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laboratorial de doenas
sexualmente transmissveis,
incluindo o vrus da
imunodeficincia humana
Publicado pela Organizao Mundial da Sade em 2013 sob o ttulo Laboratory diagnosis of sexually transmitted
infections, including human immunodeficiency virus
Organizao Mundial da Sade 2013
A Organizao Mundial da Sade concedeu os direitos de traduo e publicao da presente edio em portugus
Coordenao de Laboratrio do Departamento de DST, AIDS e Hepatites Virais, que a nica responsvel pela
qualidade e fidelidade da traduo em portugus. Em caso de qualquer inconsistncia entre as edies em ingls e
portugus, a edio original em ingls dever ser considerada a edio juridicamente vinculativa e autntica.
Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana /
Coordenao de Laboratrio do Departamento de DST, AIDS e Hepatites Virais 2014.
1.Doenas sexualmente transmissveis diagnstico. 2.Infeces por HIV - diagnstico. 3.Tcnicas e procedimentos de
diagnstico. 4.Laboratrios.
2013
2015
Editor-chefe
Magnus Unemo
Fbio Mesquita
Editores
Ronald Ballard
Miriam Franchini
Catherine Ison
Traduo:
Reviso tcnica:
David Lewis
Jos Boullosa
Francis Ndowa
Genebra, Sua
Mariana Villares
Rosanna Peeling
Regina Comparini
Sumrio
Siglas e abreviaturas
vii
Prefcio xi
Agradecimentos xiii
1
11
Micoplasmas genitais
Jrgen Skov Jensen e Magnus Unemo
17
4 Gonorreia
Magnus Unemo e Catherine Ison
23
61
6 Tricomonase
Yaw Adu-Sarkodie, Magnus Unemo, e Barbara Van Der Pol
83
Vaginose bacteriana
Yaw Adu-Sarkodie e Catherine Ison
95
8 Candidase
Yaw Adu-Sarkodie e Catherine Ison
101
105
10 Sfilis
Ronald Ballard e Edward W. Hook III
121
147
12 Cancro mole
David Lewis
149
157
161
175
Sumrio
Anexos
vi
189
197
205
223
245
Diagnstico laboratorial do diagnstico de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Siglas e abreviaturas
ACT
AEQ
AIDS
DNA
Sndrome da imunodeficincia
adquirida; do ingls acquired
immunodeficiency syndrome
DP
Desvio padro
dsDNA
AIQ
DST
ARV
Antirretroviral
EA
ster de acridnio
AVAI
ECD
EDL
BD
EIA
bDNA
EID
ELISA
EM
Espectrometria de massa
EQI
Ensaio de quimioluminescncia
EUCAST
C2CA
CCUG
CDC
CH/CH2
CIM
FCE
Fluido cerebroespinal
CIQ
FDA
CLSI
CO2
Dixido de carbono
FITC
CQ
Controle de qualidade
CSPS
FO
Fluido oral
FRET
Transferncia de energia de
ressonncia por fluorescncia; do ingls
fluorescence resonance energy transfer
FTA-Abs
Acelerao da gravidade
GASP
Programa de Vigilncia da
Susceptibilidade Antimicrobiana;
do ingls Gonococcal Antimicrobial
Susceptibility Surveillance Programme
GC
Ct
Ciclo limiar
CV
Carga viral
CV
Coeficiente de variao
CVA
CVV
Candidase vulvovaginal
DBS
DIP
DMC
DNA metiltransferase
citosina-especfica
Siglas
vii
gG
Glicoprotena G
GKNP
Soluo glicose-potssio-sdio-fosfato
GQ
HBV
LR
Garantia de qualidade
LSIL
MALDI-TOF
MH
Mueller-Hinton
MIF
Microimunofluorescncia
MOMP
MTM
HCV
HIV
HIVDR
HPA
HPV
NAAT
HR
NAH
HSH
HSIL
NASBA
NCTC
NIBSC
HSV
ICT
IF
Imunofluorescncia
IFA
IgA/IgG/IgM Imunoglobulinas A, G, M
viii
IGD
NIC
IMDM-VGA
nvCT
NYC
OMS
IP
Imunoperoxidase
Pap
Papanicolau
ISO
Organizao Internacional de
Padronizao; do ingls International
Organization for Standardization
PBS
KOH
Hidrxido de potssio
PCR
LGV
Linfogranuloma venreo
LIA
PET
LJ
Grfico de Levey-Jennings
PID
LPMN
Leuccitos polimorfonucleares
LPS
Lipopolissacardeo
PIP
Prolilaminopeptidase; do ingls
prolyliminopeptidase
POC
Teste point-of-care
POP
PR
PRR
RCA
RCUT
RHR
TPHA
TPPA
TRUST
TSB
UE
Unio Europeia
UFC
RNA
UG
RPR
UK NEQAS
RT
SARA
UNAIDS
UNG
Uretrite no gonoccica
UNGNC
UNG no clamidial
SDC
VB
Vaginose bacteriana
SGQ
VDRL
SNP
SPG
Sacarose-fosfato-glutamato
VPN
spp.
Espcies
VPP
TARV
Terapia antirretroviral
WB
Western blot
TC
WR
TDR/OMS
TMA
TOC
SDA
Siglas
ix
Prefcio
As doenas sexualmente transmissveis (DST), incluindo aquelas causadas pelos vrus da imunodeficincia humana
tipos 1 e 2, permanecem como uma rea de importante foco para a sade pblica. Isso se deve alta morbidade
associada s DST, tais como as sequelas de infeces no trato reprodutivo, cncer cervical, sfilis congnita,
gravidez ectpica e infertilidade, assim como a morbidade de doenas relacionadas ao HIV e morte pela sndrome da
imunodeficincia adquirida (AIDS). As estratgias de sade pblica para o controle das DST incluem a promoo de um
comportamento sexual mais seguro e oferta de preservativos (preveno primria), assim como o gerenciamento eficaz
e precoce de pacientes com DST, usando tanto abordagens de gesto sindrmica quanto etiolgicas.
Na abordagem de gesto sindrmica, o gerenciamento fsica e economicamente acessvel e eficiente de indivduos
portadores de DST baseia-se na utilizao de fluxogramas (algoritmos) para cada DST. Os fluxogramas permitem o
diagnstico de DST comuns, a oferta de tratamentos atuais e apropriados para cada pas, o aconselhamento na gesto
de parceiros sexuais e a nfase na importncia dos testes para HIV no mesmo dia da visita ao profissional de sade.
Os fluxogramas devem ser baseados na etiologia local e os dados de susceptibilidade antimicrobiana obtidos por
meio de pesquisas laboratoriais peridicas. Em geral, os testes de laboratrio no so realizados para a maioria dos
pacientes com DST que recebem gesto sindrmica. No entanto, pode ser apropriado coletar espcimes para exames
laboratoriais dos pacientes que no responderam s terapias de primeira gerao, para definir o diagnstico e/ou
determinar se a falha do tratamento se deve a resistncia antimicrobiana. Nos pases que podem custear a abordagem
do diagnstico etiolgico, os exames laboratoriais desenvolvem um papel muito maior em termos de diagnstico
de patgenos de DST especficos e determinao de susceptibilidade antimicrobiana. Os laboratrios tambm
desempenham um papel-chave na vigilncia das DST e nos programas de pesquisa tanto em naes com menos
recursos quanto naquelas mais ricas.
A Organizao Mundial da Sade publicou uma verso anterior deste manual, intitulada Diagnstico laboratorial de
doenas sexualmente transmissveis, em 1999, com o objetivo de oferecer um guia completo de procedimentos-padro
para isolar, detectar e diagnosticar as DST por microbiologistas e tecnlogos mdicos. O guia foi concebido como um
manual de bancada, sintonizado com as necessidades e capacidades dos laboratrios nos diferentes nveis do sistema
de sade. O manual, subsequentemente, mostrou-se muito popular tanto em laboratrios nacionais como particulares.
Desde a publicao do manual de 1999, houve uma srie de avanos fundamentais nos procedimentos de diagnstico,
em especial no que se refere amplificao de cido nucleico e testes rpidos, assim como as metodologias e
recomendaes dos testes de susceptibilidade antimicrobiana. Um conjunto de especialistas internacionais atualizaram
extensivamente os captulos do manual de 1999. Alm disso, a verso revisada inclui novos captulos abordando
uma srie de tpicos, a exemplo das tcnicas de diagnstico de Mycoplasma genitalium, os testes rpidos para
DST e gesto da qualidade de laboratrios. Embora este manual atualizado aborde os mais importantes patgenos
causadores de DST, ele no deve ser visto como completo, cabendo ao leitor consultar outras fontes de referncia
para maiores informaes, por exemplo, no que diz respeito s polticas nacionais dirigidas s DST, guias para teste de
susceptibilidade microbiana, questes mdico-legais e testes de DST em menores.
Este novo manual, Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da
imunodeficincia humana, fornece o conhecimento bsico sobre os princpios dos testes laboratoriais no contexto das
abordagens de triagem e diagnstico, assim como o teste de susceptibilidade antimicrobiana, como componentes do
controle das DST. Assim como na publicao de 1999, este manual trata de cada doena em um captulo separado,
fornecendo informao detalhada quanto coleta, transporte e testagem laboratorial de espcimes. Dois anexos teis,
abordando equipamentos, testes, meios, reagentes e corantes, encontram-se no final do manual.
Prefcio
xi
Prev-se que o manual atualizado ser informativo para administradores, gerentes de programas, equipes de mdicos
e enfermeiros, assim como para o pblico-alvo primrio, que continua sendo formado pelos microbiologistas e
tecnlogos mdicos. O manual deve constituir uma ferramenta til para auxiliar na escolha dos testes diagnsticos
mais apropriados no cenrio individual, idealmente por meio de comits nacionais e/ou locais de especialistas
em aconselhamento. O manual tambm uma fonte valiosa de informaes para estudantes e estagirios, tanto
dentro quanto fora do ambiente de laboratrio. Finalmente, prev-se que a ampliao de produtos e metodologias
de diagnstico continuar nos prximos anos e, dessa forma, ser importante para todos os leitores manterem-se
atualizados quanto aos progressos mais recentes no campo.
xii
Agradecimentos
O Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana, foi
revisado utilizando a estrutura testada e comprovada do manual de 1999, criada por Eddy Van Dyck, do Instituto de
Medicina Tropical, Anturpia, Blgica; Andr Z. Meheus, da Universidade de Anturpia, Blgica; e Peter Piot, DiretorExecutivo do Programa Conjunto das Naes Unidas sobre HIV/AIDS (UNAIDS). O Departamento de Sade Reprodutiva e
Pesquisa (RHR), da Organizao Mundial da Sade (OMS) em Genebra, Sua, reconhece e expressa sua gratido para
com a viso desses autores e agradece-lhes a permisso para atualizar o manual, a fim de garantir que este mantenha
sua relevncia global, incorporando a ele novas tecnologias e mtodos de diagnstico.
Especialistas experientes e qualificados em diferentes reas da medicina diagnstica atualizaram o documento
para garantir que a diversidade de mtodos disponveis para o diagnstico das doenas sexualmente transmissveis
(DST) estivesse nele representada, tornando-o o mais atual possvel nessa rea da medicina, que est em constante
mutao. A OMS/RHR gostaria de agradecer a diversos especialistas e suas instituies pela dedicao e entusiasmo,
que garantiram a alta qualidade e a perspectiva global deste documento no que diz respeito ao diagnstico das DST.
Agradecimentos sinceros so dirigidos a Yaw Adu-Sarkodie, Manju Bala, Ronald Ballard, Alan Herring, Edward W. Hook
III, Catherine Ison, David Mabey, Rosanna Peeling e Magnus Unemo, que revisaram o manual de 1999 e determinaram
as sees que necessitavam de mudanas e atualizaes, alm de identificar os novos captulos a ser adicionados. O
grupo tambm props uma lista de possveis autores para a reviso dos captulos existentes e a elaborao dos novos
captulos, e indicaram alguns dos possveis revisores desses contedos.
A OMS/RHR gostaria de agradecer aos seguintes autores, que revisaram a primeira verso dos captulos e continuaram
o trabalho para sua finalizao: Manju Bala, Ronald Ballard, Laurent Blec, Fatim Cham, Jo-Anne Dillon, Suzanne
Garland, Edward W. Hook III, Catherine Ison, David Lewis, Bharat Parekh, Rosanna Peeling, Ye Tun, Magnus Unemo e
Barbara Van Der Pol. Os seguintes funcionrios do Departamento da OMS forneceram informaes e orientaes para
a finalizao do manual: Nathalie Broutet, Lori Newman e Igor Toskin. Francis Ndowa liderou o processo de reviso do
manual.
A OMS/RHR tambm reconhece e agradece aos autores remanescentes: Cheng Y. Chen, Dennis Ellenberger, Jrgen
Skov Jensen, John Nkengasong, Stefania Starnino, Larry Westerman e Chunfu Yang pelo grande esforo e tempo
empregados para garantir que a qualidade dos captulos fosse a mais alta possvel.
A OMS/RHR grata s seguintes pessoas por concordarem em revisar os captulos relacionados aos seus respectivos
campos de especializao: Rajesh Bhatia, Xiang-Sheng Chen, Charlotte Gaydos, Monica Lahra, Jrme Le Goff, Jeanne
Marrazzo, Allan Ronald e Patricia Totten.
A OMS/RHR tambm reconhece a dedicao de Fatim Cham, que conferiu os comentrios dos revisores, compilou os
captulos e garantiu a harmonizao entre os diferentes captulos e anexos.
A OMS/RHR agradece a assistncia fornecida pelos Centros de Controle e Preveno de Doenas (CDC), em Atlanta,
Gergia, pela edio das cpias da verso final do manual e o auxlio da equipe da Green Ink, Reino Unido, pelo design,
layout e reviso.
Agradecimentos
xiii
Captulo 1
Escolha de testes para doenas sexualmente transmissveis
1.1 Introduo
Mais de 30 bactrias, vrus e patgenos parasitas
so transmitidos sexualmente e constituem um grupo
de infeces denominadas doenas sexualmente
transmissveis (DST). Embora alguns patgenos possam
ser adquiridos por meio de outras rotas de transmisso
que no a sexual, epidemiologicamente o contato sexual
mais importante para a sua transmisso de uma
pessoa para a outra (Tabela 1.1).
Os testes laboratoriais e os testes rpidos (TR) ou
point-of-care (POC) so instrumentos potencialmente
poderosos para a gesto e controle das DST, por
facilitarem a preveno da transmisso das DST e
suas sequelas. O alto nmero de DST, assim como a
variedade dos possveis testes para cada DST tornam
difcil a escolha do teste de diagnstico apropriado. No
momento, uma ampla variedade de testes disponveis
para as DST apresentam atributos e possveis limitaes
que podem influenciar sua aplicao, a fim de aumentar
o controle das DST. Alm disso, em uma era de recursos
limitados, a deciso sobre em quais e em quantas DST
se deve investir para a realizao de testes, quem deve
ser testado e quais dos mltiplos testes disponveis
devem ser utilizados para um determinado propsito
pode ser difcil. A seleo do teste deve refletir um
processo de priorizao que considera a prevalncia
da infeco, o impacto e complicao das infeces
nos indivduos e populaes, as caractersticas de
desempenho do teste, os custos do teste e a razo pelo
qual o teste est sendo realizado.
Os testes para DST podem ser utilizados para uma
variedade de diferentes propsitos que, por sua vez,
podem afetar a escolha do teste. Essas diferentes
razes para testagem incluem fins de vigilncia,
validao de algoritmos de gesto sindrmica, garantia
de qualidade (GQ), diagnstico de pessoas com sinais
ou sintomas de possveis DST, triagem de pessoas
de risco assintomticas, e testes de susceptibilidade
Tabela 1.1: Principais patgenos transmitidos sexualmente e doenas por eles causadas
Patgeno
Infeces bacterianas
Neisseria gonorrhoeae
GONORREIA
Homens: corrimento uretral (uretrite), epididimite, orquite, infertilidade
Mulheres: cervicite, endometrite, salpingite, doena inflamatria plvica,
infertilidade, ruptura prematura de membranas, perihepatite; comumente
assintomtica
Chlamydia trachomatis
INFECO CLAMIDIAL
Homens: corrimento uretral (uretrite), epididimite, orquite, infertilidade
Mulheres: cervicite, endometrite, salpingite, doena inflamatria plvica,
infertilidade, ruptura prematura de membranas, perihepatite; comumente
assintomtica
Ambos os sexos: proctite, faringite, sndrome de Reiter
Recm-nascidos: conjuntivite, pneumonia
Chlamydia trachomatis
(sorotipos L1L3)
Treponema pallidum
Haemophilus ducreyi
Klebsiella (Calymmatobacterium)
granulomatis
Mycoplasma genitalium
LINFOGRANULOMA VENREO
Ambos os sexos: lcera, inchao inguinal (bubo), proctite
SFILIS
Ambos os sexos: lcera primria (cancro) com adenopatia local, erupes na
pele, condiloma lata; danos sseos, cardiovasculares e neurolgicos
Mulheres: perda da gravidez (aborto, natimorto), parto prematuro
Recm-nascidos: natimorto, sfilis congnita
CANCRO MOLE
Ambos os sexos: lceras genitais doloridas; podem ser acompanhadas por
bubo
DONOVANOSE (GRANULOMA INGUINAL)
Ambos os sexos: inchaos nodulares e leses ulcerativas das reas inguinal
e anogenital
Homens: corrimento uretral (uretrite no gonoccica)
Mulheres: cervicite, endometrite, provvel doena inflamatria plvica
Homens: corrimento uretral (uretrite no gonoccica)
Mulheres: cervicite, endometrite, provvel doena inflamatria plvica
Tabela 1.1: Principais patgenos transmitidos sexualmente e doenas por eles causadas (continuao)
Patgeno
Infeces virais
Vrus da imunodeficincia humana
(HIV)
Papilomavrus humano
Vrus da hepatite B
Citomegalovrus
Vrus do molusco
VERRUGAS GENITAIS
Homens: verrugas penianas e anais; carcinoma no pnis
Mulheres: verrugas vulval, anal e cervical; carcinoma cervical, carcinoma
vulval, carcinoma anal
Recm-nascidos: papiloma de laringe
HEPATITE VIRAL
Ambos os sexos: hepatite aguda, cirrose heptica, cncer de fgado
INFECO POR CITOMEGALOVRUS
Ambos os sexos: febre subclnica ou no especfica, inchao difuso no
linfonodo, doenas hepticas, etc.
MOLUSCO CONTAGIOSO
Ambos os sexos: ndulos firmes e umbilicados na pele, genitais ou
generalizados
SARCOMA DE KAPOSI
Herpesvrus associado ao sarcoma de
Ambos os sexos: tipo de cncer agressivo em pessoas imunossuprimidas
Kaposi (herpesvrus humano tipo 8)
Infeces por protozorios
Trichomonas vaginalis
TRICOMONASE
Homens: Corrimento uretral (uretrite no gonoccica); frequentemente
assintomtico
Mulheres: vaginose com corrimento vaginal abundante e espumoso,
nascimento prematuro, bebs de baixo peso ao nascer
Recm-nascidos: baixo peso ao nascer
Tabela 1.1: Principais patgenos transmitidos sexualmente e doenas por eles causadas (continuao)
Patgeno
Candida albicans
CANDIDASE
Homens: infeco superficial na glande do pnis
Mulheres: vulvo-vaginite com secreo vaginal espessa e aspecto de
coalhada, prurido ou queimao vulvar
Infeces parasitrias
Phthirus pubis
Sarcoptes scabiei
Determinao de susceptibilidade
antimicrobiana. Para algumas DST (vale
ressaltar como exemplo a N. gonorrhoeae),
o desenvolvimento continuado de resistncia
tem levado, periodicamente, a mudanas na
terapia recomendada. A vigilncia sistemtica
da susceptibilidade antimicrobiana e/ou o teste
de isolados especficos para a susceptibilidade a
agentes antimicrobianos utilizados em terapias
fornecem informaes que podem ser usadas para
ajustar as recomendaes de tratamento de forma
antecipada, preferencialmente antes que a falha
teraputica se torne um problema. A determinao
da susceptibilidade antimicrobiana melhor realizada
em isolados clnicos vivos de culturas de organismos
e tipicamente melhor utilizada para guiar terapias
recomendadas populao do que para a gesto
individual de pacientes. Na maioria das vezes, a
vigilncia da resistncia antimicrobiana melhor
conduzida por laboratrios de referncia, utilizando
espcimes coletados a partir de um espectro de
localidades geograficamente representativo e de
populaes de interesse.
Tabela 1.2: Efeito da sensibilidade, especificidade e prevalncia no valor preditivo positivo, usando somente o
teste primrio ou, adicionalmente, o teste suplementar
Prevalncia na populao = 1%
A
Sensibilidade/especificidade do
teste primrio
99%/99%
99%/99,9%
99%/99%
99,5%/99,5%
99,5%/99,5%
Sensibilidade/especificidade do
teste suplementar/confirmatrio
ND
ND
99%/99%
ND
99,5%/99,5%
1000
1000
11
1000
15
Nmero total
980
989
985
Negativos verdadeiros
980
989
985
Total
20
11
10
15
10
Positivos verdadeiros
10
10
10
10
10
Falso-positivos
10
50%
91%
100%
67%
100%
Nmero testado
Negativos
Falso-negativos
Positivos
ND: no determinado.
1.5 Sintetizando
No existe um nico teste ideal para a deteco de
agentes causadores de DST. Para uma tomada de
deciso programtica, as vrias DST e as populaes
impactadas devem ser consideradas como uma matriz
para definir no somente qual teste laboratorial o mais
apropriado para a comunidade em questo, mas tambm
qual a proporo do total de recursos disponveis
(oramento, pessoal, etc.) deve ser alocada para cada
DST a ser testada (Tabela 1.3).
1.6 Referncias
1. Geisler WM et al. The natural history of
untreated Chlamydia trachomatis infection in
the interval between screening and returning for
treatment. Sexually Transmitted Diseases, 2008,
35(2):119123.
2. Gift TL et al. The rapid test paradox: when fewer
cases detected lead to more cases treated:
a decision analysis of tests for Chlamydia
trachomatis. Sexually Transmitted Diseases, 1999,
26(4):232240.
3. Kuypers J, Gaydos CA, Peeling RW. Principles of
laboratory diagnosis of STIs. In: Holmes KK et al.,
eds. Sexually transmitted diseases, 4th ed. Nova
York, McGraw-Hill Medical, 2008:937958.
4. Adler MW et al. Sexual health and care: sexually
transmitted infections: guidelines for prevention and
treatment. [Occasional paper]. Londres, ODA, 1996
5.
10
Captulo 2
Gesto de qualidade no laboratrio
2.1 Introduo
A finalidade de um sistema de qualidade garantir que
todos os laudos emitidos por laboratrios e utilizados
para a gesto de pacientes sejam de alta qualidade. Para
manter um servio de alta qualidade, os laboratrios
devem investir em um programa de melhoria de
qualidade e se credenciarem junto a um organismo
nacional ou internacional idneo, como a Organizao
Internacional de Padronizao (ISO, do ingls
International Organization for Standardization; www.iso.
org). A certificao envolve uma auditoria externa sobre
a capacidade do laboratrio de fornecer um servio de
alta qualidade, por meio da definio de uma prtica
padro, a qual confirmada por uma reviso realizada
por especialistas. Entretanto, isso no inclui a avaliao
do grau de adequao do teste para o diagnstico de
Auditoria externa dos procedimentos do laboratrio, que contribui para a qualidade do laudo.
Sistema de gesto Estrutura para uma abordagem sistemtica para a gesto da qualidade dos procedimentos
de qualidade (SGQ) laboratoriais.
Garantia de
qualidade (GQ)
Processo sistemtico para garantir o cumprimento dos requisitos de qualidade para um produto
ou servio.
Documento contendo a descrio detalhada dos procedimentos individuais para cada protocolo
Procedimento
ou teste usado no laboratrio. A finalidade de um POP garantir que as operaes sejam
operacional padro
realizadas corretamente e sempre da mesma forma. Um POP deve estar sempre disponvel no
(POP)
laboratrio.
Avaliao interna
da qualidade (AIQ)
Avaliao externa Processo que permite a introduo de amostras de contedo conhecido, porm no divulgado no
da qualidade (AEQ) procedimento de testes de rotina de um laboratrio, a partir de uma fonte independente.
Controle interno da
Procedimento usado para detectar problemas e falhas em um ou mais reagentes de um teste.
qualidade (CIQ)
Avaliao dos
testes
Processo sistemtico e extenso que compara diferentes sistemas projetados para executar
funes iguais ou similares.
Validao dos
testes
Procedimento usado para examinar todo o processo que est sendo utilizado, a fim de verificar
se os resultados esto corretos.
CSPS
11
Organizao e gesto
Uma estrutura organizacional necessria para
o laboratrio, na qual estejam claros os papis
e responsabilidades de cada indivduo. Trata-se
normalmente de uma estrutura hierrquica, dirigida por
um diretor ou pelo chefe do departamento, com chefes
de sees ou unidades, um gerente de laboratrio e uma
gama de cientistas da sade, de diferentes reas. Um
indivduo deve assumir a liderana pela qualidade, o que
pode constituir tanto uma funo especfica como uma
parte integral de um trabalho mais amplo. O manual de
qualidade deve incluir um organograma das funes dos
diferentes indivduos e de suas linhas de gerncia e a
descrio de suas responsabilidades. Cada funcionrio
deve ter a descrio detalhada de seu trabalho, a qual
deve ser revisada anualmente.
12
13
Avaliao da qualidade
Avaliao interna
da qualidade
Avaliao externa
da qualidade
Controle de qualidade
Avaliao e
validao de
testes
Controle interno
da qualidade
Avaliao e
monitoramento
de equipamentos
Figura 2.1
Diferentes elementos que contribuem para a garantia de qualidade (GQ)
14
Avaliao da qualidade
Avaliao interna da qualidade (AIQ)
A AIQ realizada pelo reenvio e testagem de amostras
clnicas annimas selecionadas randomicamente no
mesmo laboratrio, a fim de garantir a reprodutibilidade
dos resultados. Todos os espcimes da AIQ devem
ser submetidos a anlises de rotina, sem receber
qualquer tratamento especial. Para que o esquema
fornea informaes relevantes e teis, a AIQ deve ser
realizada regularmente em todos os tipos de amostras.
As amostras so selecionadas por um funcionrio
treinado, o qual no pode ser a mesma pessoa que
realizar os testes. As amostras devem ser selecionadas
randomicamente para evitar vis, sendo reintroduzidas
no sistema do laboratrio da mesma maneira que as
amostras normais.
O nmero de espcimes testados e a frequncia
dos testes dependem do nmero total de espcimes
15
2.4 Referncias
1. Dobbs T et al. A comprehensive evaluation of the
proficiency testing program for the HIV-1 BED
incidence assay. Journal of Clinical Microbiology,
2011, 49(10):34703473.
2. Alemnji GA et al. Strengthening national laboratory
health systems in the Caribbean Region. Global
Public Health, 2012, 7(6):648660.
3. Nkengasong JN et al. Laboratory systems and
services are critical in global health: time to end
the neglect? American Journal of Clinical Pathology,
2010, 134(3):368373.
16
Captulo 3
Micoplasmas genitais
3.1 Introduo
Micoplasma o nome comum para os membros da
classe Mollicutes. Os micoplasmas so bactrias
muito pequenas de vida livre, com tamanhos variando
normalmente de 0,3 a 0,5 m. Elas no apresentam
uma parede celular rgida, como outras bactrias, o que
torna essas ltimas resistentes penicilina e outros
antibiticos. O M. genitalium, o M. hominis e as duas
espcies de Ureaplasma, U. urealyticum (anteriormente
conhecido como U. urealyticum, biotipo 2) and U. parvum
(anteriormente conhecido como U. urealyticum, biotipo 1)
so encontrados comumente no trato urogenital humano.
importante esclarecer que antes de o U. urealyticum
e o U. parvum serem reconhecidos como espcies
diferentes, ambos eram designados como U. urealyticum,
tornando difcil a interpretao dos resultados de estudos
prvios. A Tabela 3.1 apresenta as doenas associadas a
esses microrganismos.
O M. genitalium encontrado em 1-3% de homens e
mulheres sexualmente ativos, segundo estudos de base
populacional. Os ureaplasmas podem ser encontrados
no colo do tero ou na vagina de 40-80% de mulheres
assintomticas, sexualmente ativas, e o M. hominis
Vaginose
Uretrite Cervicite bacteriana
M. genitalium
++++
+++
+++
+/
M. hominis
++++
+/
+/
ND
Ureaplasmas
(no-diferenciados)
+/
+++
ND
+/
ND
U. urealyticum
ND
ND
ND
ND
ND
ND
U. parvum
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND: no determinado; PID: doena inflamatria plvica (do ingls pelvic inflammatory disease)
a
++++ associao forte, +++ associao na maioria dos estudos, + associao apenas em alguns estudos, +/ resultados conflitantes.
Microplasmas genitais
17
19
20
A resistncia a macroldeos em M.
genitalium muito comum em pacientes que
apresentam falha teraputica azitromicina,
e a moxifloxacina a segunda gerao de
tratamento mais frequentemente utilizada.
A resistncia a macroldeos em M. genitalium,
mediada por mutaes especficas no gene do
RNAr 23S, pode ser detectada por amplificao
por PCR e sequenciamento desse gene a partir
do espcime clnico.
Mutaes em M. genitalium em regies
determinantes de resistncia a quinolonas
foram encontradas em pacientes que falharam
o tratamento com esse grupo de antibiticos,
mas suas correlaes clnicas no foram
estabelecidas.
3.6 Referncias
1. Taylor-Robinson D, Jensen JS. Mycoplasma
genitalium: from chrysalis to multicolored
butterfly. Clinical Microbiology Reviews, 2011,
24(3):498514.
2. Andersen B et al. Mycoplasma genitalium:
prevalence and behavioural risk factors in the
general population. Sexually Transmitted Infections,
2007, 83(3):237241.
3. Manhart LE et al. Mycoplasma genitalium among
young adults in the United States: an emerging
sexually transmitted infection. American Journal of
Public Health, 2007, 97(6):11181125.
4. McCormack WM et al. Sexual activity and vaginal
colonization with genital mycoplasmas. Journal
of the American Medical Association, 1972,
221(12):13751377.
5. Totten PA, Taylor-Robinson D, Jensen JS. Genital
mycoplasmas. In: Holmes KK et al., eds. Sexually
transmitted diseases, 4th ed. New York, McGrawHill Medical, 2008:709736.
6. Falk L, Fredlund H, Jensen JS. Symptomatic
urethritis is more prevalent in men infected with
Mycoplasma genitalium than with Chlamydia
Microplasmas genitais
21
22
Captulo 4
Gonorreia
4.1 Introduo
A gonorreia, causada pela Neisseria gonorrhoeae
(gonococo), uma doena antiga, transmitida quase
exclusivamente por contato sexual. Em 2008, de acordo
com estimativas da Organizao Mundial da Sade
(OMS), havia, globalmente, 106 milhes de novos
casos entre adultos. Isso coloca a gonorreia como a
mais prevalente doena sexualmente transmissvel
(DST) bacteriana, junto com a infeco por Chlamydia
trachomatis (tambm com 106 milhes de novos
casos) (1). Por conseguinte, a gonorreia, incluindo
suas complicaes severas, causa morbidade e custos
econmicos substanciais, e mantm-se, mundialmente,
como um importante problema de sade pblica.
de grande preocupao o fato de essa bactria ter
desenvolvido resistncia a praticamente todos os
antibiticos introduzidos para o seu tratamento, e
teme-se que a gonorreia possa se tornar no tratvel em
certas circunstncias (2,3).
O gnero Neisseria contm duas principais espcies
patognicas a humanos, N. gonorrhoeae e N.
meningitidis, e, aproximadamente, 30 espcies no
patognicas, tais como N. lactamica, N. sicca, N.
cinerea, N. flavescens, N. subflava e N. mucosa. Esses
organismos habitam predominantemente o trato
respiratrio superior como comensais, mas podem
ser esporadicamente encontrados no trato urogenital
inferior. Os gonococos so Gram-negativos, aerbicos,
capnoflicos (preferem concentraes aumentadas
[3-7%] de dixido de carbono [CO2]), no flagelados,
no esporulados e constituem cocos produtores de
oxidase e catalase, tipicamente dispostos em pares
(diplococos) com os lados cncavos adjacentes; isto ,
em microscopia, eles aparecem com a morfologia tpica
de um rim ou gro de caf. A N. gonorrhoeae exigente
e requer meios de cultura complexos e nutricionalmente
enriquecidos para seu crescimento in vitro.
Gonorreia
23
Gonorreia complicadab
Uretra
Complicaes
masculinas
Colo do tero
Edema peniano
Abscesso nas glndulas de Tyson
Abscesso nas glndulas de Cowper
Vesiculite seminal
Epididimite
Infertilidade (raro)
Complicaes
femininas
Endometrite
Salpingite
Abscesso das glndulas de
Bartholin
Linfagite
Abscesso tubo-ovariano
Gravidez ectpica
Infertilidade
Infeco
gonoccica
disseminada
(IGD)
Bacteremia
Febre
Dermatite (leses na pele: macular,
eritematosa, pustular, necrtica,
hemorrgica)
Tenossinovite
Articulaes; artrite sptica
Endocardite
Meningite
Reto
Faringe
Faringite leve
Ligeira irritao na garganta
Eritema
Conjuntiva
24
Como mencionado acima, a infeco gonoccica pode ser assintomtica, principalmente em mulheres, na faringe e reto.
Estudos epidemiolgicos e biolgicos forneceram evidncias fortes de que a gonorreia facilita significativamente a transmisso do HIV.
Tabela 4.2: Testes de diagnstico comuns (junho de 2012) para a deteco de N. gonorrhoeae
Microscopiaa
Cultura
NAAT
Sima
Sim
Sim
No
Simb
No
No
No
No
Simc
Sim
Sima
Sim
Sim
Sim
Nod
No
Sim
Nod
Sim
Sim
Nod
Sensibilidadee
Baixa-altaa
Moderada-alta
Muito alta
Especificidadee
Moderada-muito alta
Custos
Baixo
Moderado
Alto-muito alto
Instrumentao
Microscpio
Microbiologia de rotina
Grande infraestrutura
Rendimento/
automatizao
Moderado/no
Moderado/no
Alto/possvel
Complexidade tcnica
Baixa
Moderada
Alta
Nvel de infraestrutura
do laboratrio
Perifrico
Perifrico-intermedirio
Intermedirio-central
Mltiplos patgenos de
uma mesma amostra
No
No
Tipos de espcime
Urina
Feminina
Masculina
Haste com secreo
uretral
Desempenho
Outras consideraes
Outros comentrios
Gonorreia
25
No um espcime ideal, sendo aplicado principalmente em meninas impberes ou mulheres que realizaram histerectomia.
A urina no a amostra ideal para a deteco de N. gonorrhoeae em mulheres, devido baixa sensibilidade.
No h NAAT licenciado internacionalmente para o uso em amostras extragenitais, mas existem evidncias crescentes de que os NAAT so mais
sensveis para essas regies que a cultura. Recomenda-se que o NAAT positivo para espcimes do reto e da laringe sejam confirmados com um
teste confirmatrio (NAAT utilizando outra sequncia-alvo) para evitar resultados falso-positivos.
d
e
As estimativas de sensibilidade e especificidade variam amplamente, dependendo das diferentes sensibilidades e especificidades dos ensaios de
uma mesma metodologia, assim como em relao queles usados para comparao (o padro ouro).
Gonorreia
27
Figura 4.1
Microscopia da colorao de azul de metileno do
exsudado uretral masculino, mostrando diplococos
intracelulares em LPMN (1000x).
Fonte: Reproduzido de Morse SA et al., eds. Atlas
of sexually transmitted diseases and AIDS, 4th ed.
Edinburgh, Saunders/Elsevier, 2010.
Figura 4.2
Microscopia da colorao de Gram do exsudado
uretral masculino, mostrando diplococos Gramnegativos intracelulares em LPMN (1000x).
Fonte: Reproduzido de Morse SA et al., eds. Atlas
of sexually transmitted diseases and AIDS, 4th ed.
Edinburgh, Saunders/Elsevier, 2010
28
Local
anatmico
Instrumento
de coleta
Procedimento de
amostragem
Endocrvice
Haste/plsticoa
(ou escova
endocervical
ou conjunto
de coleta
especfico
para ensaio de
NAAT).
Use um espculo
vaginal e limpe o
ectocrvice. Insira
2-3cm de uma
haste e gire-a por
5-10 segundos.
Microscopia
Cultura
NAAT
Realize inoculao
imediata em
meio gonoccico
seletivo e incube
imediatamente. Se a
coleta e inoculao no
puderem ser realizadas
no mesmo lugar,
deve-se utilizar meio de
transporte gonoccico
no nutritivo ou
nutritivo.b
Espcimes em meio de
transporte no nutritivo
devem ser inoculados
no laboratrio o mais
rpido possvel e, no
mximo, em 48 horas
(ver tambm seo
4.5).
Coloque no
instrumento
de coleta do
fabricante.
Transporte e
armazene de
acordo com
as instrues
de fabricante.
Se o meio de
transporte no for
providenciado pelo
fabricante, use
meio de transporte
apropriado para
estabilizar o cido
nuclico, por
exemplo, tubos
GeneLock.
Instrumento
de coleta
Procedimento de
amostragem
Uretra
(coletada aps
1h aps
ltima urina)
Haste/
alumnioc
(ou conjunto
de coleta
especfico
para ensaio de
NAAT).
Colete a secreo
diretamente na
haste. Insira
2-3cm da haste
na uretra e gire-a
gentilmente por
5-10 segundos.
Vagina
Haste/plsticoa
(ou conjunto
de coleta
especfico
para ensaio de
NAAT).
A amostra pode
NA
ser obtida por
mdicos ou pelo
prprio paciente.
Gire a haste contra
a parede vaginal
posterior por 5
segundos.
Microscopia
Cultura
NAAT
Para o transporte e
armazenagem, ver
cultura de amostras
endocervicais.
Para o transporte
e armazenagem,
ver cultura
de amostras
endocervicais para
NAAT.
Para o transporte
e armazenagem,
ver cultura
de amostras
endocervicais para
NAAT.d
NA
Para o transporte
e armazenagem,
ver cultura
de amostras
endocervicais para
NAAT.
NA
Reto
Haste/plsticoa
(ou conjunto
de coleta
especfico
para ensaio de
NAAT).
Insira 2-3 cm da
NA
haste no reto e
gire-a contra todas
as paredes retais
por 10 segundos.
Para o transporte e
armazenagem, ver
cultura de amostras
endocervicais.
Para o transporte
e armazenagem,
ver cultura
de amostras
endocervicais para
NAAT.d
Orofaringe
Haste/plsticoa
(ou conjunto
de coleta
especfico
para ensaio de
NAAT).
Para o transporte e
armazenagem, ver
cultura de amostras
endocervicais.
Para o transporte
e armazenagem,
ver cultura
de amostras
endocervicais para
NAAT.d
Gonorreia
29
Instrumento
de coleta
Procedimento de
amostragem
Conjuntiva
Haste/
alumnioc
(ou conjunto
de coleta
especfico
para ensaio de
NAAT).
A secreo
purulenta deve ser
removida com uma
haste. Retraia a
plpebra inferior.
Mova uma haste ao
longo da superfcie
da conjuntiva
palpebral inferior.
Microscopia
Cultura
NAAT
Para o transporte e
armazenagem, ver
cultura de amostras
endocervicais.
Para o transporte
e armazenagem,
ver cultura
de amostras
endocervicais para
NAAT.d
Deve-se utilizar o meio de transporte para N. gonorrhoeae no nutritivo apropriado, como o Amies ou Stuart (estocar a 4C antes do transporte),
ou o meio de transporte nutritivo (crescimento), como o Jembec, o Transgrow, o Gono-Pak ou o Sistema Intray GC (armazenar a 361C antes do
transporte).
b
Ainda no h NAAT para amostras extragenitais de gonococos aprovado pela Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados Unidos da
Amrica (FDA, do ingls United States of America Food and Drug Administration); no entanto, para espcimes do reto e faringe, NAAT adequados
mostraram-se mais sensveis que a cultura (4-6), os quais podem ser teis caso haja dados de validao.
d
30
Gonorreia
31
Figura 4.3
Jarro de anaerobiose com vela para a incubao de
placas de cultura de N. gonorrhoeae.
32
Figura 4.4
Colnias tpicas de N. gonorrhoeae em meios de
cultura gonoccicos de gar seletivos (esquerda:
MTM) e no seletivos (direita: MTM sem antibiticos
adicionados), mostrando leve inibio de
crescimento pelos antibiticos seletivos.
Fonte: Reproduzido de Morse SA et al., eds. Atlas
of sexually transmitted diseases and AIDS, 4th ed.
Edinburgh, Saunders/Elsevier, 2010.
Figura 4.5
Colnias roxas oxidase-positivas de N. gonorrhoeae em uma placa de cultura (foto esquerda, placa de gar
direita) e papel-filtro ( direita, tambm mostrando uma reao negativa que permanece amarela), aps
reao com soluo aquosa a 1% de tetrametil para-fenilenodiamina dihidrocloreto.
Gonorreia
33
34
Figura 4.6
Produo de cido a partir da utilizao de
carboidrato em meio gar cistena tripticase (ACT).
Os tubos da esquerda para a direita so meios
base de ACT sem carboidrato, meio ACT contendo
1% de glicose e meio ACT contendo 1% de maltose.
O isolado bacteriano inoculado N. gonorrhoeae.
Fonte: Reproduzido de Morse SA et al., eds. Atlas
of sexually transmitted diseases and AIDS, 4th ed.
Edinburgh, Saunders/Elsevier, 2010.
Tabela 4.4: Utilizao de carboidratos (acar) e atividade enzimtica de diferentes espcies de Neisseria e
outras espcies oxidase-positivas como a Moraxella catarrhalis e Kingella denitrificans
Atividade bioqumica
Espcies
Glicose
Maltose Lactose
Saccharose Frutose
(sacarose) (Levulose) ONPGa
N. gonorrhoeae
+ ()
N. meningitidis
+ ()
(+)
N. lactamicad
N. polysaccharead
+/
N. cineread
(+)
N. subflavad,e
+/
+/
N. sicca
N. mucosa
N. flavescens
M. catarrhalis
(+)
K. denitrificans
ONPG, orto-nitrofenil--galactosidase.
GGTb
PIPc
N. lactamica normalmente cresce em meios seletivos para gonococos, mas tambm podem aparecer essas outras Neisseria saprfita no
patognicas.
Incluem os biotipos subflava, flava e perflava, os quais diferem em suas atividades contra sacarose e frutose.
+/-, no consistente para a espcie; + (-), maioria positiva, mas existem linhagens negativas; - (+),maioria negativa mas existem linhagens
positivas.
Gonorreia
35
Figura 4.7
Conjunto de identificao API NH demonstrando o perfil de N. gonorrhoeae.
36
Figura 4.8
Reao de duas cepas de N. gonorrhoeae (A,
poos 1 e 2, e B, poos 5 e 6) com reagentes de
coaglutinao Phadebact WI (poos 1 e 5) e WII/III
(poos 2 e 6).
Fonte: Reproduzido de Morse SA et al., eds. Atlas
of sexually transmitted diseases and AIDS, 4th ed.
Edinburgh, Saunders/Elsevier, 2010.
Gonorreia
37
38
Gonorreia
39
Tabela 4.5: NAAT aprovados pela Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados Unidos da Amrica (FDA)
para a deteco de N. gonorrhoeae (junho de 2012)
Teste
APTIMA
Combo 2
(AC2)
Cobas Amplicor
Cobas 4800
Probetec ET
Probetec GC
Qx
Tempo
real CT/
NG
Fabricante
Gen-Probe
Roche
Roche
Becton,
Dickinson
Becton,
Dickinson
Abbott
Alvo
RNAr 16S
Gene da DNA
metiltransferase
citosinaespecfica
Regio
Repetida
Direta 9 (DR9)
PivNg
(homlogo
da protena
inversora de
pili)
Pili (regio
diferente da
Probetec ET)
Opa genes
Tecnologia
Amplificao
mediada por
transcrio
(TMA,
do ingls
transcriptionmediated
amplification
Reao em
cadeia da
polimerase
(PCR, do ingls
polymerase
chain reaction)
PCR em
tempo real
Amplificao
por
deslocamento
de cadeia
(SDA, do
ingls strand
displacement
amplification)
SDA
PCR em
tempo real
Teste
suplementar
disponvel
Sim
(diferentes
regies do
RNAr 16S)
No
No
No
No
No
40
A
97,8%
99,2%
B
96,4%
97,9%
C
98,0%
99,7%
93%
84%
97%
87%
73%
95%
55%
35%
77%
Gonorreia
41
42
Gonorreia
43
Susceptvel (S)
Susceptibilidade
intermediria (I)
Resistente (R)
Ceftriaxona
0,25
ASDa
ASDa
Cefotaxima
0,5
ASDa
ASDa
Cefixima
0,25
ASDa
ASDa
Cefpodoxima
0,5
ASDa
ASDa
Benzilpenicilina
0,06
0,12-1
Ciprofloxacina
0,06
0,12-0,5
Ofloxacina
0,25
0,5-1
Espectinomicina
32
64
128
Azitromicinab
0,25
0,5
1c
O CLSI (45) ainda no postulou os pontos crticos para a azitromicina e, consequentemente, so fornecidos os pontos crticos do Comit Europeu
para o Teste Susceptibilidade Antimicrobiana (EUCAST, do ingls European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing; www.eucast.org).
b
Nas Amricas do Norte e do Sul, um ponto crtico de resistncia de 2mg/L frequentemente usado, de acordo com a recomendao dos Centros
de Controle e Preveno de Doenas dos Estados Unidos da Amrica (www.cdc.gov/std/GISP2007/).
44
ATCC
49226a
WHO F
WHO G
WHO K
WHO L
WHO M
WHO N
WHO O
WHO P
Penicilina G
0,016
0,064 (S)
0,251,0
(I)
1,04,0
(R)
1,04,0
(R)
4,016,0
(R)
4,016,0
(R)
>32 (R)
0,125
0,5
(I)
0,251,0
Cefixima
<0,016
(S)
<0,016
(S)
0,251,0
(SR)b
<0,016
(S)
<0,016
(S)
0,004
0,032
<0,002
(S)
0,004
0,016
(S)
0,032
0,125
(SR)b
0,008
0,032
(S)
0,002
0,008
(S)
<0,016
0,032
(S)
0,016
0,064
(S)
<0,016
(S)
Ceftriaxona
0,125
0,5
(SR)b
0,064
0,25
(SR)b
0,002
0,008
(S)
0,004
0,016
Eritromicina
0,25
1,0 (S)
0,5
2,0 (I)
0,5
2,0 (I)
1,0
4,0 (I)
0,5
2,0 (I)
0,251,0
(S)
0,5
2,0 (I)
2,0
8,0 (R)
1,0
2,0c
Azitromicina
0,064
0,25 (S)
0,125
0,5
(S)
0,125
0,5 (S)
0,25
1,0 (I)
0,1250,5
(S)
0,064
0,25 (S)
0,125
0,5
(S)
1,0
4,0 (R)
0,5
1,0c
Ciprofloxacina
0,002
0,008 (S)
0,064
0,25 (I)
>32 (R)
>32 (R)
1,04,0
(R)
2,08,0
(R)
0,004
0,016 (S)
0,002
0,008
(S)
0,001
0,008
Espectinomicina
1664
(S)
832
(S)
832 (S)
832 (S)
832 (S)
832 (S)
>1024
(R)
832
(S)
8,032,0
Produo de
-lactamase
No
No
No
No
Sim
Sim
Sim
No
No
Sorotipo
Arst
Arst
Bpyust
Brpyust
Bpyust
Arst
Boys
Bopt
NG-MASTd
ST3303
ST621
ST1424
ST1422
ST3304
ST556
ST495
ST3305
PIP-negativoe
No
Sim
No
No
No
Sim
No
No
Note-se que as CMI exatas mostradas devem ser usadas e interpretadas com cautela, pois foram definidas utilizando-se apenas um mtodo Etest
especfico e, consequentemente, podem diferir ao se utilizarem outros mtodos. Entretanto, os fentipos de resistncia identificados (categorizao
SIR) devem ser consistentes entre os diferentes mtodos.
a
SR: susceptibilidade reduzida, pois os isolados com essas CMI apresentam os determinantes primrios para resistncia s cefalosporinas de
amplo espectro.
b
No produz a enzima prolilaminopeptidase (PIP, do ingls prolyliminopeptidase), o que pode resultar na identificao duvidosa ou falso-negativa
de espcies de N. gonorrhoeae utilizando alguns testes bioqumicos ou de enzima-substrato (17, 20).
e
Gonorreia
45
46
Solvente
Ceftriaxona
gua destilada
Cefixima
Benzilpenicilina
gua destilada
Ciprofloxacina
Azitromicina
Eritromicina
Espectinomicina
gua destilada
Gentamicina
gua destilada
Canamicina
gua destilada
Tetraciclina
gua destilada
Cloranfenicol
Etanol a 95%
b
Para o cido actico glacial, use gua destilada para a metade do
volume e adicionar o cido actico glacial gota a gota, at que este se
dissolva; no exceder 2,5L/mL.
Gonorreia
47
Tabela 4.10: Preparo de diluies dos agentes antimicrobianos para a determinao da CMI, utilizando o
mtodo de diluio em gar
Soluo antimicrobiana
Volume
de gua
destilada
Concentrao
final na diluio
de 1:10 em gar
(mg/L)
Passo
Concentrao
(mg/L)
5120
Estoque
5120
Estoque
2560
256
5120
Estoque
1
1
1280
128
5120
Estoque
640
64
Passo 4
320
32
Passo 4
160
16
Passo 4
80
Passo 7
40
Passo 7
20
10
5
6
7
8
9
640
640
640
80
80
Fonte
Volume
(mL)
Concentrao da
diluio com a
qual se trabalhar
(mg/L)
10
80
Passo 7
11
10
Passo 10
0,5
Passo 10
2,5
0,25
Passo 10
1,25
0,125
Passo 13
0,625
0,06
Passo 13
0,3125
0,03
Passo 13
0,156
0,016
Passo 16
0,08
0,008
0,04
0,004
0,02
0,002
12
13
14
15
16
17
10
10
1,25
1,25
1,25
0,156
18
0,156
Passo 16
19
0,156
Passo 16
Figura 4.9
Resultados da determinao da CMI para N. gonorrhoeae usando o mtodo de diluio em gar. O meio
contendo 0,5mg/L de penicilina (placa esquerda) mostra a inibio de vrias cepas gonoccicas, enquanto
todas as cepas crescem satisfatoriamente no meio controle (placa a direita).
48
Gonorreia
49
Figura 4.10
Pincelagem da placa de cultura para Etest.
50
Figura 4.11
Resultado da determinao da CMI em N.
gonorrhoeae usando o Etest. A CMI da penicilina G
(PG) determinada no ponto em que a elipse cruza a
tira (0,094mg/L).
manual da OMS descreve o mtodo do teste de discodifuso de sensibilidade dicotmica calibrada (SDC) (47,
48). O mtodo SDC usado para o teste e vigilncia
da susceptibilidade antimicrobiana gonoccica, por
exemplo, na OMS do Pacfico Ocidental ou do Sudeste da
sia. NOTA: o meio gar, o procedimento e os critrios
de interpretao do mtodo SDC difere dos outros
mtodos de disco-difuso. Se esses mtodos forem
utilizados, necessrio que suas instrues sejam
estritamente seguidas.
4.8.6.2 Meio gar recomendado para o mtodo SDC
O meio de teste utilizado no mtodo SDC para isolados
de N. gonorrhoeae o gar-chocolate, incluindo o gar
base Columbia (o da Oxoid adequado; outras marcas
comerciais devem ser avaliadas quanto qualidade) com
8% de sangue de cavalo achocolatado a 70C por 30
minutos (ver Anexo 4). Outros meios no foram validados
e no devem ser utilizados sem uma avaliao estrita e
provveis ajustes dos critrios interpretativos.
Antibitico
Contedo do
disco
Categorias de susceptibilidade
Resistncia
Susceptibilidade
reduzida
Susceptibilidade
Benzilpenicilina
0,5UI
<3mm
3-9mm
9mm
Azitromicina
15g
<8mm
8mm
- cido nalidxico
30g
0mm
0mm
>6mm
- Ciprofloxacina
1g
6mm
>6mm
>6mm
- Ceftriaxona
0,5g
ASDc
5-9mm
>9mm
- Cefpodoxima
10g
ASDc
12mm
>12mm
Espectinomicina
100g
<6mm
6mm
Teste de ciprofloxacinaa
Teste de ceftriaxonab
Para testar a susceptibilidade de fluoroquinolonas (ciprofloxacina), ambos os discos com cido nalidxico e ciprofloxacina devem ser utilizados e
interpretados simultaneamente.
b
Para testar a susceptibilidade de ceftriaxonas, ambos os discos com ceftriaxona e cefpodoxima devem ser utilizados e interpretados
simultaneamente.
ASD: a ser determinado. Devido ausncia de um nmero adequado de cepas resistentes e correlaes baseadas em evidncias entre as CMI dos
isolados e o resultado do tratamento, os pontos crticos ainda no podem ser determinados. Os isolados com susceptibilidade reduzida/resistncia
ceftriaxona devem ser confirmados pelo teste de CMI (diluio em gar ou Etest) pelo laboratrio local ou, idealmente, em um Laboratrio de
Referncia da OMS.
Gonorreia
51
3.
2.
4.
5.
6.
7.
Figura 4.12
O halo de inibio (mm) a menor distncia medida da borda do disco para a borda do crescimento aderente.
A borda do crescimento aderente corresponde normalmente borda mais acentuada da zona de inibio.
Fonte: Reproduzido do Teste de Susceptibilidade Antibitica SDC (http://web.med.unsw.edu.au/cdstest/).
52
Tabela 4.12: Antibiticos, potncia dos discos e raio de inibio anular aceitvel para as cepas de referncia
de N. gonorrhoeae da OMS, recomendados para o controle de qualidade (CQ)
Cepa/antibitico
Potncia do disco
15g
8,9-12,5
Benzilpenicilina
0,5UI
2,1-4,1
Cefpodoxima
10g
10,9-14,5
Ceftriaxona
0,5g
8,2-11,0
Ciprofloxacina
1g
12,7-16,3
cido nalidxico
30g
11,3-14,5
Espectinomicina
100g
6,9-8,9
Cefpodoxima
10g
7,6-11,1
Ceftriaxona
0,5g
7,3-9,3
15g
3,8-7,4
N. gonorrhoeae WHO K
N. gonorrhoeae WHO P
Azitromicina
Gonorreia
53
Figura 4.13
Atividade da -lactamase em N. gonorrhoeae determinada em placa de cultura com cefalosporina
cromognica, nitrocefina. O meio da esquerda demonstra uma reao positiva (vermelho) e o meio da direita
demonstra uma reao negativa (permanece amarelo).
54
Gonorreia
55
56
4.11 Referncias
1. Global incidence and prevalence of selected curable
sexually transmitted infections2008. Genebra,
Organizao Mundial da Sade, 2012 (http://
www.who. int/reproductivehealth/publications/
rtis/2008_STI_ estimates.pdf, acessado em 2 de
abril de 2013).
2. Tapsall JW et al. Meeting the public health challenge
of multidrug- and extensively drug-resistant
Neisseria gonorrhoeae. Expert Review of AntiInfective Therapy, 2009, 7(7):821834.
3. Ohnishi M et al. Is Neisseria gonorrhoeae initiating
a future era of untreatable gonorrhea?: detailed
characterization of the first strain with high-level
resistance to ceftriaxone. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, 2011, 55(7):35383545.
4. Bachmann LH et al. Nucleic acid amplification
tests for diagnosis of Neisseria gonorrhoeae and
Chlamydia trachomatis rectal infections. Journal of
Clinical Microbiology, 2010, 48(5):18271832.
5. Mimiaga MJ et al. Gonococcal, chlamydia, and
syphilis infection positivity among MSM attending
a large primary care clinic, Boston, 2003 to
2004. Sexually Transmitted Diseases, 2009,
36(8):507511.
Gonorreia
57
58
32. Goire N et al. A duplex Neisseria gonorrhoeae realtime polymerase chain reaction assay targeting
the gonococcal porA pseudogene and multicopy
Gonorreia
59
60
Captulo 5
Infeces por clamdia
5.1 Introduo
A Clamydia trachomatis, agente etiolgico da clamdia,
causa morbidade e custos econmicos substanciais
no mundo. Em 2008, a Organizao Mundial da
Sade (OMS) estimou a ocorrncia de 106 milhes
de novos casos de clamdia urogenital entre adultos,
mundialmente. Isso coloca a clamdia como a mais
prevalente doena sexualmente transmissvel (DST)
bacteriana, junto com a gonorreia (tambm com 106
milhes de novos casos).
A C. trachomatis classifica-se em trs biovariantes, cada
uma contendo vrios sorotipos e gentipos (dependendo
do mtodo utilizado para classificao). As biovariantes
so definidas com base no tipo de infeco, localizao
comum da infeco (tropismo por tecido) e virulncia
relativa da doena (Tabela 5.1), dividindo-se entre
aquelas que causam tracoma (a maior causa de cegueira
evitvel em todo o mundo, endmica em muitos pases
em desenvolvimento), as que causam infeces genitais
(a DST bacteriana mais frequente no mundo) e as que
causam linfogranuloma venreo (LGV, uma doena de
lcera genital que afeta os tecidos linfoides) (ver Captulo
11).
A biovariante ocular consiste dos sorotipos A-C, os quais
so encontrados predominantemente em infeces na
conjuntiva. O tropismo por esse tecido no absoluto,
uma vez que esses organismos, especialmente o
sorotipo B, tambm podem ser isolados de infeces
genitais, mas a frequncia dessas ocorrncias rara.
A biovariante predominante consiste dos sorotipos
D-K, os quais so transmitidos sexualmente e infectam
o epitlio genital, causando uretrite em homens e
cervicite (e uretrite) em mulheres (Tabela 5.2). Infeces
urogenitais assintomticas ocorrem em at 50% dos
homens e at 90% das mulheres. Se no for detectada
e tratada, a infeco pode ascender para o trato genital
superior, causando epididimite em homens e doena
plvica inflamatria (PID, do ingls pelvic inflammatory
disease) e sequelas relacionadas (gravidez ectpica,
61
Caractersticas
Infeco
No invasivo
Clulas epiteliais/tracoma
Cegueira endmica
causada por tracoma
No invasivo
Clulas epiteliais/tracoma
Urogenital, conjuntivite,
pneumonia neonatal
L1, L2, L3
(incl. L2a, L2b)
Invasivo
Clulas linfticas/LGV
LGV
Primria
Sequelas
Mulheres
Homens
Epididimite, prostatite
Infeces no genitais
Primria
Sequelas
Reto
Proctite
Orofaringe
Linfonodos
Inflamao linftica
Ocular
Conjuntivite
Pneumonia neonatal
Pneumonia
Nota: estudos forneceram evidncias de que as infeces por C. trachomatis podem facilitar a transmisso do HIV; entretanto, o odds ratio
relativamente baixo.
62
63
64
Aparato de
coleta
Procedimento de NAAT
amostragem
Cultura
EID
POC
Endocrvice
Haste/
plsticoa,
escova ou
vassoura
para citologia
em meio
lquido
Coloque a
amostra no
aparato de
coleta do
fabricante
ou use meio
lquido para
citologia.
Armazene e
transporte a
amostra de
acordo com
as instrues
do manual.
Coloque a
amostra
diretamente
em meio de
transporte
apropriado
para clamdia
(por exemplo,
tampo SPG
com inibidores
antimicrobianos).
Mantenha a
amostra a 4C
para inoculaes
em 24h ou a
-70C para
armazenamentos
mais longos.
Passe a
amostra pela
lmina (uma
fina camada)
e deixe-a
secar ao ar
livre.
Coloque a
amostra no
tampo de
extrao do
kit e siga as
instrues do
manual.
Uretra
Haste/
alumniob
Insira 2-3cm da
haste na uretra
e gire 360. A
coleta de clulas
epiteliais cuboides
essencial para
o EID.
Coloque a
amostra no
aparato de
coleta do
fabricante.
Armazene e
transporte a
amostra de
acordo com
as instrues
do manual.
Coloque a
amostra
diretamente
em meio de
transporte
apropriado
para clamdia
(por exemplo,
tampo SPG
com inibidores
antimicrobianos).
Mantenha a
amostra a 4C
para inoculaes
em 24h ou a
-70C para
armazenamentos
mais longos.
Passe a
amostra pela
lmina (uma
fina camada)
e deixe-a
secar ao ar
livre.
Coloque a
amostra no
tampo de
extrao do
kit e siga as
instrues do
manual.
65
66
Local
Aparato
de coleta
Procedimento
de amostragem
NAAT
Cultura
EID
POC
Urina
Copo
estril para
coleta de
urina
O paciente no
deve limpar a
rea genital.
Obter o primeiro
jato (em geral,
menos de 25mL).
Coloque a
amostra no
aparato de coleta
do fabricante.
Armazene e
transporte a
amostra de acordo
com as instrues
do manual.
NA
NA
NA
Vagina
Haste/
plsticoa
As amostras
podem ser
obtidas pelo
mdico ou pelos
pacientes. Gire a
haste para que
esta entre em
contato com toda
a parede vaginal.
Coloque a
NA
amostra no
aparato de coleta
do fabricante.
Armazene e
transporte a
amostra de acordo
com as instrues
do manual. Vrios
ensaios toleram
esfregaos secos
recebidos sem
meio.
NA
Siga as
instrues
do
manualc.
Reto
Haste/
plsticoa
Insira 2-3cm da
haste no reto e
gire 360.
Atualmente,
nenhum fabricante
faz referncia
a esse tipo de
amostrad. Trate-a
como uma amostra
endocervical. As
amostras podem
ser enviadas sem
o meio, caso o
ensaio utilizado
aceite esse tipo
de amostragem
para espcimes
endocervicais.
Passe a
amostra
pela
lmina
(uma fina
camada)
e deixe-a
secar ao
ar livre.
NA
Coloque a amostra
diretamente em
meio de transporte
apropriado para
clamdia (por
exemplo, tampo
SPG com inibidores
antimicrobianos).
Mantenha a
amostra a 4C
para inoculaes
em 24h ou a
-70C para
armazenamentos
mais longos.
Aparato Procedimento
de coleta de amostragem
NAAT
Cultura
EID
POC
Orofaringe
Haste/
plsticoa
Atualmente, nenhum
fabricante faz
referncia a esse
tipo de amostrad.
Trate-a como
uma amostra
endocervical. As
amostras podem
ser enviadas sem o
meio, caso o ensaio
utilizado aceite esse
tipo de amostragem
para espcimes
endocervicais.
Coloque a amostra
diretamente em
meio de transporte
apropriado para
clamdia (por
exemplo, tampo
SPG com inibidores
antimicrobianos).
Passe a
amostra pela
lmina (uma
fina camada)
e deixe-a
secar ao ar
livre.
NA
Passe a haste na
faringe posterior
e nas criptas
tonsilares.
Nasofaringe Haste/
(para
alumniob
casos de
suspeita de
pneumonia
neonatal)
Passe a haste na NA
nasofaringe ou
colete o aspirado
traqueobronqueal.
Coloque a amostra
diretamente em
meio de transporte
apropriado para
clamdia (por
exemplo, tampo
SPG com inibidores
antimicrobianos).
Mantenha a
amostra a 4C para
inoculaes em 24h
ou a -70C para
armazenamentos
mais longos.
NA
NA
Conjuntiva
Passe a haste
na superfcie
da conjuntiva
palpebral inferior.
Coloque a amostra
diretamente em
meio de transporte
apropriado para
clamdia (por
exemplo, tampo
SPG com inibidores
antimicrobianos).
Mantenha a
amostra a 4C para
inoculaes em 24h
ou a -70C para
armazenamentos
mais longos.
Passe a
amostra pela
lmina (uma
fina camada)
e deixe-a
secar ao ar
livre.
NA
Haste/
alumniob
NA
67
EID: ensaio de imunofluorescncia direta; NA: no se aplica; NAAT: teste de amplificao de cidos nucleicos; POC: teste point-of-care; SPG:
sacarose-fosfato-glutamato.
a
Os dados indicam que os NAAT apropriados apresentam um bom desempenho para esse tipo de amostra, mas nenhum fabricante se refere a
espcimes extragenitais.
d
Tabela 5.4: Testes diagnsticos avaliados* (at junho de 2012) para a deteco de C. trachomatis
NAAT
Cultura
EID
POC
Sim
Sim
Sim
Sim
No
No
No
Obtidas pelo
paciente
No
No
Coletadas pelo
mdico
No
No
Tipos de espcimes
Urina
Mulheres
Sim
Homens
Sim
No
No
No
No
No
No
Sim
Sim
Sim
Simb
Simb
No
Simb
Simb
No
Sim
Sim
No
Desempenho
Sensibilidadec
Muito alta
Moderada-alta
Baixa-moderada
Baixa-moderada
Especificidade
Muito alta
Muito alta
Moderada
Muito alta
Custo
Muito alto
Moderado
Baixo
Baixo
Transporte e
armazenamento
Em temperatura
ambiente por at
60 dias (checar o
manual)
4C por 24h
Temperatura
ambiente
NA
Instrumentao
Grande presena de
instrumentao
Microbiologia de
rotina/virologia
Microscpio de
fluorescncia
Pequena-nenhuma
Rendimento/
automatizao
Alto/sim
Baixo/no
Baixo/no
Baixo/no
Outras consideraes
68
Tabela 5.4: Testes de diagnstico avaliados* (at junho de 2012) para a deteco de C. trachomatis (continuao)
NAAT
Cultura
EID
POC
Alta
Nvel de
infraestrutura do
laboratrio
Referncia
Referncia
Central
Local
Mltiplos patgenos
de uma mesma
amostra
N. gonorrhoeae,
Trichomonas
vaginalis e HPV em
algumas plataformas
No
No
No
Outros comentrios
Devido s
caractersticas
de desempenho
superiores,
os NAAT so
altamente
Outras consideraes
O rigor na coleta
Altamente
e no transporte
recomendado para
essencial
a identificao
para manter a
imediata de
viabilidade do
infeces na
teste essa a
conjuntiva.
maior barreira
recomendados
nesse ensaio para
para o diagnstico
a sensibilidade.
e triagem.
O potencial para
Requer adeso
obter isolados
estrita aos
protocolos devido
viveis til em
ao potencial de
testes adicionais,
contaminao do
como o de
laboratrio.
determinao de
Alguns exigem
gentipos e o teste
grandes lotes, o
de susceptibilidade
que pode aumentar
a antibiticos.
o tempo de retorno
do resultado.
As infeces
identificadas
podem ser tratadas
antes que o
paciente deixe a
clnica.
EID: ensaio de imunofluorescncia direta; HPV: papilomavrus humano; NAAT: teste de amplificao de cidos nucleicos; POC: teste point-of-care.
* Avaliado pela Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados Unidos da Amrica.
a
Os dados indicam que os NAAT apropriados apresentam um bom desempenho para esse tipo de amostra, mas nenhum fabricante se refere a
espcimes extragenitais.
b
Comparada aos NAAT modernos, a sensibilidade da cultura e do EID tende a ser ainda menor para esse tipo de espcime.
A estimativa das sensibilidades varia muito, dependendo das diferentes sensibilidades dos ensaios de uma mesma metodologia, bem como
dos ensaios utilizados para comparao (o padro ouro). Os NAAT so superiores a qualquer outra classe de testes quanto sensibilidade e
apresentam excelente especificidade.
Fonte: Adaptado de Unemo M, Papp JR. Infections caused by Chlamydia trachomatis. In: Morse SA et al., eds. Atlas of sexually transmitted diseases
and AIDS, 4th ed. Edinburgh, Saunders/Elsevier, 2010:4063.
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
5.6.3 Sorologia
Os mtodos sorolgicos para o diagnstico das infees
por clamdia esto entre as tecnologias mais modernas
disponveis. Esses mtodos identificam e, em alguns
casos, titulam o nvel da resposta do anticorpo aos
antgenos da clamdia. Enquanto o primeiro ensaio,
fixao complementar e microimunofluorescncia
(MIF) dependiam de organismos inteiros, os ensaios
subsequentes foram desenvolvidos para apresentar
respostas especficas a protenas individuais ou classes
de anticorpos. A sorologia pode ajudar o diagnstico e/
ou a triagem de infeces complicadas de C. trachomatis
(artrite reativa, PID, gravidez ectpica, infertilidade
por fator tubrio); diagnosticar pneumonia neonatal e
infeces de LGV (ver Captulo 11); e pode ainda ser
til em pesquisa e estudos epidemiolgicos, como, por
exemplo, para o histrico cumulativo de exposies
de uma populao amostral a infeces por clamdia.
Entretanto, importante que os resultados sorolgicos
sejam sempre interpretados com cautela e no fora de
contexto.
Em uma infeco primria aguda por clamdia,
podem-se detectar IgM especficas, assim como IgG
e IgA. No entanto, muitas vezes a resposta sistmica
de anticorpo retardada ou no mensurvel aps
infeco urogenital descomplicada. Em contrapartida,
nveis altos de anticorpos contra C. trachomatis podem
persistir muito tempo aps a eliminao da infeco.
Consequentemente, devido baixa sensibilidade e
especificidade, a mensurao de anticorpos contra
clamdia de pouco valor para o diagnstico de
infeces agudas por C. trachomatis e no deve
ser usada para o diagnstico de rotina de infeces
descomplicadas por C. trachomatis.
79
5.7 Referncias
1. Schachter J et al. Confirming positive results
of nucleic acid amplification tests (NAATs) for
Chlamydia trachomatis: all NAATs are not created
equal. Journal of Clinical Microbiolowgy, 2005,
43(3):13721373.
2. Martin DH et al. Use of multiple nucleic acid
amplification tests to define the infected-patient
gold standard in clinical trials of new diagnostic
tests for Chlamydia trachomatis infections. Journal
of Clinical Microbiology, 2004, 42(10):47494758.
3. Masek BJ et al. Performance of three nucleic acid
amplification tests for detection of Chlamydia
trachomatis and Neisseria gonorrhoeae by use
of self-collected vaginal swabs obtained via an
Internet-based screening program. Journal of
Clinical Microbiology, 2009, 47(6):16631667.
4. Hobbs MM et al. From the NIH: proceedings of
a workshop on the importance of self-obtained
vaginal specimens for detection of sexually
transmitted infections. Sexually Transmitted
Diseases, 2008, 35(1):813.
5. Bachmann LH et al. Nucleic acid amplification
tests for diagnosis of Neisseria gonorrhoeae and
Chlamydia trachomatis rectal infections. Journal of
Clinical Microbiology, 2010, 48(5):18271832.
6. Mimiaga MJ et al. Gonococcal, chlamydia, and
syphilis infection positivity among MSM attending
a large primary care clinic, Boston, 2003 to
2004. Sexually Transmitted Diseases, 2009,
36(8):507511.
80
81
82
Captulo 6
Tricomonase
6.1 Introduo
O Trichomonas vaginalis o agente etiolgico da
doena sexualmente transmissvel (DST) no viral
mais prevalente em todo o mundo. Em 2008, a
Organizao Mundial da Sade estimou a ocorrncia
de 276,4 milhes de novos casos de T. vaginalis
mundialmente entre adultos com 15-49 anos. Isso
representa, substancialmente, mais casos de DST do
que os causados por Chlamydia tracomatis e Neisseria
gonorrhoeae juntas (1). Apesar da alta prevalncia de
infeces causadas por T. vaginalis, os esforos para
o controle das DST tm, historicamente, subestimado
esse patgeno. Embora T. vaginalis possa causar
um corrimento vaginal anormal (tricomonase) em
mulheres e ser responsvel por at 10-12% dos
casos de uretrites no gonoccicas em homens (2), a
infeco pode ser assintomtica em pelo menos 50%
das mulheres e 70-80% dos homens (3). Assim, o
diagnstico laboratorial essencial para complementar
as estratgias de gesto sindrmica para o tratamento
dessa infeco.
O T. vaginalis um protozorio mvel, ovoide, em
formato de pera e flagelado (10-20m de comprimento).
Os organismos apresentam quatro flagelos anteriores
livres e um quinto flagelo imerso em uma membrana
ondulada que se estende anteriormente at cerca de dois
teros da clula. Esse flagelo impele o protozorio com
movimentos irregulares.
A epidemiologia de infeces por T. vaginalis difere
em dois importantes aspectos de outras infeces que
causam corrimento vaginal. Primeiro, a faixa etria
em que a infeco incide distinta daquela na qual
ocorre a infeco por clamdia ou gonorreia. Nessas
ltimas, em menor medida no que se refere infeco
gonoccica, o pico de prevalncia ocorre em mulheres
com 15-25 anos, enquanto que as infeces por T.
vaginalis apresentam o seu pico substancialmente
mais tarde na vida (entre 40-50 anos de idade). Essa
diferena na distribuio relevante para orientar
Tricomonase
83
Primria
Sequelas
Mulheres
Homens
84
Tricomonase
85
Aparato
de coleta
Procedimento de
amostragem
Microscopia
POC
Cultura
NAAT
Vaginal
(coletado
pelo mdico)
Haste/
plsticoa
Colete a amostra
do frnice
posterior antes
da insero do
espculo.
Dilua a
amostra em
0,5mL de
soluo salina
e aplique
uma gota da
soluo na
lmina com
lamnula.
Coloque a
amostra no
tampo de
extrao do
kit e siga as
instrues
do manual.
Coloque a
amostra
diretamente em
meio de cultura
(por exemplo,
meio de Diamond
ou InPouch).b
Coloque a
amostra no
aparato de
coleta do
fabricante.
Pode ser
Entregue a
amostra ao
fornecedor
para a diluio
e preparao
da lmina.
Entregue a
amostra ao
fornecedor
para
que seja
processada
como
descrito
acima.
Vaginal
Haste/
(coletado
plsticoa
pelo paciente)
86
Incube a 37C.
Entregue a
amostra ao
fornecedor para
a inoculao em
meio de cultura.
enviada seca
ao laboratrio.
Armazene e
transporte de
acordo com as
instrues do
manual.
Coloque a
amostra no
aparato de
coleta do
fabricante.
Pode ser
enviada seca
ao laboratrio.
Armazene e
transporte de
acordo com as
instrues do
manual.
Aparato
de coleta
Procedimento de
amostragem
Microscopia
Uretra
(apenas em
homens
sintomticos)
Haste/
alumnioc
Colete secrees
da uretra >1 hora
aps a ltima
urina.
Urina
Copo
estril
para
coleta de
urina
O paciente no
deve limpar a rea
genital. Obter a
primeira parte do
jato de urina (em
geral, menos que
25mL), >1 hora
aps a ltima
urina.
POC
Cultura
NAAT
Dilua a
NA
amostra em
0,5mL de
soluo salina
e aplique
uma gota da
soluo na
lmina com
lamnula.
Coloque a
amostra
diretamente em
meio de cultura
(por exemplo,
meio de Diamond
ou InPouch).b
Incube a 37C.
Coloque a
amostra no
aparato de
coleta do
fabricante.
Armazene e
transporte de
acordo com as
instrues do
manual.
Centrifugue
NA
a amostra
a 500g por
cinco minutos.
Coloque o
sedimento
em 0,5
de soluo
salina. Aplique
uma gota da
soluo na
lmina com
lamnula.
Centrifugue
a amostra a
500g por cinco
minutos. Coloque
o sedimento
em um meio
de cultura (por
exemplo, meio
de Diamond ou
InPouch).b Incube
a 37C.
Coloque a
amostra no
aparato de
coleta do
fabricante.
Armazene e
transporte de
acordo com as
instrues do
manual.
NA: no se aplica; NAAT: teste de amplificao de cidos nucleicos; POC: testes point-of-care.
a
Para lugares que no tm acesso a meio de cultura, as hastes podem ser colocadas em tubos contendo meio Amies, sendo armazenadas a 4C e
transportadas ao laboratrio central em at 24 horas.
b
Tricomonase
87
Tabela 6.3: Caractersticas de desempenho dos testes de diagnstico para a deteco de T. vaginalis
Microscopia
POC
Cultura
NAAT
No
No
No
Sim
No
No
No
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Feminina
No
No
No
Sim
Masculina
Sim
No
Sim
Sim
Sim
No
Sim
Sim
Sensibilidade
Baixa
Altaa
Moderada-alta
Muito alta
Especificidade
Muito alta
Muito alta
Muito alta
Muito alta
Custo
Baixo
Moderado
Moderado
Alto
Transporte e
armazenamento
NA
NA
Ambiente
Ambiente
Instrumentao
Microscpio
Nenhuma
Estufa, microscpio
Grande infraestrutura
Rendimento/automatizao Baixo/no
Baixo/no
Baixo/no
Alto/possvel
Complexidade tcnica
Moderada
(experincia em
microscopia)
Baixa
Moderada (experincia
em microscopia)
Alta
Nvel de infraestrutura do
laboratrio
Perifrica
Perifrica
Intermedirio-central
Central
Outros comentrios
Resultados
As infeces
falso-negativos
identificadas
so mais
podem ser
provveis que
tratadas
resultados
antes que
negativos
o paciente
reais. Assim, o
deixe a
contexto clnico
clnica.
essencial.
necessrio
um mximo de
ateno para uma
microscopia precisa.
necessria a
adeso estrita aos
protocolos, devido
possibilidade
de contaminao
laboratorial.
Tipos de espcime
Urina
Outras consideraes
Com a probabilidade
de obter isolados
viveis, til para
Alguns exigem
testes adicionais,
grandes lotes, o
como a determinao
que pode atrasar o
de gentipos e o teste
tempo de entrega
de susceptibilidade
de resultados.
antimicrobiana.
NA: no se aplica; NAAT: teste de amplificao de cidos nucleicos; POC: teste point-of-care.
a
88
Figura 6.1
Trichomonas vaginalis em microscopia de
preparao a fresco.
6.4.3 Cultura
Por muitos anos, a cultura foi fundamental para
o diagnstico de T. vaginalis. O T. vaginalis um
organismo anaerbico, que cresce muito devagar
em condies aerbicas. Atualmente, a cultura
normalmente realizada utilizando-se o meio de Diamond
modificado ou o sistema de cultura InPouch TV (BioMed
Diagnostics, EUA) (Figura 6.2). As culturas devem ser
incubadas por at 5-7 dias. importante ressaltar que o
T. vaginalis deve crescer no fundo do tubo de cultura e,
consequentemente, os tubos necessitam ser incubados
em uma posio vertical. Alm disso, o meio de cultura
deve ser pr-reduzido e os tubos de cultura levemente
abertos antes de serem colocados no recipiente
anaerbico para incubao a 37C.
Tricomonase
89
90
Figura 6.2
Sistema de cultura InPouch TV.
6.6 Referncias
1. Global incidence and prevalence of selected curable
sexually transmitted infections2008. Geneva,
World Health Organization, 2012 (http://www.who.
int/reproductivehealth/publications/rtis/2008_STI_
estimates.pdf, accessed 2 April 2013).
2. Wetmore CM, Manhart LE, Golden MR. Idiopathic
urethritis in young men in the United States:
prevalence and comparison to infections with
known sexually transmitted pathogens. Journal of
Adolescent Health, 2009, 45(5):463472.
3. Sea AC et al. Trichomonas vaginalis infection in
male sexual partners: implications for diagnosis,
treatment, and prevention. Clinical Infectious
Diseases, 2007, 44(1):1322.
4. Zhang ZF et al. Trichomonas vaginalis and cervical
cancer. A prospective study in China. Annals of
Epidemiology, 1995, 5(4):325332.
5. Van Der Pol B. Trichomonas vaginalis infections.
In: Kumar B, Gupta S, eds. Sexually transmitted
infections, 2nd ed. New Delhi, Elsevier,
2012:602609.
Tricomonase
91
92
Tricomonase
93
94
Captulo 7
Vaginose bacteriana
7.1 Introduo
A vaginose bacteriana (VB) a causa mais comum de
corrimento vaginal entre mulheres na idade reprodutiva.
Embora no seja considerada uma doena sexualmente
transmissvel, a atividade sexual um fator para sua
aquisio (1). Isso foi demonstrado pelo aumento de
sua incidncia em relao ao aumento no nmero de
parceiros recentes e ao longo da vida, e em relao a
ter um novo parceiro sexual. A identificao de vaginose
bacteriana tambm em mulheres virgens se ope
ideia da transmisso sexual exclusiva. A condio
provavelmente muito mais relacionada a alteraes na
microbiota vaginal (devido a mecanismos at o momento
desconhecidos e a fatores do hospedeiro), causando
um aumento no pH local, o que resulta na reduo de
lactobacilos produtores de perxido de hidrognio. Os
lactobacilos ajudam a manter a acidez do pH de vaginas
saudveis e a inibir outros microrganismos anaerbicos.
Normalmente, vaginas saudveis apresentam altas
concentraes de lactobacilos. Na VB, a populao de
lactobacilos muito reduzida, enquanto as populaes
de vrios anaerbios e de Gardnerella vaginalis so
aumentadas. Os anaerbios envolvidos na VB incluem
Mobiluncus spp., Prevotella spp., Bacteroides spp.,
Peptostreptococcus, Fusobacterium, Eubacterium
spp., Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum.
Com as atuais tcnicas independentes de cultura,
um maior nmero de organismos foram identificados
como parte da microbiota encontrada em mulheres
com VB, incluindo Atopobium vaginae (2). Muitas
das bactrias associadas a VB so encontradas em
mulheres saudveis, embora em menor nmero.
Assim, o diagnstico laboratorial de VB repleto de
dificuldades, com vrios mtodos descritos na literatura.
O isolamento e identificao de organismos individuais
como a G. vaginalis frequentemente proposto, mas no
adequado para o diagnstico clnico de VB (3), alm de
poder levar ao excesso de tratamentos. O diagnstico
melhor realizado usando tanto os critrios clnicos de
7.2 Diagnstico
A VB uma manifestao clnica caracterizada pelo
aumento da quantidade de corrimento vaginal ftido. O
diagnstico baseia-se na presena de pelo menos trs
dos quatro critrios seguintes (critrios de Amsel) (4):
Corrimento branco ou cinzento, homogneo e viscoso;
Fluido vaginal com pH >4,5;
Liberao de odor de amina, semelhante a peixe, do
fluido vaginal quando misturado a soluo a 10% de
hidrxido de potssio (KOH);
Clulas indicadoras visveis em anlise no
microscpio.
Corrimento. A avaliao desse sinal clnico subjetiva.
O corrimento em mulheres com VB normalmente no
muito maior do que o observado em mulheres saudveis.
Alm disso, a aplicao de duchas vaginais pode reduzir
a quantidade de corrimento.
pH vaginal. O pH do fluido vaginal deve ser mensurado
utilizando-se tiras de papel indicador de pH no intervalo
adequado (3,8 a 6,0), tais como o papel com intervalo
estreito de Whatman. Um espcime dos frnices laterais
e posterior da vagina coletado com uma haste, a qual
, ento, colocada diretamente sobre a tira de papel.
Alternativamente, o papel de pH pode ser tocado com
a ponta do espculo aps este ser retirado da vagina
(Figura 7.1). O contato com o muco cervical deve ser
evitado, uma vez que este apresenta pH >7,0. Uma
vagina madura normal apresenta um pH cido de 4,0. Na
VB, o pH geralmente elevado a >4,5.
Vaginose bacteriana
95
Figura 7.1
Teste do pH do fluido vaginal, comparado a uma
escala padronizada de cores.
O teste do pH vaginal apresenta a maior sensibilidade
das quatro caractersticas, mas a menor especificidade.
Tambm se observa um pH elevado se o fluido vaginal
estiver contaminado por sangue menstrual, muco
cervical ou smen e em mulheres com infeco por T.
vaginalis.
Odor. Mulheres com VB normalmente reclamam de
um odor desagradvel na vagina. Esse odor devido
liberao de amina, produzida pela descarboxilao dos
aminocidos lisina (para cadaverina) e arginina (para
putrescina) por bactrias anaerbicas. Quando o KOH
adicionado ao fluido vaginal, essas aminas se tornam
Figura 7.2
Microscopia de esfregaos vaginais
96
Figura 7.3
Colorao de Gram de esfregao vaginal normal
mostrando os lactobacilos (1000x).
Fonte: Reproduzido com permisso da Associao
Britnica para Sade Sexual e HIV (BASHH, do ingls
British Association for Sexual Health and HIV).
Figura 7.4
Grau I
Figura 7.5
Grau II
Grau III (VB): morfotipos bacterianos misturados com
poucos ou nenhum morfotipo de lactobacilos (Figura 7.6).
97
Figura 7.7
Grau 0
Figura 7.8
Grau IV
Fonte: Figuras 7.4-7.8 reproduzidas com permisso da
Associao Britnica para Sade Sexual e HIV (BASHH,
do ingls British Association for Sexual Health and HIV).
Ambos os graus 0 e IV so encontrados em mulheres
saudveis. O grau 0 ocorre principalmente aps
tratamento antimicrobiano intravaginal e o grau IV
encontrado em menor nmero em mulheres que
so colonizadas longitudinalmente com cocos Grampositivos, normalmente streptococos, com lactobacilos
reduzidos ou ausentes.
98
7.6 Referncias
99
100
Captulo 8
Candidase
8.1 Introduo
A candidase vulvo-vaginal (CVV) causada pelo fungo
Candida albicans (1) em aproximadamente 85% dos
casos, sendo a C. glabrata responsvel pelos 15%
restantes (2). Outras espcies, tais como C. krusei e C.
tropicalis, raramente causam vaginites (3). As Candida
spp. so geralmente de origem endgena e podem ser
isoladas a partir do trato genital de at 25% de mulheres
saudveis assintomticas em idade reprodutiva. Para
as Candida spp. colonizarem a vagina, elas devem
primeiro aderir s clulas epiteliais vaginais, onde
crescem, proliferam-se e germinam antes de finalmente
causarem os sintomas de inflamao. Normalmente,
so necessrias alteraes no ambiente vaginal antes
que o organismo possa induzir os efeitos patolgicos.
Provavelmente, a microbiota natural a defesa mais
importante contra a colonizao e a inflamao. O
mecanismo pelo qual a cndida induz a inflamao
ainda no foi determinado, mas fatores importantes de
predisposio colonizao e inflamao incluem:
Alteraes nos nveis dos hormnios reprodutivos
associados a perodos pr-menstruais, gravidez e
contraceptivos orais;
Uso de antibiticos;
Diabetes mellitus;
Imunossupresso.
A candidase normalmente de origem endgena
e no se transmite sexualmente. A CVV crnica ou
recorrente ocorre em um pequeno nmero de mulheres,
causando sintomas persistentes, e pode estar associada
aos fatores de risco descritos acima (4, 5). Produtos
qumicos, alergias locais e hipersensibilidade tardia
tambm podem contribuir para a induo de vaginite
sintomtica ou vulvite.
Em homens, a importncia de Candida spp. no
clara, embora o agente possa ser transmitido entre
8.2 Diagnstico
O diagnstico de CVV normalmente estabelecido por
meio da combinao entre as manifestaes clnicas
e anlise microscpica de preparao a fresco. Os
sintomas clssicos e os sinais de CVV incluem prurido
vaginal, corrimento branco e coalhado sem odor (queijo
cottage), sensao de queimao na vulva, disria e
eritema dos lbios e vulva. Entretanto, os sintomas e
sinais so frequentemente mais ambguos. A deteco
do brotamento de clulas de levedura por meio de
microscopia de preparao a fresco ou com hidrxido
de potssio (KOH) pode ser realizada em laboratrios
ou clnicas e apresenta um valor preditivo muito alto
para o diagnstico de CVV. Embora essa combinao
seja geralmente usada, frequentemente razovel
oferecer terapia a mulheres com sinais clssicos de
CVV, com base em um diagnstico clnico presuntivo,
sem uma confirmao adicional por microscopia. O uso
de esfregaos com colorao de Gram e a deteco
do brotamento de clulas de levedura e pseudo-hifas
preferido em alguns centros para a determinao de
candidase.
Em mulheres com corrimento vaginal anormal, e na
ausncia de um microscpio, a deteco de um pH <4,5
um bom indicador de CVV e pode ajudar a diferenci-la
de uma vaginose bacteriana ou tricomonase, as quais
tipicamente produzem um pH >4,5. Um papel de pH
com intervalo estreito (Whatman) um mtodo de baixo
custo, sensvel e simples de usar e est disponvel na
maioria dos lugares.
A cultura atualmente o mtodo mais sensvel para
a deteco de Candida spp., mas deve ser usada
com cautela, uma vez que Candida spp. tambm so
encontradas em mulheres sem CVV. Dessa forma,
a cultura s deve ser considerada em caso de CVV
clinicamente suspeita, mas com microscopia negativa
(embora, nesse caso, o tratamento presuntivo possa
ser aplicado, resultando em menor custo financeiro) ou
Candidase
101
Figura 8.1A
Preparao de hidrxido de potssio (KOH) de
secreo vaginal, mostrando o brotamento de
leveduras e pseudo-hifas (400x).
Figura 8.1B
Preparao a fresco de leveduras sem pseudo-hifas.
Fonte (A e B): reproduzidas com permisso da
Associao Britnica para Sade Sexual e HIV (BASHH,
do ingls British Association for Sexual Health and HIV).
102
Figura 8.2A
Esfregao de secreo vaginal com colorao de
Gram mostrando as leveduras Gram-positivas e
pseudo-hifas (1000x).
Figura 8.2B
Brotamento de leveduras sem pseudo-hifas.
Fonte (A e B): reproduzidas com permisso da
Associao Britnica para Sade Sexual e HIV (BASHH,
do ingls British Association for Sexual Health and HIV).
8.5 Cultura
O gar dextrose Sabouraud com cloranfenicol um
excelente meio de crescimento para o isolamento de
Candida spp. Aps a inoculao do espcime clnico, as
placas so incubadas a 36C por dois dias. As colnias
de clulas de levedura so opacas e com colorao de
branca a creme. A nica identificao importante para
o diagnstico de rotina a diferenciao de bactrias. A
microscopia pode ser utilizada para confirmar a presena
de clulas de levedura.
No necessria a identificao adicional de levedura
para o diagnstico de rotina de CVV descomplicada.
Entretanto, o teste de tubo de germinao representa
um mtodo simples para a identificao presuntiva de C.
albicans. Uma colnia emulsificada em 0,5mL de soro
bovino ou de cavalo e incubada a 36C por quatro horas.
A C. albicans mostrar filamentos de hifa laterais curtos
sem nenhuma constrio. Uma identificao completa de
levedura em nvel de espcie pode ser obtida por meio
de mtodos auxanogrficos para a assimilao de nitrato
e carboidrato, ou mediante testes de fermentao de
carboidrato. Kits para a identificao de leveduras, em
nvel de espcie, esto disponveis comercialmente.
8.6 Referncias
1. Sobel JD. Vulvovaginal candidosis. The Lancet,
2007, 369(9577):19611971.
2. Sobel JD. Vulvovaginitis due to Candida glabrata.
An emerging problem. Mycoses, 1998, 41(Suppl
2):1822.
3. Horowitz BJ, Giaquinta D, Ito S. Evolving pathogens
in vulvovaginal candidiasis: implications for patient
care. Journal of Clinical Pharmacology, 1992,
32(3):248255.
4. Morton RS, Rashid S. Candidal vaginitis: natural
history, predisposing factors and prevention.
Proceedings of the Royal Society of Medicine, 1997,
70(Suppl 4):36.
5. Sobel JD. Pathogenesis and treatment of recurrent
vulvovaginal candidiasis. Clinical Infectious
Diseases, 1992, 14(Suppl 1):S148S153.
6. Marrazzo J, Hillier S, Sobel J. Vaginal infections. In:
Morse SA et al., eds. Atlas of sexually transmitted
diseases and AIDS, 4th ed. Edinburgh, Saunders/
Elsevier, 2010:7693.
Candidase
103
104
Captulo 9
9.1 Introduo
Os vrus do herpes simples tipo 1 (HSV-1, do ingls
herpes simplex virus type 1) e tipo 2 (HSV-2, do ingls
herpes simplex virus type 2) so vrus de DNA de dupla
fita. O HSV-1 e o HSV-2 compartilham uma estrutura
genmica similar, com 40% de sequncias semelhantes
e 83% de similaridade em suas regies codificantes, o
que explica as numerosas semelhanas biolgicas e a
reao cruzada antignica entre os dois sorotipos.
Contato
sexual
-4
-2
Cura da crosta da
lcera
Sintomas
locais
Sintomas
sistmicos
Sintomas
-6
lcera mida
10
12
14
16
18
Leses
Mdico Formao de Leses Desaparecimento
observadas contactado leso nova comeam dos sintomas,
comum
a curar a menos que as
leses estejam
irritadas
20
Dias
Leses
curadas
Figura 9.1
Evoluo clnica de herpes genital primrio
105
Tabela 9.1: Sintomas, sinais ou complicaes clnicas durante infeco por herpes genital sintomtico
Sintomas clnicos
Homens
Mulheres
Sinais clnicos
Meningite assptica
Erupo cutnea vesicular
extensiva
Reteno urinria
Radiculopatia com
sensibilidade, devido ao
comprometimento de
nervos sacrais
Mielite transversa
Risco aumentado de
adquirir HIV por exposio
sexual
Leses papulares ou vesiculares
Leses papulares,
em reas genitais, perigenitais ou
vesiculares e pustulares, Risco aumentado de
transmisso de HIV em
extragenitais (coxa, olhos, ndega,
seguidas de ulceraes
indivduos co-infectados
dedo)
na vulva, perneo e coxa
por HIV/HSV
Leses pustulares
Corrimento vaginal e
Herpes neonatal aps
Ulcerao genital
cervical
parto vaginal
Dor perineal
Cervicite
Disria
Hiperemia das
Desconforto ou dor inguinal
membranas mucosas da
(periadenite)
vulva e vagina
Dispareunia
Corrimento uretral
Infeco na faringe (contato orogenital) Uretrite
As infeces primrias em mulheres
so normalmente piores em
intensidade e durao que em homens.
106
Complicaes
107
Tabela 9.2: Recomendaes para a coleta de amostra para o diagnstico de infeces por herpes genital,
adaptadas de Domeika et al. (1)
108
Regio de coleta
Mtodo de coleta
Pele ou membrana
mucosa de leses em
homens (incluindo a
regio perianal)
Agulhas estreis
Haste de madeira, plstico ou alumnio,
com extremidade de algodo, dacron ou
flocos de nylon
Lminas para microscpio
Uretra em homens
Pele ou membrana
mucosa de leses em
mulheres (incluindo a
regio perianal)
Gaze e hastes
Lminas para microscpio
Tabela 9.2: Recomendaes para a coleta de amostra para o diagnstico de infeces por herpes genital,
adaptadas de Domeika e colaboradores (1) (continuao)
Regio de coleta
Mtodo de coleta
Uretra em mulheres
Colo do tero
Espculo vaginal
Gaze estril (para remover o excesso de
corrimento)
Haste de madeira, plstico ou alumnio
com extremidade de algodo, dacron ou
flocos de nylon
Princpio
Exame
Esfregao
citolgico de Tzanck,
Papanicolau
(Pap) ou
colorao de
Romanovsky
Deteco
de clulas
infectadas
por imunofluorescncia
direta
Amostra
Desvantagens
Leses na
pele/mucosa
Bipsias
Esfregaos da
crnea/conjuntiva
Baixa
Baixo custo
Leses frescas
Sensibilidade
e especificidade abaixo
do timo
Esfregaos,
seces de
tecidos
Esfregao
da base da
vescula
Baixo custo
Rpido
(vivel em
<4 horas)
Possibilidade de determinao
do tipo
Vesculas
frescas
Sensibilidade
abaixo do
timo
Demorado
Trabalhoso
No padronizado
Baixa
109
110
Mtodo
Princpio
Amostra
Deteco
de
antgeno
viral
Colorao
de imunoperoxidase
Amostras
Mdia (80%)
coletadas com
haste
Esfregaos de
leses
Esfregaos ou
fluido vesicular do exsudato da base
da vescula
ELISA
Amostras
Alta (lcera
Alta (62-100%)
coletadas com genital: >95%)
haste
Fluido vesicular ou exsudato da base
da vescula
Teste rpido
Amostras
Desconhecida
coletadas com
haste
Fluido vesicular do exsudato da base
da vescula
Alta (90%)
Desconhecida
Desvantagens
Princpio
Amostra
Amostras
coletadas
com haste
Leses de
pele
Fluido vesicular ou
exsudato
da base da
vescula
Amostras de
mucosa sem
leso
Bipsias
Esfregao
da crnea/
conjuntiva
Recmnascidos
Desvantagens
Permite vrus
Menos sen Classicamente,
svel que o
mtodo paPCR
dro ouro
As condies
Atualmente, o
de armazeteste preferido
namento e
(2)
transporte
Simplicidade
da amostra
na coleta de
influenciam
amostras
a sensibili Determinao
dade (transdo tipo
porte rpido,
Teste de
refrigerado e
resistncia
em meio de
fenotpicaa
transporte
viral protegido da luz)
Trabalhoso
Caro
Laboratrios
especializados
Resultados
em 2-7 dias
Necessidade
de convnio
com laboratrio
111
Princpio
Biologia
Deteco
molecular do DNA de
HSV e/ou
quantificao
por NAAT,
incluindo a
clssica PCR
in-house,
PCR em
tempo real
e ensaios
comerciais
Amostra
Sensibilidade
Especificidade Vantagens
Desvantagens
Amostras
coletadas
com haste
Leses de
pele
Fluido vesicular ou
exsudato
da base da
vescula
Amostras
de mucosa
sem leso
Humor
aquoso/
vtreo
Lquido
crticoespinhal
Sangue
A mais alta
(98%)
Alta (~100%)
O controle
de possveis
contaminaes
cruzadas
importante
Somente em
laboratrios
especializados
No padronizado
No validado para
todos os
tipos de
amostras
Risco de
contaminao (PCR)
Pode ser
relativamente caro
(PCR em
tempo real)
Genotipagem de
resistncia
de rotina no
disponvel
Alta sensibilidade
Atualmente, o
teste preferido
(2)
Permite a deteco viral e a
determinao do
tipo no mesmo
teste
Rpido
Pode ser automatizado
Eficiente em termos de trabalho
Resultados em
24-48 horas,
possivelmente
em <3 horas
Genotipagem de
resistncia
Mtodo de escolha para LCR
PCR em tempo
real:
Amplificao
rpida
Anlise
quantitativa
Risco de
contaminao
reduzido
Mtodo de
escolha para
leses na
pele
LCR: lquido cefalorraquidiano; ELISA: ensaio imunossorvente ligado enzima; HSV: vrus do herpes simples; NAAT: teste de amplificao de cidos
nucleicos; PCR: reao em cadeia da polimerase.
a
A deteco de mutaes de resistncia codificando resistncia a drogas anti-herpes (aciclovir) por meio da genotipagem de resistncia a drogas
do HSV provavelmente substituir o teste fenotpico em poucos anos.
112
Figura 9.2
Imunofluorescncia intracelular de HSV em
espcime clnico (400x).
113
Figura 9.3
Isolamento do vrus do herpes em cultura de clulas (50x). esquerda, monocamada difusa de fibroblastos
humanos diploides MRC-5 no infectados; direita, efeito citoptico tpico de HSV em clulas MRC-5 obtidas
aps 24-48 horas de cultura viral.
114
115
116
117
Tabela 9.4: Abordagens virolgicas e sorolgicas para o diagnstico de HSV-2 na presena e ausncia de
leses genitais, adaptado de Gupta e colaboradores (9)
Primeira avaliao
das leses
genitais
Sem leses
Leses genitais
recorrentes
Deteco de
IgG especfica
HSV-2 por
para HSV-1
mtodo direto
IgG
especfica
para HSV-2
Interpretao
Positivo
Positivo ou
negativo
Negativo
Positivo
Positivo ou
negativo
Positivo
NA
Negativo
Negativo
NA
Positivo
Negativo
NA
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo ou
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Positivo
NA: no se aplica.
118
9.8 Referncias
1. Domeika M et al. Guidelines for the laboratory
diagnosis of genital herpes in eastern European
countries. Eurosurveillance, 2010, 15(44):pii:19703.
119
120
Captulo 10
Sfilis
10.1 Introduo
A sfilis uma doena sexualmente transmissvel
crnica, caracterizada por manifestaes pontuais e
longos perodos de quiescncia. Ela causada pelo
Treponema pallidum subsp. pallidum, um organismo
espiralado e delicado, intimamente relacionado com
os organismos causadores das treponematoses no
venreas, denominados T. pallidum subsp. pertenue
(bouba), T. pallidum subsp. endemicum (sfilis endmica)
e T. carateum (pinta). Esses quatro patgenos so
morfolgica e antigenicamente idnticos. Eles s podem
ser diferenciados entre si pelo modo de transmisso,
epidemiologia, manifestaes clnicas e, mais
recentemente, por sequenciamento gentico (1).
A sfilis venrea normalmente transmitida como
resultado do contato sexual com uma leso infecciosa
da membrana mucosa ou pele desgastada ou por meio
da placenta de uma gestante para o feto. A multiplicao
bacteriana ocorre preferencialmente no momento da
inoculao, resultando na formao da ulcerao genital
primria, seguida de um perodo de incubao de 9-90
dias. Entretanto, a sfilis deve ser considerada uma
doena sistmica, uma vez que a bactria causadora
entra na corrente sangunea logo aps a infeco.
Muitos anos at
por toda a vida
Infeco
6 semanas a
6 meses
Primria
(cancro)
Perodo de incubao
9-90 dias
Secundria
(erupes)
(Sfilis meningovascular)
1 ano
Sfilis precoce
Sfilis latente
(sem sinal da doena)
Terciria
Figura 10.1
Representao esquemtica do curso da sfilis no tratada
Sfilis
121
122
Sfilis
123
Figura 10.2
Treponema pallidum, microscopia de campo escuro.
Fonte: cortesia de David Cox, Centros de Controle e
Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.
124
Figura 10.3
Teste de imunofluorescncia direta positivo para T.
pallidum.
Fonte: cortesia de David Cox, Centros de Controle e
Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.
Sfilis
125
126
0,5mL
Na2HPO4, andrico
0,037g
KH2PO4
0,170g
NaCl
10,00g
gua destilada
1000,0mL
Sfilis precoce
Primria
Sfilis tardia
Secundria
Latente precoce
Latente tardia
Terciria
Normalmente
positivo
Normalmente
positivo mas
tornando-se
negativo
Permanece
positivo
Resultado sem
alterao
No tratado
Negativo
tornando-se
positivo
Sempre positivo
Normalmente
positivo
Tratado com
sucesso
Tornando-se
negativo
Tornando-se
negativo
Tornando-se
negativo
Figura 10.4
Reatividade dos testes sorolgicos no treponmicos durante o curso da sfilis no tratada (quadrados) e resposta
dos testes acompanhando uma terapia bem sucedida (crculos), por estgio da doena.
Sfilis
127
9.
4. Acetona.
6. Parafina.
2.
3.
128
1.
2.
3.
4.
4.
5.
6.
7.
8.
1.
1.
2.
3.
4.
5.
2.
3.
4.
5.
2.
Leitura
Registro
Aglomerados mdios
ou grandes
Reativo (R)
Aglomerados
pequenos
Sem aglomerados
ou rugosidade muito
discreta
No reativo (N)
Sfilis
129
(A)
1.
2.
4.
5.
7.
8.
3.
6.
9.
Figura 10.5
Procedimentos para a realizao (A) e interpretao (B) do teste de reagina plasmtica rpida (RPR)
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.
130
(B)
Resultados qualitativos:
Reativo
(Aglomerao/
surgimento de
aglutinao).
Minimamente reativo
(Leve aglomerao/
aglutinao)
No reativo
(Padro cinza suave)
Todas as amostras
reativas devem ser
testadas por RPR
quantitativa para obter
um nvel de titulao.
1.
1. Rotule um carto de teste com a
identificao (ID) das amostras e as
diluies em duas vezes seriadas. Cada
amostra ser testada sem estar diluda
(1:1) e diluda (1:2, 1:4, etc.).
2.
2. Adicione 50L de soluo salina a 0,9%
em cada crculo que conter a amostra
diluda ou o controle. NO adicione
soluo salina no primeiro crculo para
cada amostra (poo 1:1).
3.
3. Adicione 50L de amostra no primeiro
(1:1) e segundo (1:2) crculos.
Resultados quantitativos:
Sfilis
131
Sfilis precoce
Primria
Sfilis tardia
Secundria
Latente precoce
Latente tardia
No tratado
Negativo
tornando-se
positivo
Sempre
positivo
Sempre
positivo
Sempre
positivo
Tratado com
sucesso
Permanece
positivo (se
inicialmente
positivo)
Permanece
positivo
Permanece
positivo
Permanece
positivo
Terciria
Normalmente
positivo,
tornando-se
eventualmente
negativo
Resultado sem
alterao
Figura 10.6
Reatividade dos testes sorolgicos treponmicos durante o curso da sfilis no tratada (quadrados) e resposta dos
testes acompanhando uma terapia bem-sucedida (crculos), por estgio da doena.
132
Figura 10.7
Teste FTA-Abs positivo mostrando espiroquetas T.
pallidum fluorescentes.
Fonte: adaptado de Larsen et al., 1998 (3)
Reagentes:
1.
1.
2.
2.
7,65g
Na2HPO4
0,724
KH2PO4
0,21g
H2O destilada
1000mL
3.
4.
3.
Equipamentos:
1.
Estufa, 35-37C.
2.
3.
Centrfuga.
4.
5.
6.
6.
7.
5.
Papel absorvente.
8.
9.
Acetona.
Sfilis
133
2.
3.
4.
5.
6.
2.
3.
Soluo absorvente
Reidrate a soluo absorvente com gua destilada estril
ou de acordo com as instrues do fabricante. Armazene
a soluo absorvente reidratada a 2-8C ou a -20C.
Ela pode ser utilizada enquanto apresentar reatividade
aceitvel e o produto no estiver contaminado.
134
f.
Procedimento do teste
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Sfilis
135
136
(A)
Verifique o kit antes de utiliz-lo. Coloque todos os espcimes e reagentes em temperatura ambiente. Anote o nmero do
lote e a data de validade.
Sempre use as medidas universais de segurana quando estiver manipulando espcimes.
Tempo de execuo: aproximadamente uma hora. O nmero mximo de espcime/placa de 21.
Este guia no tem a inteno de substituir o manual do produto ou seu procedimento operacional padro (POP).
Figura 10.8
Procedimentos de execuo (A) e interpretao dos resultados (B) do ensaio de aglutinao passiva de partculas
para Treponema pallidum (TPPA).
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.
Sfilis
137
(B)
O controle positivo
ocupa toda a
primeira fileira.
O controle
negativo ocupa
quatro poos
consecutivos.
Cada espcime
ocupa quatro
poos
consecutivos.
Adicione
partculas
sensibilizadas.
Adicione
partculas no
sensibilizadas.
Interpretao
Clulas-teste
Clulas-controle
Positivo
Padro de organizao
Anel grande definido com uma margem externa
irregular multiforme e aglutinao perifrica, ou
partculas aglutinadas espalhadas, cobrindo
uniformemente o fundo do poo.
As partculas se concentram no formato de um
boto no centro do poo, com uma margem
externa suave e arredondada.
Negativo
As partculas se concentram no formato de um
anel compacto, com uma margem externa suave
e arredondada.
Inespecfico
O uso de nome e recursos comerciais apenas para a identificao e no implica apoio pela OMS.
138
Cont
Figura 10.9
Deteco de anticorpos para Treponema pallidum por western blot (WB).
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.
Sfilis
139
140
(A)
Este guia no tem a inteno de substituir o manual do produto ou seu procedimento operacional padro (POP).
Figura 10.10
Procedimentos de execuo (A) e interpretao dos resultados (B) de um teste rpido treponmico de fluxo lateral.
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.
A sororreverso dos testes no treponmicos em
pacientes devidamente tratados ocorre normalmente
dentro de um perodo de seis meses a alguns anos
e est associada durao da infeco e titulao
de anticorpos no soro no momento da terapia (28).
Entretanto, em alguns indivduos, principalmente
naqueles que receberam tratamento 1-2 anos aps
o incio da infeco, os anticorpos no treponmicos
podem persistir por longos perodos, mesmo aps o uso
de terapia adequada. Esses indivduos so conhecidos
como soro-rpidos. A sororreverso de testes
treponmicos pode ocorrer tambm em uma minoria dos
pacientes em poucos anos.
Sfilis
141
(B)
Positivo
Negativo
Invlido
Invlido
Nenhuma linha aparece na rea de controle e aparece uma linha na rea do paciente.
No registre resultados invlidos. Repita o teste com um novo dispositivo de teste.
Tabela 10.1 Caractersticas de desempenho de testes sorolgicos para sfilis selecionados, por estgio da
doena
Sensibilidade (%)
Estgio da infeco por sfilis
Teste
Primria
Secundria
Latente
Terciria
Especificidade (%)
FTA-Abs
98 (93-100)
100
100
96
99
TPHA/PA
82 (69-90)
100
100
94
99
RPR
86 (81-100)
100
80 (53-100)
73 (36-96)
98
VDRL
80 (74-87)
100
80 (71-100)
71 (37-94)
98
FTA-Abs: absoro do anticorpo treponmico fluorescente; TPHA: ensaio de hemaglutinao para Treponema pallidum; TPPA: ensaio de
aglutinao passiva de partculas para Treponema pallidum; RPR: reagina plasmtica rpida; VDRL: Laboratrio de Pesquisa de Doenas Venreas.
142
No reativo
Somente a linha do
controle
Reativo confirmado
3 linhas
Reativo (2 linhas)
Treponmico e controle
(caso antigo ou tratado)
Reativo (2 linhas)
No treponmico e controle
(falso-positivo)
Figura 10.11
Teste point-of-care (POC) duplo, no treponmico/treponmico, indicando os padres de reatividade e as
possveis interpretaes.
no ligados, adiciona-se o substrato enzimtico e os
indicadores cromognicos. Se o soro contm anticorpos
IgM especficos para T. pallidum, ocorrer uma reao
colorida, com a intensidade de cor proporcional
concentrao de anticorpos presentes.
10.5 Neurossfilis
Anormalidades no LCR so comuns em pacientes
com sfilis precoce que no apresentam sintomas
neurolgicos. Enquanto uma grande proporo desses
Sfilis
143
10.7 Referncias
1.
2.
3.
4.
5.
6.
144
8.
9.
Sfilis
145
Captulo 11
Linfogranuloma venreo (LGV)
11.1 Introduo
O linfogranuloma venreo (LGV) uma das trs doenas
sexualmente transmissveis tropicais clssicas. Ele
causado pela biovariante tpica L de Chlamydia
trachomatis, a qual apresenta as sorovariantes (L1, L2,
L2a, L2b e L3), mais invasivas do que as responsveis
pela infeco clssica nos olhos por tracoma
(sorovariantes A-C) e por uretrite no gonoccica, e
por infeces associadas ao trato genital (sorotipos
D-K). O LGV apresenta uma distribuio mundial,
sendo, porm, mais prevalente em pases tropicais e
subtropicais; por exemplo, endmico em partes do
Leste e do Oeste da frica, ndia, Sudeste da sia,
Amrica do Sul e Caribe. Na maioria dos casos, essas
observaes epidemiolgicas so relacionadas
apresentao clnica clssica de LGV, que se caracteriza
por uma linfadenopatia inguinal, com ou sem leso
primria associada (1). Esses sintomas so mais
comumente referidos em homens que em mulheres.
Em 2003, foram relatadas infeces retais por LGV,
com comprometimento caracterstico do linfonodo e/ou
proctite ou proctocolite, em homens que fazem sexo com
homens (HSH) na Holanda (2). Relatos subsequentes
foram realizados em muitos outros pases europeus,
alm da Amrica do Norte, Austrlia e outros, nos quais
anteriormente se registraram apenas casos espordicos
e importados de LGV (3-5). O nmero de C. trachomatis
no reto pertencentes ou no s biovariantes do LGV
continua desconhecido, devido carncia de triagem e
ao uso disseminado de um teste discriminatrio.
Classicamente, o LGV apresenta uma leso primria
transitria herpetiforme na genitlia externa; porm,
em muitos casos, a leso pode passar despercebida,
manifestar-se como uma uretrite no gonoccica aguda
em homens ou ser completamente assintomtica em
mulheres, como resultado da infeco primria do colo
do tero. Muitos casos necessitam de ateno mdica
quando ocorre infeco dos gnglios linfticos regionais,
como resultado da disperso linftica do organismo
causador. Em homens, o inchao das glndulas inguinais
147
11.3 Referncias
1. Mabey D, Peeling RW. Lymphogranuloma venereum.
Sexually Transmitted Diseases, 2002, 78(2):9092.
2. Nieuwenhuis RF et al. Resurgence of
lymphogranuloma venereum in Western Europe:
an outbreak of Chlamydia trachomatis serovar L2
proctitis in The Netherlands among men who have
sex with men. Clinical Infectious Diseases, 2004,
39(7):9961003.
148
Diagnstico laboratorial do diagnstico de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Captulo 12
Cancro mole
12.1 Introduo
O cancro mole causado pela bactria Haemophilus
ducreyi, sendo transmitido exclusivamente por contato
sexual, com a invaso direta do organismo pela pele
saudvel ou desgastada. A doena , aproximadamente,
sete vezes mais comum em homens que em mulheres
e sua transmisso est associada ao nmero elevado
de parceiros sexuais. O cancro mole produz lceras
na genitlia, tipicamente no sulco coronal peniano,
em homens, e na vulva, em mulheres. O cancro mole
perianal pode ocorrer em homens que fazem sexo com
homens com comportamento receptivo e, tambm, em
mulheres que tiveram relaes sexuais com penetrao
anal. O cancro mole pode estar associado linfadenite
inguinal supurativa, principalmente se houve um atraso
na procura pelo servio de sade ou na realizao de
um diagnstico correto. Raramente, o cancro mole pode
ser adquirido no laboratrio por meio de uma inoculao
acidental de H. ducreyi por via digital.
O tempo de inoculao , normalmente, de 4-10 dias.
A lcera genital comea como uma ppula tenra, que
se torna pustulosa e ulcera em dois dias. A lcera
dolorida, irregular, com extremidades no definidas
e, normalmente, no endurecida. Essas so as
caractersticas clssicas que diferenciam o cancro
mole das lceras sifilticas. Entretanto, importante
destacar que a sensibilidade do diagnstico baseado
simplesmente no surgimento clnico de ulceraes
baixa. A base da lcera encontra-se frequentemente
coberta por uma secreo purulenta e necrtica,
sangrando facilmente quando raspada ou limpada.
comum haver mltiplas leses, que podem se fundir
e formar lceras grandes. Tambm costuma ocorrer
adenite inguinal dolorosa unilateral; caso esta no
seja pronta e adequadamente tratada, pode levar
ruptura espontnea dos linfonodos supurados (nguas).
Apresentaes atpicas de cancro mole so comuns
e a doena pode ser facilmente confundida com
outras lceras genitais (UG) de etiologia sexualmente
transmissvel, principalmente o herpes genital. Algumas
Cancro mole
149
150
Figura 12.1
Crescimento de H. ducreyi em placa de gar chocolate GC enriquecido.
Figura 12.2
Aglomerados de H. ducreyi em um meio baseado em carvo.
de gua, contendo 5% de dixido de carbono, ou,
preferencialmente, em condies microaeroflicas.
Incube as culturas por 48 horas antes da anlise inicial
e as mantenha por cinco dias antes de defini-las como
negativas. As colnias de H. ducreyi podem variar de
tamanho, dependendo do tempo e da temperatura de
incubao, da atmosfera e do meio de crescimento.
As colnias so no mucoides, elevadas, granulares,
apresentam uma cor amarela acinzentada e so
Cancro mole
151
152
12.7 Microscopia
O exame direto de material clnico em esfregaos com
colorao de Gram pode, ocasionalmente, ser til
para o diagnstico de cancro mole, caso se visualizem
bacilos Gram-negativos pequenos tpicos, agrupados em
correntes dos tipos cardume de peixes, vias frreas
ou impresses digitais. Entretanto, essas aparncias
morfolgicas clssicas so raramente visualizadas
na prtica clnica. Alm disso, a maioria das lceras
genitais abriga uma microbiota polimicrobiana devido
contaminao secundria. A presena de bacilos Gramnegativos em um esfregao, dessa forma, pode ser
mal interpretada e contribuir para o fraco desempenho
da microscopia como uma ferramenta de diagnstico.
Consequentemente, devido sua baixa sensibilidade e
especificidade, os esfregaos com colorao de Gram
no so recomendados para o diagnstico de cancro
mole.
12.9 Sorologia
Atualmente, os testes sorolgicos para a deteco
de anticorpos contra H. ducreyi no esto disponveis
comercialmente. As respostas sorolgicas de humanos
e coelhos para infeces por H. ducreyi foram
detectadas mediante uma srie de tecnologias, a
exemplo de imunoensaios enzimticos, precipitao,
Cancro mole
153
154
12.13 Referncias
1. Lewis DA. Diagnostic tests for chancroid. Sexually
Transmitted Infections, 2000, 76(2):137141.
2. Dangor Y, Radebe F, Ballard RC. Transport media
for Haemophilus ducreyi. Sexually Transmitted
Diseases, 1993, 20(1):59.
3. Morse SA et al. Comparison of clinical diagnosis
and standard laboratory and molecular methods for
the diagnosis of genital ulcer disease in Lesotho:
association with human immunodeficiency virus
infection. Journal of Infectious Diseases, 1997,
175(3):583589.
4. Hammond GW et al. Comparison of specimen
collection and laboratory techniques for isolation
of Haemophilus ducreyi. Journal of Clinical
Microbiology, 1978, 7(1):3943.
5. Morse SA. Chancroid and Haemophilus ducreyi.
Clinical Microbiology Reviews, 1989, 2(2):137157.
6. Nsanze H et al. Comparison of media for the
primary isolation of Haemophilus ducreyi. Sexually
Transmitted Diseases, 1984, 11(1):69.
7. Lockett AE et al. Serum-free media for isolation
of Haemophilus ducreyi. The Lancet, 1991,
338(8762):326.
8. Orle KA et al. Simultaneous PCR detection of
Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum, and
herpes simplex virus types 1 and 2 from genital
ulcers. Journal of Clinical Microbiology, 1996,
34(1):4954.
Cancro mole
155
156
Captulo 13
Donovanose (granuloma
inguinal)
13.1 Introduo
A donovanose, tambm conhecida como granuloma
inguinal, uma infeco crnica envolvendo a pele, as
membranas mucosas e o sistema linftico da genitlia
e rea perianal (1). A ocorrncia de donovanose
geograficamente limitada, por exemplo, ao Brasil,
Caribe, ndia, Papua-Nova Guin e ao sul da frica.
Essa doena, que apresenta baixa infecciosidade,
transmitida entre humanos principalmente por contato
sexual. O tempo de incubao pode ser prolongado,
variando entre 1-12 semanas. A doena comea
como um ndulo subcutneo endurecido, que corri
a pele para formar uma lcera vermelha, hipertrfica
e granulomatosa, com a borda bem definida. A leso
sangra facilmente com o contato. A lcera progride
devagar e pode se tornar dolorosa caso se desenvolva
uma infeco bacteriana secundria. Tal infeco com
outros organismos pode contribuir para a formao de
detritos necrticos na lcera. Novas leses costumam
formar-se por autoinoculao e os linfonodos inguinais
aumentam de tamanho, como resultado de infeco
secundria (pseudonguas). A donovanose pode se
espalhar hematogenicamente para os ossos, juntas e
fgado. Por vezes a disseminao tambm resulta em
leses cutneas em locais extragenitais. Leses genitais
e perianais em vrios estgios podem lembrar leses
formadas por outras condies, como sfilis, cancro
mole, carcinoma e amebase.
A donovanose causada pelas Klebsiella (anteriormente
chamada Calymmatobacterium) granulomatis, bactrias
Gram-negativas (1,5 x 0,7m) que podem ser observadas
no interior de vacolos em grandes clulas histiocticas,
onde so denominadas corpos de Donovan (1,2).
13.4 Microscopia
Foi descrito um mtodo simples e rpido (1 minuto)
de microscopia usando colorao de Giemsa (4). Com
esse mtodo de colorao, a lmina mergulhada
cinco vezes em um fixador, seis vezes em uma soluo
de eosina, seis vezes em uma mistura de corante
tiazdico e, ento, lavada com tampo fosfato, pH 6,8.
Os corantes de Giemsa a 10% ou de Leishman, diludo
de forma semelhante, tambm podem ser empregados
como alternativa, seguidos da fixao do material na
lmina com metanol por 2-3 minutos. Cubra a lmina
com o corante diludo por 10 minutos (corante de
Leishman) ou por at 30 minutos (corante de Giemsa)
e, ento, lave a lmina em um fluxo de gua tamponada
corrente ou de soluo salina de tampo fosfato (pH
7,0-7,2). Em seguida, deixe a lmina secar ao ar livre e,
ento, examine-a em um microscpio de luz, utilizando
leo de imerso (aumento de 1000x). Os corpos de
157
13.5 Histopatologia
O exame histopatolgico de uma bipsia pode ser til
no diagnstico diferencial entre donovanose e outras
condies. Uma lcera com um infiltrado inflamatrio
mesclado de clulas plasmticas, neutrfilos e
histicitos, com ausncia notvel de linfcitos,
sugestiva de donovanose. Retire um pedao de tecido
(3-5mm de espessura) da borda da leso com uma pina
perfuradora para bipsia e coloque-o em um recipiente
com soluo salina-formaldedo fixadora. O diagnstico
pode ser realizado por meio da identificao de corpos
de Donovan, utilizando o reagente de impregnao de
prata de Warthin-Starry (6). As bipsias parafinadas
devem ser cortadas em seces de 6m. Aps a
desparafinizao e hidratao com gua destilada, fixe
as seces em uma lmina de vidro com glicerol, seque
e trate com soluo cida de nitrato de prata a 43C,
por 30 minutos. Lave com gua quente, enxague em
gua destilada, desidrate em etanol 95% e clarifique em
xileno.
13.6 Cultura
Aps um relatrio descrevendo a cultura de K.
granulomatis a partir de fezes, em 1962, mostrou-se,
subsequentemente, ser muito difcil a cultura do
organismo com base em espcimes clnicos (1, 7 ).
Em 1997, dois grupos reportaram a multiplicao
bem-sucedida de K. granulomatis utilizando diferentes
sistemas de cultura, isto , um sistema de cocultura
de moncitos e uma tcnica modificada de cultura
de clamdia (8, 9). Com exceo dessas publicaes
158
Figura 13.1
Esfregao com colorao de Giemsa de material de
lcera, contendo moncitos de corpos de Donovan
(1000x).
13.9 Referncias
1. OFarrell N. Donovanosis. Sexually Transmitted
Infections, 2002, 78(6):452457.
2. Carter JS et al. Phylogenetic evidence for
reclassification of Calymmatobacterium
granulomatis as Klebsiella granulomatis comb nov.
International Journal of Systematic Bacteriology,
1999, 49(Pt4):16951700.
3. Carter JS et al. Diagnostic polymerase chain
reaction for donovanosis. Clinical Infectious
Diseases, 1999, 28(5):11681169.
159
160
Captulo 14
Infeces pelo papilomavrus
humano (HPV)
14.1 Papilomavrus humano (HPV)
Os HPV so vrus pequenos (~55nm de dimetro),
icosadricos, no envelopados, com um genoma de DNA
de fita dupla circular e enrolado de, aproximadamente,
8kb (Figura 14.1). Esses vrus infectam, tipicamente,
a pele e superfcies mucosas de humanos (1). Ao
contrrio da maioria dos vrus que infectam pessoas,
os papilomavrus no podem se propagar por meio
de cultura in vitro convencional. Dessa forma, no se
pode utilizar uma classificao clssica antignica
e de sorotipo para a determinao do tipo viral. Em
vez disso, utiliza-se uma abordagem de genotipagem
para a identificao e classificao desses vrus. Os
HPV individuais so identificados quanto ao tipo e ao
gentipo, distinguidos de acordo com sua sequncia
genmica e enumerados na ordem em que so
descobertos. O gene L1, que codifica o principal
componente do capsdeo viral (Figura 14.2), a regio
mais conservada entre os tipos individuais, sendo
utilizada pela taxonomia para a construo de rvores
filogenticas (Figura 14.3) (2). Os HPV com divergncia
de 2-10% na sequncia de L1 so conhecidos como
subtipos, e aqueles com menos de 2%, como variantes.
E6
E7
MY09
MY11
E1
L1
HPV
L2
E4
E2
E5
Figura 14.1
Microscopia eletrnica de HPV mostrando as
partculas virais nas clulas selecionadas de um
esfregao de Papanicolau (Pap).
Fonte: cortesia de Colin Laverty, Sydney, NSM,
Australia, 1978.
Figura 14.2
Organizao gentica dos HPVs(48).
URR: regio reguladora proximal (do ingls upstream
regulatory region)
Fonte: reproduzido com permisso da Organizao
Mundial da Sade (OMS).
Infeces pelo papilomavrus humano (HPV)
161
Figura 14.3
rvore filogentica contendo as sequncias de L1 de 118 tipos de papilomavrus (2).
Fonte: reproduzido com permisso da Virology.
162
163
Local
Colo do tero
Destes, so
positivos
Atribuveis para o HPV 16
ao HPV (%) e/ou 18 (%)
Ambos os sexos
Total de
cnceres
Atribuveis
ao HPV
% de
todos os
cnceres
Atribuveis
ao HPV
16/18
% de
todos os
cnceres
100
70
492.800
492.800
4,54
344.900
3,18
Pnis
40
63
26.300
10.500
0,10
6.600
0,06
Vulva, vagina
40
80
40.000
16.000
0,15
12.800
0,12
nus
90
92
30.400
27.300
0,25
25.100
0,23
Boca
95
274.300
8.200
0,08
7.800
0,07
12
89
52.100
6.200
0,06
5.500
0,05
10.862.500
561.100
5,17
402.900
3,71
Orofaringe
Todos os locais
Fonte: adaptado de Parkin DM. The global burden of infection-associated cancers in the year 2002. International Journal of Cancer, 2006, 118: 3030-3044.
164
Normal
ASCUS/limtrofe
LSIL
HSIL
Coilcito
Figura 14.4
Citologia de Papanicolau (Pap) de clulas esfoliadas normais, coilocitose tpica, mas no patognica, da
infeco por HPV, clulas escamosas atpicas de significncia indeterminada, mudanas celulares LSIL e HSIL.
WNL, 200x
NIC1, 200x
NIC2, 200x
NIC3, 200x
Figura 14.5
p16 no expressa em tecidos normais (WNL) e
progressivamente expressa com anormalidades
crescentes (NIC1 a NIC3).
Fonte: reproduzido com permisso de Magnus von
Knebel Doeberitz, Departamento de Biologia aplicada a
tumor, Instituto de Patologia, Universidade de Heidelberg,
Heidelberg, Alemanha.
representando a expresso ativa de oncogenes do
HPV (40) (Figura 14.5). Alm disso, em combinao
com a expresso aumentada de outros fatores do
hospedeiro, tais como o Ki67, a expresso em excesso
de p16 est altamente relacionada com infeces virais
transformadoras (Figura 14.6) (41).
165
HSIL persistente
HSIL regressivo
Progresso do HSIL
% de ncleos positivos para p53 na
metade profunda do epitlio
Regresso
Persistncia
Figura 14.6
Vrios marcadores de fatores de risco viral e do hospedeiro com HSIL. Centro: Grfico de disperso da
deteco da protena do retinoblastoma (pRb) e p53 na metade inferior do epitlio de leses HSIL que
persistem (tringulos vermelhos) ou regridem (crculos azuis abertos) durante o acompanhamento. Esquerda:
HSIL persistente. Direita: HSIL com regresso (41).
Fonte: reproduzido com permisso da American Journal of Surgical Pathology.
166
Fabricante
Mtodo
Tipos (alvo)
Amplificao de sinal
HR 13 (DNA genmico)
Cervista HPV HR
HPV16/18
APTIMA HPV
Amplificao do alvo (ampliGenProbe (So Diego, CA, EUA) ficao mediada por transcrio)
HR 14 (RNA de E6/E7)
Cobas HPV
HR 14 (DNA de L1)
FDA: Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados Unidos da Amrica; HPV: papilomavrus humano; HR: tipos de alto risco; PCR: reao em
cadeia da polimerase.
Pr-anlise
So essenciais a utilizao dos espcimes adequados
e o manuseio apropriado de amostras clnicas para
a obteno de resultados precisos. Para a deteco
de HPV, as amostras adequadas incluem aquelas
coletadas por hastes, raspagem e bipsia de tecidos.
O manuseio apropriado das hastes inclui o transporte
seco ou em um meio de transporte para vrus, enquanto
que as raspagens e bipsias so coletadas em meio
de transporte viral. O transporte deve ser realizado
em temperatura ambiente em 24 horas ou em at
quatro dias a 4C. Os ensaios com a aprovao da FDA
especificam os mtodos de coleta e armazenamento, e
os resultados no devem ser considerados vlidos caso
haja irregularidades na coleta e armazenamento.
167
Anlise
Aps a coleta do espcime, deve-se proceder extrao
ou liberao do cido nucleico das amostras. Os
ensaios aprovados pela FDA especificam os mtodos
de processamento ou extrao para cada ensaio. Os
resultados no so considerados vlidos se houver
modificaes na realizao do processamento ou
extrao. O uso de ensaios comerciais no isenta os
laboratrios da necessidade de manter mtodos de
garantia de qualidade (GQ) e controle de qualidade (CQ)
vigentes. A incluso de cepas celulares como controles
negativos e positivos pode ser til para o monitoramento
dos resultados. O processamento de gua em todos
os passos do ensaio particularmente crucial para o
monitoramento de resultados falso-positivos, que podem
ocorrer por meio da contaminao cruzada de amostras.
Alguns ensaios incluem um alvo endgeno da clula
hospedeira, tal como a -globulina, para monitorar a
presena de DNA passvel de amplificao. Amostras
negativas para o alvo endgeno e para o HPV no podem
ser interpretadas. Os ensaios aprovados clinicamente
incluem as diretrizes para o monitoramento e relato
de ensaios. Os ensaios desenvolvidos em laboratrios,
in-house, otimamente verificados, podem tambm ser
utilizados no diagnstico de rotina. Sempre que um ensaio
comercialmente aprovado estiver disponvel, as autoridades
de credenciamento devem recomendar sua utilizao.
Uma das vantagens desse procedimento que os ensaios
comerciais normalmente incluem reagentes com qualidade
controlada, assim como controles apropriados.
Epidemiologia/teste em pesquisa
Vrios ensaios comerciais e in-house so usados
na epidemiologia e pesquisa. Eles variam quanto s
caractersticas de desempenho, como ressaltado por
estudos de proficincia global para a determinao do
tipo de HPV (52). A Tabela 14.3 mostra exemplos de
168
Todos os ensaios
L1/E1/E6/E7
L1 (PGMY)
PGMY-RBH
L1 (PGMY)
InnoLiPA (Innogenetics)
L1 (SPF10)
CLART (Genomica)
L1 (PGMY)
L1
Microarray (Genetel)
L1
L1 (SPF10)
Microarray (Papillocheck)
E1
L1
L1 (PGMY-GP)
L1 (GP)
L1
L1
L1
E6/E7
E6/E7
Marcadores de progresso
Nem todas as mulheres com infeco persistente por
HPV HR, ou com NIC 3, progridem para cncer cervical,
caso no sejam tratadas. Dessa forma, esto sendo
investigados outros marcadores para atuar como
preditores de progresso, tais como o p16. Esses
marcadores de progresso, juntamente com a deteco
de HPV HR, prometem oferecer um diagnstico mais
preciso de displasias de alto grau (40, 41).
14.9 Concluses
Uma enorme quantidade de informaes sobre HPV e
doenas relacionadas tem sido disponibilizada, incluindo
muitas tecnologias novas para a deteco do HPV.
importante que se utilizem testes apropriados, seja para
aplicaes clnicas ou para propsitos epidemiolgicos.
Alm disso, para garantir uma melhor qualidade dos
resultados, os laboratrios que realizam esses ensaios
devem aderir s prticas de GQ e CQ.
169
Pontos principais:
Os HPV oncognicos so causas necessrias da maioria dos cnceres cervicais e de uma alta proporo de
outros cnceres anogenitais, incluindo alguns da orofaringe. Os HPV genitais so extremamente comuns;
aproximadamente 80% das pessoas sexualmente ativa so infectadas em algum momento de suas vidas.
A infeco persistente por HPV oncognico um pr-requisito para o desenvolvimento de leses precursoras e
neoplasia subsequente.
O cncer um desfecho raro dessa infeco genital, embora esta seja muito comum.
Os tipos 16 e 18 do HPV causam regularmente 70% dos cnceres cervicais em todo mundo.
A leso precursora para o cncer cervical a neoplasia intraepitelial cervical de grau 3 (NIC 3); os tipos 16 e
18 causam 50% desses casos.
A deteco do HPV baseia-se em tecnologia molecular, uma vez que o vrus no pode ser prontamente
cultivado pelos mtodos de diagnstico virais tradicionais, e a sorologia no sensvel. A triagem primria
de HPV est sendo incorporada triagem de cncer cervical em vrias combinaes com a citologia cervical
tradicional (teste de esfregao Pap).
Os ensaios utilizados clinicamente para a triagem de NIC3 ou cncer so diferentes daqueles utilizados em
estudos epidemiolgicos, tais como a vigilncia antes e aps a implementao de programas de vacinao.
Atualmente, no h indicaes clnicas para a testagem de HPV LR. Testes clnicos exigem uma padronizao
cuidadosa para a coleta, processamento e teste de amostras, com correlao aos desfechos clnicos (e no
analticos).
importante haver alta GC e CQ para a deteco de HPV. A LabNet de HPV da OMS, em colaborao com a
NIBSC, desenvolveu padres internacionais para o DNA de ambos os HPV 16 e 18 e de anticorpos para o HPV
16.
Para os ensaios de deteco de HPV, o cuidado na coleta de amostras clnicas e no transporte para o
laboratrio, assim como para o subsequente manuseio, imprescindvel para a preveno de contaminao e
ensaios falso-positivos.
A deteco de DNA do HPV um excelente preditor negativo (se o HPV HR no for detectado, improvvel
que a doena se manifeste), mas h muitos resultados falso-positivos na predio de doenas. Uma pesquisa
em andamento est investigando a utilidade de certos marcadores de progresso a fim de melhorar a
especificidade para desfechos clnicos importantes.
Com programas de sade adequados para a vacinao contra o HPV, o valor preditivo positivo da citologia
para detectar displasias em alto grau ir diminuir e, no futuro, ser provvel a utilizao de vrios mtodos
moleculares para a deteco do HPV.
170
14.10 Referncias
1. Stoler MH. Human papillomavirus biology and
cervical neoplasia: implications for diagnostic
criteria and testing. Archives of Pathology and
Laboratory Medicine, 2003, 127(8):935939.
2. de Villiers EM et al. Classification of
papillomaviruses. Virology, 2004, 324(1):1727.
3. Schiffman M et al. Classification of weakly
carcinogenic human papillomavirus types: addressing
the limits of epidemiology at the borderline. Infectious
Agents and Cancer, 2009, 4:18.
4. Van Ranst M, Kaplan JB, Burk RD. Phylogenetic
classification of human papillomaviruses:
correlation with clinical manifestations. Journal of
General Virology, 1992, 73(10):26532660.
5. Garland SM et al. Natural history of genital warts:
analysis of the placebo arm of 2 randomized phase
III trials of a quadrivalent human papillomavirus
(types 6, 11, 16, and 18) vaccine. Journal of
Infectious Diseases, 2009, 199(6):805814.
6. Grulich AE et al. Cancers attributable to human
papillomavirus infection. Sexual Health, 2010,
7(3):244252.
7. Bosch FX et al. Prevalence of human papillomavirus
in cervical cancer: a worldwide perspective.
International biological study on cervical cancer
(IBSCC) Study Group. Journal of the National
Cancer Institute, 1995, 87(11):796802.
8. Clifford GM et al. Human papillomavirus types
in invasive cervical cancer worldwide: a metaanalysis. British Journal of Cancer, 2003,
88(1):6373.
9. Muoz N et al. Epidemiologic classification of
human papillomavirus types associated with
cervical cancer. New England Journal of Medicine,
2003, 348(6):518527.
10. Wallboomers JM et al. Human papillomavirus is
a necessary cause of invasive cervical cancer
worldwide. Journal of Pathology, 1999, 189(1):1219.
171
31. Cuzick J et al. Overview of human papillomavirusbased and other novel options for cervical cancer
screening in developed and developing countries.
Vaccine, 2008, 26(Suppl 10):K29K41.
172
173
Captulo 15
Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV)
15.1 Introduo
Os primeiros casos da sndrome da imunodeficincia
adquirida (AIDS, do ingls acquired immunodeficiency
syndrome) foram descritos em 1981 e o vrus causador
da doena, o HIV, foi isolado pela primeira vez em 1983.
Desde ento, o vrus se espalhou pelo mundo, com uma
estimativa de 34 milhes de pessoas vivendo com HIV e
2,7 milhes de novas infeces s em 2010 (1). A frica
subsaariana foi a regio mais impactada, com 23,1
milhes de pessoas vivendo com HIV e uma estimativa de
1,9 milhes de novas infeces em 2010. A prevalncia
do HIV alcanou >30% entre adultos em alguns pases.
Apesar do desenvolvimento da terapia antirretroviral e da
expanso da cobertura do tratamento para muitos pases
com recursos limitados, estima-se que para cada pessoa
que inicia o tratamento haja 2-3 novas infeces por
HIV-1. Dessa forma, na ausncia de uma vacina efetiva, o
diagnstico de HIV acessvel, com aconselhamento para
preveno, e o encaminhamento de pessoas infectadas
por HIV para receber cuidados apropriados so estratgias
importantes para desacelerar a propagao da epidemia.
O HIV transmitido principalmente por meio de trocas de
fluidos corporais, que podem ocorrer por via sexual e por
sangue ou produtos sanguneos contaminados. Gestantes
infectadas por HIV tambm podem transmitir o vrus para
a criana durante a gravidez, parto (transmisso perinatal)
ou por meio da amamentao (transmisso ps-natal). A
transmisso do HIV tambm reportada em seguida ao
transplante de rgos, quando se descobre posteriormente
que o doador era HIV positivo. Atualmente, para garantir
a segurana, o sangue, os produtos sanguneos e os
doadores de rgos so testados rotineiramente para a
presena de HIV ou anticorpos para HIV, a fim de eliminar a
possibilidade de transmisso do vrus.
O HIV pertence famlia Retroviridae, subfamlia dos
lentivirus, da qual fazem parte vrus similares tais
como o vrus Maedi-Visna, o vrus da artrite encefalite
caprina, o vrus da anemia infecciosa equina e o vrus
da imunodeficincia em smios. O vrion apresenta,
aproximadamente, 100nm em dimetro, com um capsdeo
175
176
Glicoprotena
de ancoragem
Membrana
lipdica
gp41
Glicoprotena
transmembrana
Capsdeo
Matriz
Transcriptase
reversa
Figura 15.1
Estrutura e organizao da partcula viral do HIV
Anticorpo
para HIV
1 gerao
3 gerao
4 gerao
Infeco
indetectvel
Infeco
Aguda
2 gerao
Figura 15.2
Dinmica precoce da replicao viral e
desenvolvimento de anticorpos com marcadores da
infeco por HIV. Mostra-se o tempo aproximado
da deteco dos anticorpos pelos imunoensaios
enzimticos de primeira, segunda, terceira e quarta
geraes.
177
negativo
positivo
negativo
positivo
(A)
(B)
Figura 15.3
Exemplos de teste rpido para HIV, mostrando (A)
dispositivo de imunoconcentrao por fluxo e (B)
dispositivo de fluxo lateral. So mostrados testes
rpidos com resultados positivo e negativo.
Foram desenvolvidos vrios testes rpidos que utilizam
espcimes de fluido oral (FO) coletados por meio de
uma haste. O FO contm 1/500-1/1.000 vezes menos
IgG que os espcimes sanguneos, mas o suficiente
para diagnosticar a infeco por HIV. A maioria dos
anticorpos no FO transferida passivamente a partir
do sangue e no produzida localmente, e contm um
complemento total de IgG do soro, embora com uma
concentrao mais baixa. Os testes de FO podem
simplificar ainda mais o teste para HIV, tornando-os
mais acessveis, enquanto reduzem os riscos biolgicos
associados aos testes que utilizam amostras de
sangue. Atualmente, pelo menos trs kits de testes
rpidos orais esto disponveis comercialmente.
15.2.1.3 Ensaios confirmatrios
Embora os ensaios individuais listados acima sejam
muito sensveis e especficos, resultados falso-positivos
ou falso-negativos podem ocorrer. Os resultados falsopositivos podem ter consequncias maiores em nvel
individual. Dessa forma, ensaios confirmatrios foram
desenvolvidos para corroborar os resultados positivos
iniciais. Esses ensaios confirmatrios, baseados em
diferentes formatos e princpios, incluem os ensaios de
imunofluorescncia (IFA, do ingls immunofluorescence
assay), western blot (WB) ou imunoensaios em linha
(LIA, do ingls line immunoassay). Os IFA envolvem
o uso de lminas com fixao de clulas infectadas
178
Recente
Crnica
Figura 15.4
Ensaio de western blot confirmatrio e padro de
bandas de anticorpos que podem ser observados
durante infeces recentes (tiras 3-7) e infeces
crnicas (tiras 8-13). P, controle positivo; N, controle
negativo. Vrias protenas virais especficas so
mostradas prximas ao controle positivo.
179
180
Anti-CD4
Anti-CD3
com
com
marcao em marcao em
ouro
vermelho
Moncito
Clula B
Figura 15.5
Clulas sanguneas brancas com anticorpos anti-CD4 e anti-CD3 marcados.
181
10 0 101 10 2 10 3 10 4
CD45 PerCP
CD4 Cy5
R2
R1
10 0 101 10 2 10 3 10 4
800
0 200 400 600
Disperso lateral
1000
Moncito
Clulas T CD4
Clula B
Clulas T CD8
10 0 101 10 2 10 3 10 4
CD3 FITC
Figura 15.6
Exemplo de grficos de disperso de citmetro de
fluxo de um ensaio de CD4.
15.3.1.2 Plataformas de CD4 e estratgias
A contagem de CD4 era tradicionalmente determinada
utilizando uma tcnica de plataforma dupla com
um citmetro de fluxo, fornecendo a porcentagem
de clulas CD4 em uma populao de clulas
sanguneas brancas ou de linfcitos, e um analisador
de hematologia, fornecendo a contagem absoluta de
182
Instrumentos/
companhias
Ensaio
Princpios do ensaio
Sistemas de
rendimento alto
PLG CD4
FACSCount/BD
Bioscience
Guava PCA/
Millipore
Billerica, MA, EUA
Easy CD4,
Easy CD4%
Auto CD4/CD4%
Beckman Coulter
Invitrogen
Oslo, Noruega
Cyto-Spheres
Kit T4 Quant
Pima Analyzer/
Alere Technologies
Jena, Alemanha
Pima CD4
Sistemas de
rendimento mdio
a baixo
Sistemas manuais
POC
183
184
185
15.4 Referncias
1. UNAIDS world AIDS day report 2011. Genebra, Joint
United Nations Programme on HIV/AIDS, 2011.
186
187
188
Anexo 1
Microscopia e princpios de colorao
A1.1 Introduo
A microscopia para doenas sexualmente transmissveis
(DST) fornece um teste simples, rpido e de baixo custo,
que pode ser utilizado prximo ao paciente (1). Ela pode
ser sensvel e especfica, ideal para triagens e,
frequentemente, pode fornecer um diagnstico
presuntivo que orienta o tratamento, quebrando, dessa
forma, a cadeia de transmisso. A interpretao de
imagens microscpicas uma habilidade que requer
treinamento, incluindo um bom conhecimento
profissional do microscpio (1).
Ligue o microscpio
Abaixe a platina, coloque a lmina
Selecione a objetiva de 10x
Olhando para a platina, eleve-a (pensando na
distncia a ser trabalhada)
5. Ajuste a distncia intraocular e focalize o espcime
6. Feche o diafragma de campo e abra totalmente o
condensador
7. Mova o condensador para cima e para baixo at que
o canto fique ntido
8. Utilizando o charriot, centralize a imagem
9. Abra o diafragma de campo (tenha cuidado com a
intensidade da luz)
10. Reajuste a intensidade da luz para uma viso
confortvel
11. Feche lentamente o condensador at que a imagem
fique ntida e o brilho intenso desaparea
12. Reajuste a intensidade da luz, caso seja necessrio.
Definies-chave
Aumento - o nmero de vezes que o comprimento, a
largura ou o dimetro, mas no a rea, de um objeto so
multiplicados.
a. Aumento til quando a imagem ntida e os
pequenos detalhes so revelados, normalmente a um
mximo de 1.000x.
b. Aumento vazio quando a a nitidez da imagem se
perde e mais nenhum detalhe revelado.
Aumento = poder da ocular x poder da objetiva x poder
do canho. Normalmente, melhor utilizar um aumento
menor para ver claramente os detalhes do objeto e obter
um maior campo de viso.
189
Ajuste interpupilar
Ocular (lentes oculares)
Corpo
Revlver
Brao
Parafuso macromtrico
Condensador
Controle da abertura do diafragma
Base com fonte de luz
Nivelador do diafragma de campo
Parafuso micromtrico
Charriot
Figura A1.1
Componentes de um microscpio de transmisso de luz.
Fonte: reproduzido com permisso da Associao Britnica para Sade Sexual e HIV (BASHH, do ingls British
Association for Sexual Health and HIV).
- As lentes condensadoras podem estar sujas de
leo
- A lmina podia estar molhada antes de se
aplicar o leo
- leos de diferentes lotes podem ter se
misturado
- A lamnula pode ser muito espessa
- O material no est suficientemente espalhado
na lmina ou esta muito espessa
- No se utilizou o lado correto da lmina
190
Iluminao desigual
microscopia de fluorescncia:
devidamente alinhados;
191
transmitida
campo escuro
Figura A1.2
Comparao do caminho de luz entre um microscpio de
transmisso de luz e um microscpio de campo escuro.
Fonte: Reproduzido com permisso da Associao
Britnica para Sade Sexual e HIV (BASHH, do ingls
British Association for Sexual Health and HIV).
2. Abaixe o condensador e coloque uma gota de leo
no topo das lentes. Tome cuidado para evitar a
formao de bolhas.
3. Coloque a lmina na platina e suba o condensador
lentamente at que o leo toque a lmina. Um breve
feixe de luz ser visualizado. Tome cuidado para no
permitir a formao de bolhas.
4. Focalize o objeto com uma objetiva de menor poder
(10x). Se o condensador estiver focalizado de forma
correta, um pequeno ponto de luz iluminar o objeto
contra o fundo escuro. Se for visualizado um anel de
luz, o condensador precisa ser ajustado.
5. Com o auxlio do charriot, ajuste o condensador at
que o ponto de luz fique no meio do campo.
6. Coloque uma gota de leo na lamnula e focalize o
objeto com as lentes para leo de imerso. Caso se
utilize uma objetiva com diafragma de ris, pode ser
necessrio um pequeno ajuste. Se as objetivas no
estiverem centralizadas, talvez seja preciso
centralizar o condensador.
7. A microscopia de campo escuro melhor conduzida
em uma sala escura.
Os seguintes problemas podem ocorrer na microscopia
de campo escuro:
192
193
Peptideoglicano
Exterior
Espao
periplasmtico
Interior
Membrana celular
Figura A1.3A
Estrutura de uma parede celular Gram-positiva.
Fonte: reproduzido com permisso da Associao Britnica para Sade Sexual e HIV (BASHH, do ingls British
.
Association for Sexual Health and HIV).
Exterior
Lipdeo A
Porina
Lipoprotena
Espao periplasmtico
Fosfolipdeo
Peptideoglicano
Membrana celular
Interior
Figura A1.3B
Estrutura de uma parede celular Gram-negativa.
Fonte: reproduzido com permisso da Associao Britnica para Sade Sexual e HIV (BASHH, do ingls British Association
for Sexual Health and HIV).
194
Gram-negativa
Gram-positiva
Fixao
Cristal violeta
A1.10 Imunofluorescncia
O passo de descolorao o mais crucial na colorao
Gram e, quando feito em excesso ou insuficiente,
resultar na categorizao incorreta da bactria como
Gram-negativa ou Gram-positiva, respectivamente.
195
196
A1.12 Referncia
British Association for Sexual Health and HIV (BASHH).
Microscopy for Sexually Transmitted Infections (http://
www.bsig-resources.org.uk/).
Anexo 2
Princpios dos testes point-of-care rpidos
A2.1 Introduo
O Relatrio Mundial da Sade de 2004 menciona a
indisponibilidade e a inacessibilidade como os dois
principais motivos pelos quais os servios de sade
falham (1). Em pases com altos ndices de doenas
sexualmente transmissveis (DST), os servios
de laboratrio para DST ou no esto disponveis
ou, quando alguns servios esto disponveis, os
pacientes no conseguem acess-los fisicamente ou
pagar por eles. A OMS recomenda o uso da gesto
sindrmica, segundo a qual os pacientes so tratados
para todas as principais causas de uma sndrome em
particular (2). A gesto sindrmica de DST funciona
melhor para corrimento uretral, dor plvica e lcera
genital, mas as avaliaes dos fluxogramas da OMS
mostraram que o algoritmo para corrimento vaginal
carece tanto de sensibilidade como de especificidade
para a identificao de mulheres com infeces de
Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae.
Testes rpidos simples e acessveis podem ser
realizados no local de atendimento e permitem o
tratamento e o manejo de casos urgentes dessas
infeces. Os testes point-of-care (POC) simples
e rpidos so necessrios no s para aumentar
a especificidade da gesto sindrmica e reduzir
o tratamento em excesso para infeces genitais
gonoccicas e clamidiais, como tambm para realizar
a triagem de DST assintomticas (3, 4, 5 ). Um modelo
matemtico estimou que um teste para sfilis que
no requer infraestrutura laboratorial pode salvar
mais de 201.000 vidas e evitar 210.000 natimortos
por ano no mundo. Semelhante teste poderia poupar,
aproximadamente, 4 milhes de anos de vida por
incapacidade (AVAI), evitar mais de 16,5 milhes de
gonorreia incidente e infeces clamidiais e prevenir
mais de 212.000 infeces por HIV a cada ano (6).
197
198
Tabela A2.1: Diferenas entre dois tipos de testes rpidos, utilizando testes no treponmicos e testes
treponmicos rpidos como exemplos
Teste rpido
Exemplo: teste no treponmico de reagina
plasmtica rpida (RPR)
DST
Equipamento
Custo aproximado
em dlares (US$)
Microscopia:
Colorao de Gram
Neisseria gonorrhoeae
Microscpio
Eletricidade
$ 0,50
Vaginose bacteriana
pH
Amina (KOH)
Vaginose bacteriana
Vaginose bacteriana
Nenhum
Nenhum
Floculao:
RPR
VDRL
Sfilis
Eletricidade
para utilizar
centrfuga e
agitador
Microscpio
Nenhum
Neisseria gonorrhoeae
Chlamydia trachomatis
Trichomonas vaginalis
Sfilis
HIV
Vrus da herpes simples
Vaginose bacteriana
Nenhum
(Gardnerella spp.)
Neisseria gonorrhoeae Ensaios de PCR
Chlamydia trachomatis
em tempo real
ou ensaios de
amplificao
isotrmica
NAAT
Sensibilidade
de 95% para
infeces da
uretra em homens
sintomticos, mas
<50% em mulheres
Trichomonas vaginalis
Candidase
Vaginose bacteriana
Clulas de indicao
Pontuao Nugent
Deteco enzimtica
Comentrios
$ 3,00-6,00
$ 0,20
Resultado nem
sempre liberado no
mesmo dia, devido
ao processamento
em lote
$ 6,00-$20,00
$ 6,00-$20,00
$ 3,00-5,00
$ 0,50-3,00
$ 5,00-10,00
$ 35,00
$ 3,00-6,00
$ 15,00-35,00
Esses novos
ensaios moleculares
necessitam de muito
pouca interveno
do usurio e podem
fornecer resultados
em 15-100 minutos
VDRLHIV: vrus da imunodeficincia adquirida; KOH: hidrxido de potssio; NAAT: amplificao de cido nucleico; PCR: reao em cadeia da
polimerase; RPR: reagina plasmtica rpida; DST: doena sexualmente transmissvel; VDRL: teste do Laboratrio de Pesquisa de Doenas Venreas.
199
Figura A2.1
Teste de reagina plasmtica rpida (RPR).
Fonte: Van Dyck E, Meheus AZ, Piot P. Laboratory
diagnosis of sexually transmitted diseases. Genebra,
Organizao Mundial da Sade, 1999.
200
Amostra
Tira (membrana) absorvente
Linha controle
Linha teste
Membrana
Membrana impregnada
com conjugado
Figura A2.2A
Esquema para um teste de sfilis positivo em um formato imunocromatogrfico de fluxo lateral.
negativo
C T
positivo
C T
indeterminado
Figura A2.2B
Interpretao de um ensaio de fluxo lateral para a deteco de anticorpos treponmicos de um paciente com sfilis.
201
202
A2.5 Referncias
1. Devarajan S, Reinikka-Soininen R, World Bank.
Making services work for poor people: world
development report 2004. New York, Oxford
University Press for the World Bank, 2003.
2. Guidelines for the management of sexually
transmitted infections. Genebra, Organizao
Mundial da Sade, 2003.
3. Peeling RW et al. Why do we need qualityassured diagnostic tests for sexually transmitted
infections? Nature Reviews. Microbiology, 2006,
4(12):909921.
4. Peeling RW et al. Rapid tests for sexually transmitted
infections (STIs): the way forward. Sexually
Transmitted Infections, 2006, 82(Suppl 5):v16.
5. Peeling RW. Applying new technologies for
diagnosing sexually transmitted infections in
resource-poor settings. Sexually Transmitted
Infections, 2011, 87(Suppl 2):ii2830.
6. Aledort JE et al. Reducing the burden of sexually
transmitted infections in resource-limited settings:
the role of improved diagnostics. Nature, 2006,
444(Suppl 1):5972.
7. Kettler H, White K, Hawkes S. Mapping the
landscape of diagnostics for sexually transmitted
203
11. Sorger PK. Microfluidics closes in on pointof-care assays. Nature Biotechnology, 2008,
26(12):13451346.
12. Chin CD et al. Microfluidics-based diagnostics of
infectious diseases in the developing world. Nature
Medicine, 2011, 17(8):10151019.
13. Niemz A, Ferguson TM, Boyle DS. Point-of-care
nucleic acid testing for infectious diseases. Trends
in Biotechnology, 2011, 29(5):240-250.
14. Piepenburg O et al. DNA detection using
recombination proteins. PLoS Biology, 2006,
4(7):e204.
15. Xu G et al. Cross priming amplification: mechanism
and optimization for isothermal DNA amplification.
Scientific Report, 2012, 2:246.
16. Mahmoudian L et al. Rolling circle amplification
and circle-to-circle amplification of a specific gene
integrated with electrophoretic analysis on a single
chip. Analytical Chemistry, 2008, 80(7):2483-249.
Anexo 3
Princpios dos testes moleculares para o diagnstico de
doenas sexualmente transmissveis
A3.1 Introduo
As doenas sexualmente transmissveis (DST) podem ser
causadas por vrus, bactrias ou parasitas, no sendo
raras as coinfeces. Os espcimes clnicos para a
testagem de DST tambm so colhidos a partir de
diferentes regies anatmicas, utilizando vrias tcnicas
e aparatos de coleta, e em vrios locais, havendo
grandes variaes no transporte e armazenamento de
espcimes, assim como recursos diferenciados para o
diagnstico de DST. Consequentemente, existem muitos
mtodos diferentes para realizar o diagnstico
laboratorial de DST efetivo em todo o mundo, e esses
mtodos podem variar significativamente quanto
sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade tanto
para testar uma nica infeco quanto para uma grande
gama de DST. Os mtodos laboratoriais histricos para a
deteco de agentes etiolgicos das DST incluem a
cultura bacteriolgica ou de tecido, vrios testes
sorolgicos para detectar a presena de anticorpos
especficos, imunohistoqumica, deteco de antgenos e
microscopia. De forma similar ao diagnstico de muitas
outras doenas infecciosas, a deteco direta de cidos
nucleicos especficos de patgenos que causam DST,
utilizando diferentes testes de amplificao de cido
nucleico (NAAT, do ingls nucleic acid amplification
tests), tornou-se o novo padro ouro para o
diagnstico de muitas DST, devido sua sensibilidade e
especificidade superiores. Muitos NAAT foram aprovados
pela Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados
Unidos da Amrica (FDA, do ingls United States of
America Food and Drug Administration), ou outros
organismos regulatrios internacionais, nacionais ou
regionais, e esto disponveis comercialmente.
Entretanto, diversos ensaios para o diagnstico de DST
desenvolvidos por laboratrio (EDL), utilizando mtodos
baseados na reao em cadeia da polimerase (PCR, do
ingls polymerase chain reaction) convencional ou em
tempo real, tambm so populares, principalmente para
fins epidemiolgicos e de pesquisa. Atualmente, muitos
Anexo 3. Princpios dos testes moleculares para o diagnstico de doenas sexualmente transmissveis
205
206
Tabela A3.1: Exemplos de ensaios para DST baseados em cido nucleico disponveis comercialmente (junho de 2012)
Organismos-alvo
Tecnologia
Companhia
PCR
TMA-HPA
CH (sonda de DNA)
PCR em tempo real
SDA
CH (sonda de RNA)
RT-PCR
Roche, Cepheid
Gen-Probe
Gen-Probe
Abbott, Roche, Siemens
Becton, Dickinson
Qiagen
Roche
HIV
Abbott
NASBA
bioMrieux
Genotipagem do HPV
bDNA
Sequenciamento
Sequenciamento
PCR em tempo real
TMA-HPA
HC
PCR
PCR
PCR hibridizao em linha
Anexo 3. Princpios dos testes moleculares para o diagnstico de doenas sexualmente transmissveis
207
Tabela A3.1: Exemplos de ensaios para DST baseados em cido nucleico disponveis comercialmente (junho de 2012)
(continuao)
Organismos-alvo
Tecnologia
Companhia
HBV
Roche
Abbott
Siemens
Qiagen
Becton, Dickinson
Genotipagem do HBV
HCV
Genotipagem do HCV
HSV
Trichomonas vaginalis
C. trachomatis, N. gonorrhoeae e
Mycoplasma genitalium
Gardnerella vaginalis, T. vaginalis
e Candida spp.
Roche
Abbott
National Genetics Institute
Siemens
Abbott
Abbott
Roche
Qiagen
EraGen Biosciences
Becton, Dickinson
BioHelix
Gen-Probe
Bio-Rad Laboratories
bDNA: ensaio de hibridizao de DNA em cadeia ramificada; HBV: vrus da hepatite B; CH: captura hbrida; HCV: vrus da hepatite C; HIV: vrus da
imunodeficincia humana; HPA: ensaio de proteo da hibridizao; HPV: papilomavrus humano; HSV: vrus da herpes simples; NASBA:
amplificao baseada na sequncia de cido nucleico; PCR: reao em cadeia da polimerase; RT-PCR: reao da transcriptase reversa seguida de
PCR; SDA: amplificao por deslocamento de cadeia; TMA: amplificao mediada por transcrio.
208
Tecnologia
Companhia
Isotrmica
Alvo
Enzima
PCR
Roche
No
DNA
DNA polimerase
Abbott, Roche
No
DNA
DNA polimerase
TMA
Gen-Probe
Sim
RNA
Transcriptase reversa e
RNA polimerase
SDA
Becton, Dickinson
Sim
DNA
DNA polimerase e
endonuclease de
restrio
NASBA
bioMrieux
Sim
RNA
Transcriptase reversa,
RNase H, RNA
polimerase
NAAT, teste de amplificao de cido nucleico; NASBA: amplificao baseada na sequncia de cido nucleico; PCR: reao em cadeia da
polimerase; SDA: amplificao por deslocamento de cadeia; TMA: amplificao mediada por transcrio.
Anexo 3. Princpios dos testes moleculares para o diagnstico de doenas sexualmente transmissveis
209
Iniciadores de DNA
DNA parental
Etapa 1:
desnaturao
(95C)
Taq
3'
5'
Nucleotdeos
(dTTP, dCTP, dATP, dGTP)
DNA polimerase
3'
5'
Etapa 2:
anelamento
(55C)
5'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
3'
5'
5'
Taq
Repetir o ciclo
(20-40 vezes)
3'
3'
P
5'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
3'
5'
Taq
Figura A3.1
Reao em cadeia da polimerase (PCR): processo de trs etapas.
Fonte: cortesia da Encyclopdia Britannica, Inc. (http://www.britannica.com/EBchecked/media/18071/The-three-stepprocess-of-the-polymerase-chain-reaction, acessado em 23 de junho de 2013).
210
Plat
Amostra
1,000,000
Incio
Fase
exponencial
CT
Linha de base
0
20
40
Nmero do ciclo da PCR
Figura A3.2
Curva de amplificao tpica de uma PCR em tempo real.
Fonte: cortesia do Centro Nacional para Informao em
Biotecnologia (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/
genome/ probe/doc/TechQPCR.shtml, acessado em 23
de junho de 2013).
Green; e a deteco especfica, utilizando sondas
fluorescentes especficas para o alvo, tais como a sonda
TaqMan (sonda de hidrlise), sinalizadores moleculares
ou sondas de hibridizao dupla. O SYBR Green ,
provavelmente, o marcador de ligao a dsDNA para PCR
em tempo real mais amplamente utilizado. Na soluo,
as molculas marcadoras no ligadas exibem muito
pouca fluorescncia, mas a fluorescncia aumenta
significativamente quando se liga ao dsDNA. Conforme o
dsDNA se acumula, o SYBR Green gera sinais que so
proporcionais concentrao de DNA-alvo (Figura
A3.3A). Considera-se que essa tecnologia no apresenta
uma especificidade muito alta, uma vez que o marcador
se liga indiscriminadamente a todos os dsDNA formados
durante a PCR e, consequentemente, qualquer produto
falso de amplificao tambm pode contribuir, de modo
geral, para o sinal de fluorescncia. Entretanto, a
Anexo 3. Princpios dos testes moleculares para o diagnstico de doenas sexualmente transmissveis
211
A3.3B)
Fluorencncia normal
(A)
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1 Incio
0.0
10
15
20
25
30
35
40
45
Ciclo
Ciclagem de A.Green (Pgina
1);
R=0.99716
R^2=0.99433
M=-3.283
B=38.737
Eficincia =1.02
35
CT
30
25
20
102
101
103
104
Concentrao
105
106
Fluorescncia
(B)
15
10
5
45
50
50
55
60
65
70
75
80
85
90
70
75
80
85
90
C
0.8
dF/dT
0.6
0.4
0.2
0.0
45
50
50
55
60
65
C
Figura A3.3
(A) Curva de amplificao tpica de uma PCR em tempo real, mostrando os espcimes com uma diluio em
srie do DNA-alvo e a curva padro; (B) anlise da curva de fuso utilizando as temperaturas de fuso (Tm)
para aumentar a especificidade da PCR em tempo real baseada em SYBR Green.
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.
212
Iniciador senso
Sonda
3'
Iniciador anti-senso
5'
3'
5'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
5'
3'
5'
Figura A3.4
PCR em tempo real baseada na sonda TaqMan
(sonda de hidrlise).
Fonte: cortesia da Life Technologies Corporation (http://
www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/
applications-technologies/real-time-pcr/taqman-andsybr-green-chemistries.html, acessado em 23 de junho
de 2013).
Anexo 3. Princpios dos testes moleculares para o diagnstico de doenas sexualmente transmissveis
213
Sequncia da sonda
Grampo
Fluorforo
Sinalizador
molecular
Supressor
+
Alvo de DNA ou
RNA
Hbrido
Figura A3.5
Sinalizador molecular (sonda do tipo grampo).
Fonte: cortesia de Horspool D. Wikipedia, 2009 (http://
en.wikipedia.org/wiki/Molecular_beacon, acessado em
11 de abril de 2013); Introduction to molecular beacons.
Nova Jersey, EUA, Public Health Research Institute, 2013
(http://molecular-beacons.org/MB_introduction.html,
acessado em 23 de junho de 2013).
214
Sonda oligo 1
Fluorforo receptor 5
(FR),
DNA alvo amplificado
Sonda oligo 2
Figura A3.6
Sistema de sonda de hibridizao dupla ou de transferncia de energia de ressonncia por fluorescncia (FRET).
Fonte: cortesia de SIGMA-ALDRICH, St Louis, MO, EUA (http://www.sigmaaldrich.com/life-science/custom-oligos/dnaprobes/product-lines/fluorescent-probes/lightcycler-probes.html, acessado em 23 de junho de 2013).
1
rRNA alvo
2
RT
3
Atividades da
RNAse H
DNA
RNA
DNA
5
RT
Iniciador 2
6
Fita molde de DNA
Iniciador-promotor
RT
RNA pol
12
100-1000 cpias
Amplicon de RNA
11
Atividades da
RNAse H
9
10
RT
Iniciador 2
Figura A3.7
Amplificao mediada por transcrio (TMA).
Fonte: Hill CS. Gen-Probe transcription-mediated amplification: system principles. Cortesia de Gen-Probe Inc., San
Diego, CA, EUA (http://www.gen-probe.com/pdfs/tma_whiteppr.pdf, acessado em 23 de junho de 2013).
Anexo 3. Princpios dos testes moleculares para o diagnstico de doenas sexualmente transmissveis
215
Sinalizador
molecular
RNA senso
Fluorforo
P2
Oligo P1
Transcriptase
reversa
RNase H
Iniciador P2
Supressor
RNA polimerase T7
P1
41C
Transcriptase
reversa
RNase H
Oligo P1
Processo de
amplificao
Transcriptase reversa
Transcriptase reversa
Iniciador P2
T7 RNA Polymerase
Luz
RNA anti-senso
Figura A3.8
Amplificao baseada na sequncia de cido nucleico (NASBA)
Fonte: NASBA technology. Cortesia de PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, EUA (http://www.premierbiosoft.com/tech_
notes/NASBA.html, acessado em 23 de junho de 2013).
216
A. Gerao de alvo
BP
AP
TS
DNA polimerase
Extenso e
deslocamento
5'
AP1
5' TS1
TS2
5'
AP2
5'
TS1
TS2
Figura A3.9
Amplificao por deslocamento de cadeia (SDA).
Fonte: cortesia de Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, EUA.
Anexo 3. Princpios dos testes moleculares para o diagnstico de doenas sexualmente transmissveis
217
DP
TS2
5'
5'
AP2
218
1.
Hibridizao de sonda de
RNA com DNA alvo. O DNA
alvo combina com sondas
especficas de RNA, criando
hbridos RNA:DNA.
2.
Figura A3.11
Tecnologia de captura hbrida (CH).
3.
Amplificao de sinais. As
capturas de hbridos RNA:DNA
so detectadas com vrios
anticorpos conjugados
fosfatase alcalina. O sinal
resultante da reao de
quimioluminescncia
lido e os resultados so
interpretados.
Anexo 3. Princpios dos testes moleculares para o diagnstico de doenas sexualmente transmissveis
219
Amplicon de RNA
Sonda
AE
A.
60C
AE
AE
AE
15 min
Hibridizar
Sonda no hibridizada
B.
Selecionar
AE
AE
Detectar
Ausncia
de luz
Sonda hibridizada
C.
AE
AE
Selecionar
AE
AE
Detectar
Luz
Figura A3.12
Ensaio de proteo da hibridizao.
Fonte: Hill CS. Gen-Probe transcription-mediated amplification: system principles. Cortesia de Gen-Probe Inc., San
Diego, CA, EUA (http://www.gen-probe.com/pdfs/tma_whiteppr.pdf, acessado em 23 de junho de 2013).
220
B
Release RNA
Libera
o RNA
Label extender
Extensor
do marcador
Extensor
Capture
extender
de
captura
Hibridiza
sondas
Hybridize
probes
to ou
para
o RNA
RNA or DNA
DNA
and eto para
solid a
fase
slida
phase
Libera
e
Release and
denature RNA
desnatura o RNA
C
Capture probe
Sonda
de captura
Micropoo
Microwell
Molculas
Amplifieramplificadoras
molecules
Pr
amplificador
Preamplifier
RNA alvo
Target RNA
Extensor
do marcador
Label extender
Extensor
Capture
de extender
captura
Sonda
de captura
Capture probe
Microwell
Micropoo
Amplifier
with hybridized
Amplificadores com
sondas
marcadas hibridizadas
label probes
Pr amplificador
RNA alvo
Extensor do marcador
Extensor
de captura
Sonda de captura
Microwell
Micropoo
Figura A3.13
Ensaio de amplificao de sinal de DNA em cadeia ramificada (bDNA)
Fonte: Tsongalis, GJ. Branched DNA technology in molecular diagnostics. American Journal of Clinical Pathology, 2006,
126:448453.
Anexo 3. Princpios dos testes moleculares para o diagnstico de doenas sexualmente transmissveis
221
A3.4 Referncias
1. Palmer HM et al. Evaluation of the specificities of
five DNA amplification methods for the detection of
Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical
Microbiology, 2003, 41(2):835837.
2. Tabrizi SN et al. Evaluation of six commercial nucleic
acid amplification tests for the detection of Neisseria
gonorrhoeae and other Neisseria species. Journal of
Clinical Microbiology, 2011, 49(10):36103615.
3. Ripa T, Nilsson P. A variant of Chlamydia trachomatis
with deletion in cryptic plasmid: implications for use
of PCR diagnostic tests. Eurosurveillance, 2006,
11(11):E061109.2.
4. Unemo M, Clarke IN. The Swedish new variant of
Chlamydia trachomatis. Current Opinion in Infectious
Diseases, 2011, 24(1):6269.
222
Anexo 4
Meios, reagentes, testes de diagnstico e corantes (protocolos)
NOTA: Os reagentes para a preparao de meios e corantes esto listados em ordem alfabtica por categoria*. Alguns
protocolos aparecem nos captulos e no esto repetidos neste anexo.
10g
Cloreto de sdio
3,0g
Hidrogenofosfato dissdico
1,15g
Dihidrogenofosfato de potssio
0,2g
Cloreto de potssio
0,2g
Tioglicolato de sdio
1,0g
Cloreto de clcio
0,1g
Cloreto de magnsio
0,1g
gar
4,0g
gua destilada
1L
3,7g
Glicerol
20mL
gua destilada
80mL
1. Misture os ingredientes em uma garrafa com tampa de rosca de 150mL, autoclave e resfrie em temperatura
ambiente.
2. Utilizando uma pipeta estril, dispense assepticamente 1,0mL da soluo em criotubos de polipropileno com
tampa de rosca de 1,5mL ( essencial a utilizao adequada dos tubos para evitar quebra).
3. Armazene o meio a 4C at que este seja utilizado.
223
Chocolate gar ver meio gar-base CG (CG) com hemoglobina (em meio Thayer-Martin)
gar sangue Columbia
gar base sangue Columbia
39g
90mL
gua destilada
1L
1. Suspenda 39g de gar-base sangue Columbia em 1L de gua destilada, mantendo a mistura sob agitao.
Subsequentemente, mantenha sob vapor ou ferva, gentilmente, at que o gar esteja completamente dissolvido.
2. Autoclave a 121C por 15 minutos.
3. Deixe o meio de gar esfriar a 70C em banho-maria.
4. Adicione, assepticamente, 90mL de sangue desfibrinado de cavalo ao gar. Misture com movimentos circulares e
mantenha a 70C por 30 minutos, continuando a mexer, gentilmente, at que o sangue assuma uma cor marrom
chocolate.
5. Transfira o frasco para um banho-maria a 50C para que resfrie, antes de dispens-lo em volumes de 20mL em
placas de Petri de 9cm.
6. Espere que as placas se solidifiquem em temperatura ambiente e armazene-as invertidas a 2-8C em sacolas de
plstico seladas por at quatro semanas.
Agar Columbia + 1% de hemoglobina + carvo ativado + 5% de soro fetal bovino + 1% de enriquecimento com
IsoVitalex + vancomicina (3L/mL)
Esse meio recomendado para a cultura de Haemophilus ducreyi.
gar-base Columbia
40g
Hemoglobina bovina
10g
Carvo ativado
2g
50mL
Enriquecimento IsoVitaleX
10mL
Soluo de vancomicina
gua destilada
1L
1. Pese a hemoglobina bovina em um frasco (A) e adicione 400mL de gua destilada. Deixe a soluo na geladeira, a
4C, durante toda a noite. Na manh seguinte, agite o frasco e suspenda o p. Coloque em temperatura ambiente.
2. Em um segundo frasco (B), adicione o gar Columbia, o carvo ativado e 600mL de gua destilada.
3. Autoclave os frascos A e B, separadamente, a 121C, por 15 minutos.
4. Esfrie os frascos em um banho-maria a 56C.
5. Com uma tcnica assptica, em capela com fluxo laminar, derrame vagarosamente a soluo de hemoglobina
bovina esterilizada (frasco A), com cuidado, no frasco B, contendo o gar base Columbia e o carvo, deixando
escorrer a soluo pelo lado interno do frasco para evitar a formao de bolhas.
6. Assepticamente, adicione 50mL (5%) de soro fecal bovino, 10mL (1%) de enriquecimento IsoVitaleX e um volume
estril do fluido contendo 3mg de vancomicina (esterilizada por filtrao, caso necessrio).
224
7. Uma vez que tudo estiver adicionado, misture o meio, cuidadosamente, com movimentos circulares. Derrame o
contedo, assepticamente, em placas de Petri de 20mL e deixe-o assentar antes de coloc-lo em sacolas plsticas e armazen-lo na geladeira, a 4C, at que seja utilizado. As placas de gar devem ser usadas em at 1-2
semanas aps a preparao.
Meio de Diamond (os ingredientes se referem ao produto disponvel comercialmente; Van Dyck et al., 1999)
O meio de Diamond utilizado para a cultura de Trichomonas vaginalis. Outro sistema de cultura comercial o InPouch
TV (Anexo 5).
Peptona de tripticase
20g
Extrato de levedura
10g
Maltose
5,0g
Cloridrato de L-cistena
1,0g
cido L-ascrbico
0,2g
Hidrogenofosfato dipotssico
0,8g
Dihidrogenofosfato de potssio
0,5g
gar
0,5g
1. Suspenda e dissolva 38g do p de meio de Diamond (todos os ingredientes acima) em 900mL de gua destilada.
2. Autoclave e esfrie o meio a 50C.
3. Adicione 100mL de soro bovino ou de ovelha e 0,1g/L de clorafenicol.
4. Armazene a 4C e utilize em trs meses.
Meio gar-base GC (GC) suplementado com 1% de suplemento de crescimento definido (suplemento definido de
Kellogg ou IsoVitaleX/Vitox)
O meio GC com suplemento recomendado para os mtodos de diluio em gar, disco de difuso e Etest (bioMrieux
Frana) para o teste de susceptibilidade antimicrobiana de N. gonorrhoeae.
GC
IsoVitaleX/Vitox/suplemento definido de Kellogg
gua destilada
36g
10mL
1L
225
40g
Glutamina
1,0g
10mL
gua destilada
90mL
36g
Hemoglobina bovina
20g
50mL
Enriquecimento IsoVitaleX
10mL
Soluo de vancomicina
gua destilada
1L
1. Em um frasco de dois litros (A), adicione a hemoglobina bovina a 500mL de gua destilada e misture bem.
2. Em outro frasco de dois litros (B), adicione GC aos 500mL restantes de gua destilada e aquea em um agitador
at que ferva.
3. Autoclave os frascos a 121C por 30 minutos e, ento, resfrie a 56C.
4. Com uma tcnica assptica, em uma capela com fluxo laminar, dispense vagarosamente a soluo de
hemoglobina bovina esterilizada (frasco A), com cuidado, no frasco B contendo GC, deixando a soluo escorrer
pelo lado interno do frasco para evitar a formao de bolhas.
5. Adicione 50mL (5%) de soro fecal bovino estril, 10mL (1%) de enriquecimento IsoVitaleX e um volume estril do
fluido contendo 3mg de vancomicina (esterilizada por filtrao, caso necessrio).
6. Misture bem o meio com movimentos circulares cuidadosos.
7. Dispense o meio, assepticamente, em placas de Petri de 20mL e deixe-o meio assentar antes de coloc-lo em
sacolas plsticas. Armazene em geladeira, a 4C, enquanto for necessrio.
8. As placas de gar devem ser utilizadas em at 1-2 semanas aps a preparao.
226
Meio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM-VGA) (disponvel comercialmente, Sigma-Aldrich, Life
Technologies, EUA).
Meio Kupferberg (os ingredientes se referem aos produtos disponveis comercialmente; Van Dyck et al., 1999)
Triptose (ou tripticase)
20g
Maltose
1,0g
Cloridrato de L-cistena
1,5g
gar
1,0g
Azul de metileno
0,003g
Cloranfenicol
0,1g
Extrato de levedura
0,1g
1. Suspenda 23,7g do p do meio Kupferberg em 950mL de gua destilada, autoclave e esfrie a 50-55C.
2. Adicione 50mL de soro (bovino, humano, de ovelha, rato ou cavalo), 1.000.000UI de penicilina e 150g de
estreptomicina.
Meio lquido para citologia (disponvel comercialmente, BD Diagnostics)
Meio de Eagle modificado (MEM-VG) (disponvel comercialmente, Sigma-Aldrich, GibconLife Technologies, EUA)
Meio de Thayer-Martin modificado
Prepare o meio GC com hemoglobina e suplementos (ver meio Thayer-Martin). Adicione misturas antimicrobianas
seletivas, as quais esto disponveis comercialmente: VCAT (vancomicina, colistina, nistatina, lactato de trimetropima)
ou LCAT (lincomicina, colistina, anfotericina B ou anisomicina, lactato de trimetropima). Esses suplementos devem ser
hidratados como recomendado pelo fabricante e, ento, adicionados ao meio (3, 4). O meio tambm est disponvel
comercialmente.
Caldo Mueller-Hinton (disponvel comercialmente)
Ingredientes em preparaes comerciais:
Extrato de carne
Digesto cida de casena
Amido solvel
2,0g
17,5g
1,5g
227
36g
Sangue de cavalo
50mL
50mL
Enriquecimento IsoVitaleX
10mL
Soluo de vancomicina
gua destilada
1L
1. Pese 38g de gar-base Mueller-Hinton, prepare 1L de soluo com gua destilada, autoclave e resfrie a 56C.
2. Adicione 50mL (5%) de sangue de cavalo estril quando o gar-base dissolvido atingir 56C, e misture.
3. Para achocolatar o sangue de cavalo, aquea a suspenso a 70C, colocando o frasco em banho-maria por,
aproximadamente, 15 minutos.
4. Resfrie a 56C e, ento, adicione 50mL (5%) de soro fetal bovino, adicione 10mL (1%) de enriquecimento
IsoVitaleX e um volume estril do fluido contendo 3mg de vancomicina (esterilizado por filtro, se necessrio).
5. Misture o meio, mexendo cuidadosamente.
6. Derrame o meio, assepticamente, em placas de Petri de 20mL e deixe-o assentar, antes de coloc-lo em sacolas
plsticas. Armazene em geladeira, a 4C, enquanto for necessrio.
7. As placas de gar devem ser utilizadas em at 1-2 semanas aps a preparao.
Base do caldo de micoplasma (5) (o meio est disponvel comercialmente)
Infuso de corao bovino
50g
Peptona
10g
NaCl
5,0g
gua destilada
1L
5,0g
Glicose
0,5g
Bicarbonato de sdio
0,075g
Sangue de cavalo lisado: lisar por meio de congelamento e descongelamento ou por meio da adio de 5mL/L de
saponina ao meio GC.
228
40g
10g
gar
15-20g
1L
gua desmineralizada
1. Aquea a mistura at a completa dissoluo; pH final de 5,6.
100g
gua destilada
1L
1,0g
10,0g
Cloreto de clcio
0,1g
Azul de metileno
0,002g
Cloridrato de cistena
gar
0,5g
3-5, 0g
gua destilada
1L
229
6. Se a cor mudar para azul, quando armazenado, o meio est gaseificado e, portanto, imprprio para o uso.
7. Afrouxe a tampa de rosca e aquea o meio para remover o ar.
Meio de transporte sacarose fosfato (2SP) com antibiticos (os ingredientes se referem ao produto disponvel
comercialmente; Van Dyck et al., 1999)
Hidrogenofosfato dipotssico
2,1g
Dihidrogenofosfato de potssio
1,1g
Sacarose
68,5g
gua destilada
1L
10mL
Gentamicina
10mg
Vancomicina
10mg
Anfotericina B
0,5mg
75g
KH2PO4
0,6g
K2HPO4
2,83g
1L
1,0g
Hidrogenofosfato dipotssico
4,0g
Dihidrogenofosfato de potssio
1,0g
Cloreto de sdio
5,0g
gar
10,0g
10,0g
230
15,0g
10,0mL
1L
1. Dissolva 36g de GC (Difco, BD) em 500mL de gua destilada. Deixe essa mistura descansar at que o p esteja
completamente dissolvido. Se necessrio, utilize uma barra magntica para misturar.
2. Suspenda 10g de hemoglobina em 500mL de gua destilada, faa uma pasta antes de adicionar a gua, misture
vigorosamente para dissolver e ferva.
3. Esterilize ambas as solues, autoclavando-as a 121C, por 15 minutos. Resfrie, colocando os frascos em um
banho-maria a 50C.
4. Remova cada frasco do banho-maria e, assepticamente, adicione a soluo de hemoglobina ao frasco de GC.
5. Tambm assepticamente, adicione 10mL de suplemento definido dissolvido (por exemplo, suplemento definido de
Kellogg, IsoVitaleX ou Vitox).
6. Misture os contedos completamente, agitando gentilmente com movimentos circulares.
7. Despeje imediatamente 20-25mL da mistura em placas de Petri (9cm).
8. Deixe que o meio se solidifique em temperatura ambiente.
9. Armazene as placas invertidas a 2-8C, em sacolas de plstico fechadas, por at trs semanas.
O IsoVitaleX e o Vitox podem ser adquiridos comercialmente, enquanto o suplemento definido de Kellogg preparado in
house (ver GC).
Adicione vancomicina, colistina e inibidor de nitatina (VCN) ao gar chocolate.
Frmula VCN:
Vancomicina
300g/mL
Colistina
750g/mL
Nistatina
1250 unidades/mL
O meio de Thayer-Martin modificado obtido pela adio de lactato de trimetoprima a uma concentrao de 5g/mL.
Caldo triptona de soja (Van Dyck et al., 1999)
Digesto cida de casena (triptona)
17g
Peptona de soja
3g
Cloreto de sdio
5g
Hidrogenofosfato dipotssico
2,5g
Glicose
2,5g
gua destilada
1L
231
10,3g
Anfotericina B
5,0mg
100mL
Gentamicina
gua destilada
50mg
1L
232
Tampes
Tipo de
soluo
Concentrao
(mol/L)
Tampofosfato
Tampo
citratohidrxido
de sdio de
Srensen
pH
0,025
3,41g de KH2PO4
4,46g de
Na2HPO4 x
2H2O
6,8
50,8
49,2
0,1
6,9
43,9
56,1
0,01
Dissolva 2,1g
de cido ctrico
monoidratado
em 20mL de
NaOH a 1mol/L
e adicione gua
destilada para 1L
(=0,01mol/L de
citrato dissdico)
5,6
69,3
30,7
HCL a
0,01mol/L
Testes de -lactamase
Vrios testes podem ser utilizados para determinar se um isolado produz -lactamase (por exemplo, iodomtrico,
vermelho de fenol) (3). O mais fcil o teste de cefalosporina cromognica (nitrocefina). Ver Captulo 4 para detalhes.
Testes de utilizao de carboidratos
Ingredientes para gar cistena tripticase (ACT) (Difco, BD, EUA):
Triptona
20g
L-cistena
0,5g
Cloreto de sdio
5,0g
Sulfato de sdio
0,5g
gar
2,5g
Vermelho de fenol
17mg
233
6. Esfrie os tubos em posio inclinada para criar uma rampa e permitir que o meio se solidifique em temperatura
ambiente.
7. Armazene os tubos a 4C.
8. Teste o meio preparado quanto ao desempenho utilizando culturas de controle tpicas e estveis, como
especificado pelo fabricante (Difco, BD, EUA).
Teste de utilizao rpida de carboidrato (RCUT)
Os reagentes a seguir esto disponveis comercialmente:
Meio de gar sangue lisado (LBA, do ingls lysed blood agar) com 0,5% de glicose
Soluo indicadora de sal balanceada tamponada (BSS, do ingls buffered balanced salt indicator solution)
Solues de carboidrato:
Glicose 10% (G)
Lactose 10% (L)
Sacarose 10% (S)
Maltose 10% (M)
Soluo de ampicilina (200mg/mL) para teste de produo de -lactamase.
Uma cultura pura para a identificao de N. gonorrhoeae suspeita obtida por meio da subcultura de uma nica colnia
em um meio LBA, contendo 0,5% de glicose.
1. Emulsifique duas alas completas de 10L do isolado de uma cultura pura crescida ao longo da noite em um tubo
contendo 1,5mL de BSS e misture bem, com uma pipeta Pasteur, para obter 109 organismos por mL.
2. Marque seis poos de uma placa de microtitulao com C (controle), G, L, M, S e Pase (penicilinase).
3. Adicione 25mL de soluo de carboidrato estril 10% nos poos G, L, M e S e 25mL de soluo de ampicilina no
poo Pase. O primeiro poo sem acar servir de controle.
4. Adicione 100mL (quatro gotas) da suspenso bacteriana em cada um dos seis poos.
5. Leia aps 2-4 horas de incubao a 35-37C em ar (no em CO2). Recomenda-se que a reao de -lactamase
seja examinada novamente aps 24 horas, j que, em algumas cepas, pode ocorrer uma reao de -lactamase
lenta.
Interpretao:
Uma vez que a N. gonorrhoeae utiliza glicose (no maltose, sacarose e lactose), somente o tubo contendo glicose deve
mostrar alterao de cor.
Os resultados da utilizao de carboidrato e produo de -lactamase so registrados da seguinte maneira:
234
Tubo/poo controle
= Vermelho
Cor amarela
= Reao positiva
Cor vermelho-alaranjada
= Reao negativa
Nota: caso se suspeite de N. gonorrhoeae e se obtenha um resultado indefinido no teste de utilizao rpida de carboidrato, verifique a pureza da cultura e confirme a identidade utilizando outros testes, tais como testes sorolgicos.
Soluo glicose-potssio-sdio-fosfato (GKNP)
Essa soluo corresponde HBSS sem Ca++ e Mg++ (disponvel comercialmente)
Estoque 10X
NaCl
80,0g
Glicose
10,0g
KCl
4,0g
KH2PO4
0,60g
Na2HPO4
0,48g
100mL
H2O
900mL
1. Misture os ingredientes.
2. Autoclave e armazene o estoque 10X a 4C at que seja utilizado; a soluo-estoque expira aps seis meses.
3. A soluo de trabalho obtida por meio da diluio 1:10 da soluo-estoque 10X com H2O.
Gonochek-II
O Gonochek-II (TCS Biosciences, Ltd.) um teste de crescimento independente, utilizado para distinguir espcies
de Neisseria em funo da sua capacidade de hidrolisar trs enzimas produzidas especificamente por uma espcie:
prolina iminopeptidase/prolilaminopeptidase (PIP, do ingls prolyliminopeptidase), para N. gonorrhoeae; -glutamilaminopeptidase, para N. meningitidis; e -galactosidase, para N. lactamica.
O kit Gonochek-II compreende um nico tubo contendo trs substncias cromognicas. A hidrlise dessas substncias produz uma cor distinta. A cor especfica produzida est relacionada enzima presente e, dessa forma, indica a
presena de N. gonorrhoeae, N. meningitidis e N. lactamica, respectivamente.
Outras espcies comensais de Neisseria podem produzir PIP. Assim, testes enzimticos devem ser realizados em cepas
crescidas em meios seletivos. Tambm foram relatadas cepas de N. gonorrhoeae negativas para PIP (6, 8). Dessa
forma, os espcimes devem ser confirmados utilizando um mtodo alternativo (3).
GonoGen-II
O GonoGen-II (New Horizons Diagnostics Corporation) um teste colorimtrico baseado em anticorpo monoclonal, no
qual anticorpos monoclonais contra protena PorB (PorB IA e PorB IB) de N. gonorrhoeae foram agrupados e adsorvidos
em molculas sol-metlicas suspensas. O GonoGen II utiliza um tampo de solubilizao para remover a parede celular
do organismo a ser testado, permitindo, assim, a exposio da protena PorB. Um agrupamento de anticorpos monoclonais ligados a um carreador sol-metlico utilizado para detectar os antgenos especficos de N. gonorrhoeae. O
complexo antgeno-anticorpo subsequente detectado por meio de um aparato de filtrao, dando origem a um ponto
vermelho bem definido (3).
1. Etiquete um tubo de teste separado para cada isolado e cepas-controle.
235
2. Dispense 0,5mL de tampo de solubilizao e ajuste a turvao de McFarland para 1,0, por meio da coleta de
colnias em gar seletivo ou enriquecido.
3. Misture vigorosamente ou agite com movimentos circulares (vrtice) o reagente do GonoGen-II.
4. Adicione uma gota do reagente do GonoGen-II em cada um dos tubos a serem testados. Misture bem.
5. Deixe os tubos descansarem por, pelo menos, 5-15 minutos (tempos maiores aumentam a nitidez da reao).
Interpretao:
Positivo: indica N. gonorrhoeae (ponto rosa a vermelho no poo).
Negativo: no h N. gonorrhoeae (ponto branco a rosa claro no poo).
Padres de turvao de McFarland (9)
Os padres de turvao de McFarland so preparados por meio da mistura das solues seguintes em razes
diferentes, para obter a escala de turvao de McFarland desejada (por exemplo, 0,5, 1, 2 etc).
0,5
0,05mL
0,1mL
0,2mL
0,3mL
0,4mL
9,95mL
9,9mL
9,8mL
9,7mL
9,6mL
Feche os tubos apertando bem e armazene-os em temperatura ambiente no escuro (permanecero estveis por seis meses).
Antes de us-los, inverta os tubos vrias vezes para suspender os precipitados de brio.
Para comparao, utilize um fundo com faixas pretas e brancas.
Teste de oxidase (para a confirmao da identificao de N. gonorrhoeae aps a cultura)
Preparao in-house (Morse, et al., 1996 e 2010):
Dicloridrato de tetra-metil-fenilenodiamina
0,5g
gua destilada
50mL
236
Mtodo do papel-filtro:
1. Quebre a ampola de vidro contendo o reagente em seu interior, apertando as laterais do tubo.
2. Etiquete o papel-filtro com o nmero do organismo a ser testado e umedea o papel-filtro com o reagente.
3. Colete uma colnia de uma cultura crescida durante a noite, com uma ala estril ou um aplicador.
4. Esfregue o inculo em um papel-filtro saturado de reagente.
5. Examine o surgimento da colorao roxa escura (reao positiva) em 10-30 segundos.
Mtodo direto na placa de gar:
1. Adicione 2-3 gotas do reagente oxidase diretamente nas placas de gar contendo a cultura crescida durante a noite.
2. Examine a mudana rpida de cor de rosa para marrom e, em seguida, para roxo escuro em 10-30 segundos.
Interpretao:
Organismos positivos para oxidase produzem uma cor roxa em 30 segundos.
Organismos negativos para oxidase produzem uma cor rosa claro ou permanecem incolores.
Teste GC monoclonal Phadebact
No teste GC monoclonal Phadebact, dois agrupamentos de anticorpos monoclonais murinos so misturados
separadamente com a protena A de Staphylococcus no viveis, o que permite o subagrupamento dos isolados
gonoccicos nos grupos WI (PorB IA) e WII/WIII (PorB IB).
1. Remova colnias frescas de N. gonorrhoeae presuntivamente identificadas e as suspenda em 0,5mL de soluo
salina tamponada com fosfato (PBS, do ingls phosphate-buffered saline solution; ver abaixo) a 0,9%, para uma
turvao de McFarland de 0,5. Utilize um tubo de teste com tampa.
2. Coloque o tubo fechado em banho-maria fervente por, pelo menos, cinco minutos e, ento, resfrie em temperatura
ambiente.
3. Antes de utilizar o reagente gonoccico, agite-o vigorosamente. Coloque uma gota do reagente WI e uma gota do
WII/WIII, respectivamente, em uma lmina.
4. Adicione uma gota de suspenso gonoccica fervida ao reagente WI e uma gota ao WII/WIII. Certifique-se de
incluir um controle negativo, no qual se adiciona apenas PBS.
5. Misture as gotas vigorosa mas gentilmente, com uma ala descartvel. Utilize uma ala para cada reagente.
6. Agite a lmina e leia o resultado em um minuto.
Interpretao:
Um precipitado com qualquer um dos reagentes gonoccicos WI ou WII/WIII constitui um resultado positivo. Uma
reao positiva com ambos os reagentes um resultado equivocado que necessitar ser re-testado. Se no ocorrer
reao em nenhum dos reagentes gonoccicos WI ou WII/WIII, o resultado do teste negativo (um resultado negativo
sugere que o isolado testado no N. gonorrhoeae).
237
8,0g
Cloreto de potssio
0,2g
Hidrogenofosfato dissdico
1,78g
Dihidrogenofosfato de potssio
0,27g
gua destilada
1L
A4.3 Corantes
Corante de Giemsa (10%) (10) Klebsiella granulomatis (corpos de Donovan)
Soluo estoque:
Giemsa em p
0,5g
Glicerol
33mL
33mL
1mL
Tampo fosfato
23mL
Tampo fosfato:
Soluo 1
Na2HPO4
Soluo 2
9,47g KH2PO4
9,08g
238
Soluo B (10%)
2g Oxalato de amnia
20mL gua destilada
0,8g
80mL
Misture as solues A e B para preparar o reagente de colorao cristal de violeta. Armazene por 24 horas e filtre
utilizando papel.
239
50mL
Etanol 95%
50mL
Soluo de iodo:
Iodeto de potssio
2g
Cristais de iodo
1g
gua destilada
300mL
Soluo de trabalho
Safranina
5g
Soluo estoque
10mL
Etanol 95%
100mL
gua destilada
90mL
Colorao de Leishman
A colorao de Leishman pode ser utilizada como uma alternativa colorao de Giemsa para Klebsiella granulomatis
(donovanose, Captulo 13), aps fixar o material na lmina com metanol.
Soluo estoque:
Leishman em p
Metanol
1,5g
1L
1 parte
gua tamponada
2 partes
1. Prepare uma soluo fresca para o dia de trabalho, diluindo uma parte da soluo-estoque em duas partes de
gua destilada (gua tamponada com 3,76g/L de hidrogenofosfato dissdico e 2,10g/L de dihidrogenofosfato de
potssio, pH 7,0-7,2).
2. Armazene em uma garrafa bem vedada, para evitar que entre umidade na soluo-estoque.
240
Mtodo:
1. Prepare um esfregao das laterais da lcera (onde, normalmente, mais provvel encontrar os corpos de
Donovan) em uma lmina de vidro.
2. Cubra a lmina com soluo de trabalho do corante de Leishman, por 10 minutos, ou por at 30 minutos (corante
de Giemsa).
3. Lave a lmina com gua tamponada ou com soluo salina tamponada com fosfato (pH 7,0-7,2).
4. Deixe a lmina secar ao ar livre e, ento, examine em microscpio de luz, utilizando leo de imerso (aumento de
1.000x).
Interpretao:
Os corpos de Donovan aparecem como coco-bacilos com vacolos grandes no citoplasma de grandes histicitos e,
ocasionalmente, em clulas plasmticas e leuccitos polimorfonucleares. Os organismos aparecero azul-violeta,
normalmente, circundados por uma cpsula clara a rosa acidoflico.
Corante azul de metileno - N. gonorrhoeae (5)
Azul de metileno
Etanol
gua destilada
0,3g
30mL
100mL
241
1g
100mL
500mL
A4.5 Referncias
gua acidulada:
gua destilada ou deionizada
5g
gua acidulada
250mL
25mL
25mL
Soluo de gelatina a 5%
Gelatina, alto grau
gua acidulada
2,5g
50mL
2,5g
50mL
Soluo de revelao:
Soluo de nitrato de prata a 2%
12mL
Soluo de gelatina a 5%
30mL
16mL
A4.4 Agradecimentos
Os autores agradecem a contribuio de Rajinder Parti e
Aura Helena Corredor na preparao deste anexo.
Tambm devemos imensamente aos textos a seguir
como fontes para uma srie de protocolos:
Morse SA, Moreland AA, Holmes KK, eds. Atlas of sexually transmitted diseases and AIDS, 2nd ed. Baltimore,
Mosby-Wolfe, 1996.
242
243
Anexo 5
Materiais de laboratrio
NOTA: Os materiais de laboratrio esto listados cronologicamente, conforme aparecem em cada captulo. Indica-se
apenas o produto ou reagente e o nome do fabricante. Esta lista no tem a inteno de citar de forma abrangente todos
os fabricantes. Distribuidores locais no esto identificados.
Equipamentos
-
Centrfuga
Freezer (-70C)
Instrumento para reao em cadeia da polimerase (PCR, do ingls polymerase chain reaction)
Aparelho de eletroforese
Geladeira (4C)
Reagentes
- Agarose em p
- Brometo de etdeo
Captulo 4. Gonorreia
Equipamentos
- Balana (para pesar)
- Centrfuga
- Criotubos
245
- Geladeira (4C)
- Queimadores (bicos) de gs
- Replicador de Steer (inoculadores multiponto ou alas calibradas) (CMI-Promex Inc., NJ, EUA)
- Agitador (vrtice)
- Banho-maria
Reagentes
- gar cistena tripticase (ACT) (contendo glicose, maltose e sacarose, com concentrao final de 1-2%
(Difco, Becton, Dickinson)
- Colorao de Gram (cristal de violeta, soluo de iodo, [acetona, acetona-etanol ou etanol], safranina)
(PRO-LAB Diagnostics)
- Isovitalex/Vitox (Oxoid)
- Esses meios podem ser obtidos comercialmente por distribuidores locais ou preparados in-house
- Lminas de vidro
- Pipetas graduadas
- Placas de microtitulao
- Pipetas Pasteur
Equipamentos
- Balana (para pesar)
- Microscpio de fluorescncia
- Freezer (-80C)
- Queimadores (bicos) de gs
- Hemocitmetro
247
- Frasco a vcuo
- Agitador (vrtice)
- Banho-maria
Reagentes
- Acetona
- Anfotericina B
- Lamnulas de vidro
- Lminas de vidro
Captulo 6. Tricomonase
Equipamentos
- Geladeira (4C)
- Incubadora (37C)
- Microscpio de luz
Reagentes
- Meio de Diamond
- Meio Kupferberg
248
Materiais de consumo
- Lamnulas
- Lminas de vidro
Equipamentos
- Microscpio de luz
- Espculo
Reagentes
- Soluo salina ou soluo salina tamponada com fosfato (PBS, do ingls phosphate-buffered saline
solution)
Materiais de consumo
- Hastes com extremidades de algodo
- Lminas de vidro
Captulo 8. Candidase
Equipamentos
- Incubadora (36C)
- Microscpio de luz
Reagentes
249
- Lminas de vidro
Equipamentos
- Centrfuga
- Agitador (vrtice)
Reagentes
- Acetona
- Sacarose
Materiais de consumo
- Hastes com as pontas em algodo, dacron ou com flocos de nylon
- Tubos de cultura
- Anticorpos monoclonais tipo-especficos, marcados com FITC ou imunoperoxidase (para ser utilizado
diretamente nas clulas infectadas)
- Espculo vaginal
250
Testes
- NAAT (disponvel comercialmente, mas no aprovado pela Administrao de Alimentos e Drogas dos
Estados Unidos da Amrica).
- Testes POC rpidos para a deteco de antgeno de HSV esto disponveis comercialmente, mas no foram
amplamente avaliados.
Equipamentos
- Analisador gentico ABI 310 (Applied Biosystems)
- Leitor de ensaio imunossorvente ligado enzima (ELISA, do ingls enzyme-linked immunosorbent assay)
- Microscpio de fluorescncia
- Freezer (-70C)
- Geladeira
- Sonicador
- Banho-maria
Reagentes
- Acetona
- Fluorescena
- Fluorescena conjugada
- Soluo PBS
- Vermelho tolueno
Materiais de consumo
- Alas bacteriolgicas ou esptula de ao inoxidvel
- Hastes com extremidades de algodo
- Lminas para microscpio
251
Teste da toluidina vermelha com soro no aquecido (TRUST, do ingls toluidine red unheated serum
test; New Horizon Diagnostics)
Teste do Laboratrio de Pesquisa de Doenas Venreas (VDRL, do ingls Venereal Disease Research
Laboratory)
Teste
- O ensaio molecular para distinguir linhagens LGV e no-LGV baseado na deteco do gene pmpH, o qual
est presente apenas nos isolados LGV.
Equipamentos
- Centrfuga
- Freezer (-70C)
252
Reagentes
- Deteco de fosfatase alcalina (n-butanol, tampo citrato-hidrxido de sdio de Srensen [0,01mol/L],
2,6-dibromoquinona-4-clorimida em metanol [5g/L], fosfato dissdico sem fenol)
- Teste de reduo de nitrato (soluo de nitrato de sdio [0,5g/L]; tampo fosfato, pH 6,8 [0,025 mol/L];
cido actico [5mol/L]; -naftilamina [5g/L])
- Teste de porfirina (soluo de sulfato de magnsio; tampo fosfato, pH 6,9 [0,1mol/L]; cloridrato de cido
-aminolevulnico [2mol/L])
- Alas bacteriolgicas
Equipamentos
- Microscpio de luz
- Etanol a 95%
- Parafina
- Lminas de vidro
Materiais de consumo
Equipamentos
- Balana (para pesar)
- Centrfuga
- Aparelho de eletroforese
- Microscpio de fluorescncia
- Freezer (-70C)
253
- Geladeira
- Incubadora (37C)
- Forno de microondas
- Pipetador (Pipet-aid)
- Transiluminador ultravioleta
- Agitador (vrtice)
- Banho-maria
Reagentes
- cido actico
- P de agarose ou poliacrilamida
- Marcadores sorolgicos
Materiais de consumo
- Lminas de vidro
Kit de genotipagem para HPV multiplex (Multimetric)
- Ensaio de mRNA para HPV
Equipamentos
- Centrfuga
- Aparelho de eletroforese
- Microscpio de fluorescncia
- Freezer (-25C)
- Geladeira
- Incubadora (37C)
- Pipetador (Pipet-aid)
- Banho-maria
Reagentes
- P de acrilamida
- leo de imerso
- Anticorpos monoclonais marcados para citmetro de fluxo (anti-CD4, -CD3, -CD8 e -CD45)
Materiais de consumo
- Calibradores de pipetas
- Tiras de membranas (com protenas ou protenas recombinantes ou peptdeos especficos para HIV,
separados)
Testes rpidos
Ensaios de imunofluorescncia
Ensaios de WB
Imunoensaios em linha
- Testes moleculares
Agradecimentos
Os autores agradecem as contribuies de Rajinder Parti e Aura Helena Corredor na preparao deste anexo.
255