UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA

KM 4, 9000, COMODORO RIVADAVIA

PATAGONIA SAN JUAN BOSCO
CHUBUT, ARGENTINA
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
TEL/FAX: (++54-297)4550339
CARRERA DE FARMACIA
CATEDRA DE FARMACOGNOSIA
E-mail: fargnosi@unpata.edu.ar
www.fcn.unp.edu.ar/sitio/farmacognosia/

COMPLEMENTO TEORICO. CROMATOGRAFIAS ESPECIALES

CROMATOGRAFIA PLANAR CENTRIFUGA
Utiliza un flujo de Fase Mvil (FM) acelerado por la accin de la fuerza centrfuga.
En el transcurso del tiempo, se han ido perfeccionando los equipos en cuanto a la
practicidad de su utilizacin y a los resultados que permiten obtener.
1- Cromatografa centrfuga en papel. En 1955 consista en un rotor con dos platos
conteniendo en el medio una lmina de papel para cromatografa circular. Utilizaba
rotores horizontales, por lo que la coleccin de las muestras eluidas era difcil.
2- Cromatofuga. Consista en una especie de columna horizontal cilndrica rellena de
material adsorbente (xido de aluminio, BaCO3). La coleccin de las fracciones eluidas
era dificultosa, causando remezclas. Se utiliz para separar sustancias tales como
xantinas, amino cidos, hasta en cantidades de gramos.
3- Cromatografa en capa fina o delgada centrfuga. Surgieron dos equipos
comerciales, siendo el segundo el de mayor aplicacin:
3.1- Hitachi CLC-Centrifugal Chromatography, de origen japons. En este caso, el
adsorbente se mezcla con el eluyente y se introduce en un espacio ubicado entre 2
lminas horizontales de 30 cm de dimetro. El exceso de eluyente se remueve por
accin de la fuerza centrfuga y a continuacin se introduce la muestra en la parte
central. La FM se deja gotear en el lugar de siembra generando una separacin de las
sustancias en bandas concntricas acelerada por la accin de la fuerza centrfuga merced
a un rotor. El espesor de la capa fina puede ser variado, permitiendo trabajar a pequeas
y grandes escalas. La disposicin del rotor hace dificultosa la coleccin de las
fracciones separadas.
3.2- Chromatotron, de origen estadounidense. Se utiliza principalmente para realizar
cromatografa de tipo preparativa, radial, de capa fina (TLC), en donde la FM es
obligada a eluir con una aceleracin dada por la fuerza centrfuga aplicada
(generalmente de 800 r.p.m.), alcanzando un flujo de 1-10 ml/min. Las dimensiones
generales del equipo son 30 x 35 x 30 cm. La diferencia con los anteriores es que el
rotor se halla inclinado, lo cual favorece la coleccin de los eluidos.
Principios de la operacin: la muestra se aplica en solucin, en el centro del disco o
plato circular de vidrio que posee la FE sorbida en forma de capa fina. La elucin se
realiza mediante el solvente que se aplica en el centro, definiendo bandas circulares
correspondientes a los componentes que se van separando a medida que el sistema gira
mediante el rotor inclinado. Las prdidas de eluido por los bordes se evitan por un
cuello de cinta gruesa engomada que rodea la circunferencia del plato.
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El rotor est guardado en una cmara, cubierto por un plato de cuarzo o de otro material
que permite la observacin del desarrollo al UV, dejando entrever las zonas de
separacin de las sustancias. A travs de la cmara pasa un flujo constante de N 2 para
prevenir la condensacin del eluente y la oxidacin de la muestra.
Capacidad: en general se pueden separar de 50 hasta 500 mg de muestra, utilizando
una capa fina de 2 mm de espesor. Posee menor resolucin que un HPLC, pero a
diferencia de una TLC planar, en este tipo de cromatografa el producto es eluido y por
lo tanto se evita el tener que raspar la capa fina para obtener las sustancias separadas.
FE: slica gel, almina o slica gel nitrato de plata. No se utiliza en general para FR.
FM (solventes): es compatible con todos los solventes usados habitualmente en
cromatografa, incluyendo cido actico. No se deben usar cidos minerales.
Ventajas:
- Permite variar la FM y el gradiente de elusin. La atmsfera de N 2 previene
oxidaciones de los compuestos.
- Separaciones rpidas, aproximadamente en 20 - 30 min.
- Permite observar las zonas de separacin durante el desarrollo con una lmpara UV o
al visible.
- Las sustancias separadas eluyen fcilmente debido a la inclinacin del rotor.
- Puede utilizarse un espesor de capa fina de 1, 2, 4 o 8 mm, aumentando la capacidad
del sistema. Adems el adsorbente puede regenerarse in situ para su reutilizacin.
- Utiliza un equipo compacto, de fcil transporte y de menor precio que un HPLC.

Ejemplo: la separacin de estricnina y brucina (250 mg) sobre una capa fina de slica
gel de 2 mm de espesor, se observa con muy buena resolucin mediante las bandas
concntricas ms abajo indicadas. El revelado se realiza con lmpara UV.

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CROMATOGRAFIA LIQUIDA EN COLUMNAS

1- Convencional de laboratorio a presin hidrosttica (presin normal). Las
partculas de la FE poseen en general un dimetro de 60 200 m. El uso principal es
como cromatografa preparativa y la mayor desventaja es el tiempo que demanda el
desarrollo.
- Soporte: cilindro de vidrio o metal o plstico, en todos los casos es un soporte inactivo
o inerte. La relacin ptima de longitud d.i. es de 8:1.
- FE: slida, constituida por un adsorbente polar (slicagel, almina, ambos como tal en
el caso de las cromatografas comunes o con la polaridad an ms aumentada por ej. por
grupos nitrilos o aminos, para FN) o de menor polaridad (C18, C8, para cromatografas
en FR); tambin pueden ser resinas de intercambio aninico o catinico, geles para
cromatografa por filtracin, material para cromatografa de afinidad o partculas de
celulosa microcristalina para particin.
- FM: lquida, la cual se puede variar ampliamente durante el desarrollo, siempre en
forma gradual. En el caso de las cromatografas comunes y de aquellas en FN, la FM se
debe variar de menor a mayor polaridad; en el caso de FR, se vara de mayor a menor
polaridad.
- Proceso: depender de la FE, pudiendo ser de adsorcin, intercambio inico, filtracin,
afinidad, particin.
- Empacado: puede ser en seco (ya sea directamente en la columna vaca o en la
columna llenada previamente con la primera FM a usar), o FE en suspensin (en la
primera FM a usar).
- Siembra: muestra disuelta o suspendida en un solvente + el doble de peso del
adsorbente, formando una pastilla que al evaporarse el solvente, contendr el polvo de
adsorbente con la muestra sobre su superficie.
- Desarrollo: en general descendente.
- Deteccin: las sustancias separadas se obtienen a la salida de la columna, de tal forma
que la deteccin se realizar sobre las fracciones eluidas. Puede realizarse por mtodos
fsicos (luz natural o UV), o qumicos, o sembrando las distintas fracciones en un
sistema de TLC y revelando all.
- Factores que afectan la separacin: grado de activacin del adsorbente para el caso de
adsorcin; granulometra de la FE o viscosidad del gel cuando corresponda,
homogeneidad del empacado, inercia qumica de la FE y de la FM. La velocidad de
elusin ideal es de 2 ml / min; la relacin entre largo y d.i. de la columna de 8:1; la
temperatura deber ser constante y homognea en toda la columna durante todo el
proceso ya que afecta la volatilidad y solubilidad de las sustancias. La humedad y
presin son las normales del ambiente.
2- Instrumental: HPLC, CG, FSC.
Ver el material correspondiente entregado como Complemento Terico y lo que se
desarrolle en los grupos de metabolitos de mayor aplicacin en cada caso.
3- Cromatografa en Columnas especiales.
Dado los largos tiempos de desarrollo de las cromatografas lquidas en columnas
convencionales y por otro lado, los costos elevados del equipamiento requerido para las
instrumentales, se buscaron otros sistemas que no siendo tan costosos, ofrecieran alguna
ventaja sobre las columnas convencionales. Surgieron as las llamadas COLUMNAS
ESPECIALES.
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3.1- CROMATOGRAFIA EN COLUMNA SECA.

Es semejante a una TLC, slo que se realiza en columnas en general de material plstico
o nylon, que permiten ser cortadas en las bandas en que se separan las sustancias.
Se empacan en seco. La muestra se siembra tambin en seco, recubierta o mezclada con
el adsorbente en una proporcin de muestra / adsorbente de 1:100. En algunos casos se
siembra la muestra apenas humectada con la FM. A continuacin se deja que la FM
avance por capilaridad o simple humectacin hasta que llega al final de la columna. Las
sustancias se separarn en bandas y luego se proceder a cortar las partes de la columna
que contengan cada banda. Permite mejor resolucin y reproducibilidad.
- Soporte: inactivo. Columna plstica o de nylon, tubo fcil de cortar o extruir y que
puede verse al UV. En general de longitud importante y de d.i. pequeo (10:1; 25:1).
- Principio: una TLC ofrece mayor resolucin que la columna para una misma FE y FM
y menor tiempo de desarrollo; pero la columna permite variar la FM. Por ello esta
columna especial combina las ventajas caractersticas de una TLC con las de una
columna.
- FE: en general adsorbente slicagel 60 F254 (70 - 230 m) con 40 % de humedad
(grado de actividad III). Se empaca en seco. La relacin adsorbente muestra vara de
40:1 hasta 300:1.
- FM: el solvente en cada plato terico que se genera, va encontrando material seco. La
muestra se incorpora en la solucin o suspensin de FM (o seca en algunos casos) y se
eluye por humectacin con la FM que avanza hasta llegar al final de la columna.
- Muestra: seca o recubierta o mezclada con el adsorbente o bien apenas humectada con
la FM; hasta 500 mg en general.
- Proceso: temperatura y humedad ambiente. Presin en general normal, pero puede
combinarse con vaco para acelerar el proceso. En general, el tiempo de desarrollo es de
30 min.
- Revelado: pueden observarse las bandas correspondientes a las sustancias que se van
separando, mediante luz natural o con luz UV. Ello permite cortar las zonas separadas y
luego fluir de la FE con solventes apropiados.
3.2- CROMATOGRAFIA EN COLUMNA BAJO VACIO.
Bsicamente se aplica una succin a la base de la columna para forzar el flujo de la FM
a travs de una columna empacada con FE para TLC. Si se pretendiera utilizar FE para
TLC en columna, el proceso sera extremadamente lento, pero optimizara la separacin,
por ello una estrategia es utilizar esta FE forzando el flujo de FM merced a la aplicacin
de vaco. En general las columnas son de poca longitud, pero de mayor dimetro
(columnas cortas, pero anchas).
- Soporte: inactivo. Columna de vidrio, semejante a un embudo separador, en general de
longitud baja y de d.i. grande (5:1).
- Principio: se utiliza vaco (aproximadamente de 25 mm de Hg) para acelerar el flujo
de la FM, por lo que el tiempo de desarrollo se limita a 2 3 h como mximo.
- FE: en general adsorbente grado TLC (10 - 40 m), por lo que bajo vaco logra la
mxima densidad. Se empaca en seco, luego se aplica solvente de mediana o baja
polaridad, se aspira a seco con vaco y estar lista para sembrar la muestra e iniciar el
proceso cromatogrfico. La relacin adsorbente muestra est alrededor de 50:1 o
menos.
- FM: el solvente debe ser de punto de ebullicin medio y poco viscoso para evitar
prdidas por evaporaciones ligeras o un entorpecimiento del proceso por la viscosidad.
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- Muestra: seca o recubierta o mezclada con el adsorbente o disuelta o suspendida en un

pequeo volumen de la FM.
- Proceso: temperatura y humedad ambiente. Presin de aproximadamente 25 mm de
Hg, es decir reducida a condiciones de vaco. En general, el tiempo de desarrollo es de
2 - 3 h.
- Revelado: como en las columnas convencionales.
3.3- CROMATOGRAFIA EN COLUMNA CON PRESION.
Segn la presin por encima de la normal que se emplee, se clasifica en:
3.3.1.
FLASH CROMATOGRAFIA
3.3.2. CROMATOGRAFIA DE PRESION BAJA (LOW
CHROMATOGRAPHY)
3.3.3. CROMATOGRAFIA DE PRESION MEDIA (MEDIUM
CHROMATOGRAPHY)
3.3.4. CROMATOGRAFIA DE ALTA PRESION (HIGH
CHROMATOGRAPHY)

PRESSURE
PRESSURE
PRESSURE

La tabla siguiente destaca los principales parmetros que definen cada una de ellas, en
comparacin con la columna convencional o comn de laboratorio (open column).

En todos los casos se logra optimizar el proceso aumentando el flujo merced a un

aumento de la presin aplicada. Ello permite trabajar con menor cantidad de muestra,
con partculas de tamao muy pequeo (lo cual genera un consecuente aumento de la
resolucin), con columnas pequeas y un flujo mayor, lo que a presin normal no sera
posible.
En flash cromatografa se aplica presin a partir de un cilindro de N 2 o de aire de
calidad para cromatografa. Las columnas son de vidrio, con longitudes en general que
varan entre los 7 y los 15 cm y d.i. entre 3 y 7 cm.

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