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GUIA DE PRCTICAS
BIOQUMICA I
Lima Per
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2016
Contenido
Temas
1
Introduccin
Medidas de Seguridad
Extraccin de ADN
Clculos en bioenergtica
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milagros quintana@gmail.com
Introduccin
Para la comprensin de la Bioqumica, actividad intelectual abierta con
limitaciones que establece el mtodo cientfico, se requiere una actitud de
curiosidad despierta para observar hechos en condiciones experimentales.
La capacidad de obtener informacin precisa al mximo de exactitud,
registrar, ordenar y presentar los datos en forma comprensibles a los observadores
independientes que tengan acceso a ellos es una habilidad que no se logra sino es
por la prctica personal del ejercicio.
El costo, espacio y tiempo disponible han hecho imposible el diseo de
prcticas en paralelo con la teora. Es por ello que la mayora de las escuelas de
Biologa de vanguardia en la educacin biolgica han reducido radicalmente el
tiempo dedicado al Laboratorio de Bioqumica. Sin embargo, la experiencia
didctica, nos indica que la prctica de experimentos elementales y sencillos,
aplicados a la biologa, estimula el inters cientfico de los estudiantes de
Bioqumica.
La presente Gua de Prcticas, tiene la finalidad de cumplir con los
siguientes Objetivos Especficos:
1. Ejercitar a los alumnos en el mtodo cientfico mediante el manejo de tcnicas
generales y sencillas, aplicables a mltiples problemas particulares.
2. Desarrollar habilidad para programar experimentos, sistematizar el trabajo de
laboratorio, manipular los equipos y realizar mediciones u observaciones
rigurosas, as como saber expresar sus resultados.
3. Procurar el desarrollo de iniciativa personal y de razonamiento lgico frente a
problemas que se planteen, de tal modo que el alumno pueda realizar
innovaciones o variaciones en los mtodos de trabajo.
4. Desarrollar el sentido de responsabilidad social para manejar los recursos
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Medidas de Seguridad
Todos los accidentes personales por triviales que sean deben comunicarse al profesor
encargado de la prctica.
Las sustancias que se utilizan, y las operaciones que se realizan en el laboratorio son
potencialmente txicas y peligrosas. Trabaje con cuidado, atento a los eventos que puedan
comprometer la seguridad personal o colectiva.
1.
2.
3.
4.
No utilizar la llama del mechero sin cerciorarse antes de que no haya cerca
lquidos inflamables.
5.
Dirija la boca del tubo o matraz de reaccin, lejos de s mismo y del vecino, el
contenido puede proyectarse.
6.
7.
8.
9.
10.
No cambie de lugar los reactivos para uso del grupo. Deben estar disponibles
para todos.
11.
12.
Tenga especial cuidado con los solventes voltiles que pueden llegar a provocar
explosiones. Si se vierte accidentalmente sobre la mesa, squela inmediatamente con
un trapo hmedo y enjuguese ste en el chorro de agua, exprimindolo.
13.
Detergente no ionico al 1%
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Osmosis y Difusin
Objetivos:
a) Observar los fenmenos de difusin y smosis
b) Describir la importancia en el intercambio de sustancias en la clula.
Teora:
La membrana plasmtica celular es una bicapa lipdica fluida y semipermeable, ya que
permite el paso de algunos solutos hacia el interior de la clula.
Muchas sustancias, adems del agua, entran a la clula y salen de ella por efecto de los
gradientes de concentracin, aunque slo unas cuantas (CO2 y O2) puedan hacerlo tan
fcilmente como el agua.
El volumen celular cambia cuando el agua penetra o sale de la clula por un proceso
denominado osmosis. Por lo cual, las clulas de los organismos pluricelulares deben
permanecer en equilibrio osmtico con los lquidos tisulares que los baan.
La smosis se define como una difusin pasiva,
caracterizada por el paso del agua, disolvente, a travs
de una membrana semipermeable, desde la solucin
ms diluida a la ms concentrada.
Si los lquidos extracelulares aumentan su
concentracin de solutos, se hara hipertnica respecto
a las clulas, como consecuencia se originan prdida
de agua y deshidratacin (las clulas animales se
crenan y las vegetales la membrana puede desprende
bruscamente de la pared celular ocurriendo la
plasmlisis)
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Agua destilada
Tubos de ensayo
Algodn
Gradillas
Marcador de vidrio
Solucin hipotnica NaCl 0.065 M (0.43%)
Solucin hipertnica NaCl al 2% y 4%
Azul de metileno
Solucin isotnica de NaCl al 0.9% (suero fisiolgico)
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2
3
4
5
6
7
Cuestionario:
1. Dibujar todo lo observado en la prctica que pueda servirle para la discusin de sus
resultados.
2. Indique en que muestras se observ: a) Osmosis b) Difusin c) Turgencia d)
Plasmlisis
3. Mencione y dibuje las diferencias encontradas en cada uno de los huevos sometidos a
cada proceso.
4. Qu factores podran afectar la velocidad de difusin?
5. Defina el movimiento Browniano y como se relaciona con la difusin?
6. Diferencie la pared celular de la clulas vegetales.
Bibliografa:
1. ..
2. ..
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productos finales.
c)Estudiar la tasa de fermentacin en levadura midiendo la produccin de CO2.
d) Analizar el efecto de la presencia de O2 en cultivos anaerobios de levadura.
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Teora
Los hetertrofos obtienen energa oxidando molculas orgnicas y acoplando las
reacciones de oxidacin a la sntesis de ATP. El ATP es entonces usado para realizar
reacciones metablicas necesarias para mantener la integridad fsica del organismo y
sustentar todas sus otras actividades.
Algunos organismos son capaces de existir en ausencia de oxgeno molecular y
pueden ser perjudicados por la presencia de este elemento. La respiracin anaerbica, en
ausencia de oxgeno es llamada fermentacin. Comienza con una sustancia rica en energa
como la glucosa, utiliza las enzimas de la gliclisis y finalmente produce etanol y anhdrido
carbnico o una mezcla de cidos orgnicos y otros compuestos. Hay una ganancia neta de
solamente dos molculas de ATP por cada molcula de glucosa oxidada en la fermentacin.
Las levaduras son hongos eucariticos unicelulares comercialmente muy
importantes. Ellas son necesarias para la produccin de cerveza, vino, pan y productos
qumicos industriales. En este experimento se estudiar la produccin de CO 2 durante la
fermentacin de varios carbohidratos por clulas de levadura y el efecto del O2 en la
fermentacin.
Cuando microorganismos facultativos se estn cultivando anaerbicamente y se
exponen al oxgeno, hay una inhibicin de la fermentacin alcohlica y disminucin del
consumo de glucosa, esto es conocido como efecto Pasteur y refleja el incremento de
rendimiento energtico obtenido por el metabolismo respiratorio de la glucosa comparado
con el obtenido por la fermentacin de la glucosa. Cuando se consume glucosa
aerobiamente por cada mol oxidado se producen 36/38 moles de ATP, por lo que se
consume menos glucosa que cuando se oxida por la va anaerobia en la que solo se obtienen
2 moles de ATP por mol de glucosa.
2(ADP+Pi)
2ATP
GLUCOSA
ETANOL
Figura N1. Destino de la glucosa en condiciones aerobias (respiracin) o anaerobias (fermentacin).
Materiales y Reactivos:
1.
2.
3.
Pipetas Pasteur
Tubos de ensayo
Pipetas graduadas
2.
3.
4.
Parafilm
Levadura
Sacarosa 2%
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5.
6.
Galactosa 2%
Glucosa 2%
7.
Almidn 2%
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Experimento I:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Debe disponer de una gradilla, una piseta con agua destilada, seis tubos de ensayo, seis
pipetas graduadas de 2 ml, seis pipetas Pasteur con bulbo y trozos de parafilm. Marque
los tubos 1, 2, 3, 4 y 5. Llnelos del siguiente modo:
Tubo 1 = 1.25 ml de glucosa (2% p/v)+ 1.25 ml de suspensin de levadura.
Tubo 2 = 1.25 ml de sacarosa (2% p/v)+ 1.25 ml de suspensin de levadura.
Tubo 3 = 1.25 ml de galactosa (2% p/v)+ 1.25 ml de suspensin de levadura.
Tubo 4 = 1.25 ml de almidn (2% p/v)+ 1.25 ml de suspensin de levadura.
Tubo 5 = 1.25 ml de agua + 1.25 ml de suspensin de levadura.
Mezcle las soluciones. Selle el extremo inferior de una pipeta graduada con parafilm.
Usando la pipeta Pasteur llene completamente la pipeta graduada con la solucin del tubo
1 por el extremo superior.
Coloque sobre el extremo sin sellar de la pipeta graduada el tubo 1 invertido. Invierta
luego todo el sistema cuidadosamente manteniendo juntos el tubo de ensayo y la pipeta.
Repita el procedimiento con los dems tubos.
El gas producido se acumular en el extremo cerrado de la pipeta graduada.
Registre el nivel del gas en las pipetas cada 2 minutos por alrededor de 20 min.
Anote los datos en una la tabla.
Minut
Gluco
o
sa
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Agua
Experimento II:
Marque los tubos 1, 2, 3, 4 y 5. Llnelos del siguiente modo:
Tubo 1 = 1.25 ml de glucosa (2% p/v)+ 1.25 ml de suspensin de levadura.
Tubo 2 = 1.25 ml de agua + 1.25 ml de suspensin de levadura.
Tubo 3 = 1.25 ml de glucosa (2% p/v)+ 1.25 ml de agua
2. Mezcle las soluciones y colquelas en matraces de 25 ml. Agite por 20 minutos.
3. Filtre el contenido del tubo 1 (Experimento I) y de los matraces 1 y 2 (Experimento II) y
usando el mtodo enzimtico determine la cantidad de glucosa presente.
1.
Absorbancia
[Glucosa]
Tubo 1
Matraz 1
Matraz 2
Matraz 3
Discuta sus resultados
Cuestionario
1.
2.
3.
4.
5.
Cuando el carbohidrato es fermentado por la levadura, slo un tercio de los carbonos son
liberados en forma de CO2. El resto del carbono es liberado como molculas
de.....................
OBJETIVOS:
a) Evaluacin de la actividad de la amilasa salival
b) Definir las condiciones del sistema enzimtico
(velocidad inicial).
TEORA:
La presencia de una enzima se demuestra siguiendo la desaparicin del substrato o aparicin
del producto de la reaccin. Para ello la enzima es incubada con el substrato bajo condiciones
cuidadosamente controladas y se sacan alcuotas a intervalos de tiempo para ser analizadas. Debe
considerarse adems controles para corregir los errores que se presentan debido a reacciones qumicas
espontneas no especficas ni catalizadas por la enzima.
La amilasa es la enzima responsable de la hidrlisis del almidn, tanto su actividad como la
presencia de sus transcriptos est asociada a este polisacarido. Kuhn, en 1925 demostr la presencia
de dos amilasas: la alfa amilasa Ec 3.2.1.1 y la beta amilasa 3.2.1.2. La alfa amilasa hidroliza los
enlaces alfa 1-4 pero no puede hidrolizar los enlaces alfa 1-6 de las cadenas ramificadas de la
amilopectina, por lo que se requiere de la enzima desramificadora para la hidrlisis completa del
almidn.
El estudio "in vitro" implica, sin embargo, aislar y purificar aunque sea parcialmente la
enzima y posteriormente analizar individualmente las variables que influyen en su actividad. Para
todo este proceso es indispensable fijar inicialmente en forma tentativa las condiciones
experimentales en que se realizar el ensayo enzimtico, tomando en consideracin todos los
conocimientos generales que se tienen sobre la naturaleza de las enzimas y aquellos hechos
particulares que nos permiten suponer algunas cualidades o requerimientos especiales de la enzima en
estudio. De este modo se debe elegir un pH, una temperatura y un tiempo de incubacin compatible
con la naturaleza proteica de la enzima, condiciones que deben ser en lo posible lo ms semejantes a
las del medio en el cual la enzima acta "in vivo". Adems se debe procurar que las concentraciones
de la solucin amortiguadora del pH que se use en el medio de incubacin, garanticen la estabilidad
del pH elegido durante el lapso de observacin y que la concentracin del substrato sea lo
suficientemente alta para mantener la saturacin de la enzima, mientras dure el experimento.
Un mtodo para la determinacin cuantitativa de la actividad de la amilasa es el amiloclasico
iodometrico. En este mtodo el sustrato, almidn tamponado, se incuba con la muestra producindose
la hidrlisis enzimtica. Este se detiene al agregar el reactivo de yodo. La disminucin de color
respecto a un sustrato sin muestra permitir medir la actividad enzimtica.
La Unidad Amiloltica (UA) es la cantidad de enzima contenida en 100 ml de muestra, que puede
hidrolizar 10 mg de almidn en 30 minutos,
MATERIALES y REACTIVOS:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Enzima amilasa
Tubos de prueba y pipetas
Centrfuga clnica
Espectrofotmetro o fotocolormetro
Bao de mara a 37C.
PROCEDIMIENTO:
La presencia de una enzima se demuestra siguiendo la desaparicin del substrato o la
aparicin del producto de la reaccin. Para ello la enzima es incubada con el substrato bajo
condiciones cuidadosamente controladas y se sacan alcuotas a intervalos de tiempo para ser
analizadas. Debe considerarse adems controles para corregir los errores que se presentan
debido a reacciones qumicas espontneas no especficas ni catalizadas por la enzima.
Reactivos
Agua Destilada
Substrato
Incubar a 37 C por 5 min
Enzima
Inmediatamente mezcle e incube a 37
Agregar 4,5 de solucin reveladora
Leer al espectro a 640nm
(mL)
(mL)
0.01
0.5
--0.5
(mL)
---
0.01
CUESTIONARIO:
1. Cul es la actividad de la muestra analizada?
2. La actividad de la amilasa es directamente proporcional al volumen empleado? Si no es
as que cantidad describe mejor la cantidad de enzima presente?
3. En relacin al almidn defina los trminos gelatinizacin, licuefaccin, sacarificacin
4. En que se diferencian las enzimas amilasas y que orgenes tienen?
5. Qu reaccin catalizan las amiloglucosidasas y cul es su origen?
1 Km.
1
1
--- = ------- . ---- + ---v Vmax S
V
MATERIALES y REACTIVOS:
1. Solucin de Sustrato almidn 500
mg/L, en buffer fosfato 0.1 M y NaCl
0.15 M (pH 7)
2. Reactivo de yodo 0.01 eq/L de Yodo
en HCl 0.02M
3.
4.
5.
6.
7.
Enzima amilasa
Tubos de prueba y pipetas
Centrfuga clnica
Espectrofotmetro o fotocolormetro
Bao de mara a 37 C
PROCEDIMIENTO
Se montar el siguiente set de trabajo:
1(Reaccin 2(Reaccin 3(Reaccin 4(Reaccin
enzimatica) enzimatica) enzimatica) enzimatica)
H2Od
(mL)
0.4
0.3
0.2
0.1
Substrato (mL)
0.1
0.2
0.3
0.4
Enzima (mL)
0.01
0.01
0.01
0.01
Reactivos
5(Reaccin
enzimatica)
--0.5
0.01
Para cada tubo de reaccin deber hacerse un tubo blanco enzimtico (sin enzima)
El blanco para el espectrofotmetro se realizar mezclando 0.5mL de agua con 4.5mL
de solucin de lugol.
Inmediatamente mezcle e incube a 37 C por 7.5 min
Agregar 4,5 mL de solucin reveladora
Leer al espectro a 640nm
PROCEDIMIENTO
Se montar el siguiente set de trabajo
1(Reaccin 2(Reaccin 3(Reaccin 4(Reaccin 5(Reaccin
enzimatica) enzimatica) enzimatica) enzimatica) enzimatica)
H2Od
(mL)
0.4
0.3
0.2
0.1
--Substrato (mL)
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Enzima (mL)
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Reactivos
de solucin de lugol.
Inmediatamente mezcle e incube a 37 C por 7.5 min
Agregar 4,5 mL de solucin reveladora
Leer al espectro a 640nm
CUESTIONARIO
1.
2.
solucin de lugol.
Inmediatamente mezcle e incube a 37 C por 7.5 min
Agregar 4,5 mL de solucin reveladora
Leer al espectro a 640nm
CUESTIONARIO
3.
4.
OBJETIVO:
a) Conocer como la variacin de temperatura puede modificar la velocidad de reaccin.
PROCEDIMIENTO
Se montar el siguiente set de trabajo
1(Reaccin 2(Reaccin 3(Reaccin 4(Reaccin
enzimatica) enzimatica) enzimatica) enzimatica)
Substrato (mL)
0.5
0.5
0.5
0.5
Enzima (mL)
0.01
0.01
0.01
0.01
TEMPERATURA
Sobre hielo Ambiente
37 C
60 C
Reactivos
Usar el azul de metileno como indicador del proceso de oxidacin, es decir como
aceptor final de hidrgenos.
b) Determinar la actividad Enzimtica de la Succnico Deshidrogenasa, en un extracto de
hgado, rin o corazn.
c) Estudiar algunos factores que afectan el transporte de electrones, siguiendo esta va.
a)
Teora.La Succnico Deshidrogenasa cataliza la oxidacin del cido Succnico a cido Fumrico.
HOOC - CH2 - CH2 - COOH <===> HOOC - CH = CH - COOH + 2H+
La Succnico Deshidrogenasa es una flavoprotena que no requiere coenzima
nicotinamida y que se encuentra en las mitocondrias. Adems de formar parte del ciclo de
Krebs es capaz de reducir directamente a la coenzima Q de la cadena respiratoria. Es
altamente especfica para el cido succnico y es inhibida competitivamente por numerosos
cidos dicarboxlicos, en especial, mlico y oxaloactico. Es una tpica "enzima -SH";
inhibida no competitivamente por arsenicales trivalentes, monoyodoacetato, metales pesados
y an por el oxgeno. Estos inhibidores oxidan los grupos sulfihidrilos o forman compuestos
covalentes con ellos (Asmercapturos, derivados S-alquilos, sales de metales pesados).
Fundamento.- El azul de metileno es un pigmento de color azul que se decolora al
reducirse. El NADH2 puede reducirlo debido a la presencia en el extracto de tejido de una
diaforasa, que es una flavoprotena capaz de catalizar esa reaccin y corresponde al Lipoato
Deshidrogenasa; el potencial redox del azul de metileno es + 0.011 voltios.
La reaccin deben hacerse en anaerobiosis, pues el azul de metileno reducido es
autooxidable, es decir, puede ser oxidado espontneamente por medio del oxgeno molecular.
Para conseguir la anaerobiosis se utilizan los tubos de Thumberg, en los cuales se puede
hacer fcilmente el vaco y reemplazar el aire por un gas inerte (nitrgeno). Una anaerobiosis
relativa se puede conseguir mediante una capa de vaselina lquida, que asla el medio de
incubacin del aire.
Materiales y Reactivos:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Procedimiento:
1. Preparacin de la enzima
a.
b.
c.
d.
Moler hasta obtener una pasta fina y agregar otros 5 mL. de fosfato. Dejar esta mezcla
a la temperatura ambiente por unos 15 minutos, revolviendo de vez en cuando para
destruir substratos endgenos.
Vaciar el contenido a un tubo de centrifuga y centrifugar a baja velocidad durante
unos 5 minutos para sedimentar la arena, ncleos y clulas enteras que haya quedado
sin destruir. Conservar en hielo el sobrenadante.
5.
6.
7.
8.
PROCEDIMIENTO
Preparar frascos con agua destilada.
Colocar en estos frascos la elodea o planta acutica bajo el embudo y sumergir
dentro del frasco.
3.
Llena el tubo de ensayo con agua e invirtelo sobre el vstago del embudo,
procurando que no se derrame.
4.
Repite los pasos descritos en el otro frasco obteniendo 2 montajes similares
5.
Ilumina cada frasco con un foco distinto
6.
Espera unos 15 minutos y mide con una regla el espacio vaco que queda en el
tubo de ensayo. Hasta aqu obtenemos la cantidad de O2 en volumen.
7.
Para obtener en nmero de burbujas hacer otra preparacin con agua destilada.
8.
Colocar en estos la planta acutica sumergida cortando previamente una rama.
9.
Medir la tasa de fotosntesis cronometrando el nmero de burbujas de oxgeno
producidas por cada 10 segundos durante 100 y 120 segundos.
10.
Observa durante una hora lo que pasa en ambos frascos
11.
Anota la cantidad de burbujas que se desprenden cada minuto y mide nuevamente
el espacio vaco en el tubo de ensayo
12.
Disea una tabla de datos que resuma los resultados y colocar en una hoja de
clculos.
1.
2.
CUESTIONARIO
1. Anote sus resultados y explique.
Bibliografa
Teora
ARMSTRONG F. B. (1989): Biochemistry. Thrid Edition. Oxford University Press.
BOHINSKI C. R. (1978): Bioqumica. Fondo educativo Interamericano, S.A.
BOHINSKI C. R. (1991): Bioqumica. 5ta. Ed. Addison-Wesly Iberoamericana.
LEHNINGER A. L. (1982): Principles of Biochemistry. Worth Publishers, INC.
U.S.A.
5. LEHNINGER A.L.; NELSON D. Y COX M. (1995): Principios de Bioqumica. 2da.
Ed. Editorial Omega S.A.
6. MATHEWS C. K. y van Holde K. E. (1990): Biochemistry. The Benjamin/Cumming
1.
2.
3.
4.
Prcticas
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.