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D(cm)
Rf
Lisina
0.5
0.03
Glicina
Glutamato
03.5
12
0.27
0.94
Prolina
0.31
Leucina
0.70
Al variar Rf segn los distintos aminocidos, nos permite distinguir ms fcilmente los aminocidos que
constituyen el problema. Esta variacin se produce debido a que las fuerzas de avance ejercidas por la fase
mvil en su desplazamiento sobre la estacionaria son diferentes. Hay que tener en cuenta la absorcin del
material utilizado.
1
Los compuestos ms solubles seguirn el camino del eluyente con ms velocidad lo que nos permite de
terminar las distintas alturas alcanzadas por las manchas de los diferentes patrones.
5 min.
BLANCO
SACAROSA
GLUCOSA
XILOSA FRUCTOSA
PROBLEMA
azul
azul
Azul
Azul
amari.
azul
azul claro
azul claro
Naranja claro
Naranja
oscuro
naranja claro
azul claro
"
"
"
"
"
"
1 min.
100*C
5 min.
De esta tabla se deduce que los azcares reductores son la glucosa, la xilosa y la fructosa, dado que cambian
de color.
2. Prueba de la antrona.
Preparamos el blanco con dos gotas de agua destilada y 2 ml de antrona, 4 tubos con las muestras patrn con
una gota de cada azcar y 2 ml de antrona, y otro tubo con una gota de la muestra problema y 2 ml de antrona,
ponindolos a continuacin al bao mara.
5 min.
BLANCO
SACAROSA
GLUCOSA
XILOSA
FRUCTOSA
PROBLEMA
Amarillo
Verde oscuro
Verdeazul
verde oscuro
Amarilloverde negro
Negro
Negro
negro
negro
"
"
"
"
"
1 min.
100*C
5 min.
"
Discusin.
En la prueba de antrona todas las muestras dieron positivo porque utilizamos azcares en forma de hexosa o
pentosa, sin embargo, en la prueba de fehling la sacarosa no dio positivo porque tiene carcter no reductor
debido al enlace glucosdico (12) donde estn situados los hidroxilos de los carbonos anomricos de la
glucosa y de la fructosa.
PRCTICA 3
Determinacin cuantitativa de pnitrofenol por espectrofotometra visible
Introduccin.
La espectrofotometra visible consiste en una Tcnica analtica basada en la capacidad de absorcin de
determinadas molculas para determinadas radiaciones.
Obtencin del espectro de absorcin del pnitrofenol.
Preparamos una disolucin con 2,5 ml de solucin de pnitrofenol 0,2 mM con 1 ml de NaOH 0,5N y 4 ml de
agua destilada, y otra disolucin (blanco) con 1 ml de NaOH 0,5N y 4 ml de agua destilada.
Llevamos las disoluciones al espectrofotmetro y medimos la absorbancia de la primera disolucin con
distintas longitudes de onda, sirvindonos el blanco para calibrar la mquina.
360
380
390
395
400
405
415
440
460
MUESTRA
0
1
2
3
4
5
6
[PNITROFENOL] (mM)
0
10
20
40
50
100
200
ABSORBANCIA
0.054
0.156
0.247
0.448
0.526
0.562
1.180
TIEMPO (min.)
10
20
30
ABSORB. 400nm
0,8
1,54
2,86
3,4
68,3
131,62
244,4
290,6
[PNITROF]
(mM)
DILUCIN
[PNITROFENOL]
ML DE ESTRACTO
ABSORBANCIA
1/1
136,75
0,25
1,6
1/10
42,73
0,025
0,5
1/50
8,54
0,005
0,1
1/100
4,27
0,0025
0,05
La actividad enzimtica son los moles de producto por segundo que se forman de sustrato. Vo=[p]/t nKat
DILUCIN
1/1
1/10
1/50
1/100
ACTIVIDAD
ENZIMTICA
75,97
23,73
4,74
2,37
pH
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
6,0
ABSORBANCIA
400 nm
0,4
0,6
0,8
1,4
0,7
0,3
[PNITROFENOL]
34,2 mM
51,3
68,4
119,6
52,8
25,6
ACTIVIDAD
ENZIMTICA
19 nKat
28,5
38
66,4
33,2
14,2
6
7,0
0,1
8,5
4,7
TEMPERATURA
ABSORBANCIA
[P/NITROFENOL]
ACT.ENZIMTICA
20C
0,4
34,2
19 nKat
30
1,3
111,1
61,7
40
1,6
136,7
75,9
50
2,0
170,9
94,9
60
2,5
213,6
118,6
70
0,4
34,2
19
La temperatura ptima est alrededor de los 50C. A partir de esta temperatura se observa una cada muy
brusca de la velocidad debido a que a temperaturas altas los enzimas se desnaturalizan.
Qio es el aumento de la velocidad con un incremento de 10C.
Qio entre 30 y 40C=14,2 nKat |
Qio entre 40 y 50C=19 |> Qio=18,97 nKat
Qio entre 50 y 60C=23,7 |
Representacin de Arrhenius
1/T (K )
log[Vo/(VmaxVo)]
3,09x10
0,6
3,19x10
0,249
3,3x10
0,035
3,41x10
0,72
SUSTRATO
10 mM
20
40
60
80
100
200
400
600
ABSORBANCIA
0,25
0,46
0,71
0,87
1,00
1,10
1,30
1,42
1,43
[PNITROFENOL]
21
39,3
60,7
74,3
85,4
94,0
111,1
121,4
121,9
ACT.ENZIMTICA
11,6 nKat
21,8
33,7
41,2
47,4
52,2
61,7
67,4
67,6
V=Vmax[S]/(Km+[S]) siendo Km la cte. de Michaelis que nos da la afinidad del enzima por el sustrato.
Observando la grfica vemos primero un aumento de velocidad rpido para despus ir aumentando ms
lentamente.
Ecuacin de LinewearerBurk (clculo Vmax)
1/[S]
1/Vo
0,0116
0,024
0,0125
0,021
0,0100
0,019
0,005
0,016
0,0025
0,014
Representacin de EadieHafstee.
Vo
11,6
21,8
33,7
41,2
47,4
52,2
61,7
67,4
[S]
10
20
40
60
80
100
200
400
Vo/[S]
1,16
1,099
0,8425
0,680
0,5925
0,522
0,3085
1,168