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EDUCACIN CONTINUADA

EN EL LABORATORIO CLNICO
Ed Cont Lab Cln; 15: 11-21

2011-2012

CAPACITACION ESPERMATICA
Ana Ruiz Martn
F.E.A Anlisis Clnicos. Hospital Regional Universitario Carlos Haya. Mlaga

Ana Gutirrez Rueda


F.E.A Anlisis Clnicos. Hospital Regional Universitario Carlos Haya. Mlaga

INTRODUCCIN
Hasta hace relativamente poco tiempo no se haba tomado conciencia de la verdadera importancia de la infertilidad masculina. Estudios epidemiolgicos demuestran que un 25 % de los
pacientes que acuden por primera vez a una consulta de esterilidad presentan un claro defecto
funcional de sus espermatozoides. Por otro lado publicaciones recientes sugieren que la calidad
del semen humano se est deteriorando con el paso del tiempo, quiz como resultado de factores ambientales que empezaran a actuar en el desarrollo fetal del individuo.
Todo ello nos lleva a considerar la importancia de aumentar el conocimiento de la biologa
celular del espermatozoide humano y de definir los defectos responsables de la perdida de su
potencial de fecundacin.
Los espermatozoides se producen en el testculo en dos etapas:

Espermatognesis: produccin de espermtidas a partir de la clula madre

Espermiognesis: modificacin morfolgica de la espermtide en espermatozoide.

En los testculos los espermatozoides son inmviles y no fecundantes. Desde los testculos son
evacuados hacia el epiddimo (72 das despus del inicio de la espermatognesis) a travs de los
conductos espermticos intratesticulares (rete testi). Es en el epiddimo donde los espermatozoides adquieren su movilidad progresiva.
En el momento de la eyaculacin los espermatozoides son expulsados por el conducto deferente hacia los conductos eyaculadores y hacia la uretra prosttica donde se aade la secrecin
prosttica. En un segundo tiempo al contraerse las vesculas seminales su secrecin pasa a los
conductos eyaculadores.
En total el volumen de esperma supone un 5 % de la secrecin epididimaria, un 30 % de la prosttica y un 65 % de las vesculas seminales.

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PROCESOS IMPLICADOS EN LA PREPARACION DEL ESPERMATOZOIDE PARA LA


FECUNDACION
Los espermatozoides presentes en el plasma seminal tras la eyaculacin, no estn en disposicin
inmediata de fecundar al ovocito, incluso estando en contacto con l. El conjunto de cambios
fisiolgicos que hacen competente al espermatozoide para la fecundacin es lo que conocemos
como CAPACITACION.
Una definicin mas exacta sera aquella que describe la capacitacin como la serie de cambios
bioqumicos y fisiolgicos (tales como la prdida de protenas o sustitucin por otras de
menor peso molecular, transformacin de los fosfolpidos, disminucin de la relacin colesterol/
fosfolpidos, cambios en los radicales glcidos de las glucoproteinas, perdida de los glcidos
complejos, y movilidad de lpidos y protenas) requeridos por el espermatozoide para liberar el contenido acrosomal.
Los fenmenos que conforman el proceso de capacitacin son regulados por el estado de oxidoreduccin de las clulas espermticas. Las reacciones de xido reduccin inducen la fosforilacin
de la tiroxina, un requisito indispensable para la capacitacin. Estas reacciones dependen del aumento, hasta un nivel crtico, de las concentraciones intracelulares del calcio, debido a la entrada
de calcio extracelular que, se cree, es inducida por la progesterona.
En la capacitacin, el espermatozoide adquiere tres caractersticas:

1. reaccin acrosmica

2. unin a la zona pelcida del ovocito

3. hipermovilidad

1. Reaccin acrosmica
El acrosoma es una organela tipo lisosoma localizada en la regin anterior de la cabeza del espermatozoide por debajo de la membrana plasmtica, como un casquete sobre el ncleo. El acrosoma contiene muchas enzimas que quedan al descubierto con la reaccin acrosmica, la prdida
del acrosoma inmediatamente antes de la fertilizacin. Esta reaccin es de exocitosis, la fusin
de una vescula intracelular de almacenamiento con la superficie interna de la membrana celular,
seguida de la liberacin del contenido de la vescula. Esta reaccin requiere la entrada de iones
calcio, la salida de iones hidrgeno, un aumento del pH y la fusin de la membrana plasmtica
con la membrana del acrosoma, lo que permite el contacto con las enzimas y favorece la salida
de las retenidas por la membrana interna del acrosoma. Para que un componente de la zona
provoque la reaccin acrosmica es necesaria la unin del espermatozoide a la zona pelcida. Se
cree que este componente es un receptor de glicoprotenas espermticas que tendra una doble
funcin: unirse al espermatozoide e inducir la reaccin acrosmica.

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2. Unin espermatozoide-ovulo
La capacidad de unin de la membrana plasmtica del espermatozoide con la del ovocito se desarrolla durante o tras la reaccin acrosmica. El contacto inicial entre espermatozoide y ovocito
es un proceso mediado por receptores. La zona pelcida est compuesta por glucoprotenas
secretadas por el ovocito llamadas ZP1, ZP2 y ZP3 de las cuales la ms abundante es ZP3 y el
principal fijador para el espermatozoide. Para que el espermatozoide se una es necesario que
reconozca el componente carbohidrato de la molcula fijadora de las glucoprotenas especficas
para la especie. Despus de la unin, el componente peptdico de la glucoprotena receptora
desencadena la reaccin acrosmica. Por lo menos uno de los receptores de la cabeza del espermatozoide es una tirosinquinasa activada por la unin a la glicoprotena ZP3 y que inicia la
reaccin acrosmica. Esta interaccin sigue los principios generales de la unin y actividad hormona-receptor. En el caso del espermatozoide y el ovocito, en el reconocimiento interviene una
enzima de la superficie del espermatozoide que queda expuesta en el proceso de capacitacin.
3. Hiperactivacin espermtica
En cierto momento de la preparacin del espermatozoide para la fecundacin, ste desarrolla
un movimiento peculiar, llamado hiperactivo, que se caracteriza por una pequea velocidad de
progresin y un rpido movimiento in situ con un gran desplazamiento lateral de la cabeza. El
aumento de la movilidad, debido al estado de hiperactividad, contribuye al ltimo avance hacia
el ovocito. Es posible que esta movilidad sea en parte el resultado de una interaccin con el epitelio de la trompa, que imprime mayor velocidad y mejor orientacin y tambin impide que los
espermatozoides se adhieran y queden atrapados en el epitelio de la trompa.
CAPACITACION ESPERMATICA
En la valoracin bsica del eyaculado deben considerarse tanto el estudio macroscpico (volumen, licuefaccin, aspecto y viscosidad) como el microscpico (recuento espermtico, movilidad
y morfologa, as como concentracin de otros elementos celulares). Sin embargo el estudio
seminal no nos informa de la capacidad espermtica fecundante, y por tanto no traduce las
posibilidades reales de fecundar. Por ello en ocasiones tendremos que realizar el estudio funcional espermtico. Existen numerosas pruebas que pretenden evaluar la capacidad fecundante
espermtica, y todas ellas se relacionan con alguna fase de la fecundacin, pero debemos utilizar
aquellas que por su simplicidad sean fcilmente realizables. En nuestro caso nos centraremos en
la recuperacin de espermatozoides mviles (REM) o test de capacitacion.
RECUPERACION DE ESPERMATOZOIDES MVILES (REM) O TEST DE CAPACITACIN
Si bien la capacitacin ha sido definida como la serie de cambios que experimenta el espermatozoide en el aparato reproductor femenino, es evidente que los espermatozoides de algunas
especies, incluida la humana, pueden adquirir la capacidad de fertilizar despus de una incubacin en un medio determinado y sin permanencia en el aparato reproductor femenino. Por ello
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es posible lograr la fertilizacin con tcnicas de reproduccin asistida. La capacitacin in vitro


requiere retirar el plasma seminal y aadir un medio de cultivo que puede ser una solucin salina
equilibrada que contenga sustratos energticos como lactato, piruvato y glucosa, y una protena
como la albmina. Los medios de cultivo deben tener una osmolaridad entre 280-300 mOsm/Kg.
El pH debe mantenerse en un rango entre 7.2-7.4, para ello es necesario utilizar medios tamponados. Los medios tamponados con bicarbonato necesitan una atmsfera rica en CO2 y una
temperatura de 37 C para que se mantenga el equilibrio inico, por lo que cuando utilicemos
estos medios debemos hacerlo en estufa con temperatura y CO2 controlados.
Podemos distinguir entre dos tipos de medios:
1. Medios para la preparacin de gradientes: los ms usados contienen una suspensin
coloidal de partculas de slice unidas de forma covalente a molculas de silano y se
preparan en solucin isotnica.
2. Medios de lavado y cultivo: contienen protenas mayoritariamente albmina que acta
como captadora y transportadora de molculas, as como la concentracin de sales necesaria para la homeostasis del espermatozoide y en la mayora de los casos gentamicina
como bacteriosttico.
Es conocido que durante la maduracin en el epiddimo los espermatozoides incorporan diferentes glicoprotenas y pptidos que inhiben la capacitacin (actuaran como factores descapacitantes). Este estado de descapacitacin se mantiene tras la eyaculacin debido a estas incorporaciones y a la presencia de otros factores descapacitantes en el plasma seminal.
El plasma seminal es un fluido integrado por elementos celulares (clulas germinales maduras;
clulas epiteliales, leucocitos, etc.) y secreciones del testculo, epiddimo, prstata, vesculas seminales y glndulas de Cowper. Exposiciones prolongadas (ms de 2 horas) de los espermatozoides al plasma seminal pueden provocar una prdida de la capacidad fecundante y ejercer un
efecto negativo sobre su movilidad. As pues el laboratorio dispone de una serie de metodologas
para separar, con la mayor brevedad posible los espermatozoides del plasma seminal.
El objetivo del procedimiento de capacitacin es doble:
1. Obtener una suspensin de espermatozoides mviles libres de plasma seminal
2. Establecer in vitro las condiciones experimentales adecuadas para que los espermatozoides sufran el proceso de capacitacin (que in vivo ocurre cuando atraviesan el moco
cervical en su recorrido por el tracto genital femenino).
Por tanto la finalidad de este proceso es seleccionar los espermatozoides mviles y mejorar la
calidad de los mismos (porque disminuye la liberacin de linfoquinas y reduce la formacin de
radicales libres), y ser un requisito previo para cualquier tcnica de reproduccin asistida.
El adecuado procesamiento de la muestra va a influir en la capacidad fecundante del espermatozoide, tanto in vivo como in vitro y ser fundamental para el xito de la reproduccin asistida.
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Es muy importante tener en cuenta que las tcnicas de capacitacin espermtica no son
en si mismas pruebas diagnsticas, sino que forman parte de los mtodos de tratamiento del semen. Cuando los parmetros seminales son normales el recuento de espermatozoides mviles tras la preparacin seminal (REM) no aporta informacin adicional al estudio de
la pareja estril (recomendacin de la Sociedad Espaola de Reproduccin, Sociedad Espaola
de Androloga y Asociacin para el Estudio de la Biologa de la Reproduccin). Sin embargo el
REM se ha convertido en un referente de gran utilidad para sentar la indicacin de inseminacin
intrauterina ya que el valor pronstico que aporta un seminograma anormal es insuficiente. Es
difcil establecer un nmero mnimo de espermatozoides recuperados para realizar inseminaciones intrautero y obtener una tasa de gestacin adecuada. Algunos autores proponen que cada
centro establezca su punto de corte en funcin de los datos clnicos y de laboratorio de cada
centro. En general se considera de buen pronstico un REM por encima de 5 millones de espermatozoides mviles recuperados por mililitro.
Obtencin de la muestra
Para la realizacin de la capacitacin en el laboratorio el mtodo de recogida y transporte de la
muestra seminal ser muy importante. Ha de informarse al paciente de forma oral y por escrito
de los siguientes aspectos:

- La muestra ha de recogerse por masturbacin en un recipiente estril

- Debe tener un periodo de abstinencia sexual de 3 a 5 das ( no ms de 7 das)

- La muestra ha de recogerse en su totalidad evitando la prdida sobre todo de la

porcin inicial

- Debe ser entregada en el laboratorio antes de una hora de su recogida

Una vez recogida la muestra e identificada se incubar durante 15 minutos a una temperatura
entre 20-37 C hasta obtener la licuefaccin completa (esta incubacin no ser necesaria si la
muestra ha completado la licuefaccin en el momento de la entrega).
Tras este periodo se proceder a la evaluacin de la muestra segn los criterios de la OMS anotndose volumen, concentracin y movilidad.
TECNICAS DE CAPACITACIN ESPERMTICA
A continuacin realizaremos el procesado de la muestra. Existen varias tcnicas de capacitacin
espermtica:

1. Mtodo de lavado

2. Mtodos de Migracin

Swim- up directo

Swim inverso
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3. Mtodos de Filtrado: fibra de vidrio

4. Mtodo de centrifugacin por gradientes de densidad

5. Mtodos avanzados: anticuerpos monoclonales, tecnologa de microesferas,

electroforesis, cido hialurnico, dextrano

1. Mtodo de lavado
Es el ms sencillo. No conlleva una mejora de la calidad seminal simplemente una capacitacin
y concentracin.
Procedimiento
1. Depositar la muestra seminal en un tubo y aadir medio de cultivo en proporcin 1:5 o 1:10
para retirar la mayor parte del plasma seminal.
2. Homogeneizar y centrifugar a 500 g durante 10 minutos.
3. Retirar el sobrenadante y aadir 0.5 mL de medio de cultivo.
4. Incubar 20-30 minutos.
2. Mtodos de Migracin
Tcnica del Swim-up
Esta basado en la capacidad de desplazamiento de los espermatozoides mviles. Es el ms fisiolgico de todos los procedimientos. Requiere muestra con buenos parmetros seminales y la
muestra se recupera muy limpia. Dentro de esta categora existen dos formas principales Swim
Up directo y Swim Up convencional
Swin up directo
El semen licuado se deposita debajo o sobre un medio de cultivo y los espermatozoide con buena
movilidad se dirigen al medio de cultivo de forma semejante al proceso in vivo.
Procedimiento
1. Colocar aproximadamente 250 L de semen licuado en el fondo de un tubo no cnico (para
aumentar la superficie de contacto). Utilizar tantos tubos como sea necesario para mejorar la
recuperacin de los espermatozoides.
2. Depositar sobre el semen 500 L de medio de cultivo, resbalando por las paredes del tubo,
con cuidado de que no se mezcle con el semen.
3. Dejar en un incubador a 37 C formando un ngulo de 45, para aumentar la interfase, durante un tiempo entre 30 a 60 minutos dependiendo de la calidad del semen. No prolongar ms
all de 60 minutos para evitar la contaminacin con plasma seminal.

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4. Pasado este tiempo aspirar aproximadamente 300 L de medio de cultivo, con cuidado de no
aspirar semen (para lo cual durante todo el proceso se debe mantener el ngulo del tubo). Si no
hay ms de un tubo de una misma muestra se unifica todo el aspirado en un nico tubo.
5. Si el volumen obtenido es mayor de 500 L, valorar el grado de movilidad y la concentracin
de los espermatozoides. Centrifugar y llevar a un volumen final de 300-500 L para inseminar
Swin up convencional
Procedimiento (Figura 1)
1. Lavar el semen con medio de cultivo en relacin 1:1 y centrifugar 10 minutos a 400 g.
2. Retirar el sobrenadante con una pipeta estril, con cuidado de no aspirar el botn celular.
3. Aadir al sedimento medio de cultivo hacindolo resbalar lentamente por la pared del tubo
para evitar que se mezclen. El volumen a aadir depende de la calidad de la muestra lo normal
serian 500 L.
4. Colocar el tubo en un incubador a 37 C durante aproximadamente 45 minutos (tiempo necesario para que los espermatozoides mviles asciendan desde el sedimento).
5. Recuperar 500 L de la superficie del sobrenadante que contiene los espermatozoides mviles
libres de plasma seminal y clulas no espermticas.
6. Evaluar la muestra capacitada (nmero de espermatozoides mviles recuperados por mL) y
dejar la muestra en el incubador hasta el momento de su utilizacin.

Figura 1. Swim-up convencional.


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Tcnica de Swim- Down


Consiste en depositar un volumen de semen en el fondo del tubo y cuidadosamente verter sobre
el semen el medio de cultivo. El tubo en posicin inclinada se coloca en el incubador a 37 C
durante 1-2 horas. Los espermatozoides mviles migran desde el semen al medio de cultivo. El
sobrenadante recuperado (prximo a la interfase liquido-aire) se centrifuga y se resuspende en
500 L de medio de cultivo nuevo. Esta muestra se deja en el incubador hasta su utilizacin.
3. Mtodo de filtrado
Esta tcnica se basa en el hecho de que los espermatozoides muertos o con importantes disrupciones de membrana presentan una clara tendencia a la absorcin a determinados materiales
(fibra de vidrio, partculas de vidrio, etc.). Aprovechando esto pueden construirse columnas de
lana de vidrio que permitan filtrar a los espermatozoides obtenindose la fraccin de clulas viables. Se realiza mediante una malla de fibra de vidrio en porciones de 15-20 mg que situamos
en el interior de una jeringa de insulina hasta la divisin 0.06 mL. A continuacin lavamos el filtro
con 2-3 mL de medio para eliminar las partculas de fibra de vidrio que pudieran estar libres y
procedemos a filtrar aproximadamente 500 L del semen en fresco o previamente lavado. Despus del filtrado lavaremos el filtro de nuevo con 200-300 L de medio de cultivo para liberar los
espermatozoides de buena calidad que pudieran quedar en l. Sin embargo se ha indicado que
las columnas de lana de vidrio podran daar las membranas de la cabeza de los espermatozoides
y de pequeas contaminaciones de fragmentos de fibra de vidrio.
4. Gradientes discontinuos
Su fundamento se halla en la seleccin de los espermatozoides que pueden vencer la dificultad
que presentan los gradientes de densidad y llegar hasta el fondo del tubo, adems de actuar
como filtro para plasma seminal, clulas redondas, detritus y aquellos espermatozoides con movilidad no progresiva. Los espermatozoides maduros son clulas compactadas y alcanzan el gradiente de mayor densidad (el que se deposita en el fondo del tubo cnico). El plasma seminal
permanece flotando sobre el gradiente de menor densidad y las clulas, los espermatozoides
inmaduros y los muertos se quedan en la interfase entre los dos gradientes. Actualmente los
gradientes se usan a una concentracin de 90 % y 45 % o tambin de 80 % y 40 % y pueden
adquirirse ya preparados.
Es menos fisiolgico que el mtodo de Swim-up y se utiliza fundamentalmente para smenes con
parmetros bajos y smenes criopreservados.
Procedimiento (Figura 2)

1. Hacer deslizar un volumen determinado de gradiente de mayor concentracin, en nuestro caso de 90 % (impregnado las paredes hasta el fondo de un tubo cnico)

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2 Depositar el mismo volumen de gradiente de menor concentracin, en nuestro caso de


45 % y dejar caer lentamente igual que el anterior por la pared del tubo evitando que se
mezclen y se rompa la interfase entre ellos (el volumen de los gradientes y del semen depender de la concentracin y movilidad de la muestra pudiendo variar des de 500 a 1.500
L).

3. Depositar el mismo volumen de semen deslizndolo sobre la pared del tubo lentamente.

4. Centrifugar a 300 g durante 20 minutos y posteriormente con una pipeta Pasteur recuperar el sedimento.

5. Aadir medio de cultivo al sedimento y centrifugar a 400 g durante 5 minutos.

6. Eliminar el sobrenadante y aadir 500 L de medio de cultivo y resuspender el botn.

7. Evaluar la muestra capacitada (nmero de espermatozoides mviles por mililitro) y dejar


en el incubador a 37 C hasta el momento de su utilizacin.

Figura 2. Gradientes de densidad.

Para calcular el nmero de espermatozoides con movilidad progresiva se multiplica el porcentaje


de espermatozoides con movilidad progresiva por los millones de espermatozoides recuperados
y por el volumen final.

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La relacin del total de espermatozoides presentes en el eyaculado con el nmero de espermatozoides mviles recuperados, se expresa como porcentaje de recuperacin se calcula con la
siguiente frmula:

Porcentaje de recuperacin = [(VFxCFxREM)] / [(VUxCIxIEM)] x 100

VF: volumen final

CF: concentracin final de espermatozoides

REM: espermatozoides recuperados con movilidad progresiva

VU: volumen de semen utilizado

De las tcnicas de capacitacin anteriormente descritas las ms utilizadas en los laboratorios por
su simplicidad y eficacia son el Swim-up y los gradientes de densidad.
Aunque no existe evidencia cientfica para recomendar una tcnica de preparacin de semen las
ventajas de cada uno de estos mtodos son:

Mtodos de migracin (swim-up)

proceso fisiolgico

la muestra capacitada queda ms limpia

es independiente del volumen del eyaculado

Mtodos de centrifugacin (gradientes)

mayor capacidad de recuperacin

buenos resultados con muestras pobres o congeladas

menor tiempo para su realizacin

Finalmente sealar que han sido mltiples los intentos de realizar una mejora in vitro de los espermatozoides mediante la adicin de distintos compuestos al medio de cultivo. De ellos destacar
el uso de inhibidores de la fosfodiesterasa (pentoxifilina, teofilina, cafena, etc.) para estimular la
motilidad espermtica. La inhibicin de la fosfodiesterasa provoca un aumento de la concentracin de adenosin monofosfato cclico (cAMP). El aumento de cAMP, mediador intracelular, regula
reacciones intracelulares que activan el metabolismo del espermatozoide mejorando parmetros
de movilidad. Muchas son las publicaciones sobre el efecto de la pentoxifilina mientras unos
autores encuentran una mejora de la motilidad al incubar la muestra seminal con pentoxifilina
otros no observan diferencia alguna de ah que no se haya implantado como rutina en la prctica
clnica del laboratorio.

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BIBLIOGRAFIA
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EDUCACIN CONTINUADA EN EL LABORATORIO CLNICO


COMIT DE EDUCACIN
M.C. Vill (presidenta), D. Balsells, M. Gass, J.A. Lillo, A. Merino, A. Moreno, M. Rodrguez
ISSN 1887-6463
Noviembre 2011 (recibido para publicacin septiembre 2011)
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