TINCIN DE GRAM

En 1884 el mdico Dans, Christian Gram, desarroll un mtodo de

tincin que lleva su nombre y que es de valiosa utilidad en cualquier
Laboratorio de Bacteriologa. Un mtodo de tincin bacteriana que
coloreaba algunas clulas de color azul-violeta y otras que se
decoloraban, se tean con el color de la solucin colorante empleada
como contraste. (Llop, 2001)

La tcnica, adems de revelar detalles referentes a la forma y

agrupacin bacterianas como cualquier otra tcnica de tincin,
permite clasificar a las bacterias en dos grandes grupos: GRAM
POSITIVAS

GRAM

NEGATIVAS.

(Tortora, 2007)
Esta tincin desarrollada por el doctor Christian Gram en 1884, es hoy
la ms utilizada en los laboratorios de bacteriologa y permite, de
acuerdo con la estructura y grosor de la pared bacteriana, agrupar las
bacterias en Gram positivas y en Gram negativas permite diferenciar
las bacterias (Rodrguez,. 2005), a veces incluso cuando tienen igual
forma y tamao. Por otra razn es una tincin diferencial.
(Pumarola, 1991), las Gram positivas poseen una capa gruesa de
peptidoglicn y carecen de membrana a externa. Mientras que las
Gram negativas tienen una capa ms delgada de peptidoglicn y
poseen una membrana externa. (Rodrguez,. 2005)

Algunas

bacterias

se

clasifican

como

Gram

variables,

pues

simultneamente presentan tincin de Gram positivas y de Gram

negativas, aun bajo condiciones ptimas de cultivo. Sin embargo, en
su estructura estas bacterias poseen una pared de Gram positivas,
aunque la capa de peptigoglicn es ms delgada que la mayora de
las bacterias Gram positivas. (Rodrguez,. 2005)

Esta tincin adems, correlaciona con otras propiedades como

endotoxinas, susceptibilidad a antibiticos, sensibilidad o resistencia a
sales biliares, punto isoelctrico y tensin superficial. (Rodrguez, .
2005)

Existen variaciones de esta tcnica, pero en trminos generales, la

tincin de Gram involucra varios pasos:

1. Tincin inicial. Las clulas se tien con cristal violeta, el cual

es el colorante primario. En este paso todas las clulas se tien
de

2.

morado.

Mordente. Se adiciona yoduro (lugol) que reacciona con el

cristal violeta y forma un complejo cristal violeta-yoduro. En
este punto todas las clulas continan de color morado.

3. Decoloracin. Se adiciona un solvente no polar. El cual acta

lavando el complejo cristal violeta-yoduro de las clulas Gram
negativas. De esta manera las bacterias Gram positivas
continan moradas y las Gram negativas quedan incoloras. Este
es el paso critico dc esta tincin, pues si se exagera, decolora

las Gram positivas y si se hace muy dbil no decolora a las

Gram negativas.

4. Contratincin. Se vuelve a teir con safranina o fucsina de

manera que las bacterias Gram negativas, que hablan sido
decoloradas, se tien de rosado a fucsia segn el colorante
empleado; en tanto, las bacterias Gram positivas no se afectan
con la contratincin y permanecen moradas debido a lo intenso
de esta coloracin.

Adems de una excesiva decoloracin, otro factor que puede influir

en

que

las

bacterias

Gram

positivas

se

observen

parcial

completamente rosadas, es la edad del cultivo; las clulas viejas

tienden a perder su capacidad de retener el complejo cristal violetayoduro y por lo tanto las bacterias se vern rosadas. Otro factor de
variabilidad podra ser condiciones de estrs durante el cultivo, que
genera formas Gram negativas no viables, dentro de un cultivo de
clulas Gram positivas. Debe prestarse atencin a los lavados que se
realizan al ir agregando los diferentes reactivos, se deja un exceso de
agua en la lmina los reactivos se diluirn, especialmente el yoduro.
Se han descrito modificaciones de esta tcnica orientadas a resolver
problemas especficos y cuyas variaciones radican en la composicin
de los reactivos, especialmente en la concentracin y preparacin del
cristal violeta, as como en el tipa de solvente orgnico empleado
como agente decolorante; por lo tanto, si se cuenta con varias de
estas modificaciones es importante no confundir los reactivos de cada
una, pues los resultados pueden ser inadecuados.
Aunque esta tcnica parece simple, su realizacin con un alto grado
de confiabilidad requiere prctica y experiencia, par b que el

estudiante tendr la oportunidad de practicarla en numerosas

oportunidades a lo largo del curso.

En el procedimiento para la coloracin de Gram se usan cuatro

reactivos diferentes. El primero es una solucin de cristal violeta
(cloruro de hexametil-p-rosanalina). Que tie todas las clulas de
color azul-violeta, el segundo reactivo es una solucin de Lugol (yodoyoduro de potasio). El yoduro reemplaza al cloruro en la molcula de
cristal violeta y el complejo formado se vuelve insoluble en agua.
Todas las clulas reaccionan de igual forma. (Llop, 2001)
La adicin de un tercer reactivo, decolorante (acetona y etanol),
remueve solamente el colorante de las clulas gramnegativos. Con el
fin de explicar esta manera de actuar se han planteado diversas

causas,

entre

ellas,

diferentes

uniones

al

magnesio,

las

ribonucleasas o al cido nucleico. Tambin se sealan diferencias en

la permeabilidad, que sugiere que el alcohol decolora la membrana
externa de las bacterias gramnegativas, las cuales permiten la salida
dcl complejo cristal violeta-Lugol. (Llop, 2001)
La safranina, colorante de contraste y cuarto reactivo empleado en el
mtodo. Hace visible las clulas gramnegativas al teirlas de color
rojo.
Se ha demostrado que la estructura de la pared bacteriana es la base
de la reaccin diferencial frente a la coloracin de Gram. Las bacterias
teidas de azul-violeta, llamadas grampositivas, poseen grandes
cantidades de cido teicoico en sus paredes celulares: y las teidas
en rojo, bacterias gramnegativas,

contienen lipopolisacaridos.

Aunque no totalmente aclarada, la propiedad de la Gram positividad

depende de la naturaleza y composicin qumica de la pared
bacteriana. Como lo

prueba el hecho de que las bacterias Gram

positivas pierden esta propiedad cuando se elimina toda su pared o

parte de ella.
Se han propuesto varias teoras para su explicacin. Pero la ms
aceptada es la que mantiene que las bacterias gramnegativo son ms
permeables al alcohol debido a su alto contenido en lpidos.
Cuando la bacteria se tie con el complejo colorante bsicomordiente, este queda atrapado en las bacterias Gram positivas y no
puede ser arrastrado por el decolorante a causa de la naturaleza
fisicoqumica de su pared. Por el contrario, en las gramnegativos es
arrastrado debido a su alto contenido lipdico. (Pumarola, 1991)

Se han descrito diferentes modificaciones al mtodo original de Gram.

Entre las que podemos citar:
La modificacin de Hucker, que recomienda la utilizacin

de una

solucin de cristal violeta en lugar de la violeta genciana empleada

por Gram. Otra modificacin es la que emplea carbolfucsina como

colorante de contraste y se recomienda para el estudio de bacilos
anaerobios gramnegativos y de las especies del gnero Legionella.
La modificacin de Kopeloff recomienda para una mejor visualizacin
dc las bacterias anaerobias y consiste en adicionar a la solucin de
cristal violeta, colocada sobre el frotis, unas gotas de una disolucin
de NaHCO al 5 %. (Llop, 2001)

FUNDAMENTO

La coloracin de Gram ha constituido, desde los albores de la

bacteriologa

un elemento fundamental para la taxonoma e

identificacin. Luego del descubrimiento casual realizado por el

Investigador dans Christian Gram, pasaron muchos aos durante los
cuales se efectuaron las ms variadas especulaciones sobre el
mecanismo de esta coloracin. (Espinal, 2005)
Resultaba indudable, sin embargo, su practicidad a los fina, de la
identificacin.
El conocimiento de las estructuras de las membranas bacterianas,
tanto en el aspecto fsico corno en su composicin molecular que
fueron logrados a partir de la dcada del sesenta, demostraron que la
coloracin de Gram distingue dos grupos de bacterias totalmente
diferentes. Las bacterias Gram positivas que presentan una gruesa
capa de peptidoglicano como estructura fundamental por sobre la
membrana citoplasmtica, y las Gram negativas, que encima de sta,
presentan una delgada capa de peptidoglicano, a la que se superpone
una capa de lipopolisacaridos lipoprotena, denominada membrana
externa.

La presencia de esta membrana diferencia actualmente dos divisiones

en sistemtica bacteriana: las que no lo poseen, Firmicutes (Gram+) y
Las que s, Gracilicutes (Gram -).
La diferencia entre ambos grupos es pues de enorme importancia
taxonmica. El comportamiento como patgenos yen la sensibilidad
antibacteriana difieren sustancialmente; de ah que la realizacin
rpida de una coloracin de Gram, reviste enorme importancia en
Bacteriologa Clnica. (Espinal, 2005)

Significado taxonmico

Algunas

bacterias

se

clasifican

como

Gram

variables,

pues

simultneamente presentan tincin de Gram positivas y de Gram

negativas, aun bajo condiciones ptimas de cultivo. Sin embargo, en
su estructura estas bacterias poseen una pared de Gram positivas,
aunque la capa de peptigoglicn es ms delgada que la mayora de
las bacterias Gram positivas. (Rodrguez,. 2005)

Existen muchas modificaciones de esta tincin, pero en todos los

casos se realizan loe siguientes pasos esenciales:
La Extensin de clulas, fijadas por calor sobre un porta, se tie de
modo sucesivo con un colorante bsico, 1 violeta de cristal, y con una
disolucin diluida de yodo. La preparacin se trata luego brevemente
con un disolvente orgnico (alcohol o acetona). Las bacterias Grampositivas resisten la decoloracin y permanecen teidas de un color
azul

obscuro;

las

bacterias

Gram-negativas

son

rpidas

completamente decoloradas. Al realizar este procedimiento de uncin

es esencial examinar clulas en crecimiento, ya que ciertas bacterias

Gram-positivas (par ejemplo. Bacillus spp.) Pierden rpidamente la

capacidad de retener el complejo violeta cristal-yodo una vez que
cesa el crecimiento activo. El resultado de la tincin de Gram est,
por lo tanto, condicionado en cierta medida al estado fisiolgico de la
clula, pero tambin se corresponde con diferencias fundamentales
en la composicin qumica y en la ultra estructura de las paredes
celulares de las eubacterias. (Villanueva, 2006)
Las paredes celulares, de ambas poseen una capa basal de
peptidoglicano responsable de la rigidez caracterstica de la pared.
Sin embargo, existen diferencias estructurales en lo que respecta a
las capas ms externas. As en las Gram Negativas, existe una
membrana externa cuya constitucin qumica es similar a la de
cualquier otra membrana biolgica (fosfolpidos y protenas) pero que
posee adems un alto contenido de lipopolisacridos (endotoxina).
(Tortora, 2007)
Durante el proceso de tincin, tanto las bacterias Gram positivas
como las Gram negativas, toman el colorante primario. Sin embargo
al aplicar el agente decolorante, la pared de las bacterias Gram
positivas sufren una deshidratacin que impide la salida del
colorante. En el caso de las bacterias Gram negativas, el agente
decolorante destruye la membrana externa, incrementando as su
permeabilidad, lo cual permite la salida del colorante primario. 1
Al aplicar el colorante de contraste, este no puede penetrar
fcilmente en las bacterias Gram positivas debido a la deshidratacin
de su pared; adems de que estas bacterias quedaron previamente
teidas con el colorante primario. Por el contrario las bacterias GRAM
(-) se tien fcilmente con el colorante de contraste. El resultado final
es que las bacterias Gram (+) se tien de color violeta y las Gram (-)
de rojo.1

BACTERIAS GRAMPOSITIVAS

Una bacteria Gram positiva posee una pared celular gruesa que,
consta

de

varias

capas

est

formada

principalmente

por

peptidoglucano (150 a 500 A) que rodea la membrana citoplsmica.

El peptidoglucano es un exoesqueleto en forma de malla con una
funcin semejante a la del exoesqueleto de los insectos. Sin embargo,
y a diferencia de esta ltima estructura, el peptidoglucano de la
clula es lo suficientemente poroso como para permitir la difusin de
los metabolitos a la membrana plasmtica. (Murray, 2006)
BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
Las paredes celulares gramnegativos son ms complejas (tanto desde
el punto de vista estructural como qumico) que las de las clulas
Gram positivas. Desde el punto de vista estructural, una pared celular
gramnegativa contiene dos capas situadas en el exterior de la
membrana citoplsmica. Inmediatamente por fuera de la membrana
citoplsmica se encuentra una delgada capa de peptidoglucano que
representa tan slo un 5% a 10% del peso de la pared celular.
Adems, la pared celular gramnegativa no contiene cidos teicoicos
ni lipoteicoicos. En la parte externa de la capa de peptidoglucano se
halla la membrana externa, la cual es exclusiva de las bacterias
gramnegativas. (Murray, 2006)

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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nica.info/biblioteca/TincionBacterias.pdf]

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7

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10 Villa G, Fernndez M, Castillo S. (2012) Manual de Prcticas de Bacteriologa

y Micologa Veterinaria. Mxico: Benemrita Universidad Autnoma de Puebla.