Master Sciences

Mention Microbiologie-Biologie Vgtale et

Biotechnologies
Anne 2010/2011

Unit denseignement
Initiation la recherche en Microbiologie

Fascicule de principes techniques

Avant-propos
A titre dexemples, certains protocoles sont explicits dans ce fascicule. Ceux-ci peuvent
prsenter de nombreuses variantes.

METHODES D'OBSERVATION DES MICROORGANISMES

Bactriologie
Il est possible d'observer les microorganismes
- soit lorsqu'ils sont regroups en colonies sur bote visible lil, il s'agit alors d'une
observation macroscopique
- soit l'tat de cellule, il s'agit alors d'une observation microscopique.
1 - Observation macroscopique des colonies
C'est l'tude de l'aspect des colonies.
Une colonie est l'amas, visible lil nu, constitu par des milliards de descendants
d'une seule cellule bactrienne et dont la taille, la forme, la couleur, la consistance sont
caractristiques de chaque espce.
L'tude de l'aspect des colonies ncessite l'observation lil nu, en lumire naturelle et
artificielle, par clairage direct et par transparence des colonies.
Conditions d'examen
L'examen macroscopique des cultures est le premier examen effectu partir de l'isolement aprs
incubation . L'aspect des colonies dpend du milieu utilis, de la dure et de la temprature de
l'incubation . Il ne pourra tre dcrit convenablement qu' partir de colonies bien isoles : les
colonies sont d'autant plus petites qu'elles sont rapproches.
Les colonies sont observes par transparence, rflexion ou transillumination oblique.

Aspect
La description des colonies doit mentionner
1 : La taille ou le diamtre de la colonie
Elle peut tre mesure l'aide d'une rgle gradue pour les grandes colonies.
2 : La forme
- allure des contours
lisses, dentels, dchiquets
rguliers, irrguliers
- relief
surface bombe, demi-bombe, plate
centre parfois surlev, parfois ombiliqu (en creux)
3 : L'aspect de la surface
Il peut tre lisse ou rugueux,
4 : L'opacit
Les colonies sont dcrites comme
- opaques (ne laissent pas passer la lumire)
- translucides (laissent passer la lumire mais on ne voit pas les formes au travers, comme le
verre dpoli)
- transparentes (laissent passer la lumire et voir les formes au travers, comme le verre)
5 : La consistance
Au moment du prlvement il est possible d'apprcier si les colonies sont grasses, crmeuses (on
obtient facilement des suspensions homognes), sches ou encore muqueuses (on obtient
difficilement des suspensions homognes).
6 : La couleur (pigmentation)
Les colonies habituelles sont crme. Une couleur diffrente est due des pigments : jaune, rouge,
orange, violette ...
Principaux types
En rassemblant les critres prcdemment dcrits, trois sortes de colonies peuvent tre
distingues
- colonies S (de l'anglais Smooth - Lisse) : colonies surface lisse et bords rguliers, bombes,
de consistance crmeuse et donnant des suspensions homognes
- colonies R (de l'anglais Rough - Rugueux) : colonies surface rugueuse et bords dentels,
plates, de consistance sche et donnant des suspensions htrognes
3

- colonies M (= Muqueuse) : colonies surface lisse et bords rguliers, bombes, filantes sous
l'anse, et donnant des suspensions htrognes.
7 : Odeur
- une odeur caractristique peut tre prsente
2 - Observation microscopique
L'observation microscopique permet de faire une tude morphologique des cellules
d'une espce microbienne.
Elle comprend
l'examen l'tat frais (examen entre lame et lamelle des bactries vivantes)
l'examen aprs coloration (le plus souvent sur frottis schs et fixs).
2.1 - Examen l'tat frais
Il permet d'observer sur les cellules vivantes:
- la forme des cellules
- leur mode de groupement
- leur mobilit
- la quantit approximative des bactries par champ microscopique
* Forme des cellules
Ce caractre est trs important en bactriologie, il peut lui seul conduire la
dtermination de genre mais on doit l'utiliser avec une extrme prudence. C'est ainsi qu'on
diffrencie des germes ayant :
- une forme sphrique : les cocci (ordres de Micrococcales)
- une forme allonge en btonnet : les bacilles (ordre des Bacteriales)
- une forme intermdiaire : les cocobacilles
- une forme incurve en virgule (vibrio) ou en ondulation (ordre des Spirillales)
- une forme spirale (ordre des Spirochaetales)
- une forme ramifie (ordre des Actinobactriales).
Attention l'examen est effectu travers une certaine paisseur de liquide, des bactries
identiques pourront apparatre sous des angles divers et sembler diffrentes.
A ct de la forme elle-mme des bactries, l'tude des groupements retrouvs dans les
cultures et qui sont lis au mode de division des germes vient complter les donnes
morphologiques et fournir de prcieuses informations pour l'identification . Ainsi dans l'ordre des
Micrococcales, les diffrents groupements observs sont caractristiques d'un genre donn:
- groupement par deux en diplocoques:
genre Pneumococcus pour les cocci Gram +
genre Neisseria pour les cocci Gram- groupement en chainettes:

genres Streptococcus, Leuconostoc, Enterococcus

- groupement en ttrades : genre Gaffkya
- groupement en amas plans (grappe de raisin): genre Staphylococcus
- groupement en amas non plans:
amas cubiques: genre Sarcina
amas irrguliers : genre Micrococcus
- groupements en palissades ou en lettres (XVL): genres Corynebacterium et
Cellulomonas.
* Mobilit
La mobilit est le caractre le plus important mis en vidence l'tat frais. On doit
observer :
- la prsence ou l'absence de mobilit
- les caractres de cette mobilit : frtillement des bactries ciliature polaire ou
tournoiement des bactries pritriches.
Remarque: Une bactrie mobile doit se dplacer dans le champ microscopique avec un
mouvement qui lui est propre, les autres bactries restant immobiles ou se dplaant dans
d'autres directions. Attention cette mobilit ne doit pas tre confondue avec les mouvements
browniens qui sont des mouvements dsordonns de particules (sans dplacement vritable)
dus l'agitation thermique des molcules de liquide ni avec les mouvements transmis par les
courants (toutes les bactries sont entraines dans la mme sens).
* Elments particuliers de la bactrie
La capsule
La prsence d'une capsule est rvle l'tat frais de la souche cultive sur milieu
enrichi, par la coloration ngative l'encre de Chine. Sa mise en vidence est un indice
important .
Ex : des diplocoques Gram+ entours d'une capsule importante voquent Streptococcus
pneumoniae.
Les spores
Leur prsence permet elle seule de ranger les bactries arobies dans la famille des
Bacillaceae. De plus la spore et sa position permettent la classification des bactries en groupes
l'intrieur d'une famille.
2.2 - Examen aprs coloration
Si la plupart des bactries et des microbes peuvent tre observs en suspension aqueuse,
cette observation est grandement facilite par l'application de colorants.
Les colorations, ralises sur des frottis schs et fixs, sont classes en
coloration simple (1 seul colorant)

coloration diffrentielle type Gram

Laction de plusieurs colorants permet des effets de contraste: un premier colorant
(cristal violet), un mordant qui complexe le colorant (lugol, acide phnique, acide chromique,
chaleur), un diffrenciateur qui est une substance dcolorante (alcool 90, mlange
alcool/actone, acides forts) et enfin un deuxime colorant .
colorations spciales
des structures bactriennes (cils ou pili, capsules, spores ...)
La coloration de Gram
C'est la coloration diffrentielle systmatiquement ralise lors d'un examen
microscopique de bactries.
Elle permet non seulement d'observer la forme des cellules mais aussi de diviser les
bactries en deux grands groupes taxonomiquement diffrents:
- bactries Gram-positives : Gram +
- bactries Gram-ngatives : Gram Les bactries qui retiennent le colorant basique utilis (cristal-violet) aprs lavage
l'alcool sont dites Gram-positives, celles qui ne le retiennent pas sont dites Gram-ngatives.
Les bactries Gram-ngatives peuvent prendre la couleur d'un second colorant. Leur
paroi ne prsente pas de barrire de permabilit l'lution du complexe colorant-mordant par
l'alcool.
La paroi des bactries Gram + est impermable au complexe colorant-mordant, elles ne
sont pas dcolores.
Procdure :
- Prparer la lame et l'chantillon examiner comme pour un tat frais.
- Etaler la suspension bactrienne en un film mince et rgulier sur la lame avec une anse
de platine par un mouvement rgulier et circulaire (talement de 2 3 cm de diamtre).
- Laisser vaporer sec soit l'air libre, soit en tenant la lame bien au dessus de la
flamme, le frottis doit devenir terne mais ne doit ni brunir, ni brler.
- L'tape de fixation qui suit consiste tuer les bactries, rendre les membranes plus
permables, fixer les structures sans les altrer et faire adhrer le frottis la lame.
En tenant la lame avec une pince craser trois fois la flamme avec la lame, le frottis est
prt subir une coloration. (Il existe une technique plus dlicate qui consiste verser
quelques gouttes d'alcool 90C sur la lame, laisser quelques secondes, goutter et
enflammer).
Coloration de Gram :
- recouvrir le frottis fix de cristal-violet, laisser agir une minute
- laver l'excs de cristal violet avec quelques gouttes de Lugol; attendre 1mn
- laver l'eau et goutter sur un mouchoir en papier.
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- traiter la prparation avec de l'alcool 95 (ou avec un mlange alcool/actone) goutte

goutte jusqu' ce que l'alcool ajout n'entrane plus de cristal-violet
- recolorer avec la safranine pendant une minute (si le dcolorant utilis est un mlange
alcool/actone, ne colorer que 20 secondes avec la safranine)
- laver, goutter, scher doucement la lame entre deux feuilles de papier Joseph.
- Observer l'immersion avec l'objectif ayant le plus fort grossissement sans contraste de
phase (0 ou HF). Pour cela, dposer une goutte de liquide immersion sur la lame,
directement au contact du frottis. Ne pas utiliser de lamelle.

Champignons filamenteux
Les champignons constituent un groupe dorganisme d'une extrme varit, des espces
microscopiques aux organismes de plusieurs kilos. Ils ont colonis tous les milieux, terrestres ou
aquatiques, et jouent un rle primordial dans l'cologie de la plante en recyclant la matire
organique morte.
Les champignons prsentaient dj de grandes diversits l're carbonifre. Ils sont parmi
les plus anciennes formes vgtales diffrencies apparues sur le globe terrestre. Classs,
initialement, parmi les vgtaux cause de la structure de leurs cellules, ils ne ralisent pourtant
pas de photosynthse.
Ce groupe, dont les quelque 100 000 espces se sont adaptes des modes de vie trs varis, est
maintenant considr comme un rgne part entire. Certains s'associent par symbiose des
algues pour survivre dans des conditions climatiques extrmes, d'autres parasitent la peau de
l'homme, quant aux saprophytes, ils provoquent la pourriture du bois.
Ce sont des Eucaryotes.
Ils sont htrotrophes : ils ne peuvent pas, comme les plantes vertes, synthtiser la
matire organique partir du gaz carbonique atmosphrique et doivent donc puiser dans le milieu
ambiant l'eau, les substances nutritives et les lments minraux ncessaires la synthse de leur
propre matire. Ils les absorbent travers la paroi de leur appareil vgtatif.
Sans vritables tissus, l'inverse des plantes suprieures ou des animaux, leur appareil vgtatif :
le thalle ne comporte ni racine, ni tige, ni feuille. Le thalle peut tre constitu d'une cellule
unique, comme dans le cas de la levure de bire, ou plus souvent, d'une structure filamenteuse,
ou myclium. Le myclium est non cloisonn chez les champignons infrieurs, et les filaments
mycliens, ou hyphes, peuvent tre compars des cellules gantes. Chez les champignons
suprieurs le myclium est cloisonn, en effet les hyphes sont divises en plusieurs segments
contenant chacun un ou plusieurs noyaux.
Dun point de vue structural les hyphes sont des sortes de tuyaux contenant le cytoplasme,
les noyaux et autres organites cellulaires. Elles sont chez les champignons suprieurs cloisonnes.
Dans les parties jeunes du myclium les cloisons sont perces de pores qui permettent le passage
du contenu cellulaire d'un compartiment l'autre. Dans les parties les plus ges, les cloisons sont
fermes, isolant les parties en voie de dgnrescence des parties actives. Des septums assurent le
cloisonnement des diffrents compartiment cellulaire (Fig1, Fig 2 et Fig3).
La colonisation du susbstrat est ralise par extension et ramification des hyphes.
L'accroissement de celles-ci s'effectue par le sommet, ou apex, o s'effectue l'essentiel des
ractions de synthse et dgradation du mtabolisme dit "primaire", indispensable la
construction de la cellule du champignon. Les rgions apicales des hyphes sont caractrises par

la prsence de nombreuses vsicules cytoplasmiques contenant les enzymes et les prcurseurs de

synthses de nouveaux polymres. Les produits du mtabolisme "secondaire" non indispensable
au fonctionnement de la cellule, sont plutt stocks en rgion subapicale. Les mtabolites
secondaires les plus connus sont les pigments, les antibiotiques, les mycotoxines...
Le myclium crot et s'tend pour former un rseau trois dimensions capable de s'organiser en
structures complexes, tels que les chapeaux des champignons suprieurs. Le chapeau et le pied,
partie visible du champignon, ne constituent que sa fructification (organe a reproducteur qui
contient les spores produites au cours de la reproduction sexue).
Fig2 : Rgion apicale dune hyphe

Fig 4 : Une colonie :

Fig 3 : architecture dune cellule fongique (ascomyctes, deutromyctes)

Le dveloppement de lhyphe se fait partir dune spore (sexue ou asexue) par

mission dun ou plusieurs tubes germinatifs et par croissance de la seule cellule terminale. La
formation dune colonie se fait de faon radiale partir du point d'inoculation.

La complexit des cycles de reproduction sexue ou asexue est l'un des lments qui ont
entran la cration d'un rgne part pour les champignons. La classification des espces est
d'ailleurs fonde sur ces particularits.
La reproduction asexue se ralise diffremment selon l'espce: par bourgeonnement
chez la levure, par individualisation d'un des segments d'une hyphe ou par formation de spores
asexues.
Fig 5 : Sporulation asexue :

et

A. niger

A. fumigatus

La reproduction sexue ncessite la fusion de deux cellules spcialises, ou gamtes.

Les levures
Les levures sont des champignons microscopiques unicellulaires (ou trs faiblement
pluricellulaires) qui se multiplient par bourgeonnement ou sporulation. Elles ont la capacit de
fermenter des matires organiques, minrales ou vgtales pour produire des substances varies.
Les levures sont constitues par les espces du genre Saccharomyces, agents de la fermentation
alcoolique de la bire, du vin, du cidre, et des lments actifs du levain de boulanger. C'est
l'activit chimique des levures qui provoque le dgagement de bulles de gaz carbonique et fait
lever la pte pain. Ces levures sont des cellules rondes ou ovales, qui, places dans un milieu
sucr ou glucidique, avec ou sans oxygne, se multiplient activement.
Ces micro-organismes ont un diamtre compris entre 6 8 10 -6 m .
Saccharomyces pompe : ce groupe se caractrise par son mode de division vgtatif qui est
transversal alors que les autres levures bourgeonnent. Elle a une forme rectangulaire.
Saccharomyces cerevisiae. Au microscope, elle apparat de formes arrondies ou ovodes.
Bourgeon en formation

CROISSANCES BACTERIENNES
RAPPELS SUR L'ENERGETIQUE DE LA CROISSANCE
La croissance peut tre dfinie comme un accroissement ordonn de tous les composants
d'un organisme. Chez les organismes unicellulaires, elle aboutit une augmentation du nombre
d'individus. Cette augmentation du nombre de cellules se traduit par une augmentation de la
turbidit du milieu de culture. On peut admettre que lorsque la densit optique du milieu ne
dpasse pas la valeur 0,6 (avec les spectros de TP) il y a proportionnalit entre le nombre
d'individus prsents dans la culture et la densit optique.
Le dveloppement d'une culture sera donc facilement reprsent en traant le graphique
des densits optiques en fonction du temps : D.O. = f (t)
En ralit, pour des raisons de prcision, on tracera plutt le graphique du log de la D.O.
en fonction du temps sur papier semi-logarithmique.
Au temps to on a xo bactries dans le milieu (inoculum)
au temps t on a x bactries dans le milieu
Pendant l'intervalle de temps dt, l'accroissement du nombre de cellules de la culture sera
proportionnel x
Donc :dx/dt = .x (1)
o:
dx/x = .dt
d'o : Ln x = . t + constante (2)
Ln = log nprien
Au temps t = o, on a xo bactries, donc : Ln xo = constante (3)
De (2) et (3), on tire: Ln x = . t + Ln xo
Ln x-Lxo = . t
On passe en exponentielle :
soit :

Ln x/xo = . t
x/xo = et
x = xo . et
(4)

Si l'on considre que la masse unitaire des bactries prsentes dans la culture est
constante, la relation (4) peut s'crire :
m = mo . e t (5)
mo = masse de l'inoculum
Soit t le temps ncessaire un doublement de la population (temps de gnration). C'est
le temps pour lequel on a : m = 2.mo
Si l'on reporte cela dans (5), on a :

2 mo = mo et

2 = e t

Donc : Ln 2 = t . Ln e ( or Ln e = 1 )

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soit :0,69 = t

d'o l'on tire: = 0,69/t;

= taux nprien de croissance

Pour une culture en phase exponentielle de croissance, le logarithme du nombre

d'organismes s'accrot linairement en fonction du temps.
En consquence, on peut admettre que le log de la masse bactrienne et donc le log de la
DO600 nm s'accroissent eux aussi linairement en fonction du temps.
La croissance d'une culture est affecte par des facteurs tels que :
- l'tat physiologique des cellules utilises pour inoculer le milieu,
- la composition du milieu
- les conditions d'incubation.
Ces diffrentes influences se rpercutant sur la forme de la courbe de croissance, il sera
assez facile de mettre leurs effets en vidence par comparaison des courbes tablies dans diverses
conditions de culture.
Ces diffrents facteurs vont aussi se rpercuter sur une grandeur trs importante : le
rendement de la croissance K :
K = masse de bactries produites (en g poids sec)
quantit d'aliment consomm (en g)
Par la suite, on appellera rendement molculaire de croissance : La valeur de Y s'exprimera donc
en grammes. mole -1.
Y = masse de bactries produite ( en grammes P.S)
quantit d'aliment consomm (en moles)
Remarques : en milieu non renouvel, Y est constant tout au long de la croissance si celle ci est
bien limite par la source d'nergie.
- Y ne peut tre dtermin qu'en milieu minimum, c'est--dire ne contenant qu'un seul
substrat nergtique. Donc la masse de bactries synthtise en fin de croissance dpend de la
quantit initiale de substrat limitant.

De manire pratique
Pour tablir une courbe de croissance, il convient densemencer un milieu de culture
avec un inoculum provenant dune prculture ralise dans les mmes conditions que celles
tablies pour ltude (atmosphre, nature du milieu, riche ou minimum, temprature, agitation,
facteur limitant la croissance). La cintique de croissance est suivie par lecture de labsorbance de
fractions aliquotes prleves par exemple toutes les 20 minutes.
La valeur lue est rapporte directement sur une feuille de papier chelle semilogarithmique (DO chelle log en ordonn ; temps, chelle millimtre en abscisse). La phase
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exponentielle se traduit par une droite (trace la rgle), les phases dacclration et de
ralentissement sont lisses en courbe.
De manire routinire, on calcule dabord le temps de gnration (On se place sur la
droite et lon choisi une DO X correspondant au temps t1, puis un deuxime point correspondant
DO = 2X. Cette dernire correspondant au doublement de biomasse est obtenue t2 sur
lchelle des abscisses. Le temps de gnration ( tg en heure ou min )correspond t2-t1 : tg =
t2_t1
Pour calculer le taux de croissance (en h-1), on applique la relation = 0,69/t

Exemple d'une courbe de croissance

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TRANSFORMATION DE MICROORGANISMES
Dfinition : Modification hrditaire des proprits d'une bactrie par un ADN extrieur. Ce
phnomne existe naturellement chez certaines bactries comme Acinetobacter.
La transformation "naturelle" ou physiologique est le premier modle connu de transfert de
matriel gntique (ADN), qui est fix et absorb par des bactries rceptrices, dites en tat de
comptence. Ce modle a permis en 1944 de dmontrer que l'ADN tait le support chimique de
l'hrdit.
Principe :
D'une part, il doit y avoir de l'ADN libr d'une bactrie (exognote). D'autre part celui-ci doit
tre
fix
sur
une
bactrie
rceptrice
en
phase
de
comptence

Cette absorption d'ADN est suivie d'une recombinaison gntique avec acquisition de nouveaux
caractres gntiques stables, donc transmissibles la descendance.

Ce transfert naturel d'ADN bactrien est limit quelques espces. Il est partiel : une partie de
l'exognote (1-2% du gnome) pntre et se recombine (si homologie suffisante).
La transformation est une technique de base du gnie gntique. Elle est utilise quotidiennement
dans les laboratoires lors de clonage.
Des cellules non transformables naturellement comme E. coli mais rendues comptentes par
traitement chimique (classiquement par des traitements au CaCl2) peuvent tre transformes avec
de lADN plasmidique.

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1- Cellules comptentes
Protocole de prparation de cellules comptentes :
- pour 50 mL de culture
1 - Ensemencer le milieu liquide Luria Broth (LB) au 1/100 avec culture de la nuit. Incuber
37C avec agitation.
2 - Quand DO550 = 0,45 bloquer la croissance dans la glace pendant 15 minutes. Transfrer dans
des rcipients de centrifugation refroidis.
3 - Centrifuger 15 minutes 2500 rotations par minute (rpm) 4C.
4 - Jeter le surnageant en gouttant au maximum et reprendre le culot dans un petit volume de
CaCl2 100mM glac avec agitation douce. Complter 20 ml avec la mme solution.
5 - Conserver 15 minutes dans la glace (ou plus).
6 - Centrifuger 15 minutes 2500 rpm 4C.
7 - Jeter le surnageant et reprendre le culot dans un petit volume de CaCl2 100mM -15%
glycrol glac avec agitation douce. Complter 1,25 ml.
8 - Laisser dans la glace 15 minutes au moins.
9 - Aliquoter, refroidir dans l'azote liquide. Conserver -70C.
2-Transformation bactrienne
Prparer des tubes de bactries comptentes contenant 100l d'une suspension de cellules
d'Escherichia coli. Ils doivent tre maintenus dans de la glace.
Les manipulations devront se faire strilement prs d'un bec Bunsen allum.
Protocole :
1 - t = 0. Ajouter l'ADN dans les tubes ; agiter le tube. Les bactries restent dans la glace.
2 - t = 25 minutes. Agiter lgrement et transfrer les tubes dans un bain-marie 37C pendant 3
minutes.
3 - t = 28 minutes. Agiter legrement et laisser les tubes 10 minutes dans la glace.
4 - t = 38 minutes. Ajouter strilement 0,5 ml de milieu liquide Luria Broth (LB) prchauff
37C ; agiter lgrement. Transfrer 37C durant 60 minutes.
5 - t = 98 minutes. Agiter lgrement et taler les bactries (ventuellement aprs dilution selon le
protocole qui aura t discut). Sur chaque bote, taler 100l de la suspension de bactries.
Remarque : pendant les temps morts les botes des diffrents milieux seront marques et les
tubes de dilution prpars, selon le protocole que vous aurez entrepris.
Commentaires :
1re tape : l'ADN en solution dans le tube va venir s'adsorber la surface des bactries. Il n'entre
pas dans les bactries car 0C les phospholipides sont figs (donc les menbranes sont figes).
2me tape : on passe de 0C 37C. La fluidit membranaire se trouve alors presque
instantanment restaure. Ceci permet l'ADN de franchir l enveloppe bactrienne.
3me tape : retour temprature ambiante.
4me et 5me tapes : le milieu liquide LB prchauff 37C va restaurer le mtabolisme et la
croissance des bactries (1 2 cycles de division). Durant 60 minutes le plasmide va pouvoir se
rpliquer ; les gnes vont sexprimer, notamment le gne codant pour lenzyme confrant aux
bactries transformes la rsistance a un antibiotique. Puis on triera les bactries sensibles et les
bactries resistantes en les plaant sur un milieu renfermant un antibiotique (principe de slection
positive par expression directe). On rcuprera ainsi les bactries transformes.

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3- Lelectrotransformation
L'lectrotransformation a pour but la permabilisation de la membrane cytoplasmique sous
l'influence d'un champ lectrique. Les fonctions prcises qui induisent cette permabilisation sont
encore mal connues, mais il semble que la membrane soit destabilise localement et
transitoirement, laissant apparatre des structures transitoires de permation (STP) qui autorisent
l'entre ou la sortie de molcules. Dans le cas d'une transformation, le but recherch est l'entre
de matriel plasmidique dans les cellules avec bien sr, la notion de rendement maximum. On
cherche obtenir le maximum de transformants par g d'ADN. Pour ce faire, 3 paramtres
doivent tre contrls:
- le champ lectrique appliqu, dont la tension et la dure doivent tre suffisament leves
pour induire l'apparition de STP, sans tuer les cellules (pour E. coli, 5 6 kV/cm, 4 ms).
- la rsistance du milieu, qui doit tre trs grande de faon que l'nergie du choc lectrique
ne soit pas dissipe en chaleur.
- la concentration de cellules, qui doit tre suffisante pour que le courant passe par contact
entre les cellules (habituellement de l'ordre de 1011 cellules/ml).

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Miniprparation de plasmides et analyse de restriction

Les plasmides :
Les plasmides sont des lments gntiques que l'on trouve dans une grande varit de
bactries. Ce sont des molcules d'ADN bicatnaire et circulaire dont la taille varie, selon les
types, de 2000 200 000 paires de bases. Ils contiennent souvent des gnes dont les produits
sont utiles la bactrie (par exemple un gne confrant la rsistance un antibiotique).
L'utilisation des plasmides a permis la construction d'outils appels vecteurs, qui sont des
ADN plasmidiques (ou phagiques) modifis et qui ont permis le dveloppement des techniques
de biologie molculaire. Dans ces vecteurs on peut insrer dans des endroits prcis un fragment
d'ADN tranger (clonage). Cette construction (plasmide recombinant) est ensuite introduite dans
des bactries (transformation) o elle pourra tre produite en un grand nombre de copies.
Des mthodes rapides ont t mises au point permettant d'isoler l'ADN plasmidique en
quantit et en qualit suffisantes pour effectuer un certain nombre d'analyses. Bien que ces
mthodes puissent diffrer sur certains points, les tapes principales restent les mmes :
- croissance des bactries contenant le plasmide extraire
- rcupration des cellules bactriennes par centrifugation
- lyse des cellules avec un tampon appropri (il sagit souvent dun mlange de SDS et de
NaOH : on parle alors de lyse alcaline)
- prcipitation de lADN plasmidique en prsence dthanol ou disopropanol (il peut
aussi sagir dune fixation spcifique de lADN sur une rsine)
- resuspension de lADN dans de leau ou dans du tampon
Une fois purifis, ces ADN plasmidiques peuvent tre analyss par lectrophorse sur gel
d'agarose. On peut ainsi contrler la qualit d'une prparation de plasmides.

Les enzymes de restriction :

Les enzymes de restriction appartiennent la classe des endonuclases, cest--dire des
enzymes capables de cliver les liaisons phosphodiester entre deux nuclotides lintrieur dun
acide nuclique. Les endonuclases se diffrencient des exonuclases qui dgradent la molcule
dADN partir de lune de ses extrmits (3 ou 5).
Les enzymes de restriction sont capables de reconnatre spcifiquement une courte
squence, de 4 10 pb, et de cliver l'ADN au site reconnu. Ils permettent de fragmenter l'ADN en
segments de taille rduite. Certains enzymes coupent le site en son milieu et produisent deux
fragments dont les extrmits sont franches. Cependant, la plupart ralisent une coupure
dissymtrique : on parle dans ce cas d'extrmits cohsives (chaque fragment possde une chane
qui dpasse l'autre de quelques bases). Plusieurs centaines de ces enzymes ont t caractriss :
ils reconnaissent une grande varit de sites de coupure.
Les squences de nuclotides reconnues par les enzymes de restriction sont
habituellement des squences dites palindromiques. Les squences palindromiques sont des
squences o la succession des nuclotides lue dans le sens 5 vers 3 (gauche-droite) pour le
premier brin est identique la squence lue dans le sens droite-gauche pour le second brin (sens
5 vers 3). Ces squences palindromiques sont le plus souvent constitues de 4, 5 ou 6 paires de
bases.
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Les enzymes de restriction prsentent une nomenclature bien prcise. Leur nom comporte
plusieurs lettres (3 ou 4). La premire lettre de dnomination de lenzyme est crite en majuscule,
elle correspond au genre de la bactrie do a t extraite lenzyme. La seconde lettre et la
troisime lettre (en minuscules) correspondent lespce de la bactrie do lenzyme est
extraite. On peut avoir une quatrime lettre crite en majuscule correspondant la souche
bactrienne. Enfin pour terminer, un chiffre romain indique lordre de caractrisation de ces
enzymes.
Exemples:
EcoRI, extraite de Escherichia coli RYB, site reconnu: G / AATTC
SmaI, extraite de Serratia marcescens, site reconnu: CCC / GGG
PstI, extraite de Providencia stuartii, site reconnu: CTGCA / G
Les utilisations des enzymes de restriction sont trs nombreuses en biologie molculaire.
Elles peuvent tre utilises pour tablir une carte de restriction de toute molcule d'ADN que l'on
souhaite caractriser. Cela consiste dterminer l'ordre des sites de restriction le long de cette
molcule, qui vont produire, aprs "digestion enzymatique" de cette molcule, des fragments de
tailles diffrentes dont la taille pourra tre dfinie par lectrophorse. Les enzymes de restriction
peuvent galement tre utilises pour prparer un fragment dADN dun gne donn (insert)
tre insr dans un vecteur comme un plasmide.
Un grand nombre denzymes sont commercialises. Une unit dactivit enzymatique est
dfinie comme la quantit denzyme ncessaire pour couper 1 g dADN en 1 heure dans le
tampon et la temprature appropris pour lenzyme utilise.

17

PCR = Polymerase Chain Reaction

( raction de polymrisation en chane )

1) Introduction
La PCR est une mthode permettant la multiplication dune courte squence dADN (jusqu 2
ou 3 Kb en routine et parfois plus) appele squence cible, partir dune infime quantit dADN
gnomique ou plasmidique. Elle est mme possible partir de lADN gnomique issu dune
cellule unique voire a patir de cellules lyses. Elle est ralise dans un tube essai (Tube
eppendorf) en quelques heures. Publie en 1985 par R. Saiki, elle a rvolutionn le diagnostic
molculaire des maladies gntiques comme bien dautres domaines.

Le taux de multiplication (ou taux damplification) est tel que la raction revient rendre
ngligeable le reste du gnome qui na pas t amplifi car le produit de PCR contient presque
exclusivement des millions dexemplaires de la squence cible. Il est donc facilement analysable
par exemple sur un gel dlectrophorse en fluorescence UV sans avoir rechercher
spcifiquement la squence cible par hybridation molculaire comme ctait le cas auparavant
(technique de Southern-blot). La PCR est utilise dans la trs vaste majorit des diagnostics
molculaires.

18

2) Principe
La squence cible est multiplie par synthses successives laide :
- des amorces (Primers), fragments courts dADN, spcifiques (ou non) de la squence
amplifier, il sagit gnralement doligonuclotides de 18 25 bases, dont les squences ne
doivent pas tre complmentaires et qui ne doivent pas former de structures secondaires.
- dun enzyme particulire, une ADN polymrase active haute temprature, temprature
laquelle lADN est dnatur, comme par exemple la Taq polymrase
Chaque synthse ou cycle de PCR est constitue de 3 tapes constitues de trois plateaux de
temprature diffrents : dnaturation (autour de 95C), hybridation des amorces (entre 50 et
60C) et polymrisation ou longation (autour de 72C). On considre souvent un temps
dlongation de 1 minute par Kb amplifier. Chaque cycle dure quelques minutes. La squence
cible tant double chaque cycle, le taux damplification (thorique) est de 2(exposant)n, si bien
quaprs une trentaine de cycles de PCR, le nombre de copies de la squence cible est plusieurs
dizaines de millions de fois suprieur nimporte quelle autre squence du gnome. Cette surreprsentation la rend facilement analysable et manipulable.

3) La raction
Le milieu ractionnel doit contenir :
lADN contenant la squence amplifier ; il peut sagir de lADN gnomique ou dADN
plasmidique contenant une squence dintrt
les deux amorces olignonuclotidiques monobrins complmentaires chacune dune des
extrmits du fragment amplifier.
des dsoxynuclotides libres dATP, dCTP, dGTP, dTTP qui sont incorporables pour
former le brin dADN nosynthtis.

19

du MgCl2 et une solution donnant au milieu ractionnel un pH et une concentration saline

optimale pour le fonctionnement de lenzyme
lenzyme permettant la synthse dun nobrin partir des amorces ; il sagit dune ADN
polymrase thermostable, par exemple la Taq DNA polymrase issue du micro-organisme
thermophile : Thermus aquaticus.

Le tube contenant le milieu ractionnel est plac dans un appareil appel thermocycleur , sorte
de plaque chauffante programmable en temps et en temprature et disposant de dlais de monte
et de descente en temprature extrmement courts. Il dlivre chaque instant au milieu
ractionnel une temprature donne permettant la ralisation de lune des trois tapes du cycle de
PCR : dnaturation, hybridation ou synthse.

Simulation dune raction PCR :

Nombre de brin dADN :
Nombre de cycles :
Nombre de copies :
Nombre de copies cibles :

1
25
33 554 432
33 554 382
Copies cibles =
Nombre de copies

99.99985%

20

4) Les limites de la technique

a)
La PCR suppose la synthse chimique de deux oligonuclotides utiliss pour lamorage
de la raction. Il faut donc que la squence nuclotidique du fragment analyser soit connue au
niveau de ces rgions damorage. Il est nanmoins possible de contourner le problme en
clonant le fragment dont la squence est totalement inconnue dans un vecteur (plasmide,
bactriophage ...) afin dutiliser la squence (connue) du vecteur pour amorcer la raction de
PCR..
b) La taille du fragment amplifier ne peut pas dpasser quelques kilobases. Au-del, il se
produit des phnomnes qui empchent la raction de se faire normalement : interruptions
prmatures dues la formation de structures secondaires, rappariement des fragments
nosynthtiss entre eux etc
c) Le taux damplification est thoriquement de 2(exposant)n mais en pratique le rendement de la
raction nest jamais de 100%.
d) Au-del d'un certain nombre de cycles, le taux d'amplification baisse progressivement pour
tendre vers 1 (Voir ci aprs). Ceci est d une diminution de la concentration des
dsoxynuclotides et des oligonuclotides et l'augmentation de la concentration du produit de
PCR.

21

5) Design des amorces

Les amorces doivent tre spcifiques, stables et compatibles
Squence cible

5'

Amorce droite (antisens) 3'

Squence identique
la squence 5-3'
5'
3'

3'
5'
complment inverse
de la squence 5'-3'

3' Amorce gauche (sens)

5'

Les amorces ont en gnral une longueur de 21 nt (ou 21 mers) et sont toujours crites du
5 vers le 3.
Gnralement les nuclotides G et C plus stables, sont privilgis lextrmit 5 alors
que les nuclotides T et A moins stables sont privilgis lextrmit 3.

Extrmit 3 stable

Extrmit 5 stable

En effet le sens de la polymrisation tant 5

3, linitiation de la polymrisation par
la Taq sera rendue plus efficace par la facilit daccession cette extrmit moins rigide de
lamorce hybride sur la cible.
Ex : Choix damorces obtenues avec le programme en ligne
http://frodo.wi.mit.edu/primer3/
GTCATGGTGATGTGGTTTGTTTGCTGCTCAGCCATGCGGAAAACGGCCTCCAATGTGCTG
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
AATACGTCATGCGCATCCCCGTCAAGCTCGCTCGCGTAATGGACACCCTGTACGAAAGTG
CCTTGGGCTTTTGCAATGTCGACAGCCTCCATAATCAATCCCATATAATCCGGCTCATTC
ATTGGATAAAGGGCAAATTGGCACGGCG
<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<
En noir : squence cible
LEFT PRIMER
TGGTGATGTGGTTTGTTTGC
RIGHT PRIMER
CCAATTTGCCCTTTATCCAA

GC% : 45%;
GC% : 40%

Tm : 60,41
Tm : 59,77

Il est galement possible de rajouter sur ces amorces des sites de restriction enzymatiques
ou bien des tiquettes (sries de nucleotides codant des acides amins spcifiques ex :
CACCACCACCACCACCAC pour 6 Hist). Le rajout de ces nuclotides inexistants sur la
squence cible va crer un msappariement dont il faudra tenir compte pour choisir la
temprature dhybridation.

22

Purification d'une protine

Pour tudier la structure et les fonctions biologiques d'une protine in vitro, plusieurs tapes
essentielles doivent tre mises en uvre afin d'obtenir une protine suffisamment pure et
concentre pour tre utilise dans diffrents tests enzymatiques ou chimiques. Les principales
tapes sont schmatises ci-dessous :

1 . Surproduction

2 . Prparation d'un
extrait protique

3 . Purification
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- Surproduction : Le gne d'intrt est clon dans un vecteur d'expression, qui porte galement un
gne de rsistance un antibiotique (par exemple, le gne bla dont l'expression entrane une
rsistance l'ampicilline). Aprs des bactries par le plasmide recombinant, ces dernires sont
cultives en prsence de l'antibiotique ad hoc afin de slectionner uniquement les bactries
portant le vecteur. Arrives en phase exponentielle (DO600 comprise entre 0,4 et 0,7), il est alors
possible d'ajouter un inducteur dans le milieu de culture (arabinose pour pBAD, ou IPTG pour le
promoteur Lac par exemple) qui est ensuite import dans le cytoplasme bactrien. En se fixant
sur le promoteur localis en amont du gne clon, l'inducteur augmente le niveau de transcription
du gne, ce qui a pour effet direct de surproduire la protine d'intrt.
Prparation d'un extrait protique : Cette tape va consister prparer un extrait "brut" partir de
la culture cellulaire prcdente. Pour cela, il va falloir rompre les cellules soit par choc
mcanique (presse de French, ultrasons), soit par traitement enzymatique (lysozyme). Aprs
centrifugation, on retrouve toutes les molcules solubles dans le surnageant, alors que les dbris
cellulaires, les membranes biologiques et les molcules insolubles sont concentrs dans le culot.
Purification : A ce stade, le but est de sparer la protine d'intrt de toutes les autres protines
prsentes dans l'extrait. Plusieurs critres permettent la sparation des protines : leur taille (gel
filtration), leur charge (chromatographie changeuse d'ions), leur affinit (chromatographie
d'affinit, immuno-adspoption). Gnralement, plusieurs tapes faisant intervenir diffrents
critres de sparation sont ncessaires pour permettre une purification efficace.
Depuis une dizaine d'annes, les techniques de biologie molculaire ont permis la construction de
protines recombinantes possdant une tiquette (ou tag) greffe sur leur extrmit N- ou Cterminale. La plus rpandue est l'tiquette histidine, qui est constitue d'un hexapeptide de 6
histidines qui ont la proprit de se fixer sur le nickel. On peut galement citer le "flag peptide",
qui est un octapeptide reconnu spcifiquement par un anticorps. Le principal intrt de cette
approche est d'obtenir un protocole de purification en une tape, l'inconvnient tant que la
protine purifie porte un peptide additionnel sur l'une des deux extrmits.
Evaluation de la puret de la protine : Une fois la protine purifie, il est possible d'valuer son
degr de puret en la faisant migrer sur SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide
Gel Electrophoresis). Si la purification est correcte, on ne doit obtenir qu'une seule bande migrant
la taille de la protine si elle est monomrique, ou la taille de sa sous-unit si elle est
oligomrique. Cette tude peut tre complte par la technique de western-blot, qui permet de
confirmer les rsultats obtenus par SDS-PAGE en faisant agir un anticorps reconnaissant
spcifiquement la protine purifie. Cette exprience permet galement de visualiser les produits
de dgradation ventuels de la protine d'intrt, et d'expliquer ainsi la prsence potentielle de
bandes de plus faible poids molculaire que la protine.

24

SDS-PAGE
(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)

Principe: sparation de protines en fonction de leurs masses molculaires

Quand elles sont dnatures par la chaleur ( 95C) en prsence dun excs de
SDS et dun agent rducteur (-mercaptothanol DTT -dithiothreitol-), la
plupart des protines fixent de la mme faon le SDS (dtergent anionique)
qui les transforment en polyanions et leur confrent donc une charge nette
ngative. Les protines ayant la mme densit de charge se dplaceront la
mme vitesse dans un champ lectrique. Dans le systme SDS-PAGE, la
sparation des protines seffectue donc uniquement selon un critre de taille.

Les gels de polyacrylamide rsultent de la polymrisation dun monomre, lacrylamide, en

prsence un agent bifonctionnel (NNmthylne bis acrylamide) rticulant les chanes entre elles.
La polymrisation du gel est initie par lajout dAPS (persulfate dammonium) et est catalyse
par lajout de TEMED (NNNN-ttramthyl-thylne diamine). La polymrisation se traduit par
la formation dun rseau de mailles, dont la taille varie en fonction de la concentration en
acrylamide. La migration des protines sera plus ou moins retarde en fonction de leur taille et de
celle des mailles (9% sparation de grosses protines, 15% de petites protines). Il existe une
relation linaire entre la distance de migration lectrophortique et le log de la masse molculaire
des protines dnatures par le SDS.
La sparation des protines seffectue dans un systme discontinu constitu de deux parties. Un
gel de concentration (stacking-gel) qui contient des puits dans lesquels sont chargs les
chantillons. Ce gel est coul au-dessus dun gel de sparation (running-gel) o les protines
seront spares en fonction de la taille.
Lacrylamide est neurotoxique. Manipuler avec des gants tant quil nest pas polymris.
puits
stacking-gel
running-gel

25

Des conditions natives de PAGE peuvent tre ralises pour conserver la structure des protines,
leur activit enzymatique ou linteraction avec une autre protine partenaire. Dans ce cas, il ne
faut pas utiliser de SDS (dans aucun des tampons), dagents rducteurs, ni bouillir les
chantillons. Il sagit alors dune sparation selon la taille et la charge globale des protines.

Systme SDS-PAGE
(Miniprotean III, BioRad)

PhastSystem (Pharmacia)
Extrmement rapide
Gels pr-couls

Les protines peuvent tre colores au bleu de Coomassie ou largent (trs sensible).

26

Western-blot (Immuno-blot)
Principe: Sous leffet dun courant lectrique, les protines contenues dans le gel dacrylamide
vont tre transfres ("blottes") sur une membrane (nitrocellulose, PVDF). Les protines sont
lies irrversiblement celles-ci et peuvent donc tre visualises par raction anticorps-antigne
aprs traitement de la membrane par un anticorps spcifique de la protine tudie.
La dtection seffectue le plus souvent de manire indirecte grce
un anticorps secondaire (anti IgG) dirig contre le premier
anticorps et coupl
- un radioisotope (auto-radiogramme)
- fluorophore
- une enzyme (phosphatase alcaline ou peroxydase)
- la streptavidine (rvlation par la biotine)

Ac IIaire

Ac Iaire

Deux mthodes de dtection sont couramment utilises :

- raction chromognique qui produit un prcipit sur la membrane au niveau de la protine cible
- chmiluminescence : mission de lumire au niveau de la protine cible, dtecte aprs
exposition sur film photographique (trs sensible)
proxydase /H2O2 O2- (superoxyde) oxydation du luminol lumire
ex

27

Electrophorse ADN
Principe: sparation des acides nucliques (AN) en fonction de leurs masses molculaires
Des gels d'agarose de % diffrents (0,3 2%) sont utiliss pour sparer des fragments d'ADN de
0,2 20kb, ou de polyacrylamide pour des fragments de taille infrieure 1kb (5 20%). Ces
molcules charges ngativement migrent vers l'anode une vitesse inversement proportionnelle
leur masse molculaire. L'ADN est visualis grce au Bet (Bromure dthydium) qui s'intercale
entre les bases des acides nucliques et qui met une fluorescence orange ( 590nm) aprs
excitation aux UV ( 300nm). La taille et la quantit des fragments sont estimes par
comparaison avec le marqueur de taille (seuil de dtection dizaines de ng).
Le Bet est potentiellement cancrigne : manipuler avec des gants, et utiliser les poubelles
adquates.
L'observation du gel sous UV rclame une protection des yeux.

Mupid system
Marqueur de taille

28

DOSAGE de PROTEINES

PRINCIPE et GENERALITES
Plusieurs mthodes de dosage des protines utilisent des proprits des acides amins,
composant les protines. Ce sont gnralement des mthodes spectrophotomtriques bases sur
certaines caractristiques spectrales ou ractionnelles des acides amins. Le choix dune mthode
dpend des besoins et des caractristiques recherchs: fiabilit, sensibilit, rapidit, possibilit de
rcuprer l'chantillon aprs dosage, prsence de substances interfrentes dans l'chantillon, etc..

MTHODOLOGIES
1/ Absorption 280 nm
Le tryptophane absorbe fortement 280 nm de mme que, dans une moindre mesure, la
tyrosine. La phnylalanine et la cystine ont galement de faibles absorptions dans cette rgion de
l'U.V. rapproch. Il est donc possible de doser les protines en mesurant l'A280. videmment
l'absorption cette longueur d'onde dpend principalement du nombre de tryptophanes dans le
mlange protique. Une solution contenant 1 mg de protines/mL prsente une A280 de l'ordre de
0.5 2.0.
Pour une protine pure, il est possible de calculer le coefficient dextinction molaire. Il
s'agit de calculer l'A280 due chacun des quatre acides amins mentionns prcdemment et d'en
faire le total. Il suffit alors de mesurer lA280 dune solution protique pure, dans un tampon
contenant un agent chaotropique (chlorure de Guanidium qui permet de dnaturer compltement
la protine), pour dterminer sa concentration.
On s'est aperu qu'il y a trs peu de masquage de l'A280. On peut donc appliquer en
premire approximation le coefficient dextinction molaire calcul pour une protine non
dnature. Pour un mlange de protines, la mesure de A280 donne une approximation assez
fiable, surtout pour comparer des mlanges de composition semblable.
Les avantages de cette mthode sont sa relativement bonne sensibilit (50-100 g), sa
simplicit et sa rapidit d'excution. Elle permet en outre de rcuprer la solution protique si
besoin est, car elle ne ncessite pas que les protines de la solution soient dtruites par une
raction quelconque. Elle est particulirement utile pour suivre le contenu en protine de
l'effluent d'une chromatographie.
Elle a cependant un dsavantage majeur, la prsence de contaminants ayant une
absorption 280 nm. Parmi ces contaminants potentiels, on trouve les acides nucliques. Ils
absorbent fortement dans l'U.V., avec un maximum autour de 254 nm, et contaminent souvent les
prparations de protines. Une mthode permet de dterminer la concentration protique d'un
mlange contenant une proportion donne d'acides nucliques. Cette mthode requiert la mesure

29

de l'absorption deux longueurs d'onde: 280 nm, pour les protines, et 260 nm, pour les
acides nucliques. Ces valeurs peuvent alors s'intgrer dans l'quation:
[protines] (mg/mL) = 1.55 A280 - 0.76 A260
Parmi les autres contaminants potentiels, les produits tampons et les dtergents peuvent
souvent tre problmatiques. Une faon simple d'liminer ce facteur est d'inclure ces produits
dans le blanc, lorsque cest possible.

2/Mthode du biuret
La raction du biuret a permis de mettre au point une mthode quantitative de dosage des
protines. Cette raction du biuret est la formation d'un complexe pourpre entre le biuret (NH2CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conscutifs en prsence de cuivre en milieu alcalin.
Le complexe de coordination rsultant absorbe fortement dans le bleu.
Cette mthode est peu sensible (1-20 mg), mais elle est relativement rapide. Sa principale
qualit est d'avoir une absorption gale pour toutes les protines. Certains composs interfrent
avec ce dosage, comme les peptides, le saccharose, le tampon Tris, le glycrol, etc...

3/Mthode de Lowry
Cette mthode combine une raction au biuret et une raction au ractif de FolinCiocalteu. Ce dernier, base de phosphomolybdate et de phosphotungstate, ragit avec les
tyrosines et les tryptophanes, pour donner une coloration bleue qui s'ajoute celle du biuret.
Cette mthode a t tellement utilise que l'article original de Lowry est un des articles
scientifiques les plus cits au monde! Encore aujourd'hui on publie de nouvelles variantes de
cette mthode.
La grande sensibilit de la mthode de Lowry est sa principale qualit. Elle peut atteindre
5-10 g. La zone de linarit de la raction est cependant troite et il faut utiliser la portion
linaire de la courbe qui correspond l'absorption de l'inconnu.
Le protocole en est le suivant :
A 1 ml d'chantillon doser, convenablement dilu dans l'eau distille, on ajoute 5 ml de
ractif C. Aprs dix minutes, on ajoute rapidement 0,5 ml de ractif de Folin-Ciocalteu, dilu de
moiti dans l'eau (ajouter le ractif au centre du tube, ne pas le faire couler sur les parois). Ce
ractif est prpar pendant les 10 minutes d'attente, et en quantit juste suffisante pour le dosage
en cours (exemple: un tmoin + 5 dosages, soit 6 tubes). Il vous faudra donc 3 ml de ractif dilu
de moiti, c.a.d. 1,5 ml de ractif de Folin-Ciocalteu. Pour tenir compte d'un ventuel volume
mort de la pipette, diluez 2 ml de ractif pur ---> 4 ml final). Mlanger. Aprs trente minutes
l'obscurit, l'absorption 750 nm est lue et la concentration en protines estime par rapport
une courbe talon tablie avec l'albumine de srum de boeuf (entre 0 et 0,1 g/l).
N.B.: Ractif C = 50 parties de ractif A pour 1 partie de ractif B

30

Ractif A = Na2CO3 20 g/l dans NaOH 0,1N

Ractif B = CuSO4 5 g/l; tartrate de sodium et de potassium 10 g/l.
La courbe d'talonnage sera ralise partir d'une solution mre 100 mg/l
Cette mthode est trs sensible de trs nombreuses substances interfrentes: certains
peptides et acides amins. le saccharose, le tampon Tris, le glycrol, les drivs mercaptan,
l'EDTA, de nombreux dtergents, etc... De nombreuses variantes ont t dveloppes pour
contrer ces dfauts. Entre autres, citons une mthode permettant d'liminer les substances
interfrentes par microprcipitation des protines l'acide trichloroactique aprs complexation
avec du desoxycholate.

4/Mthode du bleu de Coomassie

Cette mthode est base sur l'adsorption du colorant bleu de Coomassie G250. En milieu
acide, ce colorant s'adsorbe sur les protines et cette complexation provoque un transfert de son
pic d'adsorption qui passe du rouge au bleu.
C'est une mthode trs sensible (2-5 g de protines) et trs rapide. Elle est aussi assez
rsistante la plupart des interfrents qui nuisent la plupart des autres mthodes. Seuls les
dtergents, comme le Triton et le dodcylsulfate de Na (SDS), et des bases fortes interfrent avec
cette mthode.
Son principal dfaut est sa ractivit trs diffrente face diverses protines. Il faut par
exemple noter que la protine souvent utilise pour la confection de courbes d'talonnage,
l'albumine srique bovine (ou BSA), ragit beaucoup plus fortement que la moyenne et n'est donc
pas approprie. Un autre inconvnient de la mthode est la tendance du ractif s'adsorber sur le
verre des cuvettes de spectrophotomtre et qu'il faut donc les nettoyer consciencieusement aprs
usage.

5/Acide bicinchonique
L'acide bicinchonique (BCA) ragit avec les complexes de Cu2+ et de protines de faon
trs similaire la raction du biuret. En formant de tels complexes, il prend une couleur pourpre
typique. C'est une mthode sensible et rapide qui rsiste aux dtergents comme le Triton ou le
SDS.

6/Mthode de Kejdahl
Cette mthode consiste mesurer la quantit d'azote organique d'un chantillon. Il faut
videmment savoir, pour l'chantillon analys, quelle est la relation entre la quantit d'azote et
celle de protines. Elle requiert un quipement coteux et complexe. On ne l'applique qu' des
chantillons difficiles homogniser comme du matriel vgtal.

31

LE DOSAGE ENZYMATIQUE
Le substrat de lenzyme doit tre fourni en concentration saturante (suprieure 10 fois le
Km).
Lactivit enzymatique est value au cours du temps soit en valuant la consommation
de substrat, soit en valuant lapparition dun produit de la raction.
Cette volution de la composition du mlange ractionnel peut tre value :
soit directement en mesurant labsorbance de llment suivi en utilisant son
coefficient dextinction molaire.
Soit en valuant la concentration de cet lment dans le mlange par un dosage
spcifique. Il est alors ncessaire de raliser une gamme dtalonnage.
Lactivit enzymatique peut tre exprime par ml de solution enzymatique
o ou rapporte la quantit de protine enzymatique et on parle dactivit spcifique
Quelques exemples concrets :
1/ Evaluation de lapparition dun produit de raction et utilisation du coefficient
dextinction molaire : exemple du dosage de la phosphatase alcaline dans un extrait
cellulaire
Principe : La mesure de l'activit de la phosphatase alcaline exploite la raction suivante :
NO2 -

- O - PO3H2 + H2O ----->

NO2 -

paranitophnylphosphate
ou pNPP

- OH + H3PO4
paranitrophnol

La phosphatase alcaline hydrolyse le paranitrophnylphosphate en acide phosphorique et

paranitrophnol qui absorbe 410 nm.
Mode opratoire
Mettre dans un tube essai :
- 2 ml dextrait cellulaire
- 1 ml de solution de pNPP 2,5 10-3 M
Incuber 1 heure 37C.
Arrter la raction en ajoutant 0,6 ml de tampon PO4Na 1 M pH 8,5.
Lire la D.O 410 nm en utilisant comme tmoin le contenu d'un tube dans lequel le
pNPP a t remplac par 1 ml d'eau distille.
Calcul
Connaissant le coefficient d'absorption molculaire du p-nitrophnol (soit = 1,75 X 103
UDO.M-1), dterminer la quantit de produit libr laide de la relation suivante DO/t
x1,8/1 = lC (l, la longueur du trajet optique est gnralement de 1 cm ; 1,8/1 permet de tenir
compte du facteur de dilution de lextrait dans le mlange enzymatique ; t est exprim en

32

minutes, C est lactivit enzymatique exprime en nombre de moles de pNP libr par litre et par
minute)
1 unit phosphatase est la quantit d'enzyme qui libre 1 mole de paranitrophnol par
minute 37C. Pour avoir lactivit enzymatique exprime en units phosphatase, il faut
multiplier C par 106 (pour passer des moles en moles) et le diviser par 1000 (pour passer des l
en ml)
2 /Evaluation de lapparition dun produit de raction :
a/ Exemple du dosage de la -galactosidase avec tablissement dune courbe
dtalonnage pour lvaluation de lONP produit.
On peut utilis l'ortho-nitrophnyl -D-galactopyrannoside ou ONPG qui est hydrolys
par la -galactosidase suivant la raction:
-galactosidase
ONPG + H2O
----------> galactose + ONP
L'ortho-nitrophnyl (ONP) libr prsente en milieu alcalin une forte coloration jaune,
dont l'intensit est proportionnelle sa concentration, ce qui permet de le doser 405 nm.
Le protocole exprimental du dosage dans un extrait cellulaire peut suivre les tapes
suivantes :
- Au temps 0, mettre dans un tube 1 ml de la solution d'ONPG dans du tampon phosphate
pH7 et 2 ml dextrait dilu dans du tampon phosphate pH7.
- Incuber 28C pendant 15 mn exactement, dans un bain-marie (ou noter exactement le
temps). On peut galement prparer un volume ractionnel plus important au dpart et faire des
prlvements de 3 ml diffrents temps.
- Ajouter 2 ml de Na2CO3 1 M pour arrter la raction et permettre le dveloppement de
la coloration jaune (en milieu alcalin) aux 3 ml de mlange ractionnel.
- Bien agiter.
- Mesurer la densit optique 405 nm en utilisant comme tmoin un mlange de 2 ml
dextrait dilu + 1 ml d'eau distille + 2 ml de Na2CO3.
- En se reportant la courbe talon (U DO= f( nmole ONP/ml dextrait dilu)) on pourra
dterminer le nombre d'units -galactosidase de lextrait cellulaire en tenant compte de sa
dilution successive dans la prise dessai de 2 ml.
Etablissement de la courbe talon
Pour tablir la courbe reprsentant les variations de la densit optique 405 nm en
fonction de la concentration en ONP, prparer une srie de dilutions de 1/10me en 1/10me ,
dans du tampon phosphate 0,1 M pH 7, partir dune solution mre d'ONP 2.10-3 M.
Raliser une courbe talon : DO (4O5nm) / nmole dONP /ml dextrait dilu
* Une unit -galactosidase est souvent dfinie comme tant la quantit d'enzyme
librant 1.10-9 mole (1 nmole) d'ONP par minute 28C.

33

Lunit officielle dactivit enzymatique est le katal. Le katal (kat) est la quantit
d'enzyme qui catalyse la transformation de 1 mole de substrat par seconde. Le katal n'est jamais
utilis, car beaucoup trop grand. On utilise plutt le kat (10-6 katal), nkat (10-9 katal) ou le pkat
(10-12 katal).
La plupart des biochimistes prfrent l' "unit internationale" (IU, International Unit),
qui est la quantit d'enzyme qui catalyse la transformation de 1 mole de substrat par minute.
60 IU valent donc1 kat.
b/ Le dosage de lactivit -galactosidase exprime en Units Miller
Principe :
Le substrat utilis est galement lONPG (ortho-nitrophnyl -galactopyranoside) qui est
hydrolys en milieu aqueux en galactose et ONP (ortho-nitophnol). Le dosage est ralis sur 0,1
ml d'chantillon de culture selon le protocole mis au point par Miller en 1972. Les units Miller
obtenues sont des units arbitraires proportionnelles une augmentation de la quantit d'ONP par
minute et par cellule. Elles prsentent l'avantage d'tre de l'ordre de plusieurs centaines lorsque la
-galactosidase est prsente dans la cellule et d'au maximum 10 lorsque l'enzyme est absente.
Mode opratoire
- Dans un tube contenant 0,9 ml de tampon Z (tampon Z (Na2HPO4,7H2O: 0,06M;
NaH2PO4,H20: 0,04M; KCl: 0,01M; MgSO4,7H2O: 0,001M; -mercaptothanol: 0,05M; pH
7). Ce tampon "phosphate" permet le maintien de l'tat rduit des groupements SH des
protines indispensable l'activit de la -galactosidase grce au -mercaptothanol) est
ajout 0,1 ml de culture pralablement refroidie. Faire un ou deux tubes tmoins avec 0,9 ml
de tampon Z et 0,1 ml de milieu de culture strile.
- Mlanger
- Ajouter 1 goutte de tolune ( la pipette Pasteur, sous la hotte). Celui-ci permet l'interruption
partielle de la membrane cytoplasmique et permet ainsi aux petites molcules comme l'ONPG
de diffuser dans le cytoplasme qui contient la -galactosidase.
- Mlanger au vortex pendant 10 secondes
- Ouvrir les tubes et les mettre dans une tuve 37C pendant environ 40 minutes. Cette tape
permet l'vaporation du tolune.
- Ajouter 0,2 ml de solution d'ONPG ( 4 mg/ml dans du tampon phosphate) et dclencher un
chronomtre, puis placer immdiatement les tubes dans un bain marie 28C.
- Surveiller la coloration jaune dans les tubes. Ds qu'elle apparat, il faut sortir le tube du bain
marie, arrter la raction avec 0,5 ml de Na2CO3 1M, et noter le temps de raction. Aprs 2
heures de raction, arrter les ractions dans tous les tubes qui n'ont pas "jauni"
- Centrifuger les tubes pendant 5 minutes
- Transfrer 1 ml de surnageant dans une microcuve.
- Lire les DO 550nm et 420nm pour chaque chantillon en faisant le zro d'absorbance sur
le tube tmoin.
Calcul des units Miller
L'activit -galactosidase mesure selon Miller est proportionnelle l'absorbance 420nm
rsultant de l'absorbance de l'ONP et est inversement proportionnelle au temps de raction, au
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volume d'chantillon utilis pour faire la raction et la concentration cellulaire de l'chantillon

(donne par l'absorbance des cellules 600nm).
L'absorbance mesure 420nm est en fait la somme de l'absorbance de l'ONP et de
l'absorbance des dbris cellulaires qu'il peut subsister dans les cuves. Pour liminer cette dernire
absorbance il convient de retrancher la mesure lue 420nm la mesure de l'absorbance 550nm
(due aux dbris cellulaires seuls) multiplie par le facteur 1,75 quand il s'agit de cultures d' E.
coli.
L'activit en units Miller est donc donne par la formule
103 x (DO420 - (1,75 x DO550)) / t x V x DO600
avec
t : temps de raction en mn
v : volume de culture utilis pour faire la raction en ml
Calcul des activits spcifiques
Il est possible de convertir les units Miller ainsi obtenues en activit spcifique de la galactosidase exprime en unit -galactosidase par mg de protine.
L'unit -galactosidase est souvent dfinie comme la quantit d'enzyme qui produit une
nmole d'ONP par minute 28C et pH 7.
Dans les conditions utilises ci-dessus, une nmole d'ONP/ml a une absorbance 420nm
de 0,0045. De plus, bien que les dosages de protines dans les extraits cellulaires soient prcis et
relativement rapides, il est possible d'estimer la quantit de protines partir de la DO 600nm
en supposant que 109 cellules contiennent 150g de protines et que 2 units DO600
correspondent 109 cellules par ml.
Conseils pour ltablissement dune COURBE ETALON
I) Dilutions
- Pour l'tablissement des courbes talon, une solution-mre (SM) dont la concentration
correspond au maximum de la courbe talon est utilise. A partir de cette SM, il faut
confectionner des dilutions de 1/10e en 1/10e de faon obtenir 10 points exprimentaux (1/10e,
2/10e,...., 8/10e, 9/10e, SM) rgulirement espacs sur votre courbe. Attention, il ne sagit pas de
dilutions en cascade.
- Prparez des volumes suffisants des dilutions pour viter les erreurs dues au pipetage de faibles
e
volumes. Par exemple, pour une dilution 8/10 :
8 ml de SM + 2 ml d'eau distille, ou
4 ml de SM + 1 ml d'ED.
II) Pipetage
- Il est prfrable d'utiliser des pipettes de prcision (volumes reprs par un code de couleur).
- Toujours pipeter un volume entre deux graduations de la pipette, et non entre une graduation et
l'extrmit de celle-ci (pipette coulement total). Vous gagnerez ainsi en prcision.
- Pour le maximum de prcision, utiliser une pipette dont le volume maximum est le plus proche
possible de votre volume pipeter.

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III) Echantillon
- Toujours bien agiter vos dilutions (au vortex de prfrence) avant de prlever le volume
d'chantillon (1 ml en gnral) ncessaire au dosage. Ne confondez pas dilution et chantillon.
e
Le volume de la dilution importe peu (exemple: 10 ml ou 5 ml pour les deux dilutions au 8/10
dcrites prcdemment). Le volume de l'chantillon est dfini par les conditions exprimentales
du dosage. Appliquer sur les diffrents chantillons ainsi confectionns les diffrentes tapes du
dosage.
IV) Tmoin
- Il est absolument obligatoire de faire un tmoin pour chaque srie de mesure. Ce tmoin
contiendra tous les ractifs (seul l'chantillon sera remplac par un volume gal d'eau distille), et
sera incub de la mme faon que les autres tubes: temps de raction, temprature, lumire ou
obscurit. A ce propos il est primordial de respecter scrupuleusement les conditions de raction si
vous voulez obtenir des rsultats prcis et reproductibles.
V) Mesures
-Vrifier que les parois des cuves de mesure ne soient pas recouvertes de bue
- Faire toutes vos mesures avec la mme cuve (neuve). Commencer par rgler le zro du
spectrophotomtre sur le tmoin, puis vider la cuve, l'goutter sur un kleenex et la remplir avec la
plus grande dilution (1/10e), faire la mesure puis vider la cuve et passer la dilution suivante;
ainsi de suite jusqu' la solution mre. Vous vous affranchirez ainsi des petites erreurs de mesure
dues aux imperfections des cuves de plastique.
- Enfin, avant de faire vos mesures, vrifiez toujours que le spectrophotomtre que vous allez
utiliser est rgl sur la bonne longueur d'onde.

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