Leveduras na fermentao

alcolica
Profa. Sandra Regina Ceccato-Antonini

DTAiSER / CCA / UFSCar Campus de Araras

antonini@cca.ufscar.br

www.cca.ufscar.br/lamam
Laboratrio de microbiologia agrcola e molecular

As caractersticas essenciais de um
processo microbiolgico industrial
MICRORGANISMOS
Vrus
Bactrias

Substrato
Adicionados no
meio de cultura

Fungos
Algas
Protozorios
Recuperao e
Purificao do
Produto
Produtos do
metabolismo
Clula microbiana
Frao das
clulas

RESIDUO
OU
MATERIAL
DE
EXCREO

Caractersticas gerais e
identificao de leveduras

Caractersticas gerais das

leveduras

Grupo heterogneo

Unicelulares

Diversidade
Cor das colnias
Textura

Reproduo

Aspecto colonial de fungos que apresentam crescimento

filamentoso (F) e leveduriforme (L).

Brotamento

Ciclo de vida de S. cerevisiae e sua relao com

as condies ambientais

+ ferormnio

Ciclo diplide

Ciclo haplide

Ciclo de vida de S. cerevisiae

A.

B.

Leveduras. Em A, clulas de leveduras

e de bactrias. Em B, clulas de
Saccharomyces cerevisiae, mostrando
clulas em brotamento. Em C,
pseudomiclio de Saccharomyces cerevisiae,
em meio Corn-meal agar.
C.

A levedura Pichia stipitis,

fermentadora de xilose,
durante crescimento
vegetativo (A), esporos em
formao (B), e sob limitao
de carbono (C). Foto Tom
Kuster.

Leveduras apiculadas

IDENTIFICAO GENRICA

Extrato de malte

Macroscopia
Sedimento
Resduo
Anel
Ilhota
Pelcula
Microscopia
Forma e tamanho
das clulas

Microcultivo
Agar fub
Tween 80
Corn meal agar

Microscopia
Pseudomiclio,
Miclio verdadeiro,
Balistsporos
Clamidsporos

Meio de acetato
Gorodkowa
YM
gua de torneira

Microscopia
Produo esporos sexuais:
Ascos e ascsporos

Outras provas:
-Urease
-Cpsula
-Meio DBB

IDENTIFICAO ESPECFICA

Auxanograma
Assimilao
Fontes C e N

Zimograma
Fermentao
Alcolica de
acares

Meios diferenciais
-meio TTC
-gar molibdnio
-gar azul Tripan
-meio de Nickerson
-meio de CGB

Outras provas:
-Crescimento 37C
-Produo de
compostos amilides
-tubo germinativo
-resistncia a
Cicloheximida
-fenol oxidase

Teste do DBB. As linhagens CCA 181, 506 e 567 so DBB

negativas, enquanto a CCA379 DBB positiva (utilizada como
controle positivo) Linhagens basidiomicticas so DBB+

S. cerevisiae

ESPOROS
SEXUAIS

S. cerevisiae

Produo
de pseudomiclio

Candida albicans - pseudomiclio

Para caracterizao de linhagens de Dekkera

Teste de produo de cido a partir da glicose em meio carbonato

de clcio, por 7-10 dias, a 30 C.

FERMENTAO DA GLICOSE

Glicose

Etanol

Maltose

Ac. Lactico

Ac. Citrico

Ramnose

Ac. Succnico
Inositol

Lisina

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

+
+
+
+
+
+
+
+
+

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

+
+
+
+
+
-

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

+
+
+
-

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

- +
+ +
- +
- + +
- nd
- - nd
- nd
- + +
+ +
+ +
- + +
+ + +
+ +
- - +
- - + +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +

- (+) = p ositivo; (-) = neg ativo e (nd) = no d eterm ina do;

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

Nitrato

Melibiose

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

Etilamina

Manitol

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

Celobiose

+ +
+ +
+ +
- + +
+ + +
+ + +
- +
+ +
- +
+ + +
+ +
- + +
+ +
+ +
+ +
- + + +
+ +
+ +
+ +
+ nd
+ +
+ +
- +
+ +

Arabinose

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-

N itrognio

Melezitose

Galactose

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

Xilose

Rafinose

Sacarose

0 05
0 06
0 07
0 08
0 12
0 22
0 23
0 27
0 35
0 37
0 53
0 59
0 77
0 83
1 15
1 51
1 55
1 81
2 09
3 73
3 85
3 97
4 47
4 67
4 71
5 06
5 40
5 67
5 93
6 10
6 12

Eritritol

Linhagem

C arbono

+
+
+
+
+
-

Chaves de identificao

Kreger-van Rij, N.J.W. The yeasts. A

taxonomic study. Elsevier, 1984.
Barnett, J.A., Payne, R.W., Yarrow, D.
Yeasts: characteristics and identification.
Cambridge Univ. Press, 1990.

Importncia do estudo da
diversidade de leveduras
na fermentao alcolica

http://www.apta.sp.gov.br/cana/anexos/Workshop_Etanol_sessao%202_Luiz%20Basso.pdf

http://www.apta.sp.gov.br/cana/anexos/Workshop_Etanol_sessao%202_Luiz%20Basso.pdf

http://www.apta.sp.gov.br/cana/anexos/Workshop_Etanol_sessao%202_Luiz%20Basso.pdf

http://www.apta.sp.gov.br/cana/anexos/Workshop_Etanol_sessao%202_Luiz%20Basso.pdf

Tcnicas avanadas no
estudo da diversidade de
leveduras em processos
fermentativos

IDENTIFICAO DE LEVEDURAS
como era feita h 20 anos

Morfologia
colnias;

das

clulas

Caractersticas bioqumicas e
fisiolgicas;
Classificao de espcies mas
no de linhagens.

IDENTIFICAO DE LEVEDURAS
como feita hoje
Cariotipagem:
anlise
do
cromossmico das leveduras.

DNA

Tcnicas baseadas em PCR (RAPD) e

RFLP.
Cada linhagem possui um padro nico
de cromossomos ou bandas de DNA
(como um cdigo de barras).

2007 Anais do XVI Sinaferm

ANDRIETTA, M. G. S. ; ANDRIETTA, Silvio Roberto ; STROPPA, C. T. . Caracterizao das

leveduras floculantes selecionadas em reator tipo torre em uma unidade de fermentao
alcolica. In: SINAFERM, 2003, Florianpolis. XIV SINAFERM, 2003.

Todos os isolados pertencem espcie Saccharomyces cerevisiae e

apresentaram o mesmo caritipo. No entanto, um dos trs tipos morfolgicos
isolados, em cada coleta, apresentou desempenho industrial diferente dos
demais. Os dados obtidos indicam que a determinao do desempenho
fermentativo, pelas tcnicas utilizadas, alm de avaliar a performance industrial
de cepas de levedura, pode proporcionar a diferenciao final entre cepas S.
cerevisiae de mesmo caritipo.

RAPD

Regio ITS

Metodologia da Capacidade Fermentativa (Andrietta et al., 1999)

Tabela 1 Pontuao e limites das faixas de variao dos parmetros utilizados na classificao da
leveduras (Andrietta et al., 1999).
Parmetro
1 (Alto)
2 (Mdio)
3 (Baixo)
Dgito
0,041 a 0,044
Yx/s (gMS/gSubst)
Primeiro
> 0,044
< 0,041
VCS (gSubst/Lxh)
5,2 a 5,7
Segundo
> 5,7
< 5,2
NCO (%)
90 a 98,5
Terceiro
> 98,5
< 90
0,45 a 0,55
Quarto
max (1/h)
> 0,55
< 0,45
PROD (gEt/Lxh)
2,2 a 2,4
Quinto
> 2,4
< 2,2
0,45 a 0,42
Yp/s (gEt/gSubst)
Sexto
> 0,45
< 0,42
Andrietta, S. R.; Migliari, P. C. e Andrietta, M. G. S. (1999), Classificao das
cepas de leveduras de processos industriais de fermentao alcolica utilizando
capacidade fermentativa. STAB Acar, lcool e Subprodutos, v.17, n.5, p.5459.

Coleta
Isolado
(dias/safra)
IN

60

120

180

74
78
79
80
81
82
83
84
85
86*
96
97
98
99
100
101
102
103
104
114
115
116
117
118
119
120
121
122

* Variante morfolgico.

PP

Yx/s

VCS

NCO

PROD

Yp/s

Grupo

100,0

0,0412
0,0412
0,0412
0,0440
0,0410
0,0424
0,0432
0,0422
0,0443
0,0434
0,0423
0,0419
0,0436
0,0430
0,0433
0,0433
0,0419
0,0435
0,0434
0,0440
0,0440
0,0417
0,0420
0,0411
0,0416
0,0410
0,0420
0,0415

5,81
5,81
5,80
5,80
5,80
5,80
5,80
4,45
3,92
5,80
5,80
5,80
5,80
4,78
4,79
5,80
5,80
5,80
5,80
3,37
3,77
5,79
5,80
5,80
5,80
5,80
5,80
5,80

99,65
99,62
99,50
99,50
99,50
99,50
99,50
76,36
67,27
99,49
99,50
99,50
99,50
81,94
82,21
99,44
99,50
99,50
99,50
57,85
64,63
99,41
99,50
99,51
99,51
99,50
99,51
99,50

0,50
0,51
0,47
0,49
0,48
0,49
0,46
0,46
0,45
0,46
0,51
0,48
0,48
0,53
0,55
0,47
0,50
0,49
0,50
0,48
0,50
0,47
0,47
0,48
0,46
0,47
0,46
0,45

2,60
2,49
2,51
2,54
2,47
2,53
2,57
2,00
1,86
2,55
2,46
2,48
2,45
2,02
2,00
2,44
2,45
2,46
2,46
1,59
1,58
2,52
2,46
2,56
2,53
2,52
2,49
2,50

0,4774
0,4579
0,4618
0,4672
0,4540
0,4650
0,4715
0,4878
0,5199
0,4688
0,4528
0,4555
0,4511
0,4574
0,4513
0,4502
0,4517
0,4539
0,4527
0,5207
0,4598
0,4645
0,4521
0,4702
0,4657
0,4633
0,4577
0,4600

211.211
211.211
211.211
211.211
211.211
211.211
211.211
233.231
233.231
211.211
211.211
211.211
211.211
233.231
233.231
211.211
211.211
211.211
211.211
233.231
233.231
211.211
211.211
211.211
211.211
211.211
211.211
211.211

77,3
12,5
10,2
55,2
29,3
15,5
43,3
31,7
25,0

ANDRIETTA, M. G. S. ; ANDRIETTA, Silvio Roberto ; STROPPA, C. T. . Caracterizao das leveduras

floculantes selecionadas em reator tipo torre em uma unidade de fermentao alcolica. In: SINAFERM,
2003, Florianpolis. XIV SINAFERM, 2003.

Tabela 2 - Valores de participao populacional, PP (%); rendimento em clulas, Y x/s

(gMS/gSubst); velocidade de consumo de substrato, VCS (gSubst/Lxh); nvel de converso de
substrato, NCO (%); velocidade especfica mxima de crescimento, max (1/h);
produtividade, PROD (gEt/Lxh); rendimento em etanol, Yp/s (gEt/gSubst); grupo de
desempenho, para as leveduras isoladas.

Utilizao de meios
seletivos

3 X 109 clulas de S. cerevisiae / ml

3 X 103 clulas de leveduras selvagens / ml
1 ml sem diluio

Meio contagem geral

No seletivo
>>> 300 colnias

Dorna de fermentao

1 ml diluio 10-8

Meio contagem geral

No seletivo
30 colnias
{3 X 109 / 108 } = 30
{3 X 103 / 108 } = < 1

1 ml diluio 10-2

Regra: contar
entre 30 e 300 colnias

Meio seletivo
{3 X 103 / 102 } = 30
Exemplo: actidione
inibe o crescimento
de S. cerevisiae

MEIO DE CULTURA WLN Wallerstein Laboratory Nutrient Medium

Contagem geral

Para Saccharomyces no-cerevisiae

Diluio
10-10
Sem
diluio

Para Saccharomyces no-cerevisiae

Para no-Saccharomyces

Sem
diluio

Sem
diluio

Tosta, C.D., Ceccato-Antonini, S.R. Eficincia de meios seletivos

no monitoramento de leveduras na fermentao alcolica
atestada por PCR. In: XV Simpsio Nacional de Bioprocessos,
2005, Recife-PE (Anais).

Analisou a eficincia de trs meios seletivos (Agar-lisina,

LWYM e WLD) no isolamento de leveduras selvagens
atravs dos testes de taxonomia clssica e de PCR.
Linhagens isoladas do vinho e fermento a partir dos
meios seletivos pertenceram exclusivamente a gneros
no Saccharomyces, com bandas de DNA da regio ITS
entre 420 e 550 bp.
Linhagens de Saccharomyces cerevisiae, isoladas
exclusivamente de WLN, apresentaram ITS acima de
800 bp, caracterstico desta e da demais espcies do
grupo Saccharomyces sensu stricto.
Os meios seletivos testados permitiram a distino entre
linhagens selvagens e do processo.

S. cerevisiae
Colnias
rugosas

= S. cerevisiae
Colnias
mucosas

Oliveira, M.C.F.L., Silva, R.B.O. Biotipo

Saccharomyces cerevisiae em cadeias
multicelulares ramificadas na fermentao
contnua. In: XVII Congresso Brasileiro de
Microbiologia, 1993, Santos-SP.
Identificaram uma levedura selvagem com as
mesmas caractersticas, apresentando elevado
poder competitivo em relao levedura usual do
processo e s demais leveduras selvagens,
substituindo em cerca de 50% o fermento de
partida.

Ceccato-Antonini, S.R., Parazzi, C. Isolamento

de levedura selvagem floculante e efeitos da
contaminao em processo de fermentao
etanlica contnua. In: VI Congresso Nacional
da STAB, 1996, Macei-AL.
Verificaram uma proporo de 1:1 entre
leveduras rugosas e no-rugosas no fermento e
no vinho, ocasionando uma queda de 10% no
rendimento fermentativo e 18% na produo de
lcool. Para a retomada do rendimento a valores
~ 89,5%, o fermento teve que ser substitudo. Os
focos de contaminao eram a gua de diluio
e o melao.

A pesquisadora Silene C. L. Paulillo (Fermentec)

apresentou os resultados de um trabalho realizado
durante 3 safras consecutivas (2002, 2003 e 2004)
sobre as caractersticas de 300 leveduras selvagens que
contaminaram 46 destilarias. As leveduras identificadas
pela cariotipagem formavam colnias de borda lisa
(57%) ou rugosa (43%). Todas as leveduras de colnias
com borda rugosa apresentaram problemas na
fermentao como: espuma em excesso, floculao e/ou
sobra de acar no vinho. Entre as leveduras de
colnias de borda lisa, 65% apresentaram pelo menos
um dos problemas citados.As leveduras com estas
caractersticas foram submetidas a mais dois ciclos
fermentativos com mosto contaminado por lactobacilos
(~1 x 107 bactrias/mL).
Nestas condies, as leveduras contaminantes flocularam intensamente (como
indicado pelas setas amarelas), enquanto que, a linhagem PE-2 (referncia), no
foi afetada. Estes resultados mostraram a importncia do uso de leveduras
selecionadas e quanto se pode perder com leveduras contaminantes.

Alguns resultados de
monitoramento utilizando
meios seletivos

UFC ou clulas
viveis/mL

Fermento da cuba

21-set

No Sacch. cerev.
Clulas viveis

14-set

Data da coleta

7-set

31-ago

24-ago

17-ago

10-ago

3-ago

No Sacch
Leveduras totais
Bactrias totais

27-jul

Safra 2005/2006

20-jul

13-jul

6-jul

29-jun

22-jun

1,00E+14
1,00E+12
1,00E+10
1,00E+08
1,00E+06
1,00E+04
1,00E+02
1,00E+00

UFC ou clulas
viveis/mL

Vinho dorna 1

21-set

No Sacch. cerev.
Clulas viveis

14-set

Data da coleta

7-set

31-ago

24-ago

17-ago

10-ago

3-ago

No Sacch
Leveduras totais
Bactrias totais

27-jul

Safra 2005/2006

20-jul

13-jul

6-jul

29-jun

22-jun

1,00E+14
1,00E+12
1,00E+10
1,00E+08
1,00E+06
1,00E+04
1,00E+02
1,00E+00

Mosto
1,00E+08
1,00E+07

UFC/mL

1,00E+06
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00

No Sacch
Leveduras totais

No Sacch. cerev.
Bactrias totais

21-set

Data da coleta

14-set

7-set

31-ago

24-ago

17-ago

10-ago

3-ago

27-jul

20-jul

13-jul

6-jul

29-jun

22-jun

Safra 2005/2006

OBRIGADA !