Valoracion Microbiologica de Antibioticos

EL TEXTO EN COLOR ROJO HA SIDO MODIFICADO
Con fundamento en el numeral 4.11.1 de la Norma Oficial

Mexicana NOM-001-SSA1-2010, se publica el presente
proyecto a efecto de que los interesados, a partir del 1 de
agosto y hasta el 30 de septiembre de 2015, lo analicen,
evalen y enven sus observaciones o comentarios en idioma
espaol y con el sustento tcnico suficiente ante la CPFEUM,
sito en Ro Rhin nmero 57, colonia Cuauhtmoc, cdigo
postal 06500, Mxico, D.F. Fax: 5207 6890
Correo electrnico: consultas@farmacopea.org.mx.
MGA 0100. VALORACIN

MICROBIOLGICA DE ANTIBITICOS
La potencia o actividad de los antibiticos se calcula comparando el grado de inhibicin de microorganismos sensibles y
especficos determinada por concentraciones conocidas del
antibitico analizado y una sustancia de referencia. Las sustancias de referencia empleadas en los ensayos, son sustancias
cuya actividad se ha definido por un organismo reconocido por
la autoridad sanitaria nacional.
En los antibiticos puede haber ligeros cambios qumicos que
se traducen en prdida de actividad antimicrobiana que no
pueden demostrarse por mtodos qumicos, por esta razn, en
caso de duda respecto a la actividad de un antibitico, los
mtodos de valoracin microbiolgica prevalecen sobre los
mtodos qumicos.
Para valorar microbiolgicamente un antibitico, se pueden
emplear dos mtodos: Mtodo cilindro-placa (mtodo de
difusin en agar) y Mtodo turbidimtrico, ambos comparan
la respuesta del microorganismo de prueba, frente a una
Sustancia de referencia (SRef) de actividad conocida y una
muestra tratadas en las mismas condiciones. En la Tabla
0100.1 Se enlistan los antibiticos que requieren ensayos
microbiolgicos y se especifica el tipo de ensayo.
Tabla 0100.1 Antibiticos que requieren
Valoracin microbiolgica.
Antibitico
Tipo de Valoracin
Amfotericina B
Cilindro - placa
Bacitracina
Cilindro - placa
Bleomicina
Cilindro - placa
Capreomicina
Turbidimtrica
Carbenicilina
Cilindro - placa
Cloranfenicol
Turbidimtrica
Clortetraciclina
Turbidimtrica
Cloxacilina
Turbidimtrica
Colistimetato
Cilindro - placa
Colistina
Cilindro - placa
Cilindro - placa
Dihidroestreptomicina
Turbidimtrica
Eritromicina
Cilindro - placa
Gentamicina
Cilindro - placa
+52 55 5207 8187
+52 55 5207 6887
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consultas@farmacopea.org.mx
Tabla 0100.1 Antibiticos que requieren

Valoracin microbiolgica.
Antibitico
Tipo de Valoracin
Gramicidina
Turbidimtrica
Nafcilina
Cilindro - placa
Natamicina
Cilindro - placa
Cilindro - placa
Neomicina
Turbidimtrica
Novobiocina
Cilindro - placa
Nistatina
Cilindro - placa
Oxitetraciclina
Turbidimtrica
Paromomicina
Cilindro - placa
Penicilina G
Cilindro - placa
Polimixina B
Cilindro - placa
Sisomicina
Cilindro - placa
Tetraciclina
Turbidimtrica
Tioestreptona
Turbidimtrica
Troleandomicina
Turbidimtrica
Tilosina
Turbidimtrica
Vancomicina
Cilindro-placa
Mtodo de cilindro en placa (difusin en agar). Se basa en
la difusin del antibitico desde un cilindro vertical, a travs
de una superficie con agar inoculado con el microorganismo
de prueba. La difusin origina zonas de inhibicin del
microorganismo cuyo tamao (dimetro) est en relacin con
la concentracin del antibitico.
Mtodo turbidimtrico. Se basa en medir espectrofotomtricamente el crecimiento del microorganismo de prueba en un
medio de cultivo lquido que permite su rpido crecimiento y
en el que al adicionar concentraciones crecientes del
antibitico se inhibe el crecimiento en forma proporcional a la
concentracin adicionada.
Nota: realizar aspticamente todos los procedimientos
descritos en el mtodo. Tomar las precauciones de seguridad
adecuadas al realizar estas valoraciones debido a las posibles
alergias a los frmacos y a que se utilizan cultivos vivos de
microorganismos.
Unidades y sustancias de referencia. La potencia de los
antibiticos se designa en unidades (U) o en microgramos (g)
de actividad. En un principio, se consideraba que un
antibitico seleccionado como sustancia de referencia
constaba en su totalidad de una sola entidad qumica y por lo
tanto, se le asignaba una potencia de 1 000 g/mg. En muchos
de estos casos, a medida que los mtodos de fabricacin y
purificacin para ciertos antibiticos avanzaron en su
desarrollo, fue posible obtener antibiticos con ms de
1 000 g de actividad/mg. Los antibiticos mencionados
tenan una actividad equivalente a un nmero determinado de
microgramos de la sustancia de referencia original. No
obstante, la mayora de las veces, los microgramos de
actividad son numrica y exactamente equivalentes a los
microgramos (masa) de la sustancia pura. En ciertas ocasiones,
CONSULTA A USUARIOS DE LA FEUM 2015-3

Preparados farmacuticos
1
Ro Rhin 57
col. Cuauhtmoc
06500, del. Cuauhtmoc
Mxico D. F., Mxico.
como las citadas a continuacin los microgramos de actividad

definidos en trminos de la sustancia de referencia equivalen a
una unidad:
para obtener colonias aisladas. Incubar los cultivos de trabajo

en condiciones apropiadas para obtener un crecimiento
satisfactorio para la preparacin de los inculos de prueba.
1. Cuando el antibitico se presenta como la base libre y en

forma de sal, y los microgramos de actividad han sido
definidos en trminos de una de estas formas.
Crecimiento o desempeo no caracterstico de un

microorganismo de prueba. Usar cultivos madre, cultivos
primarios o cultivos de trabajo nuevos cuando un
microorganismo de prueba presente crecimiento o desempeo
no caracterstico.
2. Cuando el antibitico consta de un nmero de

componentes que son qumicamente similares pero que
difieren en actividad antibitica.
3. Cuando las potencias de una familia de antibiticos se
expresan en trminos de una sustancia de referencia que
consta de un solo miembro de la familia el cual por s
mismo puede ser heterogneo. No se debe asumir que los
microgramos de actividad corresponden a los microgramos
(masa) del antibitico.
Control de temperatura. Se requiere control termosttico en
varias etapas de una valoracin microbiolgica: durante el
cultivo de un microorganismo y la preparacin de su inculo,
as como durante la incubacin en las valoraciones en placa o
tubo.
Microorganismo de prueba. El microorganismo de

prueba para cada antibitico se enlista en la Tabla 0100.4 para
la valoracin de cilindro - placa y en la Tabla 0100.11 para la
valoracin turbidimtrica. Los microorganismos de prueba se
especifican mediante un nmero de identificacin de la
American Type Culture Collection (ATCC). Para asegurar el
desempeo aceptable de los microorganismos de prueba, estos
deben almacenarse y conservarse de manera apropiada.
Durante la validacin o verificacin del mtodo se deben
establecer las condiciones de almacenamiento especficas. Si
se observa un cambio en las caractersticas morfolgicas y
fisiolgicas del microorganismo, desechar los cultivos.
Almacenamiento prolongado. Para el almacenamiento
prolongado, mantener los microorganismos de prueba en una
solucin de almacenamiento adecuada, tal como suero fetal de
ternero al 50%, en caldo glicerol al 10% - 15%, en caldo soya
tripticasena, sangre de oveja desfribinada o en leche
descremada. Los cultivos que se almacenan durante periodos
prolongados se recomienda liofilizarlos; se prefieren
temperaturas de -60C o inferiores; son aceptables
temperaturas inferiores a -20C.
Cultivos primaros. Preparar los cultivos primarios
transfiriendo microorganismos de prueba de los viales de
almacenamiento prolongado a medios apropiados e incubar en
condiciones adecuadas. Almacenar los cultivos primarios a la
temperatura apropiada, por lo general a 2 C- 8 C, y desechar
despus de tres semanas. Se puede usar el mismo cultivo
primario para preparar los cultivos de trabajo por un mximo
de siete das nicamente.
Cultivos de trabajo. Preparar los cultivos de trabajo
transfiriendo el cultivo primario a medios slidos apropiados
+52 55 5207 8187
+52 55 5207 6887
MEDIOS DE CULTIVO
Preparar los medios de cultivo a partir de mezclas
deshidratadas comerciales siguiendo las indicaciones del
fabricante. Cuando sea necesario prepararlos a partir de
ingredientes, se permiten pequeas modificaciones siempre y
cuando los medios de cultivo presenten propiedades
promotoras de crecimiento iguales o mejores a los medios aqu
descritos (Tabla 0100.3).
Disolver en 1.0 L de agua purificada los ingredientes
especificados, determinar el pH, si es necesario, ajustar con
soluciones de hidrxido de sodio 1.0 N o cido clorhdrico
1.0 N, segn se requiera para que despus de esterilizar se
obtenga el pH sealado en la Tabla 0100.3. A menos que se
indique lo contrario esterilizar en autoclave usando ciclos de
esterilizacin validados.
Material y equipo. El material que se usa debe estar limpio y
seco, libre de residuos de detergente y antibitico. En el caso
de los cilindros ocasionalmente se requiere una limpieza con
un bao de cido por ejemplo cido ntrico 2 N o con cido
crmico (Ver Limpieza de Material de Vidrio en el captulo de
Generalidades). El material en contacto con el
microorganismo de prueba debe esterilizarse empleando
procesos validados.
Cajas de Petri de vidrio o plstico de 20 mm x 100 mm
Cilindros de acero inoxidable o porcelana con las
siguientes dimensiones:
Dimetro externo 8 0.1 mm
Dimetro interno 6 0.1 mm
Longitud de 10 0.1 mm
Tapas de porcelana porosa
Material volumtrico de diferente capacidad
Tubos de ensayo estriles de 16 mm x 125 mm o de
18 mm x 150 mm, con un espesor relativamente uniforme,
sin defectos ni ralladuras en la superficie. Los tubos que se
usen en el espectrofotmetro deben ser iguales, sin
ralladuras ni defectos.
Tapas metlicas o de plstico resistentes a la esterilizacin
Incubadora con termostato capaz de mantener la
temperatura con variacin no mayor de 0.5 oC de la
temperatura seleccionada.
Bao de agua o aire caliente con termostato capaz de
mantener la temperatura seleccionada con una variacin no
mayor de 0.1C.

2
Ro Rhin 57
col. Cuauhtmoc
Mxico D. F., Mxico.
Espectrofotmetro a una longitud de onda a 530 nm o

580 nm.
Medidor de zonas de inhibicin (comparador ptico o
vernier) calibrado.
Otras soluciones
Para preparar estas soluciones consultar los captulos de
reactivos y soluciones reactivo (SR) y de soluciones
volumtricas (SV). Usar agua purificada. Como solucin
salina use solucin salina inyectable. La solucin de
formaldehdo se prepara diluyendo con agua en una
proporcin 1:3.
Mtodos de secado de la sustancia de referencia. Para cada
sustancia de referencia consultar en la etiqueta las indicaciones
de secado.
Soluciones amortiguadoras de fosfato y otras soluciones

Preparar las soluciones amortiguadoras con agua purificada
como se indica en la Tabla 0100.2, determinar el pH de la
solucin, si es necesario ajustar con soluciones de cido
fosfrico 18 N o hidrxido de potasio 10 N, segn se requiera,
para que despus de la esterilizacin se obtenga el pH indicado
en cada caso. A menos que se indique lo contrario esterilizar
en autoclave usando procesos de esterilizacin validados.
Tabla 0100.2. Soluciones amortiguadoras

Nmero
Ingredientes gramos por litro de agua
1
10
16
Concentracin
1%
0.1 M
0.1 M
10 %
0.2 M
0.1 M
pH
6.0 0.05
8.0 0.1
4.5 0.05
6.0 0.05
10.5 0.1
7.0 0.2
K2HPO4
16.73
20
35
13.6
KH2PO4
0.523
13.61
80
KOH 10 N
2.0 (mL)
39
5.0
1.5
1.5
1.0
3.68
1.32
3.5
-
40
5.0
20.0
10.0
2.0
0.1
10.0
-
41
9.0
5.0
20.0
1.0
1.0
10.0
6.7 0.2
6.8 0.1
7.3 0.1
7.0 0.1
7.0 0.1
6.6 0.1
19* 32
34 35 36
9.4 6.0 10.0 10.0 15.0
4.0
5.0
4.7 3.0
2.4 1.5 10.0 10.0 10.0 1.0
10.0 3.0 3.0 5.0
10.0 10.0 23.5 15.0
- 17.0 15.0
0.3
-
6.1 0.1
5.6 0.1
8.3 0.1
7.2 0.1
7.2 0.1
5.9 0.1
7.9 0.1
6.6 0.1
7.0 0.05
pH despus de esterilizar
6.6 0.1
Peptona (1)
Peptona de casena
Peptona de soya
Polipeptona
Extracto de levadura
Extracto de carne
Dextrosa
K2HPO4
KH2PO4
Cloruro de sodio
Polisorbato 80 (2)
Glicerol
Agar
Sulfato de magnesio
Citrato de sodio
Nmero
1
2
3
4
5
8
9
10
11
13
6.0 6.0 5.0 6.0 6.0 6.0
6.0 10.0
4.0
17.0 17.0 4.0
3.0 3.0
3.0 3.0 1.5 3.0 3.0 3.0
3.0
1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
1.5
1.0
1.0 1.0
2.5 2.5 1.0 20.0
- 3.68 2.5 2.5
- 1.32 3.5
5.0 5.0
- 10.0 15.0 15.0 - 15.0 15.0 15.0 20.0 12.0 15.0 -
6.6 0.1
Ingredientes gramo por litro
7.9 0.1
Tabla 0100.3. Medios de cultivo.
(1)
Utilizar peptona de carne o casena.

Agregar despus de hervir el medio de cultivo.
* Equivalente al medio de cultivo Antibitico Nm. 12.
(2)
+52 55 5207 8187

+52 55 5207 6887

3
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col. Cuauhtmoc
Mxico D. F., Mxico.
DISEO DE VALORACIN
Los diseos experimentales adecuados son clave para
aumentar la precisin y minimizar el sesgo. Controlar los
parmetros de incubacin, (es crtica la homogeneidad de la
temperatura dentro de la cmara de incubacin y el tiempo de
incubacin), esto se puede lograr acomodando las placas y las
gradillas segn se indica en el patrn de calificacin del equipo
y respetando el intervalo de temperatura para cada valoracin,
para minimizar el sesgo.
VALORACIN CILINDRO PLACA (MTODO DE
DIFUSIN EN AGAR)
Las comparaciones se limitan a las relaciones entre las
condiciones del dimetro de la zona de inhibicin dentro de las
placas, sin tener en cuenta la variacin entre placas. Las
respuestas individuales de las placas se corrigen basndose en
el tamao relativo de la zona de inhibicin de la SRef (c)
comparado con el tamao medio de la zona de inhibicin de la
SRef (c36) en todas las placas (a,b,d.e).
VALORACIN TURBIDIMETRICA
Para evitar un sesgo sistemtico, colocar aleatoriamente en
gradillas por separado tubos por duplicado, de manera que
cada gradilla contenga un conjunto completo de tratamientos.
El propsito de esta configuracin es minimizar la influencia
de la distribucin de la temperatura sobre las muestras. As
mismo la influencia de la variacin de temperatura se puede
disminuir asegurando un flujo de aire o la conveccin de calor
apropiado durante la incubacin (bao de agitacin).
Colocar en cada gradilla por lo menos tres tubos para cada
concentracin de la muestra y la SRef. Las comparaciones se
limitan a las relaciones entre los valores de turbidez
observados dentro de las gradillas.
CONSIDERACIONES
SOBRE
VALORACIN
MICROBIOLGICA.
Considerando las restricciones citadas anteriormente el diseo
de la valoracin recomendado emplea una curva tipo de la
SRef de cinco concentraciones y una sola concentracin para
cada muestra. Para valoraciones cilindroplaca; cada placa
incluye nicamente dos tratamientos; el tratamiento de
referencia (la concentracin central de los niveles de la SRef
es decir c y una de las otras cuatro concentraciones de la
SRef a, b, d, e o la muestra m). La concentracin de la
muestra es una estimacin basada en la concentracin deseada.
La muestra se debe diluir para proporcionar una concentracin
nominal que se estima es equivalente a la concentracin de la
SRef c. El propsito de diluir la muestra a la concentracin
central de la SRef es asegurar que el resultado de ella caer
dentro de la porcin lineal de la curva tipo. La prueba
determina la potencia relativa de la muestra (m) en funcin
de la curva tipo. La muestra m debe tener una potencia
relativa de aproximadamente 100%. La potencia final de la
muestra se obtiene multiplicando el resultado de la muestra por
el factor de dilucin. Una valoracin debe considerarse
+52 55 5207 8187

+52 55 5207 6887
preliminar si el valor de potencia de la muestra calculado es

inferior al 80% o superior a 125%. En dicho caso los resultados
sugieren que la concentracin de la muestra supuesta durante
la preparacin de la solucin madre de la muestra es
incorrecta; ya que la potencia se derivar de una porcin de la
curva tipo donde la respuesta de la SRef y de la muestra
probablemente no es paralela. Si esto ocurre se puede ajustar
la potencia supuesta de la muestra basndose en el valor de
potencia preliminar y repetir la valoracin.
Las determinaciones microbiolgicas de potencia estn sujetas
a variables intervaloracin e intravaloracin, de modo tal que
se requieren dos o ms valoraciones independientes para
obtener una estimacin confiable de la potencia de una
muestra determinada. Partiendo de soluciones madre y
diluciones de prueba tanto de la SRef como de la muestra,
preparadas por separado, llevar a cabo otro da valoraciones
adicionales de una muestra determinada. La potencia media
debe incluir los resultados de todas las valoraciones
independientes vlidas. El nmero de valoraciones requerido
para lograr una estimacin de potencia confiable depende de
la variabilidad de la valoracin y de la incertidumbre mxima
requerida para la estimacin de potencia. Esta ltima se evala
mediante la amplitud del intervalo de confianza. El resultado
combinado de una serie de valoraciones independientes ms
pequeas a lo largo de varios das es una estimacin de
potencia ms confiable que la obtenida de una sola valoracin
grande con el mismo nmero total de placas o tubos. Se debe
tomar en cuenta que las valoraciones adicionales o una menor
variabilidad permiten que el producto cumpla con intervalos
de especificacin ms estrechos. Al reducir la variabilidad de
las valoraciones se logra el lmite de confianza requerido con
menos valoraciones.
VALORACIN CILINDRO PLACA
Control de temperatura. Usar equipo calificado y calibrado
de manera apropiada para obtener los mrgenes de temperatura
especificados en la Tabla 0.100.4.
Aparato. Medidor de zonas de inhibicin (comparador ptico
o vernier) calibrado.
Cajas. Cajas Petri de vidrio o plstico desechables (de 20 x
100 mm).
Tapas de porcelana porosa.
Cilindros. Cilindros de acero inoxidable o porcelana, de 8
0,1 mm de dimetro externo; de 6 0,1 mm de dimetro
interno, de 10 0,1 mm de altura.
Preparacin de las diluciones de la SRef. Para cada SRef
consultar las condiciones de secado en su etiqueta. En la Tabla
0100.5 se indica el disolvente inicial, la concentracin madre
de la SRef, duracin en refrigeracin, diluyente final y la
concentracin central (c). Considerando la concentracin
central (c) indicada en la Tabla 0100.5 y el factor de dilucin
1:1.25 preparar las cinco concentraciones de la curva tipo, dos
por debajo (a, b) y dos por arriba (d, e) de la concentracin
central (c). Conservar la solucin concentrada en refrigeracin

4
Ro Rhin 57
col. Cuauhtmoc
Mxico D. F., Mxico.
y usar dentro del periodo de almacenamiento indicado en la

Tabla 0100.5.
Preparacin de la muestra. Para preparar la solucin de
prueba de la muestra, proceder de acuerdo a lo indicado en la
monografa especifica del producto. El da de la valoracin
preparar una solucin madre de la misma manera que se
especifica para la concentracin central (c) de la SRef. (Ver
la Tabla 0100.5)
Preparacin del inculo. A partir de un cultivo reciente del
microorganismo de prueba apropiado (Tabla 0100.4) preparar
una suspensin en 3 mL de solucin salina estril, para
facilitar la suspensin se pueden usar perlas de vidrio. Esparcir
la suspensin as obtenida sobre la superficie de dos o ms
placas de agar o sobre la superficie de un frasco Roux que
contenga 250 mL del medio especificado en la Tabla 0100.4
Incubar durante el tiempo y la temperatura especificados en la
Tabla 0100.4, o hasta que el crecimiento sea evidente.
Despus de incubar, recolectar los microorganismos de las
placas o frasco Roux con aproximadamente 50 mL de solucin
salina estril (excepto en el caso de Bleomicina para el que
debe usarse Medio 34; ver la Tabla 0100.4), usando una varilla
de vidrio estril doblada en ngulo o perlas de vidrio estriles.
Transferir la suspensin a un frasco de vidrio estril. Esta es
la suspensin de recoleccin o suspensin madre.
Para ajustar la suspensin, diluir una pequea alcuota usando
el factor de dilucin sugerido en la Tabla 0100.4, leer el
porciento de transmitancia de la dilucin a una longitud de
onda de 580 nm, la dilucin de la suspensin original debe
proporcionar una lectura de 25% 2% de transmitancia. Esta
dilucin, slo sirve de referencia para ajustar la transmitancia
de la suspensin original, sta es la que se inocula a la capa
siembra.
Tomando como base el por ciento de inculo sugerido en la
Tabla 0100.4, determinar el volumen de suspensin que debe
adicionarse a cada 100 mL de la capa siembra para obtener
zonas de inhibicin bien definidas y de tamao adecuado (14
16 mm de dimetro para la concentracin central de la SRef
c). Conservar la suspensin en refrigeracin durante el
periodo sugerido en la Tabla 0.100.4.
+52 55 5207 8187

+52 55 5207 6887
Nota: los tamaos de las zonas de inhibicin fuera del

intervalo de 11 a 19 mm no son adecuados, debido a que
contribuyen a la variabilidad de la valoracin.
Anlisis. Para cada ensayo debe realizarse la curva tipo de la
sustancia de referencia. Preparar el volumen necesario del
medio de cultivo para la capa base. Depositar en cada caja el
volumen de capa base indicando en la Tabla 0100.6. Dejar
solidificar. Preparar la cantidad apropiada de inculo para la
capa siembra segn se indica para el antibitico
correspondiente. Depositar en cada caja el volumen de capa
siembra indicada en la Tabla 0100.7. Inclinar la caja hacia
atrs y hacia adelante para esparcir el inculo uniformemente
sobre la superficie de la capa base y dejar solidificar.
Colocar seis cilindros de acero inoxidable sobre la superficie
inoculada (capa siembra), utilizando una gua mecnica u otro
dispositivo para asegurar el espacio uniforme en un radio de
2.8 cm.
Para la curva dosis respuesta utilizar un total de 12 placas, tres
para cada concentracin, excepto para la concentracin central
o punto de referencia de la curva (c), la cual se incluye en
todas las placas. Llenar tres cilindros de un conjunto de tres
placas con la concentracin de referencia y alternar tres
cilindros con la concentracin ms baja y as sucesivamente
para cada concentracin. De esta manera se obtienen 36 zonas
de inhibicin para la concentracin de referencia (c) y nueve
para las cuatro concentraciones restantes de la curva (a, b, d
y e).
Para cada muestra utilizar tres placas, llenar tres cilindros de
cada placa con la concentracin central de referencia (c) y
en forma alterna llenar los otros tres con la muestra preparada
a la concentracin central o de referencia. Incubar las placas
durante 16 a 18 h a la temperatura indicada para cada
antibitico en la Tabla 0100.4. Concluido el periodo de
incubacin medir el dimetro de las zonas de inhibicin.

5
Ro Rhin 57
col. Cuauhtmoc
Mxico D. F., Mxico.
Tabla 0100.4. Microorganismo de prueba para Valoracin Cilindro placa (Preparacin del inculo)
Antibitico
Microorganismo de Prueba
Nmero
ATCC a
Condiciones de incubacin
Medio de Temperatura
Cultivo
(C)
Tiempo
Factor de
Dilucin
Volumen de
inculo sugerido
(mL/100mL )
Duracin en
refrigeracin
Amfotericina B
Saccharomyces cerevisiae
9763
19
29 - 31
48 h
1:30
1.0
4 semanas
Bacitracina
Kocuria rhizophila *
9341
32 -35
24 h
1:35
0.3
2 semanas
Bleomicina
Mycobacterium smegmatis
607
36
36 37.5
48 h
1.0
2 semanas
Carbenicilina
Pseudomonas aeruginosa
25619
36 37.5
24 h
1:25
0.5
2 semanas
Cloxaxilina
Staphylococcus aureus
29737
32 - 35
24 h
1:20
0.1
1 semana
Colistimetato
Bordetella bronchiseptica
4617
32 - 35
24 h
1:20
0.1
2 semanas
Colistina
4617
32 -35
24 h
1:20
0.1
2 semanas
Bacillus subtilis
6633
32
32 -35
5 das
Determinar
6 meses
Eritromicina
Kocuria rhizophila *
9341
32 -35
24 h
1:40
1.5
2 semanas
Gentamicina
Staphylococcus epidermidis
12228
32 -35
24 h
1:24
0.03
1 semana
Nafcilina
29737
32 -35
24 h
1:20
0.3
1 semana
Neomicina
12228
32 - 35
24 h
1:24
0.4
1 semana
Novobiocina
12228
32 - 35
24 h
1:24
4.0
1 semana
Nistatina
2601
19
29 - 31
48 h
1:35
1.0
4 semanas
Paromomicina
12228
32 - 35
24 h
1:24
2.0
1 semana
Penicilina G
29737
32 - 35
24 h
1:20
1.0
1 semana
Polimixina B
4617
32 - 35
24 h
1:20
0.1
2 semanas
Sisomicina
12228
32 - 35
24 h
1:24
0.03
1 semana
Vancomicina
Bacillus subtilis
6633
32
32 - 35
5 das
Determinar
6 semanas
American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas VA 20110-2209 (http://www.atcc.org)
*Anteriormente: Micrococcus luteus

Tabla 0100.5. Preparacin de la solucin madre y diluciones de prueba de la SRef (Mtodo cilindro - placa)
Antibitico
Ampicilina (1)
Amfotericina B (1) (2)
Bacitracina de zinc (3)
Bleomicina
Carbenicilina
Cefalotina
Cefapirina
Cloxacilina
Colistimetato sdico (1)
Colistina
Eritromicina
Gentamicina
Nafcilina
Natamicina
+52 55 5207 8187

+52 55 5207 6887
Solucin madre
Conc. final
Disolvente inicial, (y
de la
concentracin inicial donde se
solucin
especifique) diluyente posterior
madre
si es diferente
(mL)
Agua
0.1 mg
Dimetil sulfxido
1 mg
cido clorhdrico 0.01 N
100 U
B. 16
2U
B. 1
1 mg
B. 1
1 mg
B. 1
1 mg
B.1
1 mg
Agua (10 mg/mL); [B. 6]
1 mg
Agua (10 mg/mL); [B. 6]
1 mg
B. 3
1 mg
Metanol (10 mg/mL); [B. 3]
1 mg
B. 3
1 mg
B. 1
1 mg
Dimetil sulfxido
1 mg
Dilucin de prueba
Duracin en
refrigeracin
Diluyente
final
Conc.
central(c)
(unidades o
g/mL)
7 das
Mismo da
Mismo da
14 das
14 das
5 das
3 das
7 das
Mismo da
14 das
30 das
14 das
30 das
2 das
Mismo da
B.3
B. 10
B. 1
B. 16
B. 1
B. 1
B. 1
B .1
B. 6
B. 6
B.3
B. 3
B. 3
B. 1
B. 10
0.100g
1.0 g
1.0 U
0.04 U
20 g
1.0 g
1.0 g
5.0 g
1.0 g
1.0 g
1.0 g
1.0 g
0.1 g
2.0 g
5.0 g

6
Ro Rhin 57
col. Cuauhtmoc
Mxico D. F., Mxico.
Neomicina (4)
Netilmicina
Novobiocina
Nistatina (1) (5)
Paromomicina
Penicilina G
Poliximina B (6)
Sisomicina
Vancomicina
B. 3
B. 3
Alcohol (10 mg/mL); [B. 3]
Dimetilformamida
B. 3
B. 1
Agua; [B.6]
B. 3
Agua
1 mg
1 mg
1 mg
1 000 U
1 mg
1 000 U
10 000 U
1 mg
1 mg
14 das
7 das
5 das
Mismo da
21 das
4 das
14 das
14 das
7 das
B. 3
B. 3
B.6
B. 6
B. 3
B. 1
B. 6
B. 3
B. 4
1.0 g
0.1 g
0.5 g
20 U
1.0 g
1.0 U
10 U
0.1 g
10 g
Notas: B denota solucin amortiguadora y el nmero que sigue se refiere a las soluciones amortiguadoras de fosfato de potasio definidas en este captulo.
(1) Para amfotericina B, colismetato sdico y nistatina, preparar las diluciones de la sustancia de referencia y de la muestra simultneamente.
(2) Para amfotericina B, diluir nuevamente la solucin madre con dimetil sulfxido para obtener concentraciones de 12.8, 16, 20, 25 y 31.2 g/mL antes de
realizar las diluciones de prueba. La Dilucin de prueba de la muestra debe contener la misma cantidad de dimetil sulfxido que las diluciones de la
sustancia de referencia.
(3) Para bacitracina zinc, cada una de las diluciones de prueba deben contener la misma cantidad de cido clorhdrico que la Dilucin de prueba de la muestra.
(4) Para la valoracin turbidimtrica de neomicina, diluir la solucin madre de 100 g/mL en forma cuantitativa con Solucin amortiguadora N 3 para obtener
una solucin con una concentracin equivalente a 25.0 g /mL de neomicina. A matraces volumtricos de 50 mL separados, agregar 1.39, 1.67, 2.00, 2.40 y
2.88 mL de esta solucin, agregar 5.0 mL de cido clorhdrico 0.01 N a cada matraz, diluir a volumen con Solucin amortiguadora N 3 y mezclar para
obtener soluciones con concentraciones de 0.69, 0.83, 1.0, 1.2 y 1.44 g/ mL de neomicina. Utilizar estas soluciones para preparar la lnea de respuesta de
la sustancia de referencia.
(5) Para la nistatina, diluir nuevamente la solucin madre con dimetilformamida para obtener concentraciones de 256, 320, 400, 500 y 624 Unidades/mL antes
de realizar las diluciones de prueba. Preparar las soluciones de lnea de respuesta de la sustancia de referencia simultneamente con las diluciones de la
muestra que se desea analizar. La Dilucin de prueba de la muestra debe contener la misma cantidad de dimetilformamida que las diluciones de prueba de
la sustancia de referencia. Utilizar recipientes de vidrio con proteccin actnica.
(6) Para la Polimixina B, preparar la solucin madre aadiendo 2 mL de agua por cada 5 mg de la sustancia de referencia.
Antibitico Medio
Amfotericina B NR
Bacitracina
2
Bleomicina
35
Carbenicilina
9
Cloxaxilina
2
Colistimetato
9
Colistina
9
Volumen (mL)
NR
21
10
21
21
21
21
Antibitico
Medio
Amfotericina B
Bacitracina
Bleomicina
Carbenicilina
Cloxaxilina
Colistimetato
Colisistina
Dinidroestreptomicina
Eritromicina
Gentamicina
19
1
35
10
1
10
10
5
11
11
+52 55 5207 8187

+52 55 5207 6887
Tabla 0100.6. Capa base

Antibitico
Medio
Volumen (mL)
Dihidroestreptomicina 5
21
Eritromicina
11
21
Gentamicina
11
21
Nafcilina
2
21
Neomicina
11
21
Nistatina
NR
NR
Antibitico
Medio Volumen (mL)
Novobiocina
11
21
Paromomicina
11
21
Penicilina G
2
21
Polimixina B
9
21
Sisomicina
11
21
Vancomicina
8
10
NR: No requerido
Tabla 0100.7. Capa siembra y condiciones de incubacin

Volumen
Condiciones de
Antibitico
Medio
(mL)
incubacin (C)
8
29 - 31
Nafcilina
1
4
32 - 35
Neomicina(1)
11
6
32 - 35
Nistatina
19
4
36 37.5
Novobiocina
1
4
32 - 35
Paromomicina
11
4
36 37.5
Penicilina G
1
4
36 37.5
Polimixina B
10
4
36 37.5
Sisomicina
11
4
32 - 35
Vancomicina
8
4
36 37.5

7
Volumen
(mL)
4
4
8
4
4
4
4
4
4
Condiciones de
incubacin (C)
32 - 35
36 37.5
29 - 31
34 - 36
36 37.5
32 - 35
36 37.5
36 37.5
36 37.5
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col. Cuauhtmoc
Mxico D. F., Mxico.
Clculos. Para calcular la actividad utilizar un mtodo

estadstico apropiado, (consultar el captulo de Estadstica
para ensayos biolgicos) comnmente se utiliza un
procedimiento analtico basado en la interpolacin de una
recta patrn obtenido por transformacin logartmica y
ajustada por cuadrados mnimos.
Deben ser considerados tres conceptos esenciales al
interpretar los resultados de potencia del antibitico.
1. Las relaciones biolgicas de dosis - respuesta por lo general
no son lineales. El mtodo de potencia de antibiticos
permite ajustar los datos a una lnea recta, evaluando un
intervalo de concentracin estrecho en el que los resultados
se acercan a la linealidad. Los resultados de la valoracin se
consideran validos nicamente si la potencia calculada es
80% - 125% de la potencia asumida al preparar la solucin
madre de la muestra. Cuando la potencia calculada se
encuentra fuera de dicho intervalo se debe ajustar la potencia
asumida de la muestra segn corresponda y repetir la
valoracin para obtener un resultado vlido.
2. La manera ms efectiva para reducir la variabilidad del valor
de informe (media geomtrica de la potencia de todos los
ensayos y duplicados) son los ensayos independientes del
proceso de valoracin. Una serie de valoraciones
independientes pequeas realizada a lo largo de varios das
genera resultados que al ser combinados son una estimacin
de potencia ms confiables que la obtenida de una sola
valoracin grande con la misma cantidad de placas. Son
necesarias tres o ms valoraciones independientes para la
determinacin de potencia de antibiticos.
3. El nmero de valoraciones requeridas para obtener una
estimacin confiable de potencia de antibiticos depende del
intervalo de especificacin requerido y la variabilidad de la
valoracin.
El clculo del lmite de confianza (descrito ms adelante) se
determina a partir de logaritmos de las potencias que son
aproximadamente iguales en precisin. Si el valor calculado
para la amplitud del intervalo de confianza W es demasiado

amplio, no ser posible tomar una decisin til con respecto
a si la potencia cumple con su especificacin.
Cada laboratorio debe establecer en los procedimientos
operativos de forma inicial el valor mximo aceptable para
la amplitud del intervalo de confianza. El valor mximo se
debe determinar durante el desarrollo y confirmarse en la
validacin o aplicabilidad.
Si el intervalo de confianza calculado excede este lmite, el
analista debe realizar determinaciones de potencias
adicionales para cumplir con el requisito del lmite.
Se debe tomar en cuenta que la decisin de realizar
determinaciones adicionales no depende de la potencia
estimada, sino nicamente de la incertidumbre en dicha
estimacin, segn lo determina la amplitud del intervalo de
confianza.
La variabilidad de la valoracin tiene un impacto mayor en el
lmite de confianza calculado que el nmero de
determinaciones de potencia independientes. Por lo que se
debe considerar reducir la variabilidad en la medida de lo
posible antes de realizar determinaciones de potencia.
Valoracin cilindro placa. Se describe el anlisis de los
valores obtenidos para determinar la potencia en la muestra.
Datos de muestra. Para ejemplificar el clculo de potencia
usaremos los resultados de la valoracin que se muestra en la
Tabla 0100.8.
Paso 1. Considerando que se tienen nueve datos de cada suma
de las diluciones del SRef (a, b, d, e) y nueve de la muestra
(m). En el caso de la concentracin central (c) se cuenta con
36 valores. En todos los casos se debe determinar el promedio
(X), desviacin estndar () y coeficiente de variacin (CV).
Ejemplo: Para la dilucin de la SRef a:

Xa= (12.6+13.0+12.8+13.0+12.8+12.6+12.0+13.8+12.8)/9 = 12.82
a = [ (12.6-12.82)2+(13.0-12.82)2+(12.8-12.82)2+(13.0-12.82)2+(12.8-12.82)2+(12.6-12.82)2+(12.0-12.82)2+(13.8-12.82)2+(12.8-12.82)2] / 9 = 0.47
CVa = (0.47/ 12.82) X 100 = 3.7 %.
Para el criterio de aptitud de variabilidad, cada laboratorio

debe determinar un valor mximo aceptable para el coeficiente
de variacin. Si alguno de los ocho valores del coeficiente de
variacin (cuatro para la SRef (c) y cuatro de las otras
diluciones SRef a,b, d y e ) sobrepasan este mximo
predeterminado, los datos de la valoracin no son adecuados y
+52 55 5207 8187

+52 55 5207 6887
deben desecharse. [El lmite sugerido para el coeficiente de

variacin (CV) es, no ms de 10%].

8
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Mxico D. F., Mxico.
Soluciones
(ca)
a
(cb)
b
(cd)
d
(ce)
e
Conc
(g/mL)
1
0.64
1
0.8
1
1.25
1
1.56
14.44
12.82
14.53
13.69
14.8
15.29
14.44
15.87
0.24
0.47
0.54
0.32
0.55
0.33
0.34
0.51
CV
1.7
3.7
3.7
2.3
3.7
2.2
2.4
3.2
Paso 2. Realizar una correccin de variacin de los valores de

halos de inhibicin de la curva tipo del SRef.
La correccin es aplicada para convertir la medicin de zona
promedio obtenida para cada concentracin al valor que se
obtendra si la medicin de la concentracin de referencia
promedio para dicho conjunto de tres placas repetidas fuera la
misma que el valor del punto de correccin (C36 ).
[Dil. SRef corregida] (a, b, d, e) = a,b,d,e - ( Ca,b,d,e c36)
Donde:
[Dil. SRef corregida]: Valor de la dilucin de la solucin de
referencia corregida (a, b, d, e).
a,b,d,e : Media original de a,b,d,e.
Ca,b,d,e : Media de la concentracin c en cada una de las
diluciones (ca, cb, cd, ce)
C36: Promedio de los 36 valores obtenidos de c en la valoracin
Ejemplo: Para el primer conjunto de tres placas en la solucin

de referencia (a), la correccin es la siguiente:
a =
14.17 - ( 15.72
- 15.87 )
=
14.022
Paso 3: Determinar la lnea recta de la curva tipo
Generar la lnea de la curva tipo graficando las mediciones
corregidas de la zona de inhibicin en funcin del logaritmo
de los valores de la concentracin de la SRef. Calcular la
ecuacin de la lnea de la curva tipo, realizando una regresin
lineal no ponderada estndar sobre estos valores, usando un
software apropiado o las indicaciones del captulo de
Estadstica para ensayos biolgicos.
Nota: Usar el logaritmo natural o el logaritmo en base 10 para
graficar la curva tipo y determinar la ecuacin de regresin;
ambos proporcionan el mismo resultado de prueba final.
Cada laboratorio debe determinar un valor mnimo del
coeficiente de determinacin (%R2) para una regresin
aceptable, esto ocurre solo si el %R2 obtenido excede el valor
predeterminado. La regresin es aceptable solo si el %R2
obtenido excede el valor predeterminado
[El lmite sugerido para el coeficiente porcentual de
determinacin es no menos de 95%]
Paso1. Determinar X, y CV, en la curva tipo de la SRef y en la muestra

Tabla No. 0100.8 Ejemplificacin de (Valoracin Cilindro Placa)
Curva tipo de la SRef
Soluciones
(ca)
Conc (g/mL)
1.00
14.44
0.24
CV
1.7
12.8
12.82
0.47
3.7
14.8
15.2
14.53
0.54
3.7
13.6
14.0
13.69
0.32
2.3
14.8 14.2 15.2
15.0
14.0
14.80
0.55
3.7
15.8 15.6 15.4
15.4 14.8 15.2
14.8
15.4
15.29
0.33
2.2
14.6
14.6 15.0 14.0
14.8 14.0 14.4
14.2
14.4
14.44
0.34
2.4
16.2
16.4 15.6 16.0
15.4 15.6 16.6
16.0
15.0
15.87
0.51
3.2
C36 14.56
0.168
1.2
Placa 1 (mm)
Placa 2 (mm)
Placa 3(mm)
14.2 14.8 14.4 14.8 14.2 14.4 14.2 14.6 14.4
0.64
12.6
13.0 12.8 13.0
12.8 12.6 12.0
13.8
(cb)
1.00
14.4
14.6 14.8 14.8
14.0 14.8 13.4
0.80
13.8
13.8 14.2 13.2
13.4 13.8 13.4
(cd)
1.00
15.6
15.2 15.0 14.2
1.25
15.2
(ce)
1.00
1.56
Soluciones
(cm)
m
Placa 1 (mm)
14.4
14.6
14.9
14.8
14.4
14.3
X: Promedio
+52 55 5207 8187

+52 55 5207 6887
Muestra
Placa 2 (mm)
14.9
14.3
14.7
14.2
14.8
14.1
: Desviacin estndar
Placa 3 (mm)
14.8
14.2
14.0
14.8
14.5
14.1
14.53
14.44
0.32
0.30
CV
2.23
2.05
CV: Coeficiente de variacin

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Paso 2. Efectuar la correccin de los halos de inhibicin de la curva tipo de la SRef y de la muestra.
Correccin de los halos de inhibicin de la SRef (mm)
a
b
d
e
=
=
=
=
12.82
13.69
15.29
15.87
(
(
(
(
14.44
14.53
14.80
14.44
14.56
14.56
14.56
14.56
)
)
)
)
=
=
=
=
12.93
13.71
15.04
15.98
m=
14.44
14.533
14.56
) =
14.47
Paso 3. Considerando la concentracin terica de cada una de las diluciones determinar con ayuda de un software la ecuacin
de la recta y el porcentaje de coeficiente de determinacin (%R2); donde el eje de las abscisas corresponde a la zona de
inhibicin y el eje de las ordenadas al logaritmo de la concentracin de las diluciones del SRef (a,b,c,d,e).
Valoracin Microbiolgica Antibitico
17.0
Halo de inhibicin (mm)
16.0
15.0
14.0
12.0
%R =
Log Dosis (g/ mL)
11.0
-0.25
2
y = 7.6695x + 14.446
R = 0.9935
13.0
-0.2
-0.15
99.3
Despeje de la ecuacin:
-0.1
-0.05
Pendiente (b) =
7.6695
Tabla 0100.9 Datos para calcular la ecuacin de la recta.

Zona de
Curva tipo
Concentracin
inhibicin
de la SRef
(g / mL)
Corregida (mm)
12.93
0.64
a
13.71
0.80
b
14.56
1.00
c
15.04
1.25
d
15.98
1.56
e
Resultados de la regresin lineal
Lnea de la curva tipo:
y= Medicin de zona corregida

x= Concentracin
%R2= 99.3
+52 55 5207 8187
+52 55 5207 6887
0.1
0.15
Ordenada al origen (a)=
0.2
0.25
14.446
( x ) = Antilog [(y -14.446)/7.6695
Ejemplo: La Tabla 0100.9. Resume la porcin de la Tabla

0.100.8 requerida para esta parte del clculo.
y = [7.6695 x log (x)] + 14.446
0.05
Determinacin de potencia de la muestra: Para estimar la

potencia de la muestra desconocida, promediar las mediciones
de la zona de la sustancia de referencia y las mediciones de la
zona de la muestra en las tres placas usadas. Corregir por
variacin entre placas, usando el punto de correccin
determinado anteriormente para obtener un promedio
corregido para la muestra desconocida m.
Nota: un mtodo alternativo aceptable al uso del punto de
correccin consiste en corregir usando el valor en la lnea de
regresin estimada correspondiente al logaritmo de la
concentracin de c.
Usar la medicin de zona promedio corregida en la ecuacin
de la lnea de la curva tipo para determinar el logaritmo de la
concentracin de la muestra, log(m), mediante:
log(m) = (m a ) / b
log(m) =Logaritmo de la concentracin de la muestra.
m = Muestra desconocida.
a = Ordenada al origen (Interseccin de la lnea de
regresin).
b = Pendiente de la lnea de regresin.

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col. Cuauhtmoc
Mxico D. F., Mxico.
Para obtener la potencia de la muestra desconocida, tomar el

antilogaritmo de log(m) y multiplicar el resultado por
cualquier factor de dilucin aplicable. Este valor tambin se
puede expresar como porcentaje del valor de la concentracin
de referencia.
Ejemplo: Medicin corregida de la zona de la muestra (Tabla
0.100.8)
mcorregida = 14.44 (14.53 14.56) = 14.47= m
Logaritmo en base 10 de la concentracin de la muestra:
log(m)= (14.47 14.446) / 7.6695 = 0.003129
Concentracin de la muestra: Antilog log(m)
= Antilog 0.003129
=1.007
Porcentaje de concentracin de referencia:
Resultado = 1.007/1.00 = 100.7%
MTODO TURBIDIMTRICO
Control de temperatura. Usar un equipo calificado y
calibrado de manera apropiada para obtener los mrgenes de
temperatura especificados en la Tabla 0100.11. El control de
temperatura se puede lograr con circulacin de aire o agua. La
mayor capacidad trmica del agua representa cierta ventaja
sobre el aire circulante.
Espectrofotmetro. La medicin de la absorbancia o
transmitancia dentro de una banda de frecuencia muy estrecha
requiere un espectrofotmetro adecuado en el que se pueda
variar o restringir la longitud de onda usando filtros de 580 nm
o 530 nm. Como alternativa, se puede usar un
espectrofotmetro con longitud de onda variable y ajustar a
una longitud de onda de 580 nm o 530 nm.
Ajustar automticamente el instrumento a cero con el medio
de cultivo no inoculado, preparado segn las indicaciones de
cada antibitico, conteniendo la misma cantidad de dilucin de
prueba (incluyendo formaldehdo, si se indica) que se
encuentra en cada muestra.
Durante la preparacin del inculo se puede medir tanto
absorbancia como transmitancia.
En el espectrofotmetro usar celdas o tubos idnticos exentos
de defectos y ralladura. Las celdas y tubos utilizados en la
prueba deben lavarse minuciosamente para eliminar los
residuos de antibitico y restos de soluciones de limpieza.
Utilizando ciclos validados, esterilizar los tubos antes de usar.
Preparacin de las diluciones de la SRef. Para cada sustancia
de referencia consultar las condiciones de secado en la
etiqueta. Para cada antibitico enlistado en la Tabla 0100.10
seleccionar, disolvente, diluyentes y concentracin madre de
la sustancia de referencia.
+52 55 5207 8187

+52 55 5207 6887
Considerando la concentracin central (c) indicada en la

misma tabla y utilizando el factor de dilucin 1:1.25, preparar
las cinco concentraciones de la curva, dos por debajo (a),
(b) y dos por arriba (d), (e) de la concentracin media.
Preparacin de la muestra. Asignar una potencia por unidad
de peso o volumen a la muestra desconocida, el da de la
valoracin preparar una solucin madre de la misma forma que
se indica para la solucin de referencia Tabla 0100.10. Diluir
la solucin madre de la muestra en el diluyente final
especificado hasta llegar a la concentracin central de la
Solucin de referencia, segn se indica en la Tabla 0100.10.
Inculo. A partir de un cultivo reciente suspender en 3 mL de
solucin salina estril, para facilitar la suspensin del
microorganismo de prueba usar perlas de vidrio estriles.
Enterococcus hirae (ATCC 10541) y Staphylococcus aureus
(ATCC 9144) se cultivan en medio lquido no en agar.
Esparcir la suspensin del organismo de prueba sobre la
superficie de dos o ms placas de agar o sobre la superficie de
una botella de Roux que contenga 250 mL del medio indicado
(ver Tabla 0100.11). Incubar durante el tiempo y a la
temperatura especificada en la Tabla 0100.11 hasta que el
crecimiento sea evidente.
Despus de incubar, recolectar el microorganismo de las
placas o de la botella de Roux con aproximadamente 50 mL de
solucin salina estril, usando una varilla de vidrio estril
doblada en ngulo recto o perlas de vidrio estriles. Con pipeta
estril transferir la suspensin a un frasco de vidrio estril. Esta
es la suspensin de recoleccin.
Durante la verificacin del mtodo utilizando el volumen
sugerido en la Tabla 0100.11, determinar el volumen de
suspensin de recoleccin que se usar como inculo.
Preparar un tubo extra con la concentracin (c), que servir
como prueba de crecimiento.
Incubar las pruebas durante los tiempos y temperatura
indicados en la Tabla 0100.12.
Si es necesario ajustar la cantidad de inculo a diario para
obtener una relacin dosis- respuesta.
Concluidos los periodos de incubacin especificados, los
tubos que contienen la concentracin central de la solucin de
referencia (c) deben presentar valores de absorbancia
especificados en la Tabla 0100.13. Determinar la duracin
exacta de la incubacin observando el crecimiento en la
concentracin central (c) de la solucin de referencia.
Procedimiento para la prueba. Para cada antibitico
enlistado en la Tabla 0100.11, seleccionar el microorganismo
de prueba, medio de cultivo, volumen de inculo sugerido para
cada 100 mL de medio de cultivo.
Para la curva dosis respuesta usar 15 tubos (cinco series de tres
tubos cada una) y para la muestra usar tres tubos.
A cada serie de tres tubos adicionar 1.0 mL (o 0.1 mL en el
caso de la gramicidina, tioestreptn y tilosina) de cada
concentracin de la curva dosis respuesta y en el caso de la
muestra, adicionar a cada uno de los tres tubos 1.0 mL de la

11
Ro Rhin 57
col. Cuauhtmoc
Mxico D. F., Mxico.
concentracin media. Incluir de manera similar en cada

gradilla uno o dos tubos control que contengan 1 mL del
diluyente de prueba, pero no antibitico.
Adicionar a cada serie de tres tubos (curva dosis respuesta,
muestra y control) 9.0 mL del medio de cultivo inoculado y
colocar de inmediato en bao de agua con agitacin continua
a la temperatura indicada en la Tabla 0100.11, excepto en el
caso de candicidina incubar a una temperatura de 27C a 29C.
El tiempo de incubacin se detiene cuando en los tubos que
contienen la concentracin central (c) de la SRef se observa
una turbiedad cercana al 50 por ciento de transmitancia o 0.3
absorbancia (de 2 h a 5 h).
Retirar los tubos del bao y adicionar inmediatamente a cada

uno 0.5 mL de una solucin de formaldehdo 1:3. En el caso
de tilosina calentar la gradilla que contiene los tubos en un
bao de agua a una temperatura de 80C - 90C durante 2 a 6
min, o en un bao de vapor durante 5 a 10 min. Llevar la
gradilla a temperatura ambiente. Ajustar el espectrofotmetro
a 100 por ciento de transmitancia con un blanco que contiene
medio de cultivo sin inocular y 0.5 mL de solucin de
formaldehdo a la concentracin indicada. Leer la
transmitancia de cada tubo a una longitud de onda de 530 nm
a 580 nm y promediar los valores obtenidos. Analizar una
gradilla cada vez.
Tabla 0100.10. Preparacin de la solucin madre y diluciones de prueba de la SRef (Mtodo Turbidimtrico) b
Solucin madre
Dilucin de prueba
Disolvente inicial, (y
concentracin inicial donde
se especifique) diluyente
posterior si es diferente
Conc. final
de la
solucin
madre
Duracin en
refrigeracin
Diluyente
final
Amikacina
Candicidina
Capreomicina
Cloranfenicol
Clortetraciclina
Cicloserina
Demeclociclina
Doxiciclina
Estreptomicina
Agua
Dimetil sulfxido
Agua
Alcohol (10 mg/mL); [Agua]
Agua
Agua
Agua
1 mg
1 mg
1 mg
1 mg
1 mg
1 mg
1 mg
1 mg
1 mg
1 mg
14 das
Mismo da
7 das
30 das
4 das
30 das
4 das
30 das
5 das
30 das
Gramicidina
Alcohol 95%
1 mg
30 das
Kanamicina
Metaciclina
Neomicina d
Oxitetraciclina
Rolitetraciclina
Tetraciclina
Tiostreptn Tioestreptona
o tioestreptomicina
Agua
Agua
B. 3c
Agua
1 mg
1 mg
100 g
1 mg
1 mg
1 mg
30 das
7 das
14 das
4 das
1 da
1 da
Dimetil sulfxido
1U
Mismo da
Agua
Agua
Agua
Agua
Agua
Agua
Agua
Agua
Agua
Agua
Alcohol
95%
Agua
Agua
B. 3c
Agua
Agua
Agua
Dimetil
sulfxido
Antibitico
Conc.
Central (c)
(unidades o
g/mL) a
10 g
0.06 g
100 g
2.5 g
0.06 g
50 g
0.1 g
30 g
0.1 g
30 g
0.04 g
10 g
0.06 g
1.0 g
0.24 g
0.24 g
0.24 g
0.80 U
Microgramos (g) en esta columna se refiere a microgramos de actividad.

Se puede usar la valoracin en cilindro placa como un procedimiento alternativo.
c
La letra B se refiere a la solucin amortiguadora. Ver Medios y Soluciones, Soluciones amortiguadoras para una descripcin de cada solucin amortiguadora
listada en esta tabla.
d
Diluir la solucin madre de 100 g/mL con Solucin amortiguadora B.3 para obtener una solucin con una concentracin equivalente a 25 g/mL de
Neomicina. Agregar 1.39; 1.67; 2.00; 2.40 y 2.88mL de esta solucin a sendos matraces volumtricos de 50 mL. Agregar 5.0 mL de cido clorhdrico 0,01 N
a cada matraz, diluir con Solucin amortiguadora B.3 a volumen y mezclar para obtener soluciones con concentraciones de 0.69; 0.83; 1.0; 1.2 y 1.44 g/mL
de neomicina. Usar estas soluciones para preparar la curva tipo de la sustancia de referencia.
b
+52 55 5207 8187

+52 55 5207 6887

12
Ro Rhin 57
col. Cuauhtmoc
Mxico D. F., Mxico.
Tabla 0100. 11 Microorganismo de prueba para Valoracin Turbidimtrica

Composicin sugerida del
Inculo
Condiciones de Incubacin
Antibitico
Organismo de prueba
Nmero de
ATCC
Medio
Temperatura
(C)
Capreomicina
Klebsiella pneumoniae
10031
36 37.5
16 - 24
0.05
Cloranfenicol
Escherichia coli
10536
32 - 35
24
0.7
Tiempo (h) Medio
Cantidad
(mL/100 mL)
Candicidina
9763
19
29 -31
48
13
0.2
Clortetraciclina
29737
32 - 35
24
0.1
10031
36 37.5
16 - 24
0.1
Gramicidina
Enterococcus hirae
10541
36 37.5
16 - 18
1.0
Neomicina
10031
36 37.5
16 - 24
39
2.0
Oxitetraciclina
29737
32 - 35
24
0.1
Tetraciclina
29737
32 - 35
24
0.1
Tioestreptona
Enterococcus hirae
10541
40
36 37.5
18 - 24
41
0.2
Troleandomicina
10031
36 37.5
16 - 24
0.1
Tilosina
9144
35 - 39
16 - 18
39
2-3
American Type Culture Collection
Ver Medios y soluciones.
Tabla 0100.12 Incubacin de la prueba

Antibitico
Tiempo de incubacin (h)
Oxitetraciclina
4-5
Tetraciclina
4-5
Tioestreptona
4-5
Troleandomicina
3-4
Tilosina
3-5
Clortetraciclina
4-5
3-4
Gramicidina
4-5
Neomicina
4-5
Capreomicina
3-4
Cloranfenicol
3-4
Tabla 0100. 13 Valores de transmitancia para detener el
crecimiento
Antibitico
%Transmitancia
Capreomicina
Gramicidina
Neomicina
Oxitetraciclina
Tetraciclina
Tioestreptona
Troleandomicina
Tilosina
Cloranfenicol
Clortetraciclina
40
45
50
50
45
50
50
50
50
45
+52 55 5207 8187

+52 55 5207 6887
50
Clculo.
Datos de la muestra. La tabla 0.100.14 presenta los datos de
una valoracin que se usarn como ejemplo a lo largo de esta
seccin.
Paso 1. Realizar los clculos iniciales y la verificacin de la
aptitud de variabilidad. Para cada concentracin (incluyendo
la muestra), promediar los tres valores de absorbancia.
Ejemplo: Ver a en la Tabla 0100.14
0.8612 = X (0.8650, 0.8540, 0.8450)
Para cada concentracin, determinar la desviacin estndar
de las tres lecturas y una desviacin estndar combinada de
las concentraciones.
Ejemplo: Ver ( a ) en la Tabla 0100.14
31.486 =
( 30.989,
31.679,
31.789 )
El valor combinado se calcula tomando la raz cuadrada del

promedio de las cinco varianzas:
[(0.434)2 + (2.698)2 + (1.144)2 + (1.210)2 + (1.087)2 / 5]1/2= 1.5115

13
Ro Rhin 57
col. Cuauhtmoc
Mxico D. F., Mxico.
Tabla 0100. 14. Datos de la Muestra (Valoracin Turbidimtrica)

Solucin de
referencia
a
b
c
d
e
m
Concentracin (g/mL)
% Transmitancia
Prom (%T)
64
30.989
31.679
31.789
31.486
0.434
80
40.543
43.654
45.917
43.371
2.698
100
51.897
53.897
51.935
52.576
1.144
125
62.875
63.264
61.001
62.380
1.210
156
71.890
70.167
69.879
70.645
1.087
Desconocida
50.568
51.487
49.768
50.608
0.860
Valoracin Microbiolgica Antibitico

%Transmitancia (%T)
80.0
70.0
60.0
50.0
y = 43.682x - 149.06
R = 0.9962
40.0
30.0
20.0
10.0
Ln Dosis (g/mL)
0.0
4.000
%R2 =
4.500
99.6
Pendiente
5.000
43.682
Para el criterio de aptitud de variabilidad, se debe determinar

una desviacin estndar combinada mxima aceptable. Si la
desviacin estndar excede este mximo predeterminado, los
datos de valoracin no son adecuados y se deben descartar.
Nota: el lmite sugerido para desviacin estndar combinada
es no ms de 10% del valor de absorbancia promedio a travs
de las cinco concentraciones. Si el nmero de determinaciones
repetidas por concentracin es al menos cinco, entonces se
puede calcular el coeficiente de variacin para cada
concentracin despus de verificar valores atpicos y comparar
con un coeficiente de variacin mximo aceptable.
Nota: El lmite sugerido para el coeficiente de variacin es no
ms de 10%.
Paso 2: Determinar la lnea de la curva tipo.
Generar la lnea de la curva tipo, graficando los valores de
absorbancia promedio en funcin del logaritmo de los valores
de concentracin de la SRef. Calcular la ecuacin de la lnea
de la curva tipo, realizando una regresin lineal no ponderada
+52 55 5207 8187
+52 55 5207 6887
Ordenada al origen
5.500
-149.06
sobre estos valores usando software apropiado o las

indicaciones del captulo de Estadstica para ensayos
biolgicos.
Nota: Usar el logaritmo natural o el logaritmo en base 10 para
graficar la curva tipo y determinar la ecuacin de regresin;
ambos proporcionan el mismo resultado de prueba final. Se
debe determinar un valor mnimo del coeficiente porcentual de
determinacin (%R2) para una regresin aceptable. La
regresin es aceptable nicamente si el valor %R2 obtenido
excede este valor predeterminado.
Nota: El lmite sugerido para el coeficiente porcentual de
determinacin es no menos de 90%.
Ejemplo: La tabla 0100.13 resume la porcin de la tabla
0100.12 requerida para esta parte del clculo.
Tabla 0100.13 Valores para obtener la lnea de la recta.

14
Ro Rhin 57
col. Cuauhtmoc
Mxico D. F., Mxico.
Curva tipo
a
b
c
d
e
Valores Promedio de
%Transmitancia (%T)
Concentracin
(g/mL)
31.486
43.371
52.576
62.380
70.645
64
80
100
125
156
Resultados de la regresin lineal

Lnea de la curva tipo de la SRef
Transmitancia = 149.06 [43.682 x Ln concentracin]
%R2 = 99.6%
Determinacin de la potencia de la muestra: Para estimar la
potencia de la muestra desconocida, promediar las tres
mediciones de absorbancia para obtener un promedio para la
muestra desconocida, m. Usar esta medicin promedio en la
ecuacin de la lnea de la curva tipo para determinar el
logaritmo natural de la concentracin de la muestra
desconocida, Lm mediante:
Lm = (m - a) / b
a = Interseccin de la lnea de regresin.
b = Pendiente de la lnea de regresin.
Para obtener la potencia de la muestra desconocida, tomar el
exponente y multiplicar el resultado por cualquier factor de
dilucin aplicable. Este valor tambin se puede expresar como
porcentaje del valor de la concentracin de referencia.
Ejemplo: % Transmitancia promedio de la muestra (tabla
0100.13) = 50.608
Cm = (50.608 43.682) / (-149.06) = -0.04646
-0.04646 = 0.9545
Cm = Concentracin de la muestra.
Porcentaje de concentracin de referencia = (0.9545 / 1.00) x
100% = 95.11%
Lmites de confianza y combinacin de los clculos de las
valoraciones. Debido a la variabilidad de la potencia de la
muestra para cada determinacin independiente, comenzar con
soluciones madres y diluciones de prueba tanto de la SRef
como de la muestra, preparadas por separado, y repetir la
valoracin de una muestra determinada otro da.
Para verificar valores atpicos, utilizar el procedimiento
indicado en el captulo de Estadstica para ensayos
biolgicos.
Para obtener una estimacin combinada de la potencia
desconocida, calcular el promedio, M, y la desviacin estndar
de los logaritmos de las potencias aceptadas.
Nota: usar el logaritmo natural o el logaritmo en base 10.
Determinar el intervalo de confianza para la potencia, segn se
indica a continuacin:
+52 55 5207 8187

+52 55 5207 6887
Antilog [M t(0.05, N 1) x /N], antilog[M + t(0.05, N

1) x /N]
M= Promedio
= Desviacin estndar
N= Nmero de valoraciones.
T (0.05, N-1) = el punto del 5% de dos colas de una
distribucin t de Student con N-1 grados de libertad.
Nota: El valor t est disponible en hojas de clculo, textos
estadsticos y software estadstico.
W = antilog{[t(0.05, N 1) x /N]}
W = Mitad de la amplitud del intervalo de confianza.
Comparar la mitad de la amplitud del intervalo de confianza
con un valor mximo predeterminado aceptable. Si la mitad de
la amplitud es mayor que el lmite de aceptacin, continuar con
valoraciones adicionales.
Ejemplo: Suponer que la muestra se valora cuatro veces, con
resultados de potencia en la escala logartmica natural de
1.561; 1.444; 1.517; 1.535. Entonces:
N=4
M = X (1.561; 1.444; 1.517; 1.535) = 1.514
(1.561, 1.444, 1.517. 1.535) = 0.050
t = 3.182
El intervalo de confianza en la escala logartmica es
1.514 (3.182 x 0.050/4) = (1.434, 1.594)
Tomando antilogaritmo, la potencia estimada es
e1.514 = 4.546
con un intervalo de confianza de 95% para la potencia de e1.514,
e1.594 = (4.197; 4.924)
La mitad de la amplitud del intervalo de confianza para
comparar con un valor de aceptacin es el cociente 4.924/4.46
= 1.083.

15
Ro Rhin 57
col. Cuauhtmoc
Mxico D. F., Mxico.

Valoracion Microbiologica de Antibioticos

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Con fundamento en el numeral 4.11.1 de la Norma Oficial

MGA 0100. VALORACIN

Tabla 0100.1 Antibiticos que requieren

CONSULTA A USUARIOS DE LA FEUM 2015-3

como las citadas a continuacin los microgramos de actividad

para obtener colonias aisladas. Incubar los cultivos de trabajo

1. Cuando el antibitico se presenta como la base libre y en

Crecimiento o desempeo no caracterstico de un

2. Cuando el antibitico consta de un nmero de

Microorganismo de prueba. El microorganismo de

CONSULTA A USUARIOS DE LA FEUM 2015-3

Espectrofotmetro a una longitud de onda a 530 nm o

Soluciones amortiguadoras de fosfato y otras soluciones

Tabla 0100.2. Soluciones amortiguadoras

Ingredientes gramo por litro

Tabla 0100.3. Medios de cultivo.

Utilizar peptona de carne o casena.

+52 55 5207 8187

CONSULTA A USUARIOS DE LA FEUM 2015-3

+52 55 5207 8187

preliminar si el valor de potencia de la muestra calculado es

CONSULTA A USUARIOS DE LA FEUM 2015-3

y usar dentro del periodo de almacenamiento indicado en la

+52 55 5207 8187

Nota: los tamaos de las zonas de inhibicin fuera del

CONSULTA A USUARIOS DE LA FEUM 2015-3

*Anteriormente: Micrococcus luteus

+52 55 5207 8187

CONSULTA A USUARIOS DE LA FEUM 2015-3

+52 55 5207 8187

Tabla 0100.6. Capa base

Tabla 0100.7. Capa siembra y condiciones de incubacin

CONSULTA A USUARIOS DE LA FEUM 2015-3

Clculos. Para calcular la actividad utilizar un mtodo

para la amplitud del intervalo de confianza W es demasiado

Ejemplo: Para la dilucin de la SRef a:

Para el criterio de aptitud de variabilidad, cada laboratorio

+52 55 5207 8187

deben desecharse. [El lmite sugerido para el coeficiente de

CONSULTA A USUARIOS DE LA FEUM 2015-3

Paso 2. Realizar una correccin de variacin de los valores de

Ejemplo: Para el primer conjunto de tres placas en la solucin

Paso1. Determinar X, y CV, en la curva tipo de la SRef y en la muestra

14.8 14.2 15.2

15.8 15.6 15.4

15.4 14.8 15.2

14.6 15.0 14.0

14.8 14.0 14.4

16.4 15.6 16.0

15.4 15.6 16.6

13.0 12.8 13.0

12.8 12.6 12.0

14.6 14.8 14.8

14.0 14.8 13.4

13.8 14.2 13.2

13.4 13.8 13.4

15.2 15.0 14.2

+52 55 5207 8187

CV: Coeficiente de variacin

CONSULTA A USUARIOS DE LA FEUM 2015-3

Halo de inhibicin (mm)

Log Dosis (g/ mL)

Tabla 0100.9 Datos para calcular la ecuacin de la recta.