OBTENCIN DE COLAGENO A PARTIR DE CRESTAS DE POLLOS.

CHRISTIAN DAIVID CASTRO VARGAS

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS BSICAS
ESCUELA DE QUMICA
BUCARAMANGA
2012

OBTENCIN DE COLAGENO A PARTIR DE CRESTAS DE POLLOS.

CHRISTIAN DAIVID CASTRO VARGAS

Proyecto de Grado Modalidad Investigacin presentado como requisito para optar
por el ttulo de Qumico.

DIRECTOR:
Herminsul de Jess Cano Calle, Ph.D.

DIRECTOR:
Cristian Blanco Tirado, Ph.D.

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS BSICAS
ESCUELA DE QUMICA
BUCARAMANGA
2012
2

DEDICATORIA

A mis padres, Maritza y Pedro por todo el amor y cario que me han brindado toda
la vida, por el apoyo incondicional en cada proyecto que tomo y los buenos
consejos, los AMO.

A mi abuela Oliva que ha sido mi segunda madre toda mi vida, eres un amor de
mujer ojala todas las personas te conocieran y siguieran tus consejos.

A mi hermanita Angie que me ensea da a da como los tiempos cambian y que a

pesar de las alegras, tristezas y rabietas siempre olvida todo rpido y muestra esa
linda sonrisa que alegra mis das, siempre contaras conmigo hermanita.

A July Gmez, por brindarme su compaa, cario y comprensin durante gran

parte de mi vida universitaria, por ser mi apoyo durante momentos difciles, por
ensearme muchas cosas bonitas de la vida, gracias por aportar tantas cosas
positivas en mi vida; logramos crear una historia que nunca olvidar.

A la familia Gmez Pereira, por abrirme las puertas de su casa en una etapa muy
importante en mi desarrollo como persona y profesional, siempre los llevo
presentes y nunca los olvidare.

A todos mis amigos, William, Carlos, Jose, Oscar, Jesica, Cindy, Julieth, Lina,
Marisol, Mafe, Javier, Camila, Jhon, Johana, Hernan, Diego, Carlos, Cesar y Juan

Carlos, todos personas especiales que llevaran un lugar en mi corazn por todos
los momentos compartidos, mil gracias por todo.

A los profesores, Herminsul, Cristian y Yajaira por el apoyo y confianza para

alcanzar esta meta.

Finalmente y no menos importante a Dios por darme la fe, la fortaleza y la

esperanza para culminar esta etapa.

AGRADECIMIENTOS

Al Doctor Herminsul Cano, por las enseanzas recibidas, la dedicacin, confianza

y apoyo incondicional, un nuevo amigo en este juego de la vida.

Al Doctor Cristian Blanco, por la codireccin del proyecto y ser siempre eje
fundamental del desarrollo del mismo, gracias por las correcciones y aportes.

A la Doctora Stelia Carolina Mndez, por tomarse el tiempo de calificar este

trabajo y aportar con su conocimiento al desarrollo del mismo.

A Jessika Hernndez, por el tiempo y dedicacin en compartir sus conocimientos

en electroforesis, tambin por ser un gran apoyo en momentos difciles y ser una
gran amiga siempre dispuesta a ayudar.

A Johanna Flrez, por convertirse en una gran amiga y compaera de laboratorio,

sacar tiempo para leer y corregir este proyecto, tambin por sacar tiempo para
sacarme sonrisas en tiempos difciles.

A Csar Ariza por su gran colaboracin al momento de liofilizar las muestras,

eternamente agradecido.

A los Doctores, Rodrigo Torres y Claudia Ortiz, por abrirme las puertas del
laboratorio de Bioqumica y permitirme desarrollar el proyecto.

A todos los compaeros del laboratorio de Bioqumica por compartir conmigo

largas jornadas de trabajo y momentos de esparcimiento.

A la Doctora Yajaira Combariza, por los anlisis de espectrometra de masas y

aportes al desarrollo de la investigacin.

A Martha Liliana Chacn por su gran aporte de conocimientos en el rea analtica

de esta investigacin.

Por ltimo a todas las personas que directa o indirectamente estuvieron vinculadas
de una u otra forma a este proyecto, colaborando para sacarlo adelante a pesar de
los contratiempos.

CONTENIDO
INTRODUCCIN ................................................................................................... 15
1. DEFINICIN DEL PROBLEMA ...................................................................... 17
1.1.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ....................................................... 17

1.2.

JUSTIFICACIN ....................................................................................... 18

2. OBJETIVOS .................................................................................................... 19
2.1.

OBJETIVO GENERAL .............................................................................. 19

2.2.

OBJETIVOS ESPECFICOS ..................................................................... 19

3. MARCO DE REFERENCIA............................................................................. 20
3.1.
3.2.

PROCESO DE EXTRACCIN .............................................................. 20

MARCO TERICO ................................................................................... 21

3.2.1.

Estructura del colgeno ...................................................................... 21

3.2.2.

Usos y aplicaciones del colgeno ...................................................... 22

3.2.3.

Fuentes de obtencin ......................................................................... 23

3.2.4.

Tcnicas Analticas ............................................................................ 23

3.2.7.1. Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio

(SDS) ........................................................................................................... 24
3.2.7.2. Espectrometra de Masas - MALDI/TOF ........................................ 24
3.2.7.3. Espectroscopia Ultravioleta-Visible ................................................ 25
4. METODOLOGA ............................................................................................. 26
4.1. DISEO EXPERIMENTAL .......................................................................... 26
4.1.

PREPARACIN DE LA MATERIA PRIMA ............................................... 27

4.2.

EXTRACCIN Y PURIFICACIN DEL COLGENO ............................... 29

4.3.1.

Dilisis ................................................................................................ 30

4.3.2.

Liofilizacin ......................................................................................... 30

4.4.

CARACTERIZACIN DEL COLGENO .................................................. 32

4.4.1.

Perfil Proteico - Electroforesis ............................................................ 32

4.4.2.

Espectroscopia UV-Vis....................................................................... 34

4.4.3.

Espectrometra de Masas .................................................................. 34

5. RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS ........................................... 36

9

5.1. EXTRACCIN DE COLGENO .................................................................. 36

5.2. DETERMINACIN DEL PERFIL PROTEICO DE LAS EXTRACCIONES DE
COLGENO ....................................................................................................... 38
5.3.

ESPECTROSCOIA UV-VIS ...................................................................... 42

5.4.

ESPECTROMETRA DE MASAS ............................................................. 44

CONCLUSIONES .................................................................................................. 45
RECOMENDACIONES .......................................................................................... 46
BIBLIOGRAFA ..................................................................................................... 47

10

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estructura de las fibras de colgeno.. .................................................... 21

Figura 2. Cambio en la estructura tridimensional del colgeno al reemplazar un
residuo de glicina por alanina. ............................................................................... 22
Figura 3. Representacin grfica del diseo experimental. .................................. 27
Figura 4. Crestas enteras y picadas...................................................................... 28
Figura 5. Crestas cortadas y listas para licuar.. .................................................... 28
Figura 6. Muestra homognea, lista para ser tratada.. .......................................... 29
Figura 7. Liofilizador marca labconco lyph-lock..................................................... 31
Figura 8. Rampas de temperatura y tiempo programadas en el liofilizador. ......... 31
Figura 9. Montaje utilizado para realizar electroforesis en geles de poliacrilamida
SDS.. ..................................................................................................................... 33
Figura 10. Gel de SDS-PAGE al 7.5% sin tratar las muestras con pepsina;
tratamiento 24 h -26C. .......................................................................................... 38
Figura 11. Geles de SDS-PAGE al 10%: A) tratamientos de 12 horas y 24 h. B)
tratamientos de 36 horas. ...................................................................................... 40
Figura 12. Electroforesis (SDS-PAGE) de colgeno tipo I de diferentes especies
animales ................................................................................................................ 41
Figura 13. Espectros UV-Vis del colgeno extrado; tratamiento con pepsina
durante 36 horas. .................................................................................................. 43
Figura 14. Espetros UV-Vis de colgeno tipo I de diferentes espcies animales. 43
Figura 15. Espectro de masas del colgeno tipo I, utilizando UV-MALDI-MS. ...... 44

11

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Variables a modificar. Fuente: el autor. ................................................... 26

Tabla 2. Componentes y volmenes para el gel de separacin. ........................... 32
Tabla 3. Composicin del buffer de corrido. .......................................................... 32
Tabla 4. Composicin de la solucin colorante y las decolorantes........................ 34
Tabla 5. Cantidades tratadas y cantidad de colgeno obtenido. ........................... 36
Tabla 6. Rendimientos y desviaciones estndar de las extracciones. ................... 37

12

RESUMEN
TTULO
OBTENCIN DE COLAGENO A PARTIR DE CRESTAS DE POLLO.*

AUTOR
CASTRO VARGAS, CHRISTIAN D. **

PALABRAS CLAVE
COLAGENO, CRESTAS DE POLLO.

CONTENIDO: debido a la gran demanda de colgeno en la industria farmacutica, cosmtica y

de biomateriales en la presente investigacin se extrajo colgeno de las crestas de pollos,
buscando dar un valor agregado a este subproducto de la industria avcola Santandereana. El
atelocolgeno es producido por la eliminacin del telopptido de colgeno por accin de enzimas.
El propsito de este estudio fue evaluar el efecto de la digestin con pepsina a diferentes tiempos y
temperaturas; adicionalemente, se logr la caracterizacin de la protena obtenida por diferentes
anlisis fisicoqumicos y espectroscpicos. Por medio del anlisis de electroforesis se determin
que el atelocolgeno de las crestas de pollo estaba compuesto principalmente por colgeno tipo I.
El espectro de absorcin UV presenta un perfil en forma de campana que muestra un pico de
absorcin entre los 215 a 220 nm. La caracterizacin por espectrometra de masas demostr la
presencia de 3 bandas correspondientes a las tres cadenas que conforman el colgeno la 1 a
93.26 kDa, la 2 a 140.37 kDa y la a 283.76 kDa.
Mediante los procesos de extraccin implementados en este trabajo se obtuvo un rendimiento del
[8]
2.44% logrando superar los presentados por Lin y Liu en el 2006. Con base en esto se sugiere
que las crestas de pollo son una fuente de colgeno tipo I, lo que genera un valor agregado a uno
de los subproductos de la industria avcola.

__________________________
*Trabajo de Investigacin
** Facultad de ciencias bsicas. Escuela de Qumica. Director: Herminsul de Jess Cano Calle.
Director: Cristian Blanco Tirado.

13

ABSTRACT

TITLE
OBTAINING COLLAGEN FROM CHICKEN COMBS

AUTHOR
CASTRO VARGAS, CHRISTIAN D. **

KEYWORDS
COLLAGEN, CHICKEN COMBS

CONTENT: due to the high demand of collagen in the pharmaceutical, cosmetics and
biomaterials industry in this investigation was extracted collagen from chicken combs, looking to
add value to the product of the poultry industry Santandereana. The atelocollagen is produced by
removal of the telopeptides of collagen by enzymes. The purpose of this study was to evaluate the
effect of digestion with pepsin at different times and temperatures; Also being achieved
characterization of the protein obtained by different physico-chemical and spectroscopic analysis.
By means of analysis of electrophoresis was determined that the crests of atelocollagen was
composed mainly of chicken collagen type I. The UV absorption spectrum has a bell-shaped profile
which shows an absorption peak between 215 to 220 nm. The characterization by mass
spectrometry showed the presence of three bands corresponding to the three collagen chains
comprising the 1 to 93.26 kDa, 2 to 140.37 kDa and to 283.76 kDa.
By means extracting processes implemented in this paper yield was obtained of 2.44% able to
[8]
overcome those presented by Lin and Liu in 2006. Based on this it is suggested that the crests of
chicken are a source of type I collagen, creating added value to one of the byproducts of the poultry
industry.

__________________________
*Work Degree
** Faculty of Basic Sciencies. Director: Herminsul de Jesus Cano Calle. Director: Cristian Blanco
Tirado.

14

INTRODUCCIN

El colgeno es una de las protenas ms abundantes en tejidos de animales.

Estas protenas hacen parte la matriz extracelular y le brindan propiedades
mecnicas, tales como la elasticidad, a los tejidos conectivos.

[12]

Estructuralmente

el colgeno tipo I est constituido por tres cadenas polipeptdicas denominadas

1, 2 y .

[20]

Estas cadenas se entrelazan para construir unidades de protenas

de hasta 280 kDa.

En la naturaleza se encuentran 28 tipos de colgeno que se diferencian por su
secuencia aminoacdica y sus diferentes funciones.[20] El colgeno tipo I es el ms
abundante de todos los colgenos y es de gran importancia en el campo de los
biomateriales, la industria farmacutica y cosmtica lo que ha impulsado la
investigacin para encontrar nuevas fuentes de obtencin de esta protena.
En los ltimos aos se han realizado diversos estudios para la obtencin de
colgeno tipo I de las diferentes partes del pollo como las patas, la piel y las
crestas.[3, 11] Se ha demostrado que el colgeno de las patas de los pollos es una
mezcla de de los tipos I y II, lo cual no es apetecido en la industria; [3] por otro lado
el colgeno proveniente de la piel del pollo se encuentra en una proporcin muy
baja, solo 860g de protena por cada 100kg de materia prima son obtenidos de
esta fuente, lo cual explica el poco inters por la utilizacin de esta materia prima.
[4]

Como consecuencia, las crestas, subproducto del sacrificio de pollos, son una

fuente importante de colgeno tipo I, pues se sabe que contienen alrededor del 1.6
% de colgeno en relacin w/w.[11]
Las diversas aplicaciones industriales del colgeno crea la necesidad de tener una
fuente de esta protena que permita su fcil extraccin y que su rendimiento sea lo
suficiente alto para reducir costos de produccin y abastecer parte de la demanda
de esta fuente de protena.

15

Como se establece en el plan de desarrollo departamental de Santander 20122015: La industria avcola de Santander ha venido evolucionando de manera
favorable en los ltimos aos, lo que le ha permitido consolidarse dentro de la
estructura actual de la economa colombiana y de manera particular en la
estructura econmica del departamento de Santander.[18] Como consecuencia del
establecimiento de la industria avcola se genera una gran cantidad de
subproductos, entre los cuales se encuentran: patas, vsceras, crestas, cabezas,
entre otros. En vista que las crestas son una fuente de colgeno tipo I, nosotros
consideramos que es importante disear metodologas que permitan su
extraccin, purificacin, industrializacin y comercializacin, de manera que se
contribuya con aumentar el valor agregado de la produccin avcola en Santander.
Por esta razn en este trabajo se estudiaron las variables, a nivel de laboratorio,
que permitan establecer las condiciones ptimas para la extraccin de colgeno
tipo I de crestas de pollos.
En el desarrollo de la investigacin se modificaron dos variables, el tiempo y la
temperatura de digestin con pepsina. El colgeno obtenido se caracteriz por
espectrometra de masas, espectroscopia UV-VIS y anlisis de electroforesis para
confirmar la presencia de las tres hlices polipeptdicas. Al analizar los resultados
obtenidos se pudo concluir que las crestas son una fuente importante para la
obtencin de colgeno obtenindose rendimientos de hasta el 2.44%
Este proyecto fue financiado y realizado en el Grupo de Investigacin en
Fisicoqumica Terica y Experimental (GIFTEX) en conjunto con el Grupo de
Investigacin en Bioqumica y Microbiologa (GIBIM).

16

1. DEFINICIN DEL PROBLEMA

1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Gran parte del colgeno utilizado en las industrias farmacutica, cosmtica y de
biomateriales es importado del continente europeo, lo cual se ve reflejado en los
altos costos de los productos que utilizan esta protena como principio activo.
Debido a que estas industrias estn en constante desarrollo y expansin es de
gran importancia tener un proveedor a nivel nacional que permita la reduccin de
costos y tiempos de entrega del colgeno. Esto sera posible si se lograra obtener
una fuente importante de colgeno que sea de fcil acceso y de constante
produccin en Colombia.
La industria avcola genera varios residuos que pueden ser aprovechados para la
obtencin

de

investigaciones.

colgeno

tipo

como

se

ha

demostrado

en diferentes

[12, 20, 3, 11]

En el 2011, el sector avcola santandereano produjo

300.000 toneladas de pollo, representando el 26% de la produccin nacional.[18]

Estos ndices de produccin presentan a Santander como una opcin para el
desarrollo de este tipo de industria. Por esta razn se busca optimizar una
metodologa de extraccin de colgeno tipo I, aprovechando las crestas de pollo
criado en el departamento de Santander.

17

1.2.

JUSTIFICACIN

La produccin de carne de pollo, en Santander, genera una gran cantidad de

subproductos los cuales se utilizan para producir alimentos concentrados,
principalmente. Sin embargo estos subproductos son una alta fuente de protena.
Por ejemplo, a partir de las crestas se puede extraer entre el 1 y 1.6% de colgeno
tipo I. [8] Con la extraccin selectiva de este tipo de protenas consideramos que es
posible generar valor agregado a la cadena productiva avcola del departamento.
Adicionalmente, el aislamiento y produccin de estas nueva sustancias permite el
desarrollo de nuevas industrias como la farmacutica y la de productos
cosmticos. La investigacin en dichas reas es de gran importancia, pues estos
centros se enfocan principalmente en temas como: el envejecimiento, la
desaparicin de cicatrices y manchas en la piel. Estas investigaciones dependen
en parte de la disposicin de colgeno ya que este es uno de los principios activos
en los productos utilizados en la regeneracin celular.
El colgeno es ampliamente utilizado en la medicina como un sistema
biodegradable para la liberacin de una gran variedad de drogas, incluyendo
anticonceptivos, antibiticos, insulina, hormonas del crecimiento entre otras. El
colgeno en forma de fibras se ha utilizado en el cierre de heridas quirrgicas e
incisiones.[21] Se utiliza como material de sutura para modificar la velocidad de
absorcin y para permitir la retencin de la resistencia prolongada. Las suturas de
colgeno puro se utilizan en ciruga oftlmica, as como para otras aplicaciones.[18]
Debido a la posibilidad de utilizar los subproductos de la industria avcola para la
produccin de colgeno tipo I, consideramos que este trabajo ser de gran
impacto porque permite establecer las condiciones, a nivel de laboratorio, para el
posible escalamiento e industrializacin de esta protena.

18

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GENERAL

Optimizar un procedimiento de extraccin de colgeno a partir de crestas de pollo,
producto del proceso de sacrificio avcola en Santander.

2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS

2.2.1. Evaluar el efecto de la temperatura y el tiempo de incubacin de la
pepsina para la obtencin de colgeno tipo I.
2.2.2. Utilizar reactivos grado comercial y de fcil consecucin para la
extraccin selectiva de colgeno tipo I de las crestas de pollo
producido en las plantas de sacrificio de aves en el departamento de
Santander.
2.2.3. Caracterizar

el

colgeno

por

medio

de

diferentes

tcnicas

instrumentales con miras a certificar la calidad y pureza del colgeno

obtenido.
2.2.4. Cuantificar el rendimiento a escala de laboratorio de la produccin de
colgeno tipo I a partir de las crestas de pollo.

19

3. MARCO DE REFERENCIA

3.1.

PROCESO DE EXTRACCIN

La primera investigacin relacionada con la extraccin de colgeno de fuentes

naturales fue realizada en Japn por Nagai y Suzuki,

[13]

los cuales obtuvieron

colgeno de diferentes especies de pescado utilizando la piel, el hueso y las

aletas. En esta investigacin se analiz el perfil proteico de las cadenas y de
colgeno con un patrn de pesos moleculares.
Una de las propiedades a tener en cuenta segn esta investigacin es la
temperatura de desnaturalizacin de la protena, que en la investigacin realizada
por Nagai y Suzuki se encuentra en un rango de 25 a 26.5C para las diferentes
especies de pescado utilizadas.
Despus de ser ampliamente investigado y de corroborar que el colgeno se
poda extraer de pieles de pescados, el mundo cientfico se abalanz sobre otro
tipo fuentes de colgeno entre las que se encuentran: las patas de las aves, [11,8] la
[6,24]

piel bovina,
pescado

[14]

los pollos

el tendn de los equinos

, las medusas

[3]

[15]

[1]

, la piel del sapo

, la piel porcina

[16]

[7,19]

, las escamas del

, la piel del tiburn

[17]

y la piel de

. Todas estas investigaciones se fundamentaron en el procedimiento

propuesto por

Nagai y

Suzuki en 1999; y

Lin, Y. K. y Liu, D. C. en 2006

modificando levemente los tiempos y temperaturas de extraccin.

20

3.2.

MARCO TERICO

3.2.1. Estructura del colgeno

Estructuralmente, el colgeno est constituido de una hlice triple de tres cadenas
polipeptdicas diferentes, las cuales se mantienen unidas por enlaces de
hidrogeno.[20] En 1994 se report por primera vez la estructura cristalina del
colgeno (Figura 1) mostrando que es una protena rica en prolina, glicina e
hidroxiprolina; aminocidos que le confieren su estructura caracterstica. Cualquier
cambio en la secuencia de aminocidos, cambia la conformacin espacial de la
protena, como se observa en la figura 2 en la cual se ha reemplazado un residuo
de glicina por alanina.

Figura
1.
Estructura
de
las
fibras
de
colgeno.
Fuente:
http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=4 consultada 10 de agosto de
2012.

21

Figura 2. Cambio en la estructura tridimensional del colgeno al reemplazar un

residuo
de
glicina
por
alanina.
Fuente:
http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=4 consultada 10 de agosto de
2012.

3.2.2. Usos y aplicaciones del colgeno

El colgeno posee propiedades nicas que le permiten ser utilizado en diferentes
aplicaciones

industriales,

e.g.

como

farmacutica, cosmtica y en alimentos.

materiales

biomdicos,

la

industria

[21]

Un biomaterial es una sustancia farmacolgicamente inerte diseada para ser

implantada o incorporada dentro del sistema vivo.

[22]

Los biomateriales ms

usados son las aleaciones metlicas, polmeros, cermicos y sustancias

biolgicas. Entre las sustancias biolgicas, el colgeno ha sido uno de los ms
empleados y ms comerciales.

22

La principal aplicacin del colgeno en la industria farmacutica y cosmtica es el

tratamiento de arrugas, desaparicin de manchas de la piel y el encapsulamiento
de medicamentos lo que facilita la administracin y dosificacin del mismo. De
igual manera, se ha utilizado en la fabricacin de productos cosmticos para el
fortalecimiento del cabello y la reduccin de horquilla.

[22]

3.2.3. Fuentes de obtencin

Los residuos de la piel, huesos y cartlagos bovinos y porcinos representan hoy
da la principal fuente de extraccin de colgeno en la industria. Pero una de las
dificultades que presenta este tipo de colgeno es que no puede cubrir todos los
mercados debido a limitaciones socio-culturales. Adems el costo de obtencin de
colgeno a partir de los bovinos y porcinos es elevado, debido al alto valor que
tiene la cra de este tipo de animales y la baja productividad que se puede obtener
de colgeno. [3]

La problemtica anterior ha obligado a la bsqueda de fuentes alternativas de

materia prima para la obtencin de colgeno, entre las estudiadas se encuentran
las patas de las aves, [11,8] la piel bovina, [6,24] el tendn de los equinos [1], la piel del
sapo

[7,19]

, las escamas del pescado

[14]

, las medusas

[15]

, la piel porcina

[16]

, la piel

del tiburn [17] y la piel de los pollos [3].

3.2.4. Tcnicas Analticas

Para la caracterizacin del colgeno se realizaron tres tcnicas analticas
diferentes, la electroforesis, la espectroscopia UV-VIS y la espectrometra de
masas.

23

3.2.7.1. Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio

(SDS)

La electroforesis es una tcnica de separacin de molculas gracias a la accin de

un campo elctrico. Las molculas disueltas se desplazan en un campo elctrico a
una velocidad determinada por su relacin carga-masa. Para llevar a cavo la
electroforesis se prepara el gel de electroforesis en medio de dos lminas de vidrio
y mediante la polimerizacin de una solucin de monmeros de acrilamida en
cadena de poliacrilamida. Para poder determinar el rango del peso molecular de
las molculas se utiliza un marcador de peso molecular. Finalmente el revelado se
realiza con azul de coomassie. [12]

3.2.7.2. Espectrometra de Masas - MALDI/TOF

Para la caracterizacin espectromtrica se utiliz la tcnica MALDI-TOF, la cual

utiliza una matriz para proteger a la biomolcula y facilitar la vaporizacin,[5] en
esta investigacin se empleo el acido cinmico dopado con un 1% de cido
trifluoroactico como matriz de soporte. La muestra es entonces irradiada con un
lser pulsado, como un lser de Nd:Yag de 355 nm. La energa del lser expulsa
iones de la matriz electrnicamente excitados, cationes y macromolculas
neutrales, que crean una densa nube de gas por encima de la superficie de la
muestra. La separacin de las molculas se da por su relacin masa-carga en un
analizador de tiempo de vuelo.

24

3.2.7.3. Espectroscopia Ultravioleta-Visible

El principio de la espectroscopia involucra la absorcin de radiacin ultravioletavisible (desde 160 hasta 780nm) por una molcula, causando la promocin de un
electrn de un estado basal a un estado excitado. [23]

La absorcin de radiacin UV-visible por una especie se da en 2 etapas:

1. La Excitacin electrnica: corresponde a los electrones involucrados en los
enlaces
2. La Relajacin. que puede ser por:
-

Emisin de calor

Reaccin fotoqumica

Emisin de fluorescencia / fosforescencia

Las bandas que aparecen en un espectro UV-visible son anchas, a causa de la

superposicion de transiciones vibracionales y electrnicas. [23]

25

4. METODOLOGA

4.1. DISEO EXPERIMENTAL

Para poder evaluar la repetitividad, precisin, desviacin estndar y dems

parmetros estadsticos se realiz un diseo experimental para determinar
cuntos experimentos se deban hacer, teniendo en cuenta que solo se iban a
modificar dos variables la temperatura y el tiempo de accin de la pepsina sobre la
materia prima (crestas), los tiempos y temperaturas a evaluar se registran en la
tabla 1.

Tabla 1. Variables a modificar. Fuente: el autor.

Temperaturas (C)
4
26
36

Tiempo (h)
12
24
36

Debido a que fueron solo dos variables el diseo resultante es cuadrtico como se
observa en la figura 3.

En la figura 3 se sealaron los puntos en los cuales se trabajaron bajo la accin de

la pepsina, teniendo en cuenta que cada experimento se realiz por duplicado y
que el punto en el cual se encuentran todas las proyecciones de los experimentos
(experimento de 24 horas a 26C) se le realizaron tres extracciones ms para
realizar la estadstica de las extracciones, se renen un total de 21 extracciones.

26

Tem. (C)
36

26

Tiempo (h)
12

24

36

Figura 3. Representacin grfica del diseo experimental.

4.1. PREPARACIN DE LA MATERIA PRIMA

Las crestas fueron seleccionadas de dos proveedores distintos, uno de pollos
criollos de los puestos de la plaza de mercado central y otro de una avicultora de
la planta de campollo de Rionegro-Santander.
Las crestas fueron prelavadas con agua destilada y cortadas en trozos pequeos
de aproximadamente 1 cm (Figura 4), para luego ser licuadas (Figura 5)
obteniendo una masa ms homognea como se muestra en la figura 6.

Las

muestras fueron almacenadas a -20 C en un congelador de laboratorio Thermo

Scintific forma Value FREF 2117A, para conservar la muestra y evitar su
descomposicin.

27

Figura 4. Crestas enteras y picadas. Fuente: el autor.

Figura 5. Crestas cortadas y listas para licuar. Fuente: el autor.

28

Figura 6. Muestra homognea, lista para ser tratada. Fuente: el autor.

4.2. EXTRACCIN Y PURIFICACIN DEL COLGENO

Se sigui el procedimiento descrito por Lin y Liu

[8]

para aproximadamente 100

gramos de cresta, modificando los tiempos y la temperatura de accin de la

pepsina en la muestra.
En primer lugar se realiz la eliminacin de las grasas y pigmentos mediante una
agitacin constante en etanol al 20% durante 24 h a 4C. El paso siguiente fue
centrifugar la muestra a 10.000 g por 20 minutos y se desech el sobrenadante en
el cual se encontraban todas la grasas presentes en el tejido tratado, este
procedimiento se realiz dos veces para asegurar la eliminacin total de la grasa y
los pigmentos no deseados.
Posteriormente se elimin la protenas no colgenas mediante agitacin constante
con NaOH 0.2 N por un tiempo de 24 h, para luego centrifugar nuevamente a
10.000 g durante 20 minutos y despus se desech el sobrenadante. A
continuacin se agrego 5% p/p de pepsina (EC 232-629-3, P-7000, Sigma,
EE.UU.) y 500 mL de acido actico 0.5 M al precipitado. La mezcla se someti a

29

diferentes temperaturas y tiempos de accin de la pepsina (tabla 2). La mezcla se

centrifug a 13.000 g durante 40 minutos, el sobrenadante se ajusto a pH 7.0
mediante NaOH 1 N y se mantuvo en agitacin durante 24 h para inhibir la
actividad de la pepsina, trascurridas las 24 h se ajust nuevamente el pH a 3.5 con
cido actico 0.5 M. Por ltimo, se aadi NaCl lentamente hasta una
concentracin final de 0.9 M para precipitar la protena, esta mezcla se centrifug
a 13.000 g durante 40 minutos, el precipitado resultante se disolvi en acido
actico 0.5 M. Se realiz dilisis frente a agua destilada con una membrana
(Spectra/ for Dialysis Membrane MWCO: 12-14,000). Finalmente la solucin fue
liofilizada en un liofilizador labconco lyph-lock para obtener la protena pura y seca.

4.3.1. Dilisis
Se utilizaron segmentos de 10 cm de longitud de una membrana para dilisis
marca Spectra con 20.4 mm dimetro. Estas bolsas formadas se sumergieron en
500 mL de agua destilada a 100C para activar los poros de la membrana, los
cuales permiten el intercambio inico. Posteriormente se cerr en uno de los
extremos y se adiciono la solucin de cido actico 0.5 M que contena la protena
disuelta; se anudo el otro extremo de la bolsa y se sumergi en agua destilada
durante 6 horas realizando un cambio del agua cada 2 horas.

4.3.2. Liofilizacin
Para el proceso de liofilizacin se utiliz un liofilizador marca labconco lyph-lock
(Figura 7), inicialmente los recipientes se llenaron a la mitad de su capacidad y se
congelaron en un refrigerador convencional durante 24 horas previas a la
liofilizacin. Se configur el correspondiente proceso de liofilizacin ingresando las
rampas de temperatura y tiempo (Figura 8). Se encendi la bomba de vaco y se
esper hasta alcanzar los 0.133 mbarr. Las muestras se mantuvieron congeladas

30

a -40C y al vaco durante 3 horas, luego a -10C durante otras 3 horas

conservando el vaco y finalmente a 25C durante 15 horas al mismo vaco
utilizado en los anteriores procesos. Cuando el equipo termino la etapa de secado
primario se procedi a realizar el cambio de manual a automtico. Finalmente al
terminar el proceso se retiraron los recipientes y se procedi a pesarlos para
calcular los rendimientos de cada extraccin.

Figura 7. Liofilizador marca labconco lyph-lock.

Figura 8. Rampas de temperatura y tiempo programadas en el liofilizador.

31

4.4. CARACTERIZACIN DEL COLGENO

4.4.1. Perfil Proteico - Electroforesis
Para obtener el perfil proteico se realiz electroforesis en geles de poliacrilamidaSDS, utilizando una cmara MiniProtean I marca Biorad. Se prepar una solucin
acuosa de la protena a 0.25 g/L de cada una de las extracciones realizadas; de
estas soluciones se tomaron 12 L y se mezclaron con 3 L de buffer de carga
para finalmente sembrarlas en geles al 10%. Estos geles se prepararon de
acuerdo al protocolo mostrado en la tabla 2. Despus de realizado el montaje se
utiliz como buffer de corrida la solucin mostrada en la tabla 4.

Tabla 2. Componentes y volmenes para el gel de separacin.

GEL DE CORRIDO

GEL DE STACKING

AL 10%

AL 5%

Agua destilada tipo I

1.9 mL

0.93 mL

Acrilamida-Bisacrilamida

1.7 mL

0.23 mL

1.3 mL

0.375 mL

Persulfato de Amonio

0.0025mL

0.015 mL

SDS al 10%

0.005 mL

0.03 mL

Temed

0.001 mL

0.0075 mL

COMPOSICIN

Tris-HCl pH=8.8 y pH=6.8

para stacking

Tabla 3. Composicin del buffer de corrido.

BUFFER DE CORRIDO
Tris Base

0.20%

Glicina

1.44%

SDS

0.10%

32

Fuente de
poder

Cmara de
electroforesis

Figura 9. Montaje utilizado para realizar electroforesis en geles de poliacrilamida

SDS. El voltaje utilizado fue de 120 V y una corriente de 3 A durante 1 hora y 30
minutos. Fuente: el autor.

Los geles fueron teidos con azul de Coomassie al 0.25% durante 1 hora, con el
fin de determinar el peso molecular de las protenas presentes en el colgeno.
Para conocer el respectivo peso molecular se utiliz como marcador de peso
FERMETAS, que contiene protenas entre los 10 y 200 kDa. A continuacin, se
sumergi el gel en una solucin decolorante fuerte durante 30 minutos y
finalmente en una solucin decolorante dbil durante 1 hora. En la tabla 5 se
muestra la composicin de la solucin colorante y las decolorantes para la tincin
con azul de coomassie R250.

33

Tabla 4. Composicin de la solucin colorante y las decolorantes.

SOLUCIN

SOLUCIN

DECOLORANTE

COLORANTE

FUERTE

SOLUCIN
DECOLORANTE DEBIL

Metanol 50%

Metanol 50%

Metanol 5%

cido actico 10%

cido actico 10%

cido actico 10%

Azul de Comassie 0.25%

4.4.2. Espectroscopia UV-Vis

Se prepararon soluciones de cada extraccin a una concentracin de 0.25 g /L
de protena para ser caracterizadas por un espectrofotmetro UV-Vis marca
Shimadzu UV-1601-1601 PC con un ancho de rejilla de 0.5 nm. Se realiz un
barrido desde los 200 nm hasta los 500 nm y se determin la longitud de onda
mxima caracterstica para cada solucin de las diferentes extracciones. La
solucin se coloc en una cubeta de cuarzo y la absorbancia resultante se calcul
empleando la ley de Lambert-Beer.

4.4.3. Espectrometra de Masas

Para complementar la identificacin del colgeno se empleo la tcnica de
ionizacin

suave

denominada

MALDI-TOF

(Matrix-Assisted

Laser

Desorption/Ionizatiom- Time of Fligth) que permite el anlisis de biomolculas y

molculas orgnicas de gran tamao.
La matriz empleada para este anlisis fue el cido cinmico utilizado por Klaus
Dreisewerd y colaboradores.[4] Se implement la metodologa de doble capa
siguiendo las recomendaciones del fabricante del equipo. Inicialmente se prepar

34

una solucin sobresaturada de cido cinmico en etanol al 99.99%, de la cual se

sembraron 2L sobre los posos del target, dejando secar en una cabina con el fin
de formar la primera capa. Para la segunda capa se sembraron en el target 2 L
de una mezcla en relacin 1:1 de las siguientes soluciones: una solucin de la
muestra en 0.1% de TFA ( cido tri-fluoroactico) y una solucin sobresaturada de
cido cinmico en TA ( solucin 1:2 acetonitrilo: agua con 0.1% de TFA).
El anlisis se llev a cabo en un espectrmetro Bruker UltrafleXtreme equipado
con un laser de estado slido de neodimio: YAG que opera a 355 nm. Con un 85%
de la energa del laser y sumando la seal de 3000 espectros.

35

5.

RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS

5.1. EXTRACCIN DE COLGENO

Los resultados de las diferentes extracciones se muestran en la tabla 5, en este

trabajo se contemplaron dos variables: el tiempo y la temperatura de accin de la
pepsina sobre las crestas.

Tabla 5. Cantidades tratadas y cantidad de colgeno obtenido.

Tratamiento
12h - 4C
12 h 26C
12h 36C
24h 4C

24h 26C

24h 36C
36h 4C
36h 26C
36h 36C

Peso de crestas
(g)
80.50
100.00
100.35
70.00
71.02
99.95
100.00
80.06
80.51
99.97
99.76
99.65
100.35
99.74
100.98
99.12
88.19
99.72
88.22
100.33
88.11

Peso de pepsina
(g)
5.19
5.07
5.03
4.88
4.62
4.99
5.01
5.05
5.04
5.02
4.96
5.01
5.05
5.07
4.96
4.90
5.02
5.02
4.98
5.05
4.94

Colgeno
obtenido (g)
0.6534
0.9845
1.0235
0.8334
0.6817
1.6057
1.0453
0.7596
1.1295
1.2193
1.2200
1.2412
1.2406
1.4533
2.1258
1.0438
0.8053
2.5503
2.0536
1.7671
1.7467

Los resultados obtenidos se promediaron, se calcul el rendimiento y desviacin

estndar mostrados en la tabla 6.

36

Tabla 6. Rendimientos y desviaciones estndar de las extracciones.

Tratamiento

Rendimiento (%)

Desviacin
estndar

12h 4C
12h 26C
12h 36C
24h 4C
24h 26C
24h 36C
36h 4C
36h 26C
36h 36C

0.90
1.11
1.28
1.00
1.27
1.78
0.98
2.44
1.87

0,12
0,12
0,46
0,07
0,08
0,46
0,10
0,16
0,16

Coeficiente
de Varianza
(%)
13,61
10,92
35,63
6,84
6,13
25,73
10,06
6,65
8,35

Al comparar los resultados obtenidos, se aprecia que el rendimiento alcanzado en

los diferentes tratamientos son muy similares a los obtenidos por Lin y Liu, [8] entre
el 0.7 y 1.6%. En este trabajo se logr un rendimiento significativamente mayor a
los reportados en la literatura, empleando el tratamiento de 36 horas y 26C con el
cual se obtuvo un rendimiento del 2.44%, lo cual incrementa en un 0.84% lo
esperado segn Lin y Liu.[8]
Por otro lado las desviaciones estndar obtenidas en cada uno de los
experimentos ejecutados muestran una alta reproducibilidad en las extracciones
realizadas. Los tratamientos de 24 horas 4C y 24 horas - 26C presentan
desviaciones estndar por debajo de 0.1 y con coeficiente de varianza inferior al
10%, lo que indica que fueron los tratamientos con mayor reproducibilidad, estos
resultados se evidencian en la tabla 5.
Al analizar la desviacin obtenida por el tratamiento que mostr mejores
resultados en cuanto al rendimiento de extraccin (36h-26C), se observa que su
desviacin estndar esta en un valor aceptable, ya que 0.16 no representa gran
incertidumbre en el proceso de extraccin y siguen presentando menos del 10%
en su coeficiente de varianza, cumpliendo con las buenas prcticas de laboratorio.

37

5.2. DETERMINACIN DEL PERFIL PROTEICO DE LAS EXTRACCIONES DE

COLGENO

Inicialmente se realiz la extraccin de colgeno de las crestas sin tratarlas con la

pepsina, con el fin de evaluar la posibilidad de no implementar este reactivo y
reducir en gran parte los costos de la investigacin. En la figura 10 se observan los
resultados obtenidos, donde se evidencian un gran nmero de protenas por
encima de los pesos esperados. Esto indica la posible formacin de dmeros y
trmeros de las cadenas alfa del colgeno y la presencia de otras protenas no
colgenas, lo cual evidencia que las extracciones realizadas no cumplen con los
resultados esperados ni los reportados en la literatura. [9] Por esta razn se decidi
utilizar la pepsina con el fin de realizar la ruptura de estos enlaces y
adicionalmente eliminar las protenas no colgenas que podran contaminar la
muestra final.

200
150
120

Figura 10. Gel de SDS-PAGE al 7.5% sin tratar las muestras con pepsina;
tratamiento 24 h -26C.

38

En la figura 11 se observan los resultados de la separacin de protenas en los

geles al 10% para cada mtodo de extraccin, las bandas de las cadenas alfa se
encuentran en el rango de los 100 y 120 kDa. Los perfiles de electroforesis solo
presentan 3 bandas de inters, las cadenas 1 y 2 se observan claramente en
todas las extracciones realizadas en aproximadamente 100 kDa y 120 kDa, estas
dos bandas son las cadenas ms representativas e importantes del colgeno tipo
I. Por otro lado, la cadena aparece por encima de los 200 KDa lo que no permite
su plena identificacin ya que este es el lmite del marcador de peso molecular
utilizado.
Los anteriores resultados concuerdan con los obtenidos por Lin y Liu

[8, 9]

, que

reportan bandas de 97 kDa y 120 kDa para estas cadenas alfa (figura 12). Este
tipo de deteccin se basa en la formacin de complejos fuertes con las protenas,
interaccionando electrostticamente con los grupos aminos y se correlaciona mas
con la cantidad de aminocidos bsicos de las protenas que con su masa total. [2]
Las masas moleculares de las protenas se calcularon a partir de los geles SDSPAGE mostradas en la figura 11.

kDa

(A)

39

kDa

(B)

Figura 11. Geles de SDS-PAGE al 10%: A) tratamientos de 12 horas y 24 h. B)

tratamientos de 36 horas.

40

Figura 12. Electroforesis (SDS-PAGE) de colgeno tipo I de diferentes especies

animales (M: marcador molecular; BF, patas de aves; BS, piel bovina; FS, piel de
rana; PS, piel de cerdo; SS, piel del tiburn, C II, colgeno tipo II de pollo Sigma).
Tomado de: LIN, Y., LIU, D; Comparison of physicalchemical properties of type I
collagen from different species; Food Chemistry 99 (2006) 244251.[9]

41

5.3.

ESPECTROSCOIA UV-VIS

Otra de las tcnicas utilizadas para caracterizar el colgeno extrado fue la

espectroscopia Ultravioleta Visible, donde se obtuvieron los espectros que
confirmaron la presencia de colgeno tipo I (figura 13). El colgeno extrado
presenta un pico de absorcin entre los 215 y 220 nm.
El espectro UV-Vis del colgeno se puede utilizar para detectar cualquier
contaminante y para verificar la integridad de los telopptidos no helicoidales. En
este estudio, cada espectro presenta un perfil con tendencia a una campana
gaussiana con un pico de alta absorcin en la regin antes mencionada. Este pico
de absorcin concuerda con la regin obtenida en las investigaciones realizadas
por Lin, Tan y Liu,

[9, 8]

cuyos espectros mostraron un pico de absorcin a los

218 nm para el colgeno tipo I de diferentes especies animales.

Lin y Liu

[8]

indicaron que los espectro de absorbancia de UV-Vis de las diferentes

especies de colgeno se vea desplazado asa longitudes de onda superiores a los

250 nm debido a los contaminantes proteicos. En este estudio, los espectros de
colgeno obtenido son ms estrechos, lo que indica que el colgeno extrado tena
menos contaminantes.

42

3,5
3

Absorbancia

2,5
2
36h-4C

1,5

36h-26C

36h-36C

0,5
0
100

125

150

175

200

225

250

275

300

325

350

Longitud de onda (nm)

Figura 13.

Espectros UV-Vis del colgeno extrado; tratamiento con pepsina

durante 36 horas.

Figura 14. Espetros UV-Vis de colgeno tipo I de diferentes espcies animales.

Tomado de: LIN, Y., LIU, D.[9]

43

5.4. ESPECTROMETRA DE MASAS

El colgeno tipo I mostro tres seales en el espectro de masas (figura 15), se
observan las seales correspondientes a la cadena alfa 1 en 93.26 kDa, la alfa 2
en 140.37 kDa y la cadena beta que por medio de las electroforesis solo se poda
reportar por encima de los 200 kDa mostr que su peso esta en 283.76 kDa,
siendo este el primer reporte del peso exacto de esta cadena del colgeno.
Debido a que el espectrmetro de masas es un UV-MALDI-MS se pudo corroborar
al igual que el trabajo hecho por Klaus Dreisewerd [4] que este tipo de equipos no
alcanzan a generar la energa necesaria para que la muestra pase al estado
gaseoso para luego ser detectada obligando a la matriz a hacer todo el trabajo, a
diferencia de lo reportado por Dreisewerd con un IR-MALDI-MS donde las seales
son mucho ms limpias y definidas.

Figura 15. Espectro de masas del colgeno tipo I, utilizando UV-MALDI-MS.

44

CONCLUSIONES

El colgeno obtenido de las crestas de pollo es tipo I como se pudo corroborar con
los anlisis de electroforesis. Estos anlisis muestran que las tres bandas que
componen este tipo de colgeno son la banda alfa 1 a ~100 kDa, la alfa 2 a ~120
kDa y la beta por encima de los 200 kDa.
En el espectro de absorcion UV-Vis se observ una banda en el rango de 215 a
220 nm, lo que permiti corroborar que la protena extrada fue el colgeno tipo I,
al comparar los espectros con los reportados en la literatura.
El resultado ms significativo en la caracterizacin fue el espectro de masas
obtenido por MALDI-TOF, en el cual se observa que la cadena alfa 1 tiene una
masa de 93.26 kDa, la alfa 2 de 140.37 kDa y la cadena beta de 283.76 kDa.
El tratamiento con pepsina de 36 horas a 26C fue el que mostr mayor
rendimiento con un 2.44% en la extraccin de colgeno.
El bajo costo y amplia disponibilidad de las crestas de pollo en Santander, hacen
que sea una alternativa viable para escalar a nivel industrial la produccin de
colgeno.
El colgeno obtenido a partir de las crestas de pollo puede ser un buen sustituto
para el colgeno bovino o porcino que se encuentra en el mercado para el uso
biomdico.

45

RECOMENDACIONES

Durante el proceso de extraccin se presenta una cantidad representativa de

grasa que es eliminada en la etapa de lavado. Es importante investigar alguna
aplicacin que le pueda dar un valor agregado a este subproducto de la
extraccin.
Es necesario identificar las operaciones unitarias y los equipos para escalar el
proceso de extraccin a nivel industrial, ya que se demostr que las crestas son
una buena fuente de colgeno tipo I.
Se puede mejorar la seal del espectro de masas realizando variaciones en la
relacin matriz muestra, ya que la cristalizacin de la muestra sobre el target es
un factor muy importante a la hora de impactar la muestra con el laser del
espectrmetro MALDI.

46

BIBLIOGRAFA

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49