo . Preparar un tubo blanco y un tubo de tiempo 0 y medir la absorbancia
a 620 nm. Hacer las diferencias correspondientes y calcular la actividad para cada
caso. Graficar la actividad versus pH. Determinar el pH ptimo o el rango de pHs en el
cual se obtiene la actividad ms alta.

LABORATORIO N 3
BIOENERGTICA
Los Procesos de Fotosntesis y Respiracin en Vegetales
Sr. Manuel Pinto.

33

Introduccin
El crecimiento en los vegetales es el producto de la sntesis y acumulacin de nuevas
biomolculas que se producen por la transformacin, al interior de la clula, de dos
tipos de sustratos: uno orgnico y otro mineral. El sustrato orgnico es el ms
abundante y proporciona tanto las estructuras carbonadas que servirn de base para la
nueva sntesis como la energa necesaria para efectuarla. Este sustrato corresponde
por lo general a hidratos de carbonos dentro de los cuales la glucosa es el ms
importante. Por su parte el sustrato mineral, menos abundante pero igualmente
importante, corresponde a los elementos minerales absorbidos por las races que
durante la sntesis se unen a las molculas orgnicas para permitirles cumplir diversas
funciones, Figura 6.

Sustrato
Mineral

Fotosntesis Sustrato
Orgnico
SUSTRATO
TOTAL

Respiracin

Estructuras
Carbonadas

Energa
ATP

CRECIMIENTO
VEGETAL

Figura 6.- Esquema sobre el origen del crecimiento en los vegetales

34

Origen de la Glucosa en los Vegetales

En los vegetales superiores, la glucosa destinada a constituir el sustrato orgnico,
proviene en su totalidad de la asimilacin de CO 2 en el proceso de la fotosntesis. Sin
embargo, a inicio del crecimiento de rganos previamente en latencia, como en el
caso de las yemas o durante la germinacin de semillas, la glucosa proviene del
desdoblamiento de las reservas.

La Fotosntesis: proceso encargado de incorporar la energa y el

carbono para el crecimiento de los vegetales
La fotosntesis es el proceso mediante el cual los vegetales pueden transformar la
energa de los fotones luminosos en energa de enlaces qumicos. Esta transformacin
se efecta en los cloroplastos mediante la intervencin de dos procesos bien diferentes:
el primero, conocido como fase clara, en el que la energa luminosa queda almacenada
como ATP y NADPH2 , Figura 7 y el segundo en que la energa del ATP y el NADPH 2
es usada para la

SOL

4 fotones

4 fotones = 8 fotones (Eq)

PSII

PS I
4e-

2H2O

O2 + 4 e- + 4H+

3ADP + Pi

2 NAD + 4e- + 4H+

2 NADPH2

3ATP

Figura 7.- Esquema de la fase clara de la fotosntesis

35

formacin de compuestos ms estables a partir del CO 2 atmosfrico el cual es

absorbido a travs de los estomas y reducido a hexosa (glucosa) de acuerdo con las
ecuaciones siguientes:
A) en las plantas con metabolismo C3 ,
6 CO2 + 12 NADPH+ + 18 ATP

C6 H12O6 + 12 NADP + 18 ADP + 18Pi

lo que significa que en este tipo de plantas el requerimiento energtico mnimo para la
reduccin de una molcula de CO2 el ciclo de Calvin es de 2 NADPH+ y 3 ATP que
a la postre significa una Exigencia cuntica mnimo (Eq) de 8 fotones por cada CO 2
reducido u O2 desprendido desde el agua.
B) en las plantas con metabolismo C4 ,
6 CO2 + 12 NADPH+ + 30 ATP

C6 H12O6 + 12 NADP + 30 ADP + 30Pi

lo que significa que en este tipo de plantas el requerimiento energtico mnimo para la
reduccin de una molcula de CO 2 es de 2 NADPH+ y 5 ATP que a la postre
significan una Exigencia cuntica mnima de aproximadamente 12 fotones por CO 2
reducido u O2 desprendido desde el agua. Los 2 ATP de diferencia respecto de lo
necesitado por una planta C 3 corresponden a las necesidades energticas extras del
ciclo C4 que opera en conjunto con el ciclo de Calvin en este tipo de plantas.
La glucosa as sintetizada puede ser utilizada para proporcionar cadenas carbonadas
para servir de esqueleto en la sntesis de nuevas molculas (hidratos de carbono de
reserva y estructuras, protenas, cidos nucleicos, lpidos etc.) y para proporcionar la
energa (ATP) necesaria para dicha sntesis, Figura 1. Este tipo de trabajo biolgico los
organismos vivos y por lo tanto, tambin las plantas lo efectan a travs del
metabolismo respiratorio.

La Respiracin: metabolismo esencial para el crecimiento de las

plntulas
La respiracin es el proceso mediante el cual los organismos vivos pueden extraer
estructuras carbonadas y energa bajo forma utilizable desde la glucosa para efectuar
trabajo biolgico. Uno de los trabajos biolgicos ms importantes es la sntesis de
nuevos compuestos de cuya acumulacin y reparto depende el crecimiento.
La extraccin de la energa de la glucosa se efecta mediante una serie de oxidaciones
parciales las que se pueden agrupar en tres grandes procesos:

la Gliclisis,

36

el Ciclo de los Acidos Tricarboxlicos (o ciclo de Krebs) y

la Fosforilacin Oxidativa.

Mediante la accin combinada de estos tres procesos, durante la germinacin, la

plntula puede disponer de estructuras carbonadas que servirn de base para las
nuevas biomolculas y de energa utilizable bajo forma de ATP y NADH 2 .

Reservas

Fotosntesis
GLUCOSA

Gliclisis

4 NADH2
2 ATP

CO2
Ciclo de
Krebs

6 NADH2
2 FADH2
2 ATP

O2

Fosforilacin Oxidativa
1NADH2 = 3 ATP

1FADH2 = 2 ATP

1 Glucosa = 38 ATP
Figura 8.- Esquema del proceso de la Respiracin

La Gliclisis
La gliclisis es el punto de partida de la oxidacin de la glucosa que en el caso de las
semillas de cereales proviene de la hidrlisis del almidn de reserva.
Amilasas

37

Almidn + H2O

( Glucosas ) n

Esta glucosa ( C6H12O6) se oxida a travs de unas 10 reacciones intermedias

produciendo 2 cidos pirvicos, dando como balance una ganancia neta en energa de
4 ATP + 4 NADH2 .

Ciclo de los Acidos Tricarboxlicos

Los cidos pirvicos se descarboxilan y activan a la vez transformndose en
2 Acetil Co A, liberando 2 CO2 y produciendo 4 NADH2 adicionales.
Los 2 Acetil Co A activados entran al Ciclo de los Acidos Tricarboxlicos o Ciclo de
Krebs en donde se oxidan y descarboxilan totalmente liberando 4 CO 2 y produciendo 2
ATP + 6 NADH2 + 2 FADH2
En total la oxidacin de un mol de glucosa en la Gliclisis y el Ciclo de Krebs produce:
10 NADH2 + 2 FADH2 + 4 ATP
Adems el ciclo de Krebs posee la particularidad que a lo largo de sus numerosas
reacciones, produce compuestos intermediarios que sirven de estructura base para la
sntesis de otras biomolculas como protenas, lpidos, cidos orgnicos, aminocidos
etc.

Fosforilacin oxidativa
La fosforilacin oxidativa es el proceso que ocurre en las mitocondrias mediante el cual
los compuestos reducidos, producidos en la Gliclisis y en le ciclo de Krebs (NADH 2 y
FADH2) se oxidan por accin del O 2 liberando energa que es finalmente utilizada para
la sntesis de ATP . Por cada NADH2 y FADH2 oxidados se producen 3 ATP y 2 ATP
respectivamente.
La produccin energtica final de la oxidacin de un mol de Glucosa en la respiracin
es por lo tanto, de 38 moles de ATP producindose al mismo tiempo la liberacin de 6
moles de CO2 y consumindose 6 moles de O2.

C6H12O6 + 6 O2

6 CO2 + 6 H2O + 38 ATP

Este balance ilustra bien la importancia del oxgeno durante la germinacin de la semilla
ya que sin el suministro adecuado de este elemento el metabolismo energtico de la
semilla se ver afectado y por lo tanto, no habr suficiente ATP ni estructuras

38

carbonadas para sustentar el crecimiento.

Respiracin Durante la Germinacin de Semillas

Fases energticas de la germinacin de las semillas
Desde el punto de vista energtico, a partir del inicio de la germinacin, la primera parte
del desarrollo de un vegetal se puede dividir en tres fases, Figura 9 :

la primera o fase hetertrofa, en que el crecimiento es totalmente dependiente del

sustrato orgnico originado del metabolismo de las reservas contenidas en la
semilla. En esta fase el sustrato mineral tambin viene en gran medida de las
reservas de la semilla pero es nfimo en comparacin con el orgnico.

la segunda o fase intermedia, en que el crecimiento es sustentado tanto por el

desdoblamiento de las reservas como por la fotosntesis de las primeras hojas en
desarrollo y

la tercera o fase auttrofa, en que habindose agotado las reservas es el proceso

fotosinttico quin proporciona todo el sustrato orgnico para el crecimiento de la
planta.

Fase I

Fase II

Fase III

Crecimiento
por reservas
+ fotosntesis

Crecimiento
por reservas

20

(mg)

Materia Seca / Planta

40

Consumo
de reservas

10

15

20

30

39

Das despus de siembra

Figura 9.- Evolucin del peso seco de las distintas partes de la plntula de
trigo durante las tres fases energticas de sus primeros estados
de desarrollo

En la primera fase, hasta los 15 das despus de siembra, todas las estructuras carbonadas y la
energa necesaria para el crecimiento provienen del desdoblamiento de las reservas seminales que
dan origen al denominado sustrato orgnico total (ST) . Este sustrato, por lo tanto, se puede
dividir, en aquel destinado a proporcionar estructuras (St) y aquel destinado a proporcionar
nicamente energa (Se). Por lo tanto:

ST = St +
Se
La eficiencia del crecimiento durante la germinacin
Durante la fase hetertrofa se produce, en consecuencia, el consumo de las reservas
de las que solo St va a quedar incorporado como ganancia neta en las estructuras de
la parte area (tallos y hojas) y de la raz, y Se va a ser totalmente oxidado en la
respiracin para producir la energa para la transformacin de St. As la eficiencia (Ec)
a la cual se produce este consumo de reservas se puede calcular a partir de:

Ec = St (St + Se)

Esta eficiencia se conoce como Eficiencia de Crecimiento e indica la proporcin de

reservas que se transform en estructuras vegetales en relacin al consumo de
sustrato total. As por ejemplo, si durante la fase hetertrofa del trigo (Figura 9), cuyas
reservas son esencialmente almidn, el consumo de stas (ST) fue de 24 g y la
acumulacin de materia seca en la plntula (St) de 17 g, entonces la Ec para este
perodo fue igual a 0,70. Esto significa que el 70 % del sustrato total se transform en
estructuras estables en la planta y que el 30 % de este sustrato se gast totalmente
para proporcionar la energa necesaria para esta transformacin. Una eficiencia con

40

este valor revela que el trigo, durante la fase hetertrofa, es bastante eficiente en
transformar sus reservas en estructuras radiculares y de la parte area. Esto es
consecuencia de que las molculas constituyentes de la plntula son probablemente
de estructura muy similar a la del almidn de reserva, por lo que las transformaciones
de este son menores y por lo tanto, no requieren de un gran consumo energtico. En el
caso del frejol en cambio esta eficiencia es cercana a 0,60 indicando que el consumo
energtico es mayor, cercano al 40 % de las reservas. Esto es probablemente debido al
alto contenido proteico de sus estructuras lo cual requiere una mayor inversin
energtica para la transformacin del sustrato. En el caso de oleaginosas como la
maravilla, por el hecho de tener reservas ms bien lipdicas, con mayor contenido
energtico que los hidratos de carbono y las protenas, el consumo de reservas con
fines energticos es considerablemente menor lo que hace que en estas semillas Ec
sea superior a 0,85. Es decir en este caso menos de un 15% de las reservas son
destinadas a la produccin energtica y por lo tanto, la mayor parte de ellas se usan
para formar estructuras.
El metabolismo encargado de sustentar todas las transformaciones descritas es la
respiracin y por lo tanto, es importante analizar en forma general algunas de sus
reacciones.

41

PRCTICO DE BIOENERGTICA VEGETAL

A) Determinacin de la Exigencia Cuntica (Eq) mediante la evolucin
de O2
Una de las formas para medir la actividad fotosinttica, en particular a nivel de la
cadena transportadora de electrones en la fase clara, es a travs de la determinacin
de la tasa de desprendimiento de O 2. Esta determinacin se efecta mediante el uso de
un electrodo de Clark , dotado de un nodo de Ag y un ctodo de Pt sobre el cual va
una membrana semipermeable a travs de la cual puede difundir el O 2, Figura 10.

O2

Pt

Ag

Membrana

Pt

Figura 10.- Electrodo de Clark

La reaccin que se produce luego que el O2 alcanza el Pt es la siguiente:
Ptred + O2 + OH

Ptox + HOH + 2 e-

Los electrones desprendidos generan una corriente elctrica proporcional a la cantidad

de O2 difundido a travs de la membrana.

42

El electrodo se sita en la base (a) de una cmara hermtica, compuesta de tres partes
y bajo la parte (b) donde se sita el tejido foliar al que se le va a medir la tasa de
evolucin de O2 , Figura 11.

Fuente de luz
(c)
Cmara de medicin
(b)
(d)
Cmara del electrodo
(a)

Computador

Figura 11.- Esquema del sistema de medicin de O2

Esta cmara, al momento de la medicin, est saturada con CO 2 para que la
fotosntesis pueda funcionar. En su parte superior hay una fuente de luz (c) la cual se
puede programar a distintas intensidades. El electrodo se encuentra conectado a un
computador el cual, mediante un programa especial permite la calibracin del sistema y
la medicin del O2 desprendido del tejido foliar en funcin de diferentes intensidades
luminosas.
En la Figura 12, se presenta un curva caracterstica de la evolucin de O 2 de una hoja
(A), (moles de O2 m-2 s-1) en funcin de distintas intensidades luminosas. En ella se
distinguen cuatro parmetros caractersticos :
Ro, que corresponde al O2 consumido por la respiracin mitocondrial o respiracin
oscura,
PCL, que corresponde al punto de compensacin luminoso en donde el O 2
consumido se iguala al desprendido desde la fotlisis del agua quedando la
fotosntesis (A) neta igual a cero,
Amax, que corresponde a la tasa de desprendimiento de O 2 mxima y
RQ, que corresponde al rendimiento cuntico mximo el cual a su vez corresponde
a la pendiente de la curva en su origen (moles de O 2/moles de fotones)
La exigencia cuntica mnima (Eq) corresponde al valor inverso de RQ (moles de
fotones necesarios para desprender un mol de O 2)

43

20
A, mol O2 m-2 s-1

Amax

0
Ro
PCL

500
1000
1500
2000
Intensidad Luminosa ( mol fotones m-2 s-1)

Figura 12.- Curva caracterstica de la evolucin de la fotosntesis neta (A, mol O 2 m-2
s-1) en funcin de la intensidad luminosa
Objetivo: el objetivo de este trabajo de laboratorio ser analizar los fundamentos del
mtodo usado para cuantificar el O2 desprendido por un disco de hoja de 10 cm 2 en
funcin de la intensidad de radiacin incidente con el fin de determinar los parmetros
descritos en la Figura 7.

Materiales y Equipos:
Oxgrafo (Hansatech, UK)
Computador dotado de sofware LeafDisc (Hansatech, UK)
Manual de calibracin del Oxgrafo
Sistema de control de temperatura por circulacin de agua
Solucin de KOH saturada
Cilindro de CO2 10.000 ppm
Jeringas de 1 y 10 mL
Sacabocados de 10 cm2
Plantas de poroto con hojas desarrolladas
Procedimiento
Luego de calibrar el oxgrafo segn lo sealado en el manual del equipo procdase de
la siguiente manera:
a) corte un disco de hoja de 10 cm2 con el sacabocados
b) abra la cmara del oxgrafo y deposite el disco de hoja en el comportamiento
especial sobre la gradilla
c) cierre hermticamente la cmara
d) abra las vlvulas laterales e inyecte 10 mL de CO 2 (10.000 ppm) extrados con una

44

e)
f)
g)
h)
i)

jeringa desde el cilindro correspondiente.

cierre las vlvulas y proceda a recalibrar el equipo ahora con la muestra de hoja en
su interior
lograda la calibracin, elija un programa de intensidades de radiacin, desde 0 a
2000 mol fotones m-2 s-1
haga correr el programa y para la medicin proceda segn indique el programa
computacional
una vez terminada la medicin obtenga los parmetros de la curva
repita la medicin con hojas de diferente condicin y edad y discuta sus resultados

B) Determinacin de la respiracin en semillas mediante anlisis del

CO2 desprendido
La respiracin es el metabolismo mediante el cual los organismos extraen energa de
sus reservas para efectuar trabajo biolgico (sntesis de biomolculas, transporte de
metabolitos, movimiento etc.). En el caso de las semillas, durante el perodo de latencia,
los niveles de respiracin son muy bajos debido a que prcticamente no existe trabajo
biolgico. Durante este perodo hay una muy baja actividad metablica, producto de la
falta de crecimiento, y por lo tanto, el consumo de reservas con fines energticos es
tambin mnima. Bajo condiciones favorables para la germinacin, luego que esta se
inicia, el principal trabajo biolgico a realizar por la semilla es la sntesis y el transporte
de las nuevas biomolculas que constituirn las nuevas estructuras de los rganos en
crecimiento, es decir, de la raz y del tallo y las hojas. Este trabajo lo deber efectuar,
en una primera fase, totalmente a expensas de las reservas que contenga de donde
deber extraer:
a) cadenas carbonadas para formar la estructuras de los nuevos constituyentes de los
nuevos rganos y
b) energa bajo forma de ATP para efectuar dicha sntesis
Ambos componentes son proporcionados por el metabolismo respiratorio, que en el
caso de las semillas con reservas hidrocarbonadas, como el trigo y el maz, usa como
sustrato al almidn. Este es desdoblado a glucosa, que es el compuesto que finalmente
es oxidado para la obtencin de ATP. Para que la oxidacin de la glucosa sea completa
se necesita suficiente disponibilidad de O2 en la atmsfera circundante de la semilla, de
lo contrario el consumo de las reservas no se efectuar eficientemente y por lo tanto, el
crecimiento de la plntula se ver afectado. Producto de la oxidacin de la glucosa se
producir CO2 el cual es liberado a la atmsfera.

ALMIDN + H2O
C6H12O6 + 6O2
(180 g )

(GLUCOSA)n
6CO2 + 6H2O + 38 ATP

(192g )

( 264g )

(108g )

45

Tanto el consumo de O2 como la liberacin de CO2 se pueden medir y por lo tanto,

ambas mediciones sirven de mtodo para cuantificar el comportamiento de la
respiracin de una semilla en determinadas condiciones.
Objetivo: el objetivo de este trabajo de laboratorio ser analizar los fundamentos de
los mtodos usados para cuantificar el CO 2 en la atmsfera y determinar el efecto de la
temperatura en la taza de eliminacin de CO 2. respirado por semillas de trigo en
germinacin.

Materiales y Equipos:
Estos materiales son para un grupo de seis alumnos en que tres alumnos trabajarn
midiendo la respiracin en semillas germinando a 15C y los otros tres en semillas
germinando a 30C.
Cmara de cultivo con control de temperatura
Equipo de circulacin de agua con control de temperatura
Analizador Infrarrojo de CO2
Registrador o Computador con software apropiado
12 placas Petri
2 pinzas
30 semillas de trigo pregerminadas
12 discos de papel filtro estril de dimetro similar a la placa Petri
3 picetas con agua destilada estril
1 rollo de film plstico (eurofilm)
12 jeringas plsticas de 1 mL
6 marcadores de tinta
1 rollo de cinta de papel engomado

Procedimiento
a) Pregerminar semillas de trigo en papel hmedo por 48 horas a temperatura
ambiente.
b) Cada alumno dispondr de dos placas Petri que deber identificar con las letras A y
B ms el subndice 15 o 30 C segn la temperatura que le toque analizar.
c) Colocar dos discos de papel por placa Petri y luego humedecerlas con agua
destilada estril. Colocar sobre el papel las semillas pregerminadas (2 3) y dejar
equilibrar a la temperatura correspondiente por espacio de 15 minutos.
d) Cubrir la placa con film plstico de manera que queden hermticamente cerradas.
e) Registrar el tiempo y extraer una muestra de aire (0,5 mL) desde cada placa con
una jeringa de 1 mL perforando el film plstico con la aguja y marcar la jeringa con el
papel engomado con la marca To (tiempo cero), Figura 13.
f) Guardar la jeringa insertada en una goma, a temperatura ambiente, hasta el
momento del anlisis y tapar la perforacin con otro pedazo de film plstico.

46

47

Jeringa de muestreo
Semillas en germinacin

Film transparente para mantener

disco hermticamente cerrado

Figura 13.- Extraccin de muestra de gas desde placa Petri con semillas
g) Colocar las placas con las semillas en la cmara de cultivo regulando previamente la
temperatura al nivel deseado.
h) Muestrear tres veces cada 15 minutos
i) Inyectar las muestras de gas al sistema de medicin IRGA, segn Figura 14.
j) Determinar la altura de la seal y luego calcular la concentracin de CO 2 en funcin
de una curva de calibracin previamente establecida usando muestras con
concentraciones conocidas de CO2, Figura 15
k) Calcular la cantidad de CO2 respirado por semilla en cada tratamiento de
temperatura

Registrador
IRGA

30 ppm

Referencia
Muestra

N2

Figura 14.- Sistema de medicin de

CO2 en muestras de gas

48

Volts

1,5

1,0

0,5

300
600
CO2 ppm

900

Figura 15.- Curva de calibracin

Clculos

CR = (Ci Cf) x V/ [1000 x (To Tf) x Nsemillas ]

donde:
CR = CO2 respirado (L/ min x semilla)
Ci = concentracin de CO2 inicial (ppm)
Cf = concentracin de CO2 final (ppm)
V = Volumen de la placa Petri o tubo de ensayo
To = Tiempo inicial (min)
Tf = Tiempo final (min)
Para llevar el CO2 respirado, expresado en [L / ( min x semilla)] a [g / (min x
semilla)] considere que un mol de CO2 pesa 44 g y que a presin normal su volumen
es de 22,4 L.
Igualmente si desea calcular la cantidad de glucosa consumida, a partir de la ecuacin
general de la respiracin se tiene que la oxidacin de 180 g glucosa liberan 264 g de
CO2. En consecuencia, la cantidad de glucosa consumida por cada semilla (Gc ) ser
igual a:

Gc = CR x 180 / 264
49

LABORATORIO N4
EXTRACCIN Y ANLISIS DEL DNA
Sr. Alejandro Riquelme
INTRODUCCIN
En este laboratorio ustedes podrn extraer el DNA de una variedad de clulas y ver las
molculas que resultan con sus propios ojos. Para aprovechar mejor la prctica usted
deber entender la teora celular debido que es esencial para adquirir los conceptos
de bioqumica y gentica que se desarrollarn en el laboratorio. Esta actividad ser una
manera eficaz de reforzar lo que ustedes ya saben sobre las clulas y podrn ver sus
posibles aplicaciones al campo de la agronoma.

OBJETIVO DE LA PRACTICA : Aislar el DNA de las clulas.

METODOLOGA:
-

Las clulas sern tratadas qumicamente para romper la clula y las membranas
nucleares.
La porcin de la mezcla que contienen el DNA (la porcin acuosa) ser separada de
la porcin que contiene las membranas y las protenas asociadas (la porcin
lipdica) .
Sern analizadas las protenas que protegen el DNA y que la mantienen firmemente
en un estado enrollado.
La solucin que contiene el DNA disuelto ser alterada de modo que el DNA
precipite.

El resultado ser asombroso. El DNA sale de la solucin (Este proceso se llama

precipitacin). El DNA precipitado ser observable a simple ojo!. Ser fcil aislar y
puede ser utilizado para otras investigaciones.

50

PURIFICACIN DE DNA GENMICO CON LA SOLUCIN DE CHOMCZYNSKI

DESCRIPCIN DEL REACTIVO
Reactivo de Chomczynski es un reactivo completo y listo para el aislamiento del
DNA genmico de muestras slidas y lquidas de origen animal y vegetal. El
procedimiento de Chomczynski se basa en el uso de una solucin de lisis de
guanidina y detergente que hidroliza el RNA y permite la precipitacin selectiva del DNA
desde una clula lisada. Desarrollado por P. Chomczynski (1), es un mtodo avanzado
de aislamiento del DNA. El protocolo de Chomczynski es rpido y permite el
aislamiento de la DNA genmico de una gran cantidad de muestras y de volmenes
pequeos o grandes (5).
Durante el aislamiento, una muestra biolgica es lisada (o homogeneizada) en el
reactivo de Chomczynski y el DNA genmico es precipitado desde el lisado con etanol.
Seguido de un lavado con etanol, el DNA se solubiliza en agua 8 mM NaOH. El
procedimiento lleva 10 a 30 minutos con una recuperacin del DNA genmico de 70100%. El DNA aislado se puede utilizar, sin una purificacin adicional, para anlisis
Southern, anlisis por hibridacin (dot blot), clonamiento molecular, reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR) y otras aplicaciones moleculares en biologa y
biotecnologa.
ESTABILIDAD: El reactivo de Chomczynski es estable en la temperatura ambiente por
lo menos dos aos despus de la fecha de la compra.
PRECAUCIONES DE MANIPULACIN: El reactivo de Chomczynski
contiene
irritantes. Manipule con cuidado, evite el contacto con la piel, utilice proteccin para los
ojos (blindaje, anteojos de seguridad).
EN CASO DE CONTACTO: Lave la piel con una cantidad copiosa de agua y busque la
atencin mdica.

PROTOCOLO GENERAL
1. LISIS \ HOMOGENEIZACIN: 1 ml reactivo de Chomczynski + 25 - 50 mg de
clulas del tejido 0,1 ml de muestra lquida.
2. Centrifugacin (Opcional): 10.000 g x 10 minutos.
3. PRECIPITACIN DEL DNA: lisado + 0,5 ml de etanol al 100%.
4. LAVADO DEL DNA: 1 ml de etanol de 75% (2x).
5. SOLUBILIZACIN DEL DNA: 8 mM NaOH o agua.
El procedimiento se realiza a la temperatura ambiente, a menos que est indicado de
otra manera. Reactivo requeridos: etanol y 8 mM NaOH.

51

1. LISIS / HOMOGENIZACIN
En General.
Homogenice los tejidos en un homogeneizador manual de vidrio-Tefln. Utilice un
homogenizador con una tolerancia mayor de 0,1-0,15 mm. Homogenice el tejido (25-50
mg) en 1 ml de reactivo de Chomczynski aplicando la menor cantidad de movimientos
posibles. Tpicamente, 5-10 movimientos se requieren para la homogeneizacin
completa. Las cantidades pequeas (5-10 mg) de tejidos suaves, tales como bazo o
cerebro se pueden dispersar y lisar por repetitivos pipeteos con una micropipeta.
Guardar el homogenato por 5-10 minutos a temperatura ambiente.
a) Tejidos: Homogenice las muestras de tejido con 1 ml de la Solucin de
Chomczynski por 50-100 mg de tejido, usando un homogenizador de vidrio con
tefln (uno en el que el mbolo encaje con soltura) y homogenice
completamente con el mnimo de golpes (normalmente se necesitan de 5-10
golpes). Si se trata de pequeas de un tejido suave (como el bazo y el
cerebro), se puede fragmentar y lisar por pipeteo repetido con una micropipeta.
los tejidos de plantas deben ser pulverizados antes mezclarlos con la solucin
de Chomczynski, lo que se puede hacer eficientemente si primero se congelan
en nitrgeno lquido o hielo seco con etanol.
b) Clulas crecidas como monocapa: Lise las clulas directamente en la placa de
cultivo, aadiendo 0.75-1.0. ml de Solucin de Chomczynski por cada 10 cm 2
del rea de la placa de cultivo (1 ml en una placa de 3.5 cm de dimetro),
agitando la placa y pasando suavemente con una pipeta el lisado celular a un
tubo nuevo.
c) Clular crecidas en suspensin: Aada 1 ml de Solucin de Chomczynski por
cada 1-3 x 107 clulas, sedimentadas o en suspensin, cuyo volumen no
exceda o.1 ml, y lise las clulas por pipeteo suave y repetido.
d) Ncleos de clulas: Aada 1ml de Solucin de Chomczynski por cada 1-3 x 10 7
ncleos de clulas, sedimentados o en suspensin, cuyo volumen no exceda
0,1 ml, y lise los ncleos por inversin del tubo o pipeteo suave y repetido
e) Sangre: Con muestras de hasta 100l de sangre, aada 1 ml de Solucin de
Chomczynski y lise las clulas por pipeteo suave y repetido. Si el volumen de
la muestra es mayor de 100l, entonces mezcle la sangre, en proporcin 1.5,
con un buffer de lisis (Sacarosa 0.32 M, tris 10 mM pH 7.5, MgCl 2 5 mM y
Tritn X-100 1%), y agite suavemente hasta lograr la lisis celular. Centrifugue a
4000 rpm (1000xg) por 10 min a 2-8C y deseche el sobrenadante (puede
usar una pipeta Pasteur). Aada 1ml de Solucin de Chomczynski y lise el
precipitado o sedimento de ncleos por pipeteo suave y repetido.
2. Centrifugacin (Opcional)
Sedimente el homogenato por centrifugacin a 10.000 g por 10 minutos a 4-25 C.
Luego, transfiera el sobrenadante viscoso que resulta a un tubo limpio.
Este paso quita los fragmentos insolubles del tejido, el RNA parcialmente hidrolizados
y el exceso de los polisacridos del lisado/homogenato. Se requiere solamente para el

52

aislamiento del DNA de tejidos tales como hgado, msculos y la mayora de tejidos de
planta que contienen una cantidad grande de material celular y/o extracelular y tambin
se recomienda para el aislamiento de RNA libre de DNA.
3. PRECIPITACIN DEL DNA
i.
Precipite el DNA del lisado/homogenato por la adicin de 0,5 ml de etanol al
100% por cada ml de reactivo de Chomczynski usado para la extraccin.
ii.
Mezcle las muestras invirtiendo los tubos 5-8 veces y mantngalas a la
temperatura ambiente por 1-3 minutos. Cercirese de que el reactivo de
Chomczynski y el etanol se mezclen bien para formar una solucin homognea.
El DNA debe llegar a ser rpidamente visible como precipitado blancuzco.
iii.
Si el precipitado de DNA es suficientemente grande, se puede pescar con una
punta de pipeta o una bagueta, enrollarlo sobre sta, y moverlo hacia la boca del
tubo, dejndolo en la pared del tubo cerca de la boca (otra alternatva es
transferirlo a un tubo nuevo). Deseche el sobrenadante con mucho cuidado,
coloque el tubo verticalmente por 1 min y elimine por aspiracin el resto del
sobrenadante que quede en el fondo del tubo.
iv.
Si se pipete mucho para lograr la lisis y homogenizacin, y por esa causa el
DNA se fragment o si hay poco DNA en la muestra (<15 g), el DNA no formar
el precipitado nebuloso visible. En estos casos se debe centrfugar a 4000 5.000 x g por 1-5 min a temperatura ambiente o a 4C para precipitar el DNA.
4. LAVADO DEL DNA
Lave el precipitado de la DNA dos veces con 0,8 - 1,0 ml de etanol 75%. En cada
lavado, resuspenda el DNA en etanol invirtiendo los tubos 3 - 6 veces. Coloque los
tubos verticalmente por 0,5 - 1 minuto para permitir que el DNA sedimente en el fondo
de los tubos y quite el etanol con una micropipeta.
En caso de necesidad, sedimente la pella de DNA a 1.000 g por 1 - 2 minutos a
4 - 25 C. Para quitar mejor los contaminantes al aislar la DNA de los tejidos, la primera
lavada de etanol se puede sustituir por lavado en una solucin que contiene 70% de
reactivo de Chomczynski y 30% de etanol
5. SOLUBILIZACIN DEL DNA
Seque el precipitado al aire y a temperatura ambiente por 5-15min, removiendo el
alcohol desde el fondo del tubo usando una micropipeta.
Despus, disuelva el DNA en 8 mM NaOH, pasando lentamente la pella a travs de la
pipeta. Alternativamente, disuelva el DNA en agua. Sin embargo, la solubilizacin del
DNA ocurre ms rpidamente en medio alcalino y asegura la completa solubilizacin del
DNA precipitado. Agregue una cantidad adecuada de 8 mM NaOH o agua para alcanzar
una concentracin del DNA de 200 - 300 ng/l. Tpicamente, agregar 200 - 300 l de 8
mM NaOH o agua al DNA aislado de 10-20 mg de tejido animal.
Las preparaciones del DNA aisladas de tejidos tales como hgado, msculos y plantas
contienen un poco de material insoluble (sobre todo polisacridos). Quite el material
insoluble por centrifugacin a 12.000 g por 10 minutos. Las soluciones alcalinas
dbiles son neutralizadas por el CO2 del aire. Una vez al mes, preparar 8 mM NaOH de
la solucin stock de 2 - 4 M NaOH que no debe tener mas de 6 meses de antigedad.

53

CUANTIFICACIN DEL DNA Y RESULTADOS

Mezcle una parte alcuota del DNA solubilizado con 1 ml de 8 mM NaOH, o 1-3 mM
Na2HPO4, o agua y mida A260 y A280 de la solucin que resulta. Calcule el DNA
contenido asumiendo que una unidad de A 260 es igual a 50 g de DNA doble hebra
/ ml. La razn de A260 / A 280 del DNA aislado estar dentro del rango 1,6 - 1,9 y con
un peso molecular que se extiende de 20 a 100 Kb. El peso molecular del DNA aislado
depende de las fuerzas mecnicas aplicadas durante la lisis / homogenizacin o
durante la solubilizacin del precipitado del DNA.
Para el clculo del nmero de clulas en las muestras analizadas o un rendimiento
esperado de DNA, se asume que la cantidad de DNA por 10 6 de clulas diploides de
origen humano, de rata y de ratn es igual 7,1, 6,5 y 5,8 g respectivamente (2).
El rendimiento tpico para los tejidos de animales (g DNA / mg de tejido): hgado, rin
o pulmones, 3 - 5g; msculo esqueltico, corazn o cerebro, 1 - 3g; tejido de planta,
0,3 - 0,8 g. El DNA aislado contiene el RNA parcialmente degradado. Si una reduccin
del contenido del RNA a menos que 3% es necesaria, realice la centrifugacin (paso 2)
segn el protocolo descrito. En anlisis Southern, el RNA puede ser digerido
agregando a la mezcla RNase (1 g/ml).
NOTAS Y COMENTARIOS
1 Para el aislamiento de los ncleos de clulas recomendamos un mtodo simple
y eficiente del citrato basado en la homogeneizacin de tejidos en la solucin de
1% Tritn X-100 en 40 mM citrato de sodio.
2 El procedimiento del aislamiento puede ser interrumpido y las muestras pueden
ser guardadas como sigue: El lisado / homogenato se puede guardar por 1 mes
a la temperatura ambiente o por 10 meses a 4 -20 C. Durante el lavado, el
DNA se puede guardar en etanol 95% por lo menos una semana a temperatura
ambiente o por 3 meses en 4 C.
3 El aislamiento de una cantidad pequea (< 15 g) de DNA se debe realizar en la
presencia de un portador. Lise u homogeneice la muestra en 0,5 ml de reactivo
de Chomczynski agregando 5l del portador de Poliacril. Siga el protocolo
precipitando la mezcla de DNA-carrier con el etanol (paso 3, precipitacin del
DNA).
4 Para el aislamiento del DNA de volmenes grandes de sangre, primero asle la
fraccin nuclear y en seguida utilice reactivo de Chomczynski para extraer el
DNA. Para los volmenes pequeos de la sangre ( 1 50 l), utilice 250 500 l
de reactivo de Chomczynski con 2-3 l del portador de Poliacril.
5 La digestin por proteinasa K puede simplificar y mejorar el aislamiento del DNA
eliminando el aerosol que forma los dispositivos (homogeneizadores,
mezcladores). Digiera las muestras del tejido (25 - 100 mg) por 4 - 24 h a
temperatura ambiente en 0,5 ml reactivo de Chomczynski con la proteinasa K
(100 ug/ml). La actividad de la proteinasa K en reactivo de Chomczynski es ms
alta a temperatura ambiente que a 55 C. Alternativamente, se realiza la
digestin en un buffer conteniendo: 10mM Tris-HCl, pH 7,6, 20 mM NaCl, 100

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mM Na-EDTA (pH 7,5 - 8), 1% laurilsarcosina de sodio y 0,1 mg/ml de proteinasa

K. Digiera 10-150 mg de tejido en 0,5 ml de buffer a 56 C durante la noche. En
el trmino de la digestin, licue el tejido completamente por pipeteos vigorosos y
mezclan totalmente 0,1 ml del extracto con 1 ml de reactivo de Chomczynski (4).
Despus de terminada la digestin, proceda segn protocolo.
REFERENCIAS
1. Chomczynski P., Mackey K., Drews R. and Wilfinger W. 1997. DNAzol: A reagent
for the rapid isolation of genomic DNA. BioTechniques, 22, 550-553.
2. Ausubel F., Brent R., Kingston R., Moore D., Seidman J. and Struhl K. 1990.
Current Protocols in Molecular Biology, 2, A.1.5., John Wiley & Sons, Inc. New
York, NY.
3. Mackey K., Williams P., Seim S. and Chomczynski P. 1996. The use of DNAzol
for the rapid isolation of genomic DNA from whole blood. Biomedical Products
Supplement, 13-15.
4. Liska V. and Ruprecht R. 1999. Isolation of high-molecular weight genomic DNA
from intact biohazardous mammalian tissues. Biotechniques, 26, 62-66.
5. Chomczynski P., Wilfinger W., Mackey K. 1998. Isolation of Genomic DNA from
Human, Animal, and Plant Samples with DNAzol Reagents. Biotechnology
International, 185-188.

Electroforesis en gel de agarosa

La electroforesis en gel de agarosa (2) se emplea para controlar la progresin de una
digestin de la enzima de la restriccin, para determinar rpidamente el rendimiento y la
pureza de un aislamiento de DNA o de la reaccin de PCR, y clasificar las fracciones de
las molculas de DNA, que se podran eluir del gel. Para hacer el gel, la agarosa seca
es disuelta en un buffer calentndolo y la solucin caliente del gel es vertida en un
molde (18 x 18 cm), que contiene un peine para formar bien los bolsillos. El porcentaje
de agarosa en el gel es variado. Aunque geles de agarosa al 0,7% se utilizan
tpicamente, en los casos donde el fraccionamiento de las molculas de DNA es ms
pequeo que 1 kb se requiere un gel de agarosa al 1, 1,5, o 2%, dependiendo del
tamao previsto para el o los fragmentos. El bromuro de etidio se incluye en la matriz
del gel para permitir la visualizacin fluorescente de los fragmentos de la DNA bajo luz
UV. Los geles de agarosa se sumergen en el buffer de electroforesis en un aparato
horizontal de electroforesis. Las muestras del DNA se mezclan con el colorante y se
cargan en los bolsillos del gel. La electroforesis est generalmente en 150 - 200 mA
para 0,5-1 horas a la temperatura ambiente, dependiendo de la separacin deseada.
Cuando se usa agarosa de baja temperatura de fusin, utilizado para los geles
preparativos, la electroforesis est en 100-120 mA para 0,5-1 horas, otra vez
dependiendo de la separacin deseada, y un ventilador se coloca para que el calor
generado sea disipado rpidamente. Los marcadores de peso molecular son coelectroforisados con las muestras de DNA, requeridos para la determinacin del

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tamao de los fragmentos. Dos marcadores de tamao molecular se utilizan, el phi-X

174 digerido con la endonucleasa de restriccin HaeIII para identificar fragmentos entre
0,3-2 kb y el fago lambda digerido con la endonucleasa de restriccin HindIII para
identificar fragmentos entre 2-23 KB. Despus de la electroforesis, el gel se coloca en
una caja de luz UV y una foto de la separacin de fragmentos del DNA se toma con una
cmara fotogrfica polaroid.

Protocolo
1. Prepare un gel de agarosa, segn las recetas enumeradas abajo,
combinando la agarosa (la agarosa de baja temperatura de gelificacin
puede tambin ser utilizado) y el agua en un frasco de 500 ml Erlenmeyer,
y calentndolos en una microonda por 2-4 minutos o en un bao de agua
hirviendo hasta que se disuelve el agarosa.
Tapar el matraz Erlenmeyer con papel alusaplast y perforarlo varias veces
con una aguja, o si es una botella, taparla a amedia rosca. Es recomendable
agitar de tiempo en tiempo la solucin de Agarosa, teniendo mucho cuidado,
porque la solucin de Agarosa se puede sobrecalentar y ebullir
violentamente. Tambien es recomendable verificar que el volumen de la
solucin no haya disminuido apreciablemente por la evaporacin. Esto se
verifica facilmente marcando el nivel del lquido en el recipiente antes de
calentarlo. En caso de que haya disminuido apreciablemente, rellenar con
agua.
agarosa
10X TAE
ddH2O
EtBr (10 mg/ml)

0,7%
1,05 g
15
ml
135
ml
10
l

1,0%
1,5 g
15 ml
135 ml
10 l

2,0%
3,0 g
15 ml
135 ml
10 l

vol. total

150

150 ml

150 ml

ml

2. Enfriar la solucin hasta que alcance aproximadamente 60 C y agregue 10X TAE y

el bromuro de etidio (aadir la cantidad necesaria para alcanzar una concentracin
aproximada de 0.5 g/ml; EtBr), agite la mezcla, y vierta el gel sobre una placa
con el peine ya colocado. D un plazo de 20-30 minutos para la solidificacin .
Cuando se preparan geles de alta concentracin de Agarosa (2 % o ms) se debe
enfriar rpidamente la solucin hasta los 70 C aproximadamente, y verterla
inmediatamente porque mientras mayor es la concentracinde Agarosa, la gelificacin
ocurre ms rpidamente. Cuando se preparan geles con baja concentracin de
Agarosa (< 0.5 %), se debe verter primero un gel de sostn (con Agarosa 1 %) sin
pozos, y una vez que este gelifique, verter la solucin con baja concentracin de
Agarosa sobre el gel ulterior. Prepare ambos geles con el mismo lote de buffer y

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adale el Bromuro de Etidio a ambos o a ninguno.

3.

Desmonte cuidadosamente la placa y el peine del gel y coloque el gel en un

aparato horizontal de electroforesis. Agregue el buffer de electroforesis de 1X
TAE a los depsitos hasta que el buffer apenas cubra el gel de agarosa.

Agregue por lo menos un dcimo del volumen de la solucin de carga con

colorante 6X a cada muestra de DNA, mezcle, y cargue en los bolsillos.
Electroforesis el gel a 150-200 mA hasta la separacin requerida se haya
alcanzado, generalmente 0,5-1 horas (100-120 mA para la agarosa de baja
temperatura de gelificacin), y enfriar el gel durante la electroforesis con un
ventilador. Visualice los fragmentos de la DNA en una caja de la luz UV de la
onda larga y fotografi con una cmara fotogrfica polaroid.
Si no se aadio el Bromuro de Etidio en el paso 2, teir el gel en una solucin de buffer TAE 1x
con Bromuro de Etidio 0.5 g/ml durante 30-45 minutos a temperatura ambiente. La deteccin
de cantidades muy pequeas de DNA (<10 ng) se facilita si se logra un mejor contraste,
eliminando el fondo de Bromuro de Etidio no unido a DNA, lo que se puede lograr mediante la
inmersin del gel en agua o Sulfato de Magnesio 1 mM, durante 20 minutos a temperatura
ambiente.
4.

Elusin de los fragmentos de DNA desde la agarosa

Los fragmentos de DNA son eluidos desde los geles de agarosa de baja temperatura
de gelificacin usando un procedimiento indito primero desarrollado por el Dr. Roe.
Aqu, la banda de inters es cortada con una hoja de afeitar estril o bistur ,
colocndolo en un tubo de microcentrifuga, congelar a -70 C, y despus se derrite.
Entonces, el fenol saturado con TE se agrega al trozo del gel derretido, y la mezcla es
otra vez congelada y despus descongelada. Despus de este segundo
descongelamiento, se centrifuga el tubo y la capa acuosa se quita a un tubo nuevo. El
fenol residual se quita con dos extracciones de ter, y el DNA es concentrada por
precipitacin con etanol.
Protocolo
1. Ponga el trozo del gel de agarosa que contiene el DNA en un tubo
del microcentrifuga de 1,5 ml y congele a 70 C por lo menos 15
minutos, o hasta el congelamiento. Es posible detenerse
brevemente en esta etapa en el procedimiento de elusin y dejar el
trozo de gel congelado a 70 C.
2. Derrita el trozo incubando el tubo a 65 C.
3. Agregue un volumen de fenol de TE-saturado, agite por 30
segundos, y congele la muestra a 70 C por 15 minutos.
4. Deshiele la muestra, y centrifguela en una microcentrifuga a
12.000 rpm por 5 minutos a la temperatura ambiente para separar
las fases. La fase acuosa entonces se quita a un tubo limpio,
extrado dos veces con igual volumen de ter, precipite con etanol,
y la pella de DNA es lavada y secada.

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APENDICE 3.
I.

Para determinar la concentracin deseada de Agarosa. Puede guiarse por la

siguiente tabla:
% de Agarosa recomendado
0.3
0.6
0.8
1.0
1.2
1.5
2.0
3.0

Resolucin ptima del DNA lineal

(Tamao de los fragmentos en pb)
5,000 - 60,000
1,000 - 20,000
800 - 10,000
500 - 7,000
400 - 6,000
200 - 3,000
100 - 2,000
< 100

II. Marcador de DNA (Escala de DNA)

Los marcadores de tamao molecular de DNA contiene 19 fragmentos en el rango de
100 pb a 10 kb de DNA, donde los fragmentos de 0.5 kb, 1 kb, 1.5 kb y 3.0 kb tienen
una mayor intensidad para servir como banda de referencia.
Fragmento
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18

Tamao (kb)
10.0
8.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.5
1.2
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2

58

19

0.1

Se recomienda cargar 3-5 l (0.6-1.0 g) de los marcadores de DNA, diluida en buffer

de carga 1x para electroforesis de DNA.

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