Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
EN EL LABORATORIO CLNICO
Ed Cont Lab Cln; 15: 11-21
2011-2012
CAPACITACION ESPERMATICA
Ana Ruiz Martn
F.E.A Anlisis Clnicos. Hospital Regional Universitario Carlos Haya. Mlaga
INTRODUCCIN
Hasta hace relativamente poco tiempo no se haba tomado conciencia de la verdadera importancia de la infertilidad masculina. Estudios epidemiolgicos demuestran que un 25 % de los
pacientes que acuden por primera vez a una consulta de esterilidad presentan un claro defecto
funcional de sus espermatozoides. Por otro lado publicaciones recientes sugieren que la calidad
del semen humano se est deteriorando con el paso del tiempo, quiz como resultado de factores ambientales que empezaran a actuar en el desarrollo fetal del individuo.
Todo ello nos lleva a considerar la importancia de aumentar el conocimiento de la biologa
celular del espermatozoide humano y de definir los defectos responsables de la perdida de su
potencial de fecundacin.
Los espermatozoides se producen en el testculo en dos etapas:
En los testculos los espermatozoides son inmviles y no fecundantes. Desde los testculos son
evacuados hacia el epiddimo (72 das despus del inicio de la espermatognesis) a travs de los
conductos espermticos intratesticulares (rete testi). Es en el epiddimo donde los espermatozoides adquieren su movilidad progresiva.
En el momento de la eyaculacin los espermatozoides son expulsados por el conducto deferente hacia los conductos eyaculadores y hacia la uretra prosttica donde se aade la secrecin
prosttica. En un segundo tiempo al contraerse las vesculas seminales su secrecin pasa a los
conductos eyaculadores.
En total el volumen de esperma supone un 5 % de la secrecin epididimaria, un 30 % de la prosttica y un 65 % de las vesculas seminales.
Capacitacin espermtica
A. Ruiz, A. Gutirrez
1. reaccin acrosmica
3. hipermovilidad
1. Reaccin acrosmica
El acrosoma es una organela tipo lisosoma localizada en la regin anterior de la cabeza del espermatozoide por debajo de la membrana plasmtica, como un casquete sobre el ncleo. El acrosoma contiene muchas enzimas que quedan al descubierto con la reaccin acrosmica, la prdida
del acrosoma inmediatamente antes de la fertilizacin. Esta reaccin es de exocitosis, la fusin
de una vescula intracelular de almacenamiento con la superficie interna de la membrana celular,
seguida de la liberacin del contenido de la vescula. Esta reaccin requiere la entrada de iones
calcio, la salida de iones hidrgeno, un aumento del pH y la fusin de la membrana plasmtica
con la membrana del acrosoma, lo que permite el contacto con las enzimas y favorece la salida
de las retenidas por la membrana interna del acrosoma. Para que un componente de la zona
provoque la reaccin acrosmica es necesaria la unin del espermatozoide a la zona pelcida. Se
cree que este componente es un receptor de glicoprotenas espermticas que tendra una doble
funcin: unirse al espermatozoide e inducir la reaccin acrosmica.
12
Capacitacin espermtica
A. Ruiz, A. Gutirrez
2. Unin espermatozoide-ovulo
La capacidad de unin de la membrana plasmtica del espermatozoide con la del ovocito se desarrolla durante o tras la reaccin acrosmica. El contacto inicial entre espermatozoide y ovocito
es un proceso mediado por receptores. La zona pelcida est compuesta por glucoprotenas
secretadas por el ovocito llamadas ZP1, ZP2 y ZP3 de las cuales la ms abundante es ZP3 y el
principal fijador para el espermatozoide. Para que el espermatozoide se una es necesario que
reconozca el componente carbohidrato de la molcula fijadora de las glucoprotenas especficas
para la especie. Despus de la unin, el componente peptdico de la glucoprotena receptora
desencadena la reaccin acrosmica. Por lo menos uno de los receptores de la cabeza del espermatozoide es una tirosinquinasa activada por la unin a la glicoprotena ZP3 y que inicia la
reaccin acrosmica. Esta interaccin sigue los principios generales de la unin y actividad hormona-receptor. En el caso del espermatozoide y el ovocito, en el reconocimiento interviene una
enzima de la superficie del espermatozoide que queda expuesta en el proceso de capacitacin.
3. Hiperactivacin espermtica
En cierto momento de la preparacin del espermatozoide para la fecundacin, ste desarrolla
un movimiento peculiar, llamado hiperactivo, que se caracteriza por una pequea velocidad de
progresin y un rpido movimiento in situ con un gran desplazamiento lateral de la cabeza. El
aumento de la movilidad, debido al estado de hiperactividad, contribuye al ltimo avance hacia
el ovocito. Es posible que esta movilidad sea en parte el resultado de una interaccin con el epitelio de la trompa, que imprime mayor velocidad y mejor orientacin y tambin impide que los
espermatozoides se adhieran y queden atrapados en el epitelio de la trompa.
CAPACITACION ESPERMATICA
En la valoracin bsica del eyaculado deben considerarse tanto el estudio macroscpico (volumen, licuefaccin, aspecto y viscosidad) como el microscpico (recuento espermtico, movilidad
y morfologa, as como concentracin de otros elementos celulares). Sin embargo el estudio
seminal no nos informa de la capacidad espermtica fecundante, y por tanto no traduce las
posibilidades reales de fecundar. Por ello en ocasiones tendremos que realizar el estudio funcional espermtico. Existen numerosas pruebas que pretenden evaluar la capacidad fecundante
espermtica, y todas ellas se relacionan con alguna fase de la fecundacin, pero debemos utilizar
aquellas que por su simplicidad sean fcilmente realizables. En nuestro caso nos centraremos en
la recuperacin de espermatozoides mviles (REM) o test de capacitacion.
RECUPERACION DE ESPERMATOZOIDES MVILES (REM) O TEST DE CAPACITACIN
Si bien la capacitacin ha sido definida como la serie de cambios que experimenta el espermatozoide en el aparato reproductor femenino, es evidente que los espermatozoides de algunas
especies, incluida la humana, pueden adquirir la capacidad de fertilizar despus de una incubacin en un medio determinado y sin permanencia en el aparato reproductor femenino. Por ello
13
Capacitacin espermtica
A. Ruiz, A. Gutirrez
Capacitacin espermtica
A. Ruiz, A. Gutirrez
Es muy importante tener en cuenta que las tcnicas de capacitacin espermtica no son
en si mismas pruebas diagnsticas, sino que forman parte de los mtodos de tratamiento del semen. Cuando los parmetros seminales son normales el recuento de espermatozoides mviles tras la preparacin seminal (REM) no aporta informacin adicional al estudio de
la pareja estril (recomendacin de la Sociedad Espaola de Reproduccin, Sociedad Espaola
de Androloga y Asociacin para el Estudio de la Biologa de la Reproduccin). Sin embargo el
REM se ha convertido en un referente de gran utilidad para sentar la indicacin de inseminacin
intrauterina ya que el valor pronstico que aporta un seminograma anormal es insuficiente. Es
difcil establecer un nmero mnimo de espermatozoides recuperados para realizar inseminaciones intrautero y obtener una tasa de gestacin adecuada. Algunos autores proponen que cada
centro establezca su punto de corte en funcin de los datos clnicos y de laboratorio de cada
centro. En general se considera de buen pronstico un REM por encima de 5 millones de espermatozoides mviles recuperados por mililitro.
Obtencin de la muestra
Para la realizacin de la capacitacin en el laboratorio el mtodo de recogida y transporte de la
muestra seminal ser muy importante. Ha de informarse al paciente de forma oral y por escrito
de los siguientes aspectos:
porcin inicial
Una vez recogida la muestra e identificada se incubar durante 15 minutos a una temperatura
entre 20-37 C hasta obtener la licuefaccin completa (esta incubacin no ser necesaria si la
muestra ha completado la licuefaccin en el momento de la entrega).
Tras este periodo se proceder a la evaluacin de la muestra segn los criterios de la OMS anotndose volumen, concentracin y movilidad.
TECNICAS DE CAPACITACIN ESPERMTICA
A continuacin realizaremos el procesado de la muestra. Existen varias tcnicas de capacitacin
espermtica:
1. Mtodo de lavado
2. Mtodos de Migracin
Swim- up directo
Swim inverso
15
Capacitacin espermtica
A. Ruiz, A. Gutirrez
1. Mtodo de lavado
Es el ms sencillo. No conlleva una mejora de la calidad seminal simplemente una capacitacin
y concentracin.
Procedimiento
1. Depositar la muestra seminal en un tubo y aadir medio de cultivo en proporcin 1:5 o 1:10
para retirar la mayor parte del plasma seminal.
2. Homogeneizar y centrifugar a 500 g durante 10 minutos.
3. Retirar el sobrenadante y aadir 0.5 mL de medio de cultivo.
4. Incubar 20-30 minutos.
2. Mtodos de Migracin
Tcnica del Swim-up
Esta basado en la capacidad de desplazamiento de los espermatozoides mviles. Es el ms fisiolgico de todos los procedimientos. Requiere muestra con buenos parmetros seminales y la
muestra se recupera muy limpia. Dentro de esta categora existen dos formas principales Swim
Up directo y Swim Up convencional
Swin up directo
El semen licuado se deposita debajo o sobre un medio de cultivo y los espermatozoide con buena
movilidad se dirigen al medio de cultivo de forma semejante al proceso in vivo.
Procedimiento
1. Colocar aproximadamente 250 L de semen licuado en el fondo de un tubo no cnico (para
aumentar la superficie de contacto). Utilizar tantos tubos como sea necesario para mejorar la
recuperacin de los espermatozoides.
2. Depositar sobre el semen 500 L de medio de cultivo, resbalando por las paredes del tubo,
con cuidado de que no se mezcle con el semen.
3. Dejar en un incubador a 37 C formando un ngulo de 45, para aumentar la interfase, durante un tiempo entre 30 a 60 minutos dependiendo de la calidad del semen. No prolongar ms
all de 60 minutos para evitar la contaminacin con plasma seminal.
16
Capacitacin espermtica
A. Ruiz, A. Gutirrez
4. Pasado este tiempo aspirar aproximadamente 300 L de medio de cultivo, con cuidado de no
aspirar semen (para lo cual durante todo el proceso se debe mantener el ngulo del tubo). Si no
hay ms de un tubo de una misma muestra se unifica todo el aspirado en un nico tubo.
5. Si el volumen obtenido es mayor de 500 L, valorar el grado de movilidad y la concentracin
de los espermatozoides. Centrifugar y llevar a un volumen final de 300-500 L para inseminar
Swin up convencional
Procedimiento (Figura 1)
1. Lavar el semen con medio de cultivo en relacin 1:1 y centrifugar 10 minutos a 400 g.
2. Retirar el sobrenadante con una pipeta estril, con cuidado de no aspirar el botn celular.
3. Aadir al sedimento medio de cultivo hacindolo resbalar lentamente por la pared del tubo
para evitar que se mezclen. El volumen a aadir depende de la calidad de la muestra lo normal
serian 500 L.
4. Colocar el tubo en un incubador a 37 C durante aproximadamente 45 minutos (tiempo necesario para que los espermatozoides mviles asciendan desde el sedimento).
5. Recuperar 500 L de la superficie del sobrenadante que contiene los espermatozoides mviles
libres de plasma seminal y clulas no espermticas.
6. Evaluar la muestra capacitada (nmero de espermatozoides mviles recuperados por mL) y
dejar la muestra en el incubador hasta el momento de su utilizacin.
Capacitacin espermtica
A. Ruiz, A. Gutirrez
1. Hacer deslizar un volumen determinado de gradiente de mayor concentracin, en nuestro caso de 90 % (impregnado las paredes hasta el fondo de un tubo cnico)
18
Capacitacin espermtica
A. Ruiz, A. Gutirrez
3. Depositar el mismo volumen de semen deslizndolo sobre la pared del tubo lentamente.
4. Centrifugar a 300 g durante 20 minutos y posteriormente con una pipeta Pasteur recuperar el sedimento.
19
Capacitacin espermtica
A. Ruiz, A. Gutirrez
La relacin del total de espermatozoides presentes en el eyaculado con el nmero de espermatozoides mviles recuperados, se expresa como porcentaje de recuperacin se calcula con la
siguiente frmula:
De las tcnicas de capacitacin anteriormente descritas las ms utilizadas en los laboratorios por
su simplicidad y eficacia son el Swim-up y los gradientes de densidad.
Aunque no existe evidencia cientfica para recomendar una tcnica de preparacin de semen las
ventajas de cada uno de estos mtodos son:
proceso fisiolgico
Finalmente sealar que han sido mltiples los intentos de realizar una mejora in vitro de los espermatozoides mediante la adicin de distintos compuestos al medio de cultivo. De ellos destacar
el uso de inhibidores de la fosfodiesterasa (pentoxifilina, teofilina, cafena, etc.) para estimular la
motilidad espermtica. La inhibicin de la fosfodiesterasa provoca un aumento de la concentracin de adenosin monofosfato cclico (cAMP). El aumento de cAMP, mediador intracelular, regula
reacciones intracelulares que activan el metabolismo del espermatozoide mejorando parmetros
de movilidad. Muchas son las publicaciones sobre el efecto de la pentoxifilina mientras unos
autores encuentran una mejora de la motilidad al incubar la muestra seminal con pentoxifilina
otros no observan diferencia alguna de ah que no se haya implantado como rutina en la prctica
clnica del laboratorio.
20
Capacitacin espermtica
A. Ruiz, A. Gutirrez
BIBLIOGRAFIA
Ballesc JL. Estudio del Varn Estril. En: Reproduccin Humana, 2 ed. Remohi J, Pellicer A,
Simon C. Madrid, McGraw-Hill/Interamericana, 2002 279-285
European Association of Urology. Guidelines on male infertility. Board EAU guidelines office, 2004
Fernandez PJ; Luna C, Blaner R, et al. Uso razonado de las tcnicas de seleccin espermtica
empleadas en Reproduccin Asistida. Revista Iberoamericana de Fertilidad, 1998; 1:13-28.
Kay VJ, Coutts JRF, Robertson L.: Pentoxifylline stimulates hyperactivation in human spermatozoa. Hum Reprod, 1993; 8:727-731.
Matorras R, Hernndez J (eds): Estudio y tratamiento de la pareja estril: Recomendaciones
de la Sociedad Espaola de Fertilidad, con la colaboracin de la Asociacin Espaola para el Estudio de la Biologa de la Reproduccin, de la Asociacin Espaola de Androloga y de la Sociedad
Espaola de Contracepcin. Adalia, Madrid 2007
Mortimer St, Swan MA; Mortimer D. Effect of seminal plasma on capacitacion and hyperactivacion in human spermatozoa. Hum Reprod 1998; 13:2139-2146
Mortimer D. Sperm Washing. En: Practical Laboratory Andrology. Oxford University Press. Nueva York 1994; 267-286
Nez R. Nuevos conceptos en la valoracin de la funcin espermtica. En: Temas de Actualidad en Androloga I Jaripo editores. Madrid 1999; 123-165
Ruiz A., Romero JL. Evaluacin y Preparacin del semen. En: Cuadernos de Medicina Reproductiva. Pellicer A (ed.) 1995 1 (1): 45-58
Selles E, Prez I, Pellicer J. Capacitacin espermtica. En: Manual Prctico de Esterilidad y
Reproduccin Humana Laboratorio de reproduccin asistida. 3 ed. Remohi J, Cobo A, Romero
J Madrid, McGraw-HILL 2008; 24-29
WHO Laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction 5 Edicin. Cambridge University Press. Cambridge, 2010