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DISEO Y ELABORACIN DE UNA GUA PRELIMINAR

PARA LA VALIDACIN DE MTODOS MICROBIOLGICOS ESTNDAR

MARA ANDREA ORDOEZ PARRA


DIANA MARCELA ROJAS SALAZAR

Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al ttulo de

MICROBILOGAS INDUSTRIALES

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA


FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA
Bogot, D. C. Noviembre de 2007

NOTA DE ADVERTENCIA

Artculo 23 de la resolucin No. 13 de julio de 1946

La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus


alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar porque no se publique nada
contrario al dogma y la moral catlica y porque la tesis no contenga ataques
personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo por
buscar verdad y justicia.

DISEO Y ELABORACIN DE UNA GUA PARA LA VALIDACIN


DE MTODOS MICROBIOLGICOS ESTANDAR

MARA ANDREA ORDOEZ PARRA


DIANA MARCELA ROJAS SALAZAR

APROBADO

_____________________

_____________________

Dra. LORENA VALENCIA

Dr. SAUL PEARANDA

Directora

Codirector

_____________________

_____________________

NADENKA MELO

ANDRES OTALORA

Jurado

Jurado

DISEO Y ELABORACIN DE UNA GUA PARA LA VALIDACIN


DE MTODOS MICROBIOLGICOS ESTANDAR

MARA ANDREA ORDOEZ PARRA


DIANA MARCELA ROJAS SALAZAR

APROBADO

_________________________

_____________________________

Dra ANGELA UMAA MUOZ,

Dra. JANETH ARIAS PALACIOS

M. Phil

Bacteriloga M.Sc-M Ed.

Decano Acadmico Facultad de Ciencias

Director Carreras de Microbiologa

A Dios por guiarme siempre por el mejor camino. A mi mam por ser mi mejor ejemplo de lucha y constancia. A mi
hermana por impulsarme a ser cada vez mejor. A toda mi familia por apoyarme en mis decisiones y estar conmigo
siempre que los necesito. A mis amigos por su incondicional apoyo. A todos mil Gracias.

Mara Andrea Ordez Parra

GRACIAS a Dios por ser mi luz y mi fuerza cada da y por permitirme culminar esta etapa junto a las personas
que ms amo. A mi mam por brindarme lo mejor de sus das. A mi pap por cuidarme en cada instante de mi vida. A
mi hermana por ensearme que la lucha constante nos hace grandes triunfadores. A mis hermanos porque son mi
alegra y mi compaa. Les quiero decir que son mi mayor motivo en la vida, lo ms importante e indispensable para
mi. A Sergio Muoz porque su amor me ha ayudado a superar los ms difciles obstculos. A mis amigos por crecer
conmigo y ensearme cada da cosas nuevas. A Maria Andrea por querer cumplir este gran logro junto a mi.
Dios los bendiga.

Diana Marcela Rojas Salazar

AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Lorena Valencia por todo su apoyo y dedicacin y por compartir todos sus
conocimientos para sacar este trabajo adelante.

Al Dr. Sal Pearanda por la paciencia y todo su aporte durante el desarrollo del
trabajo.

A todas las personas que de una u otra forma con su colaboracin y amistad
incondicional participaron de la elaboracin de este trabajo.

TABLA DE CONTENIDO

INTRODUCCIN
1. MARCO TEORICO

1.1 ANTECEDENTES

1.2 TIPOS DE VALIDACIN SEGN SU OBJETIVO

14

1.2.1 Validacin Primaria

14

1.2.2 Validacin Secundaria

15

1.3 PARAMETROS ANALTICOS PARA LA VALIDACIN DE


UNA TCNICA O MTODO

16

1.3.1 Selectividad

16

1.3.2 Especificidad

16

1.3.3 Calibrado y Linealidad

17

1.3.4 Precisin

17

1.3.5 Solidez y Robustez

18

1.3.6 Exactitud

19

1.3.7 Estabilidad

19

1.3.8 Limite de Deteccin

19

1.3.9 Lmite de Cuantificacin

20

1.3.10 Sensibilidad

20

1.4 MTODOS DE ENSAYO MICROBIOLGICOS

20

1.4.1 Mtodos de Ensayo Microbiolgicos Cualitativos

23

1.4.2 Mtodos de Ensayo Microbiolgicos Cuantitativos

24

1.5 MEDICIN Y ERRORES

25

1.6 MATERIAL DE REFERENCIA

26

1.6.1 Cultivos de Referencia

26

1.6.2 Cepas de Referencia

26

1.7 REPRESENTATIVIDAD Y CANTIDAD SUFICIENTE DE


MUESTRAS

27

1.7.1 Recuperacin del Analito

28

1.7.2 Material de Ensayo

29

1.7.3 Detectores

30

1.8 SISTEMAS DE GESTIN DE CALIDAD EN LABORATORIOS


DE ANLISIS MICROBIOLGICO

32

1.8.1 Aseguramiento de la Calidad de los Resultados/ Control de


Calidad

33

1.8.2 Acreditacin

36

2. FORMULACIN Y JUSTIFICACIN DEL PROBLEMA

38

2.1 FORMULACIN DEL PROBLEMA

38

2.2 JUSTIFICACIN

39

3. OBJETIVOS

41

3.1 OBJETIVO GENERAL

41

3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

41

4. MATERIALES Y MTODOS

42

4.1 TIPO DE INVESTIGACIN

42

4.2 POBLACIN ESTUDIO DE MUESTRA

42

4.3 RECOPILACIN Y REVISIN BIBLIOGRFICA

42

4.4 DOCUMENTACIN DE PARMETROS DE VALIDACIN PARA


MTODOS Y ENSAYOS EN MICROBIOLOGA ESTNDAR

43

4.5 DESPLIEGUE MODELO MATEMTICO PRELIMINAR PARA


VALIDACIN DE PRUEBAS MICROBIOLGICAS ESTNDAR

43

5. RESULTADOS Y DISCUSIN

45

5.1 REVISIN BIBLIOGRAFICA

45

5.2 MODELO MATEMTICO PRELIMINAR BSICO PARA LA


VALIDACIN DE MTODO MICROBIOLGICOS ESTNDAR

51

6. CONCLUSIONES

55

7. RECOMENDACIONES

56

8. REFERENCIAS

57

ANEXOS

ANEXO

1.

GUIA

PARA

LA

MICROBIOLGICOS ESTNDAR

VALIDACIN

DE

MTODOS

LISTA DE FIGURAS

FIGURA

TITULO

PAG

Estadsticas de la Red de Laboratorios

48

Esquema de Validacin de Mtodos Microbiolgicos

65

Procesamiento de la Muestra

77

LISTA DE TABLAS

TABLA

TITULO

PAG

Bibliografa para procesos de validacin en microbiologa


Estndar

45

Acreditaciones 2008-2012

47

Grupos de alimento analizados en el Laboratorio de


Salud Pblica, grupo de Vigilancia del Ambiente y del
Consumo, aos 1998 - 1999 2000 2001 2002

49

RESUMEN

El propsito de este trabajo es brindar una gua prctica sobre la validacin de


ensayos microbiolgicos estndar, ya que stos deben brindar certeza en los
resultados obtenidos, por lo que se hace necesaria la implementacin de mtodos que
al ser verificados y ajustados a ciertas condiciones generan confiabilidad y
competitividad.

Para llevar a cabo esta gua, se realiz una extensa revisin y recopilacin
bibliogrfica para obtener la mayor informacin posible sobre cmo validar tcnicas
microbiolgicas y poder abstraer un modelo preliminar de validacin de los ensayos
estndar que se realizan en microbiologa. A partir de la bsqueda, se inicio una
comparacin de toda la informacin obtenida para disear el protocolo. Despus de
la obtencin del esquema prctico que incluye desde la toma de la muestra (muestreo)
hasta el procesamiento de la misma, se procedi a la consulta y diseo de un modelo
estadstico preliminar para determinar parmetros y variables a tener en cuenta para
llevar a cabo una validacin.

Como resultado se obtuvo una gua en donde de forma clara, prctica y concisa se
orienta a la aplicacin de conceptos bsicos de la microbiologa estndar y
herramientas estadsticas para determinar variables preliminares para la validacin de
un ensayo estndar en microbiologa.

Gracias a la realizacin de ste preliminar, se pudo concluir que a pesar de la gran


cantidad de informacin que existe sobre el tema, ste no es fcil de abordar ni de
aplicar, por lo que se hace necesario la realizacin de ms estudios que permitan
explicar y desplegar de forma sencilla modelos matemticos completos que le
permitan al usuario determinar variables claves para la validacin de procesos
microbiolgicos.

INTRODUCCION

En el mundo actual donde el inters de los laboratorios de las diferentes reas de la


microbiologa es mantener controladas todas las variables que intervienen en sus
procesos, tienen particular importancia los procesos de validacin como una
herramienta til para asegurar la trazabilidad de cada una de las variables que se ve
reflejada en los resultados de las pruebas realizadas. Adicionalmente,

por

requerimientos de sus sistemas de calidad y para lograr el cumplimiento de los


requisitos derivados de las buenas prcticas de laboratorio; la validacin acta como
sistema de aseguramiento de la calidad mediante el cual se establecen evidencias
documentadas para demostrar que un proceso conduce a resultados de calidad
consistentes dentro de las especificaciones predeterminadas.

Sin embargo, la gran cantidad de documentacin y las pocas referencias de


investigacin sobre la validacin de tcnicas microbiolgicas, hacen difcil la
aplicacin y arduo el entendimiento de este tema en los diferentes procedimientos de
pruebas y ensayos.

En Colombia, programas como el INTERLABORATORIO y PICCAP, permiten a


travs de diferentes anlisis la estandarizacin de los procedimientos microbiolgicos
que se realizan en los diferentes laboratorios participantes, ms no se ejercen
mecanismos de vigilancia y control sobre los procedimientos de validacin, a pesar
que muchos laboratorios se encuentran en capacidad de validar sus mtodos para as
poder acreditarse. No obstante, el crecimiento en el sector industrial en Colombia,
hace que la demanda en cuanto a procedimientos con calidad aumente, y as mismo
deben aumentar los laboratorios acreditados que ofrezcan a partir de la validacin de
sus mtodos mejores resultados al cliente.

El propsito de este trabajo es inculcar la responsabilidad de los laboratorios con sus


rutinas de anlisis microbiolgicos y reducir la incertidumbre de las medidas

microbiolgicas, lo cual se traduce en la exactitud de los resultados emitidos y la


fiabilidad de sus pruebas.

Los laboratorios de anlisis tienen como principal objetivo reportar resultados


altamente confiables, por eso deben controlar y asegurar la calidad de sus resultados.
El mejoramiento de la calidad en el laboratorio consiste en implementar un programa
completo que vale el resultado final emitido por el laboratorio proporcionando
resultados tiles. Este mejoramiento, no solo incluye los conceptos ms tradicionales
de control de calidad, como el mejoramiento y la evaluacin externa de la calidad que
tiene como propsito mantener en cualquier proceso un rendimiento a niveles
aceptables segn los estndares, sino que tambin incluye el mejoramiento contino
de la calidad bajo el concepto de calidad total.

Con la elaboracin de la gua se espera de manera prctica y pedaggica facilitar la


comprensin del proceso de validacin en todas sus etapas analticas en los
procedimientos microbiolgicos estndar que se llevan a cabo dentro de los
laboratorios de pruebas y ensayos y de esta manera inculcar y difundir este tipo de
tareas en todas las reas del laboratorio.

1. MARCO TERICO

1.1 ANTECEDENTES

Se requieren mtodos analticos fiables para cumplir con las normativas nacionales e
internacionales en todas las reas de anlisis. Por lo tanto, est admitido
internacionalmente que un laboratorio deba tomar las medidas pertinentes para
asegurarse de que es capaz de producir, y de que lo hace efectivamente, datos con el
nivel necesario de calidad. Dichas medidas comprenden:

Utilizacin de mtodos de anlisis validados


Utilizacin de procedimientos internos de control de calidad
Participacin en ensayos de aptitud; y
Obtencin de la acreditacin segn una norma internacional, habitualmente
ISO/IEC 17025.

Cabe resaltar que la acreditacin ISO/IEC 17025 concierne especficamente el


establecimiento de la trazabilidad de las mediciones, al tiempo que fija un conjunto
de otros requisitos tcnicos y de gestin que incluyen todos los indicados
anteriormente. As, la validacin de mtodos es un componente esencial de las
medidas que un laboratorio debe implementar para producir datos analticos fiables.

Otros aspectos de lo anteriormente dicho han sido tratados por el Grupo de Trabajo
Interdivisional de la IUPAC sobre Armonizacin de Mtodos de Garanta de Calidad
para Laboratorios Analticos, en particular mediante la elaboracin de protocolos
sobre los estudios de rendimiento de los mtodos, ensayos de aptitud, y control
interno de calidad (OENO, 2005).

En los sistemas de calidad y en general en los sistemas de aseguramiento, lo que se


busca es que los laboratorios cumplan con los requerimientos mnimos necesarios
para asegurar que sus resultados ofrezcan confiabilidad y que las tcnicas y/o ensayos
utilizados sean realizados de manera correcta, hecho que minimiza totalmente las
posibilidades de error. Como consecuencia se obtienen procesos controlados que
conllevan a resultados con calidad. Esto indica que la organizacin, en este caso
puntual, los laboratorios de microbiologa trabajan con enfoques cientficos
reconocidos, de consenso general y que cualquier desviacin en estos puede ser
sustentada con fundamentos (validacin) considerados aceptables por los expertos en
el rea. Para llegar a obtener esos resultados confiables, debemos hablar de validacin
de pruebas y/o ensayos que permitan que esos resultados sean reales y fiables.
(http://www.ideam.gov.co/temas/calidad/Descripci%C3%B3n%20Gral.%20Norma%
20ISO-IEC%2017025.pdf)

Adems es importante que un laboratorio demuestre la capacidad para reproducir los


ensayos y/o pruebas que hace; ya que sta indica que si en un ensayo se obtuvieron
resultados objetivos, en los ensayos posteriores se obtendrn los mismos resultados
con desviaciones aceptadas y con las limitaciones que supone el uso de los mismos
procedimientos, equipos y personas involucradas en la ejecucin del ensayo. Y
Finalmente, se debe demostrar segn la ISO NTC 17025 la transparencia de sus
procesos; indicando que los resultados de los mismos estn abiertos a la inspeccin
interna y externa a fin de mitigar e identificar fcilmente los factores que podran
afectar de manera adversa la bsqueda de resultados objetivos basados en mtodos
cientficos. Con lo que se concluye que los procesos validados, son la fuente de
confianza para el que hace los anlisis microbiolgicos y para quien los solicita.
(http://www.ideam.gov.co/temas/calidad/Descripci%C3%B3n%20Gral.%20Norma%
20ISO-IEC%2017025.pdf)

La validacin es demostrar con un alto grado de confianza, por medio de evidencia


documentada que un proceso especfico producir de forma consistente y permanente

10

servicios que poseern las caractersticas de calidad predefinidas (WHO Technical


Report Series, No. 823, 1992).

Validar se refiere al conjunto de acciones que demuestran formalmente que un


sistema realiza lo que se supone debe hacer, de forma continuada y ajustada al
objetivo de anlisis. Al validar un mtodo se demuestra formalmente que el mismo
posee un determinado nivel de parmetros analticos bsicos: exactitud, precisin,
sensibilidad, intervalo lineal, selectividad y robustez (Useche, B).

En la validacin del mtodo en un solo laboratorio es de suma importancia tener en


cuenta el sesgo del mtodo y el sesgo del laboratorio. Existen unos pocos laboratorios
cuyas instalaciones permiten despreciar estos sesgos, pero se trata de casos
excepcionales (sin embargo, si un solo laboratorio realiza un anlisis particular, el
sesgo del mtodo y el sesgo del laboratorio adquieren una perspectiva distinta).
Normalmente, los efectos del mtodo y del laboratorio deben considerarse factores de
incertidumbre, pero a menudo son ms difciles de estudiar que el error de
repetibilidad y el efecto de ejecucin. En general, para valorar las incertidumbres que
producen es necesario utilizar informacin recabada independientemente del
laboratorio. Las fuentes generalmente ms tiles de dicha informacin son: (i)
estadsticas derivadas de ensayos colectivos (no disponibles en muchas situaciones de
validacin de un mtodo en un solo laboratorio), (ii) estadsticas derivadas de ensayos
de aptitud y (iii) resultados de anlisis de materiales de referencia certificados.
(RESOLUCIN OENO 8/2005).

Segn la ISO/TR 13843:2000 la validacin para mtodos microbiolgicos se hace


casi siempre en varias etapas. Las investigaciones sobre el funcionamiento real del
mtodo deberan ir precedidas de un estudio del rango de trabajo fiable en el cual es
pertinente el funcionamiento del mtodo. Cualquier comparacin entre las tasas de
recuperacin de dos mtodos debera estar limitada a los casos para los cuales ambos
mtodos sean fiables.

11

Dentro de un proceso de validacin se deben validar:

Mtodo analtico: En el cual se evalan y analizan parmetros como sensibilidad,


exactitud, linealidad, selectividad, etc.

Sistema analtico: Incluye instrumentos, ordenador y mtodo, con este se concluye


que el conjunto funciona como se espera.

Anlisis de la muestra: Donde se evidencia por medio de la documentacin la


comprobacin de los datos primarios (USP XXVI, 2003).

Por otro lado, se deben tener en cuenta algunos requisitos relacionados con el proceso
de trazabilidad, tales como la confirmacin de qu tan adecuada es la especificacin
del mtodo. La validacin del mtodo debe suministrar una prueba razonable de la
condicin y la ecuacin de medicin. En un caso ideal dentro de un laboratorio
individual incluira las siguientes actividades: (Baracaldo, R)

a. Evaluacin de la selectividad y especificidad para asegurar que el mtodo


responde a los analitos particulares de inters y no a otros similares.

b. Verificacin con material de referencia certificado que demuestre que el


mtodo no tiene errores sistemticos significativos.

c. Verificaciones razonables de otros efectos probables especficos no incluidos


en la especificacin del mtodo.

d. Estudios de precisin en un intervalo amplio de tiempo y bajo un conjunto


razonable de condiciones. Esto suministra una prueba de la ausencia de
efectos inesperados.

12

e. Estudios adicionales sobre fuentes posibles de errores sistemticos, incluyendo


spiking y recuperacin

f. Estudios sobre interferencias probables y reactividad cruzada que demuestren


nuevamente que no hay efectos adicionales de importancia. (Baracaldo, R. )

Las comparaciones entre analistas y diferentes laboratorios o mediante otros mtodos


pueden tambin demostrar posibles deficiencias en el mtodo. Si se manejan como
pruebas para efectos adicionales, ests servirn de evidencia adicional de la capacidad
de la especificacin del mtodo.

Las referencias usadas en la validacin del mtodo para controlarlo, calibrarlo y


probarlo son por s mismas trazables. Esto es importante para asegurar que los
estudios de validacin son relevantes en forma directa para los resultados obtenidos
en anlisis rutinarios. (Baracaldo, R)

La validacin juega un papel clave para establecer la trazabilidad y no es una


actividad opcional. Incluso cuando se emplee un mtodo estndar que ya haya sido
validado y probado totalmente sigue siendo necesario un nivel de validacin. No es
necesario repetir el estudio completo de todos los efectos posibles o probables: la
especificacin del mtodo puede ser tomada completamente sin verificacin
adicional. Pero los mtodos analticos son complejos y susceptibles de error.

Es indispensable demostrar por lo menos que el laboratorio est en capacidad de


llevar a cabo el mtodo correctamente (verificacin). La mejor manera de hacerlo es
con material de referencia certificado apropiado. Las evidencias de las pruebas de
aptitud y otros estudios pueden, dependiendo de la naturaleza del ejercicio,
suministrar una evidencia adecuada de la correcta operacin del mtodo. (Baracaldo,
R).

13

1.2 TIPOS DE VALIDACIN SEGN SU OBJETIVO

1.2.1 Validacin primaria Esta se basa en un proceso exploratorio cuyo objetivo es


el establecimiento de los lmites operativos y las caractersticas de funcionamiento de
un mtodo nuevo que ha sido modificado o insuficientemente caracterizado. Este tipo
de validacin se efecta generalmente por medio de planes de ensayo especialmente
diseados para este fin. (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992).

Es conveniente que un laboratorio que est desarrollando su propio mtodo o una


variante de una norma existente siga las etapas de validacin primaria. Es obligatorio
que los tcnicos implicados en la validacin primaria tengan una experiencia
considerable en otros mtodos microbiolgicos. (WHO Technical Report Series, No.
823, 1992).

Segn la ISO/TR 13843:2000 para la identificacin del objetivo en la validacin


primaria, los estudios sobre cultivos puros durante el desarrollo inicial del mtodo
proporcionan la descripcin bsica de las colonias objetivo o del tubos P/A.
Obviamente es preciso ensayar ms de una cepa de cultivo puro del microorganismo
objetivo.

Es conveniente que la validacin primaria aporte las siguientes especificaciones, en


cunto a microbiologa: (ISO/TR 13843:2000).

1. Identificacin morfolgica del microorganismo objetivo (presuntivo)


2. Instrucciones relativas a las condiciones de incubacin (temperatura, tiempo,
atmsfera gaseosa, humedad) y las caractersticas del medio (pH, estabilidad)
3. Una instruccin relativa a los lmites de trabajo en trminos de nmero de
colonias o de placas por detector (placa, filtro de membrana)

14

4. Si es posible, expresiones de la incertidumbre dentro de los lmites fiables


especificados
5. Rango de aplicacin y limitaciones.

1.2.2 Validacin Secundaria Llamada tambin verificacin, tiene lugar cuando un


laboratorio pone en marcha un mtodo desarrollado por otros. La validacin
secundaria tiene como objetivo principal recopilar los datos que permitan demostrar
que el laboratorio es capaz de cumplir las especificaciones establecidas en la
validacin primaria. Actualmente, dichas especificaciones no estn disponibles para
la mayora de los mtodos. Puede ser necesario utilizar los resultados de
aseguramiento de calidad externa como primera etapa para una validacin secundaria
completa. (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992).

Por regla general, la validacin secundaria utiliza los mismos modos operativos que
la validacin primaria pero bajo formas seleccionadas y simplificadas, aunque
posiblemente extendidas a lo largo de un periodo de tiempo mayor. Las muestras
naturales son los materiales de ensayo ptimos y el trabajo necesario se refiere
exclusivamente a que el modo operativo se inscriba dentro de los lmites
operacionales definidos en la validacin primaria. (WHO Technical Report Series,
No. 823, 1992).

Para llevar a cabo una validacin se debe tener clara la metodologa analtica, la cual
va de lo general a lo particular, se inicia con la valoracin de la tcnica, que es el
principio cientfico que puede ser til para suministrar informacin sobre la
composicin de una muestra; seguida del mtodo que es la adaptacin de la tcnica
para un propsito especfico, que para ser utilizado correctamente debe ir descrito en
un procedimiento y finalmente a partir de la informacin recopilada se obtiene el
protocolo en donde se suministran una serie de direcciones precisas y definitivas que

15

deben seguirse si se quiere que los resultados analticos se acepten, esta es la


evidencia objetiva de la validacin. (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992).

1.3 PARMETROS ANALTICOS PARA LA VALIDACIN DE UNA


TCNICA O MTODO

1.3.1 Selectividad Un mtodo selectivo aporta resultados exactos para todos los
analitos de inters, mientras que uno especfico produce resultados exactos para un
analito, al tiempo que los otros analitos de inters pueden interferir los unos con los
otros. (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992).

La selectividad es el grado en que un mtodo puede cuantificar el analito con


precisin en presencia de interferentes. Idealmente, la selectividad debera evaluarse
para todos los interferentes importantes susceptibles de estar presentes. Es de especial
importancia comprobar los interferentes capaces de responder a la prueba de acuerdo
con sus principios. En muchos tipos de anlisis, la selectividad es esencialmente un
estudio cualitativo basado en la significacin, o bien un conjunto de pruebas
pertinentes de interferencia. (RESOLUCION OENO 8/2005)

1.3.2 Especificidad

Es la capacidad del mtodo para diferenciar precisa y

especficamente el compuesto de inters, en presencia de los dems componentes, que


se espera estn presentes en la matriz de la muestra. Estos componentes pueden ser
precursores de la sntesis o subproductos de la misma, impurezas, excipientes o
productos de degradacin. (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992).

La especificidad se define como la proporcin de muestras negativas (no reactivas)


correctamente identificadas. (OCHOA , Rolando., et al. 2005)

16

1.3.3 Calibrado y Linealidad Se refiere a la proporcionalidad entre la concentracin


del analito y su respuesta, es decir si la tcnica o mtodo produce resultados directa o
indirectamente proporcionales a la concentracin o cantidad del analito, dentro de un
intervalo determinado. En algunos casos se requiere una transformacin matemtica
de la respuesta. (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992).

La linealidad determina la regin de la curva de cuantificacin en que hay relacin


directa entre la seal instrumental y la concentracin del producto analizado, siendo
un mtodo lineal cuando presenta una r > 0,99. (GOMARA, F. L, et al. 2004).
Un mtodo de anlisis presenta regresin lineal, cuando al aplicar un mtodo se
obtienen las respuestas, las cuales directamente o despus de transformaciones
matemticas son proporcionales a la concentracin del compuesto analizado dentro
de un intervalo de concentraciones apropiado. Su aplicacin principal est en curvas
de calibracin (Useche, B).

1.3.4 Precisin Se relaciona con la dispersin de la medida alrededor de un valor


medio o central y mide la concordancia entre ensayos individuales cuando el mtodo
se aplica repetidas veces a muestras separadas e idnticas, obtenidas del mismo lote
de material homogneo. (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992).

Mide el grado de cercana entre las medidas obtenidas de anlisis realizados


repetidamente de mltiples muestreos de una muestra homognea. La precisin se
mide por la dispersin que puede ser expresado como desviacin estndar o
coeficiente de variacin (desviacin estndar relativa) (Useche, B).

La precisin de un mtodo comprende:

- Repetibilidad Medida de la precisin del mtodo cuando ste se realiza por el


mismo analista, el mismo da, mismos reactivos, mismo instrumento (precisin
dentro del ensayo). Este trmino incluye las contribuciones de cualquier parte del

17

procedimiento que vara durante una ejecucin, incluidas las contribuciones


procedentes de errores gravimtricos y volumtricos conocidos, de la heterogeneidad
del material de prueba y de la variacin en las etapas de tratamiento del anlisis, y se
observa fcilmente en la dispersin de los anlisis replicados. El efecto de ejecucin
se explica por las variaciones cotidianas en el sistema analtico, como los cambios de
analistas o de lotes de reactivos, el recalibrado de los instrumentos y el entorno del
laboratorio (ej.: cambios en la temperatura) (RESOLUCION OENO 8/2005).

Es la concordancia entre resultados obtenidos con el mismo mtodo, en muestras


idnticas y bajo las mismas condiciones (experimentador, reactivos, instrumentos,
condiciones atmosfricas) (Useche, B).

- Reproducibilidad

Esta se mide cuando el ensayo se realiza en diferentes

laboratorios por diferentes analistas, diferentes das, diferentes instrumentos


(precisin entre laboratorios). El grado de reproducibilidad se determina en funcin
de las variables del ensayo. La reproducibilidad puede ser comparada con la precisin
del anlisis en condiciones normales obtenindose as una medida de la solidez del
mtodo (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992).

En conclusin, la reproducibilidad, es la concordancia entre resultados obtenidos de


diferentes laboratorios o por diferentes experimentadores usando la misma
metodologa y trabajando con muestras idnticas (Useche, B.).

1.3.5 Solidez y Robustez La evaluacin de solidez puede ser considerada durante la


fase de desarrollo y depende del tipo de procedimiento de estudio. Busca demostrar la
veracidad de un anlisis con respecto a variaciones deliberadas en parmetros del
mtodo. Al evaluarse la robustez de un mtodo, se evala la capacidad del resultado
de no sufrir alteraciones por pequeas modificaciones en los parmetros de anlisis
(GOMARA, F. L, et al, 2004).

18

La robustez en un mtodo es finalmente, el grado de reproducibilidad de los


resultados obtenidos para las mismas muestras bajo variadas condiciones (diferentes
experimentadores, diferentes lotes de reactivos). Se realiza un diseo experimental
con varios factores y se aplica anlisis de varianza (Useche, B)

1.3.6. Exactitud Se define como el grado de concordancia o como la diferencia entre


la media de los resultados del ensayo obtenidos por el mtodo y el valor verdadero o
el valor aceptado como correcto para la cantidad medida. Se conoce tambin como
error sistemtico o sesgo (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992).

Es una medida de la diferencia entre el promedio de los resultados del anlisis y el


valor verdadero; de all se puede establecer un error promedio. Mide el grado de
similitud entro los resultados del mtodo evaluado y los obtenidos usando un mtodo
de referencia (Useche, B).

1.3.7. Estabilidad Se considera adecuada si la desviacin estndar relativa calculada


en los resultados obtenidos en diferentes intervalos de tiempo, no excede el 20% del
valor correspondiente de la precisin del sistema (WHO Technical Report Series, No.
823, 1992).

1.3.8. Lmite de deteccin Es un nmero expresado en unidades de concentracin (o


cantidad) que describe el ms bajo nivel de concentracin de un analito que puede
determinarse como estadsticamente diferente del blanco analtico (WHO Technical
Report Series, No. 823, 1992).

El lmite de deteccin es la cantidad o concentracin de analito ms pequea en la


muestra de prueba que puede distinguirse fiablemente de cero. En los sistemas
analticos donde el rango de validacin no lo incluye o no se le aproxima, no es
preciso que el lmite de deteccin forme parte de la validacin (RESOLUCION
OENO 8/2005).

19

Aquella concentracin de analito que proporciona una seal significativamente


diferente de la seal de fondo. Es similar en muchos aspectos al nivel crtico. Se
estableci como 1.645 veces la desviacin estndar del blanco de anlisis. (Useche,
B. )

1.3.9. Limite de cuantificacin Corresponde a la ms baja cantidad del analito que


puede determinarse cuantitativamente con precisin y exactitud aceptables. (WHO
Technical Report Series, No. 823, 1992).
Es la concentracin de analito que produce una seal ms grande que el blanco y que
puede ser detectada dentro de los lmites aceptados por los laboratorios. Se estableci
que es la concentracin que produce una seal 10 desviaciones estndar del blanco.
(Useche, B.)

1.3.10. Sensibilidad

Es definida como la proporcin de muestras positivas o

reactivas correctamente identificadas por la prueba empleada. (OCHOA Rolando, . et


al, 2005 ).

La sensibilidad es entendida como la capacidad del mtodo de distinguir, con


determinado nivel de confianza, dos concentraciones prximas (GOMARA, F. L, et
al, 2004)

1.4 MTODOS DE ENSAYO MICROBIOLGICOS

El control de calidad es importante tanto en salud pblica como en la industria. Con


el desarrollo de tcnicas microbiolgicas de diagnstico, ha sido posible realizar un
control apropiado de las caractersticas de inocuidad. La validacin sirve como
soporte de aseguramiento de la calidad en los laboratorios brindando confianza y
solidez a los resultados emitidos por el mismo. (Cuesta, A).

20

Los laboratorios de anlisis tienen como principal objetivo reportar resultados


altamente confiables, por eso deben controlar y asegurar la calidad de sus resultados,
entendindose calidad, como el conjunto de propiedades y caractersticas ptimas de
un producto o servicio que prueban su actitud para satisfacer necesidades especficas
e implcitas. El mejoramiento de la calidad en el laboratorio consiste en implementar
un programa completo que vale el resultado final emitido por el laboratorio
proporcionando resultados tiles. Este mejoramiento, no solo incluye los conceptos
ms tradicionales de control de calidad, como el mejoramiento y la evaluacin
externa de la calidad que tiene como propsito mantener en cualquier proceso un
rendimiento a niveles aceptables segn los estndares, sino que tambin incluye el
mejoramiento contino de la calidad bajo el concepto de calidad total. (Cuesta, A).

El control de calidad abarca en los laboratorios de microbiologa el monitoreo de


medios de cultivo, reactivos, equipos y/o instrumentos, validacin de procedimientos
tcnicos y del personal. Por tanto, la validacin de las pruebas microbiolgicas es de
vital importancia ya que por medio de sta se busca determinar las variaciones entre
ensayos para disminuir las posibilidades de error en los resultados, hacindolos de
esta forma reales y confiables. As mismo se busca garantizar que las tcnicas son
compatibles con las condiciones en las que se est trabajando. En las pruebas de
diagnstico microbiolgicas tanto para alimentos, como para aguas, el recuento en
placa en profundidad es una tcnica comnmente utilizada para determinar el nmero
de clulas viables y la ausencia y/o presencia de ciertos microorganismos, al igual
que la tcnica del nmero ms probable (NMP) realizada a travs del recuento en
tubos. (ROMERO, Maria., et al, 2003).

Las tcnicas mencionadas anteriormente se constituyen como las ms utilizadas para


el control de calidad de alimentos y aguas. La validacin y verificacin de estas
tcnicas es importante para que el laboratorio pueda elaborar, desarrollar y generar
resultados confiables y seguros, como requisito parcial para dar cumplimiento a las

21

normas oficiales vigentes tales como la ISO-NTC 17025. (ROMERO, Maria., et al,
2003).

El anlisis microbiolgico tiene como fin proporcionar informacin confiable acerca


de la inocuidad y calidad sanitaria de una muestra cualquiera. Es por ello que es
indispensable la eleccin de un mtodo de ensayo adecuado. El laboratorio debe
utilizar los mtodos de ensayo que satisfagan la necesidad del cliente y que sean
apropiados para los ensayos que realiza. Se deben aplicar mtodos y procedimientos
apropiados para todos los ensayos dentro de su alcance (incluye muestreo,
manipulacin, transporte, almacenamiento, preparacin de las muestras a ensayar,
estimacin de la incertidumbre y empleo de tcnicas estadsticas para el anlisis de
datos de los ensayos). El laboratorio puede utilizar mtodos oficiales, mtodos
normalizados nacionales e internacionales, o mtodos internos desarrollados por l
mismo. (Cuesta, A).

Es recomendable la utilizacin de mtodos normalizados o de referencia, siempre y


cuando stos estn disponibles y sean apropiados. Sin embargo, el laboratorio no est
obligado a utilizar un mtodo normalizado, si dispone de un mtodo propio con el
que obtenga resultados equivalentes o superiores, utilice tecnologa ms avanzada y
presente un grado de validacin adecuado. En todos los casos, el laboratorio debe
demostrar que un mtodo es adecuado para la finalidad pretendida.

Para decidir si un mtodo es apropiado o no, se debe tener en cuenta: si ese mtodo es
aplicable al analito a analizar, la cantidad de muestra necesaria para el ensayo, el
lmite inferior del mtodo (para ensayos cuantitativos), si usando esta metodologa se
puede evaluar el cumplimiento de las exigencias requeridas para el analito. Cuando el
muestreo es llevado a cabo por el laboratorio, este debe usar procedimientos
documentados y tcnicas estadsticas apropiadas para seleccionar las muestras. (Ver
Captulo 6. Muestreo. Requisitos de la Norma 17025). La precisin, la especificidad,

22

la sensibilidad, el lmite de cuantificacin y/o de deteccin, los efectos matriciales y


facilidad de uso, son caractersticas que deben tenerse en cuenta antes de seleccionar
un determinado mtodo de ensayo. El laboratorio debe elegir los mtodos que mejor
se adecuen a sus objetivos, y debe documentarlos debidamente. (GUARNIZO,
Juliana. 2005).

Es necesario aplicar dos mtodos en paralelo sobre las mismas muestras cuando se
est desarrollando un mtodo interno, y tambin cuando se est recopilando
informacin justificativa del uso de un mtodo alternativo (ISO/ TR 13843:2000).

El mtodo que presente la tasa de recuperacin ms elevada para los organismos


buscados es obviamente el mejor, salvo que precise siempre de confirmacin para su
utilizacin en rutina. Un mtodo que permita obtener una tasa de recuperacin algo
inferior, pero que no precise confirmacin resulta preferible. Si no pueden corregirse
tasas elevadas de falsos positivos o de falsos negativos observadas en la validacin
primaria por medio de una definicin ms detalladas de las colonias objetivo, es
conveniente considerar el mtodo como no valido (ISO/TR 13843:2000).

1.4.1. Mtodos de ensayo microbiolgicos cualitativos Son mtodos en los que el


resultado se expresa en trminos de ausencia/presencia.

Los procedimientos de confirmacin e identificacin del microorganismo, deben ser


validados estimando, cuando sea apropiado, su especificidad, exactitud relativa,
desviacin positiva, desviacin negativa, lmite de deteccin, efecto matricial,
repetibilidad y reproducibilidad.

23

Las diferencias debidas a las matrices deben tenerse muy en cuenta al analizar
diferentes tipos de muestras. Los resultados deben evaluarse utilizando mtodos
estadsticos apropiados. (Cuesta, A).

1.4.2. Mtodos de ensayo microbiolgicos cuantitativos

Debe considerarse la

especificidad, sensibilidad, exactitud relativa, desviacin positiva, desviacin


negativa, repetibilidad, reproducibilidad y el lmite de cuantificacin dentro de una
variabilidad establecida y, en caso necesario, determinar cuantitativamente estos
parmetros. Las diferencias debidas a las matrices deben tenerse en cuenta al analizar
diferentes tipos de muestras. Los resultados deben evaluarse utilizando mtodos
estadsticos apropiados. (Cuesta, A).

Un ensayo cualitativo no brinda una informacin numrica de los resultados, pero


esto no implica que sea inferior a una prueba cuantitativa. Las aplicaciones de estos
dos ensayos pueden ser diferentes y en algunas situaciones un resultado cualitativo es
suficiente. Debe tenerse en cuenta que en muchos casos no existen materiales de
referencia y en otros la naturaleza de los mecanismos de proteccin no es bien
conocida, lo que limita la cuantificacin de los resultados o al menos su
interpretacin (OCHOA, Rolando et al. 2005)

La validacin analtica es uno de los elementos bsicos en sistemas de calidad. El


hecho de validar trata de disminuir o controlar los factores que llevan a la imprecisin
o inexactitud de un dato generado, a travs de la realizacin de un trabajo analtico
dentro de unos parmetros definidos. La validacin de un mtodo analtico provoca
una mayor fiabilidad y aceptacin de los datos generados, estando estas en proporcin
con la calidad del proceso de obtencin de los mismos (GOMARA, F. L, et al, 2004).
Para llevar a cabo validaciones, se debe contar con materiales de referencia que se
definen como material o sustancia, una de cuyas propiedades es lo suficientemente
homognea con valores bien establecidos, como para ser usados para la calibracin de

24

aparatos, la evaluacin de mtodos de medicin o para signar valores a materiales.


Los materiales de referencia certificados son un material acompaado de un
certificado, uno o ms de los valores asignados a sus propiedades se certifican
mediante un procedimiento que establece su trazabilidad a una realizacin exacta de
la unidad en la cual el valor de la propiedad se expresa y para la cual cada valor
certificado se acompaa de una incertidumbre a un nivel declarado de confianza.
(Hernndez, A.)

Los patrones de medicin son una medida material, instrumento o sistema de


medicin o material de referencia destinado a definir, realizar, conservar o reproducir
una unidad o uno o ms valores de una magnitud para que sirva de referencia.
(Useche, B. )

1.5 MEDICIN Y ERRORES

Aunque existen innumerables procesos de medicin diferentes, todos ellos culminan


con la obtencin de un resultado, el cual es afectado por distintos errores que surgen
de la interaccin entre el aparato de medida, el observador y el sistema bajo estudio.

Los errores asociados a las mediciones pueden dividirse en dos grandes clases: a)
errores sistemticos, y b) errores aleatorios. Los errores sistemticos, tal como su
nombre lo indica, se cometen de una misma manera cada vez que se mide. Muchos
errores sistemticos pueden eliminarse aplicando correcciones muy simples. Estos
errores son llamados tambin errores corregibles o determinados, a fines de
distinguirlos de los errores aleatorios, los cuales se encuentran en toda medicin y
estn fuera del control del observador.

Los errores sistemticos no se manifiestan como fluctuaciones aleatorias en los


resultados de las mediciones. Por lo tanto, dado que el mismo error est involucrado
en cada medicin, no pueden eliminarse simplemente repitiendo las mediciones

25

varias. En consecuencia, estos errores son particularmente serios y peligrosos, y


pueden eliminarse slo despus de realizar cuidadosas calibraciones y anlisis de
todas las posibles correcciones. Algunas veces, los errores sistemticos se manifiestan
como un corrimiento en valores medidos consecutivamente o como un cambio en el
valor experimental medido cuando se cambia la tcnica experimental de medicin.
La segunda clase de errores, los errores aleatorios o accidentales, aparecen como
fluctuaciones al azar en los valores de mediciones sucesivas. Estas variaciones
aleatorias se deben a pequeos errores que escapan al control del observador. El
propsito del tratamiento de los datos experimentales es justamente determinar el
valor ms probable de una cantidad medida y estimar su confiabilidad.
(http://arfiexp.tripod.com/manual_de_laboratorio2.htm)

1.6 MATERIAL DE REFERENCIA


Se denomina material de referencia al material o sustancia que ostenta valores de una
o ms propiedades suficientemente homogneas y bien conocidas que permite su uso
en la calibracin de aparatos, la evaluacin de un mtodo de medicin o la atribucin
de valores a estos materiales. (ISO/IEC 17025).
1.6.1. Cultivos de Referencia Es el conjunto constituido por cepas de referencia,
cepas de reserva y cepas de trabajo. Un laboratorio de microbiologa cuenta con
cultivos de referencia, a fin de acreditar o conservar la acreditacin de un ensayo. As,
el nmero, la eleccin del gnero y su especie son dependientes de los ensayos que se
elaboran y de las necesidades que asumen estos. (ISO/IEC 17025).
1.6.2 Cepas de referencia A fin de demostrar la trazabilidad, las cepas de referencia
deben obtenerse directamente de una coleccin con la resea nacional o internacional
de cultivo de referencia reconocido.

26

Segn la "ISO 11133-1:2000", son:

microorganismos definidos, por lo menos a nivel de gnero y especie

catalogados

muy caracterizados

de origen conocido

Dichas cepas son distribuidas y presentadas comercialmente liofilizadas; asimismo,


los organismos de acreditacin son los encargados de considerar vlida la fuente de
procedencia de la cepa a fin de que se cumpla con el requisito de prevenir
mutaciones, deterioro o alteracin de las caractersticas tpicas de las cepas. (ISO/IEC
17025).
El nmero de repiques a partir de la cepa de referencia ha de ser limitado,
aceptndose hasta cinco repiques como mximo a partir de dicha cepa de referencia.
Asimismo, toda cepa adquirida por una va que no sea la propia coleccin, no podr
mencionarse utilizando el nmero que tienen en esa coleccin, sino nicamente como
derivada de la cepa de coleccin. (ISO/IEC 17025).

1.7. REPRESENTATIVIDAD Y CANTIDAD SUFICIENTE DE MUESTRAS

La teora estadstica aporta soluciones para el clculo del nmero de muestras


requeridas para las diferentes situaciones de ensayo o de estimacin. Con el fin de
poner en prctica la teora, es conveniente definir la importancia de los efectos que
realmente tienen influencia y las posibilidades de detectarlos. Es conveniente
disponer de una estimacin de la incertidumbre (precisin) de la determinacin y
proceder a un muestreo aleatorio. Muchos o todos los requerimientos anteriormente
indicados son difciles de cumplir de antemano en la planificacin y ejecucin de

27

ensayos de funcionamiento de mtodos microbiolgicos. Las tcnicas estadsticas, de


utilizarse, se convierten en meras lneas directrices. (ISO/TR 13843:2000).

Para ser convincente, el nmero y variedad de las muestras a examinar debe ser
suficiente. Sin la ayuda de la estadstica no hay ninguna manera de precisa de tomar
una decisin. En ciertos casos, la primera muestra estudiada puede indicar ya que el
mtodo no es suficientemente bueno. Pero, una sola muestra generalmente no basta.
A veces, se necesita un millar de muestras para demostrar que dos mtodos P/A no
son equivalentes. Seleccionar una cantidad insuficiente de ejemplos puede constituir
una prdida de tiempo.

1.7.1 Recuperacin del analito El analito microbiolgico se compone de partculas


vivas discretas, denominadas indistintamente unidades formadoras de colonias
(UFC), partculas formadoras de colonias (PFC), grmenes, propgalos, etc. El
nmero de colonias observado es una aproximacin del nmero de partculas vivas.
El conjunto de ensayos de funcionamiento necesarios est limitado por la casi
imposibilidad de conocer la cantidad real del analito contenida en una muestra o en
una porcin de ensayo analtica. Los detectores no pueden sembrarse con un nmero
de grmenes exactamente conocido. (ISO/TR 13843:2000).

La viabilidad viene definida por el crecimiento, es decir, por el mtodo en s mismo.


La recuperacin absoluta no puede definirse y la trazabilidad es imposible. Como la
viabilidad puede ser distinta segn los detectores y/o segn la historia de la muestra,
la tasa de recuperacin relativa (del nuevo mtodo y de uno de referencia) resulta una
caracterstica de funcionamiento practicable incluso aunque no se conozca el
verdadero resultado.

28

En el medio ambiente, e incluso en las muestras de laboratorio, la distribucin de


partculas no es homognea. La varianza de muestreo no es una caracterstica del
mtodo, mientras que la varianza debido a la toma de alcuotas de la muestra de
laboratorio s que puede considerarse como una caracterstica. Puede resultar
imposible utilizar mtodos de homogenizacin suficientes para asegurar el perfecto
mezclado del contenido de la muestra sin ninguna prdida de clulas viables. La
varianza intramuestra con frecuencia es considerable y da problemas en la validacin.
Ser necesario definir el funcionamiento para matrices diferentes, en particular en lo
que se refiere a la precisin y a los lmites de trabajo superiores. (ISO/TR
13843:2000).

La variacin aleatoria debido a una muestra no homognea de las partculas entre dos
muestras paralelas, incluso en suspensiones perfectamente mezcladas, es una
caracterstica de los mtodos microbiolgicos. La variacin aleatoria bsica es
inevitable y no tiene nada que ver con la competencia tcnica o con el equipamiento.
Esta variacin obedece a una ley matemtica conocida, la distribucin de Poisson, y
por lo tanto puede calcularse.

1.7.2 Material de Ensayo Est generalmente aceptado que la validacin debe simular
en la mayor medida posible el proceso de rutina. Por lo tanto, las muestras naturales
con concentraciones naturales de microorganismos deberan ser los principales
materiales de ensayo. Hay excepciones en algunas circunstancias concretas. Los
materiales artificiales (materiales de referencia certificados y muestras enriquecidas)
se utilizan en sistemas de aseguramiento de la calidad internos y externos para
asegurar la competencia tcnica bsica de los laboratorios que participan en los
ejercicios de validacin de mtodos. (ISO/TR 13843:2000).

29

Puede ser til e incluso necesario efectuar adicin o enriquecimiento en la validacin


secundaria, siempre que sea difcil conseguir muestras naturales con el
microorganismo buscado. El personal de laboratorio deber ser capaz de
familiarizarse con los microorganismos buscados. Es conveniente limitar la
utilizacin de muestras negativas (blancos) a las operaciones de aseguramiento de la
calidad interna. Su inclusin entre las muestras estudiadas para ver la equivalencia de
mtodos puede producir la impresin falsa de una buena correlacin entre mtodos.
Si es posible saber de antemano que muestras naturales no contienen ninguno de los
organismos objetivo, stas podran ser una buena eleccin para verificar los falsos
positivos en los ejercicios reales de validacin.

El rango ptimo de concentraciones para la validacin de mtodos microbiolgicos es


ms estrecho que el rango de aplicacin previsto. No es necesario utilizar
concentraciones muy grandes. Estas muestras son comparables a cultivos puros y no
permiten verificar el comportamiento del mtodo o del laboratorio sometido a ensayo.
Ciertos mtodos microbiolgicos se han venido usando durante dcadas por
centenares de laboratorios (por ejemplo, agar ENDO para coliformes totales, mFC
para coliformes termotolerantes, agar m-Enterococcus para enterococos intestinales).
Estos mtodos tericamente podran resultar adecuados para estudios colaborativos
sobre el funcionamiento de los mtodos. (ISO/TR 13843:2000).

1.7.3 Detectores Se denomina detector al medio nutritivo en su recipiente. En


diferentes variantes de mtodos microbiolgicos se emplean dos tipos de detectores,
slidos y lquidos. Adems estn principalmente asociados con dos principios de
recuento y deteccin: liquido con el mtodo A/P y NMP y slidos con los recuentos
de colonias. En microbiologa, el objetivo fundamental de todas las formas de
validacin es la determinacin del funcionamiento de los detectores. La serie de
tubos (NMP) o de placas (contables) utilizadas para el anlisis se denomina serie de
deteccin o serie de detectores. Cada tubo de NMP es un detector A/P.

30

Para la mayor parte de los mtodos de recuento de colonias, es posible desarrollar un


lquido equivalente de la misma composicin qumica pero desprovisto de matriz
slida (agar, membrana filtrante). El efecto del entorno slido puede evaluarse
comparando los recuentos de colonias con la estimacin equivalente NMP, siempre
que la reaccin para la identificacin del microorganismo buscado sea la misma para
los dos tipos de detectores y que el nmero de tubos paralelos sea suficiente para
obtener un final de precisin adecuado. Es posible evaluar la sensibilidad de los
detectores P/A procediendo a comparaciones lquido-slido similar. (ISO/TR
13843:2000).

Para que sean tiles en la validacin, es conveniente que las caractersticas de


funcionamiento sean cuantificables y que puedan ser sometidas a ensayo, esto es;
relacionado al campo de aplicacin (lista de situaciones y tipos de muestras a las
cuales es aplicable el mtodo), a la precisin, a la linealidad, tasa de recuperacin,
lmites de trabajo en trminos de nmero de colonias superior e inferior que se
recomienda contar por placa, a la selectividad, especificidad y robustez (solidez).

Las interacciones de factores biticos y abiticos en el interior de los detectores son


causa de problemas considerables. Los detectores lquidos sufren de la posible
cohabitacin de microflora variada dentro del mismo tubo. Los detectores de colonias
tienen el problema de crecimiento masivo, lo que enmascara las colonias objetivo con
fragmentos o con el crecimiento de otros microorganismos. La lectura entonces se
hace difcil o imposible. (ISO/TR 13843:2000).

31

1.8.

SISTEMA DE GESTIN DE CALIDAD EN LABORATORIOS DE

ANLISIS MICROBIOLGICO

La validacin constituye una parte esencial de las buenas prcticas de laboratorio


(BPLs) y consiste en el establecimiento de una evidencia documentada que
suministre un alto grado de seguridad de que un proceso especfico elaborar de
forma permanente un producto que cumpla con caractersticas y especificaciones de
calidad predeterminadas. Desde 1972 y durante seis aos la validacin busc
satisfacer exigencias normativas y defender lneas de produccin. Hacia 1983 sirvi
como mtodo de accin fundamental de mejora de procesos. Desde all se enfoca a
diferentes reas de optimizacin de procesos. (JAIME, Carolina. 2002)

Desde una perspectiva metrolgica amplia, todos los mtodos microbiolgicos


estndar se comportan de igual manera. Los procesos envuelven homogenizacin
cuidadosa de la muestra y la suspensin de una porcin medida en una solucin
acuosa. Adems, la dilucin de la suspensin puede ser necesaria para llegar a la
concentracin apropiada para el instrumento de medicin, donde la deteccin y
conteo de las partculas tiene lugar (Niemel. S, 2002).

En muy pocos mtodos la preparacin envuelve otros pasos adems de la agitacin


para separar el analito (microorganismo especfico) de la muestra matriz y de las
especies no especficas interferentes. La pasteurizacin y el tratamiento cido de las
muestras son dos ejemplos de tales prcticas (Niemel. S, 2002).

Los instrumentos de medida o sistemas de deteccin usualmente consisten en muchos


detectores individuales de los cuales existen dos clases: el contador de colonias
(placas de petri) y el detector de ausencia/presencia (usualmente en tubo o en liqudo)
(Niemel. S, 2002)

32

1.8.1 Aseguramiento de la calidad de los resultados/control de Calidad Segn el


apartado 5.9 de la NTC ISO 17025 el control de calidad se divide en:

Control de Calidad Interno Consiste en todos los procedimientos realizados por un


laboratorio para la evaluacin continua de su trabajo. El principal objetivo es asegurar
la coherencia de los resultados obtenidos diariamente y el cumplimiento de los
criterios establecidos. (G-ENAC-04).

Un programa de controles peridicos es necesario para demostrar que controla la


variabilidad (por ejemplo, entre analistas y entre equipos o materiales, etc.). Dicho
programa debe abarcar todos los ensayos incluidos en el alcance de acreditacin del
laboratorio. El programa puede incluir:

El uso de muestras inoculadas


El uso de materiales de referencia (incluidos los materiales utilizados en
ensayos de aptitud)
Uso de replicados
Recuentos cruzados entre analistas

El intervalo entre estos controles depender del diseo del programa y del nmero de
ensayos realizados. Es recomendable que, en la medida de lo posible, los ensayos
incluyan controles para evaluar sus resultados. En circunstancias especiales, un
laboratorio puede estar acreditado para realizar un ensayo que rara vez se demanda.
Se reconoce que, en tales casos, un programa continuo de control interno de la
calidad no siempre ser apropiado, siendo preferible un sistema que se realice en
paralelo al ensayo y que demuestre que los resultados son satisfactorios. (G-ENAC04).

Control de calidad analtico La aplicacin de mtodos vlidos dentro de sus lmites


especificados y fiables no garantiza automticamente la obtencin de resultados

33

vlidos. Es necesario proceder a un control de calidad analtico (AQC) en relacin


con los anlisis de rutina cotidianos. Este control permite verificar la capacidad de
utilizar satisfactoriamente un mtodo. El AQC es un proceso continuo. Los grficos
de gua cuyos lmites se han deducido a partir de las especificaciones del mtodo (a
partir de la validacin primaria), o a partir de consideraciones tericas, son las
herramientas principales. (ISO/TR 13843:2000) (AOAC INTERNATIONAL)

El mtodo de AQC es un complemento del proceso analtico de rutina, por ejemplo,


replicados a distintos niveles o simplemente clculos que no se efectan
corrientemente sobre los datos de rutina.

Adems, se utilizan materiales de

referencia, intercalibraciones y muestras con adicin. El control de calidad analtico


debe efectuarse en combinacin con las validaciones primaria y secundaria. Es
conveniente utilizar solo los resultados fiables desde el punto de vista del AQC para
definir los criterios de validacin y las caractersticas de funcionamiento.

Diversos grupos de trabajo nacional e internacional han elaborado numerosos


documentos sobre el control de calidad de los mtodos microbiolgicos. En las
especificaciones se asume que los laboratorios disponen de los controles analticos
apropiados y de sistemas de aseguramiento de la calidad internos y externos de
funcionamiento. Es preciso estudiar las muestras con un bajo contenido microbiano
por razones de salud pblica, pero, por razones estadsticas, estas muestras no son
adecuadas para la comparacin de mtodos ni para otros ejercicios de validacin. El
problema queda obviado, ya que los mtodos microbiolgicos generalmente no son
sensibles a la concentracin en la parte baja de la escala. (ISO/TR 13843:2000)

Cada

microorganismo

individual

reacciona

con

el

medio

nutritivo

casi

independientemente de otras partculas de la muestra. Si un mtodo tiene una tasa de


recuperacin baja en comparaciones con otro mtodo, este hecho se pone mejor de
manifiesto con veinte o treinta unidades formadoras de colonias por placa que con
una o unas cuantas.

34

Control de calidad externo (ensayos de aptitud) Los laboratorios deben participar


regularmente en ensayos de aptitud relacionados con el alcance de su acreditacin,
dando preferencia a los programas de ensayos de aptitud que utilicen matrices
apropiadas. En algunos casos concretos, esta participacin puede ser obligatoria. Los
laboratorios deben utilizar el control externo de la calidad no slo para detectar
desviaciones en los resultados obtenidos, sino tambin para verificar la validez de
todo el sistema de calidad. (G-ENAC-04).

Cuando se hacen ensayos de competencia tcnica para organismos objetivo


especficos, con medios selectivos, las muestras casi obligatoriamente han de ser
enriquecidas con cultivos puros o con mezclas de organismos. Otra solucin es
utilizar materiales de referencia certificados. Se trata de una situacin artificial y
simplificada. Algunas dificultades importantes experimentadas por diferentes
laboratorios en el uso en rutina de los mtodos sobre muestras naturales pueden
quedar obviadas. En tanto en cuanto las caractersticas de funcionamiento de un
mtodo microbiolgico no hayan sido expresadas cuantitativamente, estos tipos de
programas de aseguramiento externo de la calidad constituyen, a pesar de todo, el
medio ms satisfactorio en lo que respecta a la validacin secundaria (verificacin) de
un mtodo (ISO/TR 31843:2000).

Los estudios que sobre materiales homogneos en los que participan, de forma
colaborativa, varios laboratorios se consideran ensayos esenciales para el
funcionamiento del mtodo, pero tambin para el de los propios laboratorios. (Una
vez identificados y eliminados los valores rechazables, se considera que los restantes
datos aportan la informacin necesaria sobre el funcionamiento y la eficiencia del
mtodo). Hoy en da, los estudios colaborativos, constituyen una herramienta de
amplia aplicacin para evaluar las caractersticas de precisin de los mtodos
qumicos. Parece algo prematuro recomendar la puesta en prctica de este tipo de
ensayos en microbiologa. Se admite en efecto, que todos los laboratorios

35

participantes tienen varios aos de experiencia en lo que concierne a los mtodos


sometidos a ensayo y demostrada su capacidad para aplicarlos. Actualmente, la
experiencia demuestra que los estudios colaborativos encaminados a la evaluacin del
funcionamiento de un mtodo tienden a convertirse en ensayos de aptitud del
laboratorio y en ejercicios de formacin.

Mtodos equivalentes

Es necesario aplicar dos mtodos en paralelo sobre las

mismas muestras cuando se est desarrollando un mtodo interno, y tambin cuando


se est recopilando informacin justificativa del uso de un mtodo alternativo. Las
caractersticas de funcionamiento de un mtodo constan de muchos aspectos. No hay
ningn ensayo individual de equivalencia de mtodos ni ningn criterio numrico
correspondiente. Un mtodo puede ser superior es especificidad pero inferior en
cuanto a recuperacin. Toda la informacin sobre robustez, la precisin y la
especificidad recopilada durante los ensayos de validacin puede utilizarse para la
comparacin de los mtodos. nicamente es necesario examinar los mtodos en
paralelo nicamente para las comparaciones de tasa de recuperacin. (ISO/TR
31843:2000).

El mtodo que presenta la tasa de recuperacin ms elevada para los organismos


buscados es obviamente el mejor, salvo que precise siempre de confirmacin para su
utilizacin en rutina. Un mtodo que permita obtener una tasa de recuperacin algo
inferior, pero que no precise confirmacin resulta preferible. Si no pueden corregirse
tasas elevadas de falsos positivos o de falsos negativos observadas en la validacin
primaria por medio de una definicin ms detalladas de las colonias objetivo, es
conveniente considerar el mtodo como no vlido.

1.8.2 Acreditacin Es el procedimiento mediante el cual, en inters de la sociedad,


un organismo autorizado evala y declara formalmente que un laboratorio es

36

tcnicamente competente para la realizacin de un ensayo o grupo de ensayos


determinados. (G-ENAC-04).

La tarea de evaluar dicha competencia tcnica y la eventual declaracin pblica de la


misma es llevada a cabo, mediante la comprobacin del cumplimiento por parte de
los laboratorios de los requisitos concretos sobre estructura y organizacin,
imparcialidad, personal, equipos, procedimientos tcnicos, sistema de la calidad, etc.,
establecidos en normas internacionales. En definitiva, los criterios sobre los que se
apoya la declaracin de competencia tcnica. (G-ENAC-04).
La acreditacin genera, as, confianza en los informes y resultados de anlisis
emitidos por los laboratorios que voluntariamente se han sometido a la evaluacin
frente a estndares altamente profesionales. (G-ENAC-04).

Finalmente, el principal beneficiario del uso de laboratorios acreditados es el cliente,


quien recibe de esta manera un producto con alto nivel de calidad.

37

2. FORMULACIN Y JUSTIFICACIN DEL PROBLEMA

2.1 FORMULACIN DEL PROBLEMA

Cuando un laboratorio pone en prctica pruebas microbiolgicas que no estn


validadas, cmo demuestra la veracidad de sus resultados? La validacin de las
tcnicas microbiolgicas ayuda a obtener resultados fiables a partir de la verificacin
del correcto desempeo y funcionamiento del mtodo microbiolgico estndar
utilizado. Sin embargo, en Colombia la falta de cultura de calidad y conocimiento
sobre el tema de validacin y la importancia que ste tipo de procesos tiene sobre los
ensayos microbiolgicos, se ve reflejada en los escasos estudios que se han realizado
respecto a este tema. As mismo, el crecimiento en el sector industrial en Colombia,
hace que la demanda en cuanto a procedimientos con calidad aumente, y as mismo
deben aumentar los laboratorios acreditados que ofrezcan a partir de la validacin de
sus mtodos mejores resultados al cliente.

Los laboratorios de anlisis tienen como principal objetivo reportar resultados


altamente confiables, por eso deben controlar y asegurar la calidad de estos,
entendindose calidad, como el conjunto de propiedades y caractersticas ptimas de
un producto o servicio que prueban su actitud para satisfacer necesidades especficas
e implcitas. Adicionalmente, por requerimientos de sus sistemas de calidad y para
lograr el cumplimiento de los requisitos derivados de las buenas prcticas de
laboratorio; la validacin acta como

sistema de aseguramiento de la calidad

mediante el cual se establecen evidencias documentadas para demostrar que un


proceso conduce a resultados de calidad consistentes dentro de las especificaciones
predeterminadas.

38

2.2 JUSTIFICACIN

Actualmente, los laboratorios de anlisis microbiolgico que prestan servicios,


cuentan con diferentes tcnicas con las cuales llevan a cabo los anlisis
correspondientes, pudiendo as emitir ciertos resultados; de esta manera, cada
laboratorio ha establecido y organizado sus procesos de forma aislada permitiendo as
que se generen posibles errores en la ejecucin de las tcnicas, disminuyendo la
confiabilidad de los resultados. Es por eso que se hace imperante la necesidad de
validar las tcnicas desarrolladas para aumentar la credibilidad de las mismas,
disminuyendo las oportunidades de error.

La validacin de las pruebas microbiolgicas es de vital importancia ya que por


medio de sta se busca determinar las variaciones entre ensayos para disminuir las
posibilidades de error en los resultados, hacindolos de esta forma reales y confiables.
As mismo se busca garantizar que las tcnicas son compatibles con las condiciones
en las que se est trabajando. La validacin y verificacin de los ensayos
microbiolgicos estndar, es importante para que el laboratorio pueda elaborar,
desarrollar y generar resultados confiables y seguros, como requisito parcial para dar
cumplimiento a las normas oficiales vigentes tales como la ISO-NTC 17025.

Con el desarrollo de la gua se pretende facilitar a los laboratorios que llevan a cabo
pruebas microbiolgicas la validacin de estas, orientndolos de forma clara y
sencilla en la consecucin de los objetivos de la ISO 17025, ya que con ello se
sustenta el hecho de presentar al cliente o a la persona interesada resultados
confiables que permitan al mismo tomar decisiones. Se sustenta al mismo tiempo, que
los procedimientos de validacin dar lugar a un sin nmero de beneficios, entre los
cuales est el poder garantizar la competencia de las tcnicas realizadas en dichos
laboratorios, el logro y mantenimiento de la calidad de los servicios ofrecidos por
estos, apertura de nuevas oportunidades de mercado, obtencin de reconocimiento y

39

de esta forma aumento de la credibilidad y confianza por parte del cliente, as como
competitividad, calidad y garanta de bienestar social, debido al logro de la
sensibilizacin del personal, el uso de equipos e instrumentos adecuados,
conocimiento de diferentes requisitos normativos, entre otros.

40

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GENERAL

Disear y elaborar una gua para la validacin de ensayos y mtodos de anlisis


microbiolgicos estndar.

3.2. OBJETIVOS ESPECFICOS

Realizar una recopilacin y revisin bibliogrfica acerca de las validaciones de


los mtodos y ensayos microbiolgicos estndar.

Proveer una descripcin prctica y detallada de los mtodos bsicos de uso


rutinario y la estimacin de variables importantes para la validacin.

Exponer los parmetros generales que se deben tener en cuenta al realizar la


validacin de algn ensayo microbiolgico estndar.

41

4. MATERIALES Y MTODOS

4.1.

TIPO DE INVESTIGACIN

Esta investigacin es de tipo descriptivo. Mediante este tipo de investigacin, que


utiliza el mtodo de anlisis, se logr caracterizar un objeto de estudio o una
situacin concreta, sealar sus caractersticas y propiedades. Combinada con
ciertos criterios de clasificacin sirve para ordenar, agrupar o sistematizar los
objetos involucrados en el trabajo indagatorio. Adems, puede servir de base para
investigaciones que requieran un mayor nivel de profundidad.

4.2. POBLACIN Y ESTUDIO DE MUESTRA

La poblacin objetivo de esta investigacin fueron las pruebas de ensayo


microbiolgicas tanto cualitativas como cuantitativas, como los son: recuento en
placa, ausencia/presencia, NMP, etc., que se desarrollan en las pruebas de
diagnstico microbiolgico; el recuento en placa en profundidad es una tcnica
comnmente utilizada para determinar el nmero de clulas viables y la ausencia
y/o presencia de ciertos microorganismos, al igual que la tcnica del nmero mas
probable (NMP) realizada a travs del recuento en tubos.

4.3.

RECOPILACION Y REVISIN BIBLIOGRFICA

La cual se realiz a partir de fuentes secundarias, apoyndonos en fuentes de


carcter documental, como documentos de cualquier especie; normas nacionales e
internacionales, protocolos, guas, guas tcnicas, normas tcnicas y documentos
que se encontraron en diferentes archivos.

Esta metodologa se bas

principalmente, en la recoleccin de la informacin para su posterior anlisis y


aplicacin.

42

Con respecto a la utilizacin de fuentes primarias, se realizaron entrevistas con


personas involucradas con los laboratorios que llevan a cabo pruebas y/o ensayos
microbiolgicos y tambin con personas conocedoras de temas como la
validacin y los modelos matemticos a nivel microbiolgico.

Se realiz lectura y anlisis de cada uno de los documentos encontrados, para


lograr a travs de la organizacin y entendimiento de la informacin recolectada,
el diseo y la elaboracin de la gua para la validacin de los mtodos
microbiolgicos.

4.4. DOCUMENTACIN DE LOS PARMETROS DE VALIDACIN


PARA MTODOS Y ENSAYOS EN MICROBIOLOGA ESTNDAR.

Despus de la obtencin y recopilacin de la informacin, anlisis y aplicacin de


los procedimientos estadsticos cualitativos y cuantitativos, se procedi a
documentar y desarrollar los parmetros estudiados en la informacin recolectada.
De esta manera, se inici el diseo de la gua para la validacin de pruebas
microbiolgicas estndar.

4.5. DESPLIEGUE DE MODELO MATEMTICO PRELIMINAR PARA


LA VALIDACIN DE PRUEBAS MICROBIOLGICAS ESTNDAR.

Luego del anlisis de las referencias bibliogrficas se pudo deducir que los
modelos lineales de la estadstica paramtrica no permiten entender de forma
adecuada el crecimiento microbiano debido a la heterogeneidad que este presenta
como consecuencia del sistema fsico, bioqumico y micro-ecolgico de la
muestra. Debido a esto se hizo necesario profundizar ms en otros mtodos
estadsticos que permitieran cuantificar las observaciones realizadas en
microbiologa estndar con el fin de expresarlas cuantitativamente.

43

Con la estadstica no paramtrica se estima la exactitud y la precisin de las


mediciones microbiolgicas. Por lo tanto se propuso un conjunto de herramientas
matemticas propias de este tipo de estadstica a travs de un modelo de
validacin en microbiologa de proceso modular, en el cual se plante la
validacin orientada a la muestra (VOM), validacin orientada al procedimiento
(VOP) y validacin orientada al sistema (VOS), pero se profundiz nicamente
en la VOM.

44

5. RESULTADOS Y DISCUSIN

5.1 REVISIN BIBLIOGRFICA

Luego de la revisin bibliografca realizada se encontr que a nivel internacional las


principales fuentes de informacin sobre el tema son la ISO, la FAO, la WHO y a
nivel nacional, el ICONTEC, las secretarias de salud y el IDEAM. Sin embargo,
tambin se pudo observar que las ms influyentes son a nivel internacional y
nacional, la ISO y el ICONTEC respectivamente. La Tabla 1 muestra la bibliografa
que ms se destaca para procedimientos de validacin en microbiologa estndar:

Tabla 1. Bibliografa para procesos de validacin en microbiologa estndar


Nacional

Internacional

-NTC 3529-1 (ISO 5725-1).

-ISO/TR 13843-2000

-NTC 3529-2 (ISO 5725-2).

-ISO/TS 11133-1

-NTC 17025 (ISO 17025)

-G-ENAC-4

-NTC 5014 (ISO 16140)

-RESOLUCIN OENO 8/2005

-Articulos y presentaciones IDEAM

-WHO Technical Reports.

-Articulos y presentaciones INAS

-NIEMEL, Seppo. 2002. Uncertainty of Quantitative

-Secretara Distrital de Salud

Determinations Derived by Cultivation of Microorganisms.


Advisory Comission for Metrology. Publication J3. Finland.
-USP. United States Pharmacopeia XXVI, 2003
-CRUBELLATI, Ricardo. 2007. Anlisis

de Aguas:

capacidades instaladas en Iberoamrica. -1 ed. Buenos


Aires: Ciencia y Tecnologa para el Desarrollo CYTED.
pp. 78-87.
-CAYR, Mara; VIGNOLO, Graciela y GARRO, Oscar.
Validacin y comparacin de modelos de crecimiento
microbiano. Facultad de Agroindustrias UNNE. Argentina
-CUESTA, Alicia. Gua para la acreditacin de laboratorios
de microbiologa de alimentos
AOAC. Peer-Verified Methods SM Program, AOAC
Internationall, Gaithersburg, MD20877-2417, USA
AOAC Research Institute. AOAC Performance Tested
Methods SM Program, AOAC International, Gaitherburg,
MD 20877-2417, USA
AOAC INTERNATINAL. AOAC International Cuts the
Number of Laboratories Required for a Collaborative Study.

45

Downloaded

from

http:

//64.55.218.151/pubs/storyarchives/cutlabs.htm. 8/28/2003

La revisin bibliogrfica adems de mostrarnos que el conocimiento y la


investigacin sobre validacin a nivel internacional es mayor que a nivel nacional, lo
cual se puede evidenciar por la cantidad de bibliografa internacional mostrada en la
tabla 1, tambin permiti obtener informacin acerca de la situacin actual en cuanto
a validacin y acreditacin de los laboratorios de ensayo en Colombia.

Como resultado de la informacin analizada, se encontr que en Colombia la


constitucin poltica estableci como deber del Estado, entre otros, proteger los
derechos de los consumidores frente a la calidad, la informacin y las garantas, y de
igual manera velar por la proteccin de la salud, la seguridad y el medio ambiente,
instaurando as su competencia estatal para intervenir y regular calidad (Crubellati, R.
2005).

Para dar cumplimiento a las polticas planteadas en cuanto a calidad se han venido
brindando los siguientes marcos regulatorios: El estatuto de Proteccin al
Consumidor y El Sistema Nacional de Normalizacin, Certificacin y Metrologa
(SNNCM) a cargo de la Superintendencia de Industria y Comercio (SIC) (Crubellati,
R. 2005). Esta superintendencia es la entidad que acredita a los organismos
evaluadores de la conformidad que operan dentro del SNNCM, el cual de acuerdo
con los lineamientos establecidos en el CONPES 3446 del 30 de octubre de 2006, se
ir transformando en el nuevo Subsistema Nacional de la Calidad. (Organismo
Nacional de Acreditacin, 2007)

En desarrollo de dicha funcin de acreditacin, a julio de 2007, la Superintendencia


de Industria y Comercio contaba con 231 organismos de evaluacin de la
conformidad acreditados, discriminados as: 104 laboratorios de ensayos, 67
laboratorios de calibracin, 31 organismos de certificacin y 29 organismos

46

de inspeccin. A la misma fecha dicha entidad tena un total de 185 solicitudes de


acreditacin en trmite y 16 solicitudes de ampliacin del alcance de acreditaciones
ya otorgadas.

Segn las proyecciones de la demanda del futuro Organismo Colombiano de


Acreditacin (OCA), a partir de las acreditaciones otorgadas por el SIC y el IDEAM
en el 2006 se realiz el calculo de la demanda para el periodo 2008-2012, en el cual,
en el ao 2008 solamente se acreditarn organismos de certificacin, organismos de
inspeccin y laboratorios de ensayo, en el ao 2009 se iniciar la acreditacin de
laboratorios de calibracin y laboratorios clnicos/salud y en el ao 2010 se iniciar la
acreditacin de laboratorios ambientales siendo estas acreditaciones evaluadas
anualmente mediante una auditora de seguimiento. (Ver Tabla 2).(Organismo
Nacional de Acreditacin, 2007)

TABLA 2. Acreditaciones 2008-2012


Nuevas Acreditaciones
Segn rea de Acreditacin

2008

2009

2010

2011

2012

Organismos de Certificacin

Organismos de Inspeccin

20

Laboratorios de Ensayo

10

13

14

16

18

Laboratorios de Calibracin

11

12

Laboratorios Ambientales

Laboratorios Clnico/ Salud

Total

13

27

37

43

49

Por otro lado ha crecido la preocupacin por la estandarizacin de metodologas para


de esta forma poder generar resultados confiables por parte de los diferentes
laboratorios ya sea que estos se encuentren o no acreditados. Debido a esto se han

47

creado programas como los llamados Interlaboratorios supervisados por la Red de


Laboratorios perteneciente al Laboratorio de Salud Pblica, con actividades de
diagnstico,

referencia,

contrarreferencia,

control

de

calidad,

capacitacin,

investigacin en apoyo a la vigilancia en salud pblica, prevencin, control y


seguimiento de enfermedades que se adelanta en atencin a las personas y al medio
ambiente, anlisis, vigilancia y control sanitario de medicamentos, sustancias
qumicas de riesgo para la salud humana, productos biolgicos, alimentos, bebidas,
cosmticos, insumos para la salud y productos varios (Secretara Distrital de Salud:
Prospectiva del Laboratorio Distrital de Salud Pblica, 2003)

La Red de Laboratorios de Alimentos se conform en el ao 2000 con 20 laboratorios


(2 de Universidades, 2 de Supermercados, 6 de Industrias y 10 particulares), para
iniciar con ellos el proceso de estandarizacin de tcnicas y procedimientos. Al ao
2003 se contaba con 104 laboratorios clnicos (76 privados y 28 pblicos), 40
laboratorios de citopatologa (39 privados y 1 pblico), 25 laboratorios privados de
alimentos y 25 laboratorios de Tamizaje neonatal (15 privados y 10 pblicos) (Ver
Figura 1.).

R E D D E L AB O R AT O R IO S
1 20

C LIN IC O S
A LIM E N TO S
C ITO P A TO LO G A
TA M IZA JE N E O N A TA L
TO XIC O LO G A

1 00

104
82

85

80
54

60

60
35

40
20

20

20

20

22

20

40
25 25
8

0
19 89

19 98

2 000

Figura 1. Estadsticas de la Red de Laboratorios

48

2 00 1

200 2

200 3

Fuente: Secretara Distrital de Salud: Prospectiva del Laboratorio Distrital de Salud Pblica, 2003

El enfoque de riesgo establecido en el sistema de vigilancia ambiental, permiti que


el uso de esta red fuera cada vez ms racional. Esto se evidenci en el total de anlisis
realizados en los laboratorios de fsico qumico y microbiologa de alimentos al
reducir de 20.000 muestras en los aos 1998 y 2000 a un promedio de 11.200 en los
aos 2001-2003 (Ver Tabla 3) (Secretara Distrital de Salud: Prospectiva del
Laboratorio Distrital de Salud Pblica, 2003).

Los procesos de estandarizacin a los grupos operativos y la elaboracin de


protocolos han sido pilares en este proceso de mejoramiento. Esto se evidencia por
ejemplo en los anlisis realizados a los alimentos clasificados como de menor riesgo
que pasaron de 6000 muestras en el ao 1998 a un nmero de 400 en el ao 2002
(Ver Tabla 3).

Tambin se determin en conjunto con los diferentes grupos de trabajo y a la luz del
decreto 475 sobre vigilancia de la calidad del agua, establecer con claridad un
muestreo adecuado en las pruebas analticas de agua, disminuyendo de 9000 a un
promedio de 6000 por ao, que garantiza la vigilancia adecuada de la calidad de agua
de consumo humano (Secretara Distrital de Salud: Prospectiva del Laboratorio
Distrital de Salud Pblica, 2003).

Tabla 3. Grupos de alimento analizados en el Laboratorio de Salud Pblica,


grupo de Vigilancia del Ambiente y del Consumo, aos 1998 - 1999 2000
2001 2002

1998

1999

2000

2001

2002

Aguas

6668

9933

6039

6005

5501

Mayor Riesgo

6867

10641

3591

1816

3094

49

Menor Riesgo

6042

Bebidas alcohlicas

823

Control Especial

1714

1244

298

202

413

892

822

1272

642

553

1377

410

457

181

181

Control de Calidad
Medicamentos

217

55

Microbiologa Ambiental
Total

11
22114

22035

11517

9989

12306

Fuente: Secretara Distrital de Salud: Prospectiva del Laboratorio Distrital de


Salud Pblica, 2003

La tabla 3 tambin permite apreciar cmo el correcto funcionamiento de la red de


laboratorios de alimentos permite el aumento en el nmero de anlisis con otras
entidades como las de control de calidad que incluye la supervisin indirecta a los
laboratorios de la red y las pruebas interlaboratorios que realiza el Laboratorio de
Salud Pblica (LSP) con otras entidades como el Instituto Nacional de Vigilancia de
Medicamentos y Alimentos (INVIMA) y el Instituto Nacional de Salud (INAS).

El Programa Interlaboratorios de Control de Calidad para Agua Potable (PICCAP),


fue creado por el grupo de Salud Ambiental- SNRL del Instituto Nacional de Salud.

El programa consta de 3 envos al ao, de muestras sintticas que se preparan y


envasan en ampollas de vidrio, que son

empacadas y embaladas en material

apropiado. Con estas muestras control se determinan los parmetros bsicos


contemplados en el Decreto 475 de 1998. Los resultados se tratan estadsticamente
para establecer el rango de resultados vlidos: a) Clculo de ndices de variacin
individual y mvile para determinar el desempeo del laboratorio, b) elaboracin de
informes parciales y anuales para cada participante.

50

El Programa PICCAP ha impulsado la adecuacin y el desarrollo de los Laboratorios


de Salud Pblica y la estandarizacin de metodologas para generar resultados
confiables. Actualmente hay 218 laboratorios inscritos, convirtindose el PICCAP en
uno de los mejores programas de control de calidad externo de pas (Crubellati, R. et
al, 2007).

5.2.

MODELO

MATEMTICO

PRELIMINAR

BSICO

PARA

LA

VALIDACIN DE MTODOS MICROBIOLGICOS ESTNDAR

La variabilidad representa la verdadera heterogeneidad de la poblacin microbiana,


esto como consecuencia del sistema fsico, bioqumico y micro-ecolgico de la
muestra. En la microbiologa tradicional la estabilidad de la muestra es considerada
como la variabilidad,

pero en el modelo que se propone la variabilidad y la

incertidumbre forman un todo coherente despus de un tiempo fijo.

Debido a lo anterior, se propuso un modelo de validacin en microbiologa de


proceso modular. Basndonos principalmente en la validacin orientada a la muestra
como propuesta en este modelo, herramientas matemticas como la distribucin de
Poisson y la distribucin binomial negativa, permiten realizar diferentes estimaciones
a partir de datos microbiolgicos obtenidos desde la aplicacin de un mtodo,
permitiendo tomar determinaciones a cerca del funcionamiento de este. Cuando los
datos son obtenidos a partir de repeticiones de anlisis de la misma muestra bajo
condiciones constantes, se analizan aplicando la distribucin de Poisson y los datos
obtenidos a partir de muestras recolectadas de diferentes sitios son analizados
aplicando la distribucin binomial negativa.

Esta gua plantea metodologas no solo matemticas sino practicas ya que especifica
adems, la toma de la muestra, el nmero de muestras tomadas, el mtodo de
muestreo, entre otras variables que podran o no afectar los resultados de la
validacin de un mtodo microbiolgico, en caso que no se obtengan resultados

51

adecuados implicara la realizacin del proceso nuevamente y esto acarreara perdida


de tiempo y aumento de los costos de la validacin que no es un proceso econmico
en su implementacin (Ver Anexo 1).

Por otro lado, teniendo en cuenta que los anlisis microbiolgicos

repercuten

directamente en la salud tanto humana como animal, los mtodos de ensayo, como
los laboratorios que realizan los anlisis deben asegurar los resultados fiables, lo cual
implica que adems de reunir los aspectos tcnicos que aseguren su validez, se deben
poder reproducir

y realizar con una serie de precauciones que conlleven a la

obtencin de resultados comparables, independientemente del laboratorio que los


realice.

Para dar cumplimiento al propsito establecido por la ISO/IEC 17025 segn la cual
la validacin es la confirmacin, a travs del examen y el aporte de evidencias
objetivas, de que se cumplen los requisitos particulares para un uso especfico
previsto, se hace necesario el conocimiento de las caractersticas de funcionamiento
del mtodo teniendo en cuenta que la validacin de los mtodos microbiolgicos no
puede realizarse igual a la de mtodos fsicos o qumicos debido a la variabilidad que
se puede presentar. Sin embargo, un laboratorio que realice actividades de control de
calidad interno y adems participe en actividades interlaboratorios que lleven a cabo
comparaciones, est en la capacidad de obtener informacin sobre las caractersticas
de funcionamiento de los mtodos.

La participacin en actividades interlaboratorios permite el anlisis del sesgo,


accediendo el laboratorio as a demostrar su permanencia dentro de los rangos de
aceptacin definidos segn las diferentes normas especificadas bien sea por el
laboratorio, por el cliente o por entidades estatales.

Debido a la carencia en la difusin de la informacin sobre estudios de validacin ya


realizados, se hace necesaria la coordinacin de todos los entes que participan en el

52

desarrollo de mtodos para la validacin con el fin de obtener metodologas ms


completas, que faciliten al personal la toma de decisiones correctas en el proceso.

Al ser el objetivo de esta gua facilitar a los laboratorios la implementacin de la


validacin de sus pruebas microbiolgicas, se pudo determinar

a travs de las

referencias consultadas que por la dificultad del tema no es fcil que las personas
involucradas en procesos microbiolgicos se comprometan con el tema de la
validacin, a pesar de saber que para garantizar los resultados obtenidos en los
anlisis, se debe contar con metodologas, materiales y personal validado. Debido a
que los laboratorios se han preocupado nicamente en implementar metodologas
aceptadas por entes nacionales e internacionales, se ha olvidado el hecho de
comprobar si el mtodo es capaz de alcanzar su rendimiento segn las publicaciones
realizadas por estos entes (o si es capaz de cumplir los requisitos de las tareas
analticas). El laboratorio debe realizar estudios de validacin de esas metodologas
publicadas en las condiciones y ambiente en las que se desarrollan sus actividades:
EL LABORATORIO DEBE UTILIZAR UN MTODO BIEN ESTABLECIDO,
PERO NO ESTUDIADO DE FORMA COLECTIVA (OENO, 2005) (AOAC
INTERNATIONAL, 2003), ya que el desempeo de los materiales, del personal y en
si de las pruebas de ensayo puede variar. Por ello lo que propone la gua debe ser
implementado y probado en las condiciones en las que se realizan normalmente los
ensayos, por lo que la comparacin de los resultados de un laboratorio que ha
validado sus pruebas, no puede llevar al hecho de asumir los mismos resultados en
otro laboratorio.

Para seguir la metodologa planteada por esta gua se discute tambin no solo la
competencia de las condiciones ambientales sino tambin de los materiales, as como
la ms crtica y de gran importancia, la competencia tcnica para desarrollar las
metodologas fuera y dentro del laboratorio (Cuesta, Alicia).

53

Al hablar de capacidad tcnica y condiciones ambientales favorables para el


desarrollo de la validacin, se debe hablar tambin de la utilizacin de elementos que
faciliten el proceso; como equipos, reactivos, medios de cultivo y cepas de referencia.
Esta ultima de gran importancia ya que se deben tener cepas de referencia para la
validacin de mtodos microbiolgicos estndar (tema de esta investigacin) y
mtodos microbiolgicos alternos. Por supuesto que la utilizacin de materiales y
condiciones favorables son indispensables en cualquier proceso de validacin, pero
en el caso de esta gua se hablara de cepas de referencia, su conservacin,
reconstitucin y obtencin de cepas de trabajo. (ISO 11133-1. 2000) Ya que del
tratamiento de stas dependen los resultados de la validacin de los ensayos.

54

6. CONCLUSIONES

A pesar de encontrar disponibilidad de informacin sobre validacin, se concluye


que la falta de inters, la falta de cultura de calidad, la desinformacin, la falta de
personal capacitado, la escasez de recursos y la falta de incentivos y motivacin
por parte de las entidades del Estado, dificultan la implementacin de los
procedimientos de validacin en los Laboratorios de Microbiologa.

El modelo propuesto es una herramienta preliminar para abordar el tema de la


validacin, sin embargo, debe haber continuidad de los planteamientos
matemticos tratados en la gua.

La tcnica, la matriz y la variable son factores influyentes en el proceso de


validacin ya que dependen especficamente del objetivo del mtodo abordado
por el analista, por lo tanto es importante diferenciar el tipo de matriz para as
poder definir la tcnica o metodologa a aplicar y poder hallar la variable de
inters de forma adecuada.

El conjunto de herramientas matemticas propuestas, plantea a partir de la


estadstica no paramtrica, la estimacin de la exactitud y precisin de las
mediciones microbiolgicas con el fin de poder expresar cuantitativamente las
observaciones que se hacen a nivel de microbiologa estndar.

La distribucin de Poisson y la binomial negativa permiten por medio de datos


obtenidos a travs de diferentes condiciones de muestreo, realizar estimaciones
que permitan tomar decisiones sobre los mtodos utilizados en las validaciones a
realizar.

55

7. RECOMENDACIONES

En lo posible, deberan realizarse los estudios necesarios para obtener una


estimacin realista del nmero y la gama de efectos que se producen durante el
uso normal de un mtodo, al tiempo que se deben analizar la gama de
concentraciones y de tipos de muestra que abarca el mtodo.

Se debe hacer seguimiento al modelo matemtico planteado en este trabajo, con el


fin de especificar, mejorar y profundizar todos los aspectos que en este se definen

Se recomienda la realizacin de un protocolo o de otra gua que contemple la


validacin de mtodos microbiolgicos alternos, para abarcar y avanzar ms en el
tema de la validacin en microbiologa.

Realizar estudios complementarios, incluyendo estudios prcticos donde se


realice un despliegue especfico de propiedades de las validaciones como
reactivos y medios de cultivo, equipos, cepas de referencia, entre otros.

Se sugiere inculcar en los diferentes laboratorios el inters por la implementacin


de procedimientos que permitan la mejora continua en los mtodos utilizados.

Validar

e implementar la aplicacin de la presente gua o de documentos

similares en laboratorios de pruebas y ensayos, que faciliten el proceso de


validacin de estos.

56

8. REFERENCIAS

AOAC. Peer-Verified Methods SM Program, AOAC Internationall, Gaithersburg,


MD20877-2417, USA

AOAC Research Institute. AOAC Performance Tested Methods SM Program,


AOAC International, Gaitherburg, MD 20877-2417, USA

AOAC INTERNATINAL. AOAC International Cuts the Number of Laboratories


Required

for

Collaborative

Study.

Downloaded

from

http://64.55.218.151/pubs/storyarchives/cutlabs.htm. 8/28/2003

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Facultad

de

Ciencias.

Microbiologa

Industrial.

Pontificia

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