Enzimas

BrenesC*,CastroG*,MarotoD*,MarnD*
Resumen
Las actividades vitales delosseres vivosno sonms que un conjuntode reaccionesqumicas
entre las clulas, realizadas a gran velocidad, gracias a presenciade catalizadoresorgnicos,
llamados enzimas. Las enzimas son protenas especializadas que tienen como funcin la
catlisis o regulacin de la velocidad de las reacciones qumicas que se llevan a cabo.Cada
reaccin qumica es catalizada por una enzima especfica por lo que se clasifican segn su
funcin.El objetivo de laprcticaesdeterminarlapresenciadeenzimasen lostejidosal realizar
tres experimentos sencillos.Enelprimerosedemostr laactividad deinvertasaenlalevaduraal
exponerla a temperaturas altas. Posteriormente, utilizando rbano morterizado y filtrado yuna
solucin indicadora, mediante un anlisis espectrofotomtrico se observ el desarrollo de la
reaccin yla accindelasperoxidasas.Finalmente,eltercerexperimentoseutilizarontrozos de
papay una solucin de trifeniltetrazolioal 0,5%. Seexpusolostrozosdepapaavariosfactores
como oscuridad y calor para analizar la actividad de las deshidrogenasas. Los resultados
indicaronque elsupernatante de levadura hervidoluegodecalentarlopermanecicolorazulpor
la desnaturalizacin de las invertasas, la velocidad de reaccin en la solucin de extracto de
rbano y guayacol (segn elcambiode color)medidoademsconelespectrofotmetroyqueel
tubo con trozos de papa a temperatura ambiente y cubiertos con papel aluminio se pusieron
rojasdebidoaladegradacindelTTCaformazn,fenmenoquenoocurreeneltubohervido.

Palabrasclave:
catalizadores,deshidrogenasas,desnaturalizacin,formazn,
guayacol,invertasas,peroxidasas,protenas,TTC

Marcoterico

Las enzimas son protenasqueactancomocatalizadores dereacciones especficas,

su actividad esta enfocada en simplificar y acelerar el alcance de la energia de
activacion (Monge
et al. 2002). Pueden sufrir cambios en su composicin y accin,
llamados desnaturalizacin, son ocasionados por factores como altas temperaturas,
niveles extremos de pH, polaridad de algn disolvente o fuerzas inicas (Gonzlez,
2015).

Algunasenzimas necesitancofactores paraempezarsulabor,estospuedenser

iones metlicos, molculas orgnicasovitaminas.Los cofactores son especficospara
cadaenzima,ycada enzima generaunproductoespecficodelosdiferentessustratos
(Avilez,2009).

*Estudiantes de la carrera de Ingeniera en Biotecnologa. Laboratorio de Fisiologa

Vegetal.EscueladeBiologa.InstitutoTecnolgicodeCostaRica.
Existen distintos sistemas enzimticos que catalizan reacciones que les son
propias.Entre ellos se encuentran las invertasas,quesegn McMurry (2012)catalizan
la hidrlisisde sacarosa a glucosa y fructosa,lasperoxidasascatalizanlaoxidacinde
los substratos por elperxido de hidrgeno (Tortora
etal.2007)ylasdeshidrogenasas
sonuntipo de oxidorreductasas,queoxidancompuestosorgnicosporlatransferencia
dedostomosdehidrgeno(Ferreiro,J.2006).

ElreactivodeBenedictesunadisolucindesulfatodecobreII,citratodesodioy
carbonato de sodio, que permite identificar los carbohidratos simples (Bolaos
et al.
2003). TCC identifica los tejidos metablicamente activos, la transferencia de
electronesenreaccionesredox.

ObjetivoGeneral
Demostrarlapresencia devariasenzimas,definirsumodo deaccinycuantificarlasen
algunostejidos.

ObjetivosEspecficos
Utilizarreactivosparaidentificarlaactividaddeciertasenzimasenlostejidos.
Analizar y cuantificar, utilizando un espectrofotmetro, la actividad de las enzimas en
reacciones.
Observar y explicar el efecto de ciertos factores en el funcionamiento de ciertas
enzimas.

Metodologa
PresenciadeInvertasas
Setrituraron5 g de levaduraen 10ml deagua destilada y secomplethasta25
ml con agua destilada. Se dej reposar por 20 min y se centrifug durante 5 min a

500g. El lquido supernatante sedistribuy en dostubos deensayo.Uno delos tubos

secalenthastaebullicinyelotrosedej atemperaturaambiente.Posteriormente,se
le agregaron 25 ml de solucin de sacarosa al 2% a cada tubo y se dej en reposo
durante 30 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se le agregaron 2ml de
Benedict a cada tubo y para acelerar el proceso, se calent ambos tubos con un
mechero.
PresenciadePeroxidasas
Para extraer lasperoxidasas, sepelunrbanoysecortentrozospequeos
y delgados. Estos trozos setrituraronutilizando un mortero y se agreg 20mldeagua
destilada. Despus se filtr en un beaker con doble gaza, y se trasvas a un baln
aforado mantenido en una fuente con hielo. El baln se complet a 100mlcon agua
destilada.
Parapreparar lasolucin indicadora,seagreg a un tubo deensayo0.01mlde
guayacol puro, 2 ml de aguaoxigenada0.1% , 2mldeaguadestiladayseagitpara
disolverelguayacol.
Parapreparar elblanco, se coloc en otrotubo deensayo0.01 mldeguayacolpuro,1
ml de extracto de peroxidasa y 7 ml de agua. Con esta preparacin se calibr el
colormetroa500nm.
Finalmente ,en otrotubodeensayoseagreg1mldeperoxidasa, 3mldeagua
destilada y se coloc toda la solucin indicadora recin preparada, rpidamente se
mezcl. Esta muestra se coloc en un tubo del espectrofotmetro y se ley la
absorbancia a 500nm cada 20 segundos para medir la velocidad de formacin del
producto.

PresenciadeDeshidrogenasas
Se pelo una papa y se cort varios palitos finos iguales. Se coloc lamitadde
ellos en un tubo de ensayo y se cubri con la solucin de trifeniltetrazolio al 0.5%
(TTC). Rpidamente se envolvi el tubo con papel aluminio para darle oscuridad.
Despus de 30 min se observ el desarrollo de color rojo al reducirse el

compuesto.Los restantes trozosdepapa se hirvieron durante 5 min en un beaker

conagua,sedejaronenfriarysetrataronigualqueeneltratamientoanterior.

Resultados

PresenciadeInvertasa

El cuadro 1 muestralos resultados obtenidos despus decalentarlostubosdeensayo

que contenan supernatante de levadura, sacarosa y benedict, con un mechero. Ver
figura2enlosanexos.

Cuadro1.Observacionesalaplicarlelasdistintassolucionesalsupernatantede
levadura

Tubo1(Hervido)

Tubo2(Tempambiente)

Supernatante

Colorcafclaro

Colorcafclaro

Supernatante+sacarosa

Colorcafclaro

Colorcafclaro

Supernatante

Colorazul

Colorazul

+sacarosa+benedict
Despusdecalendarcon Permanecicolorazul

Setornocolor

mechero

anaranjado
Fuente:EstudiantesdeLaboratoriodeFisiologaVegetal,ITCR.2015

PresenciadePeroxidasa

El cuadro 3 describe lo observado al mezclar 1 ml de peroxidasa, 3 ml de agua

destiladaylasolucinindicadora.Verfigura3enlosanexos.

Cuadro2.Observacionesdelasmuestraspreparadas

Muestra

Observaciones

Peroxidasa

Incoloro

Solucinindicadora

Incoloro

Peroxidasa+solucin

Colorrojizo

indicadora
Fuente:EstudiantesdeLaboratoriodeFisiologaVegetal,ITCR.2015

La figura 1 muestra los resultados de la absorbancia (nm) obtenidos cada 20 seg a

500nm.

Figura1.Grficodelaabsorbanciaeneltiempoconlosvaloresmedidos

Fuente:EstudiantesdeLaboratoriodeFisiologaVegetal,ITCR.2015

PresenciadeDeshidrogenasa


El cuadro 3 describe lo observado 30 min despus de haberle aplicado el TTC y de
cubrirambostubosdeensayoconpapelaluminio.Verlafigura4enanexos.

Cuadro 3.Observacionesdespus de30min de aplicar elTTCal tubo de ensayocon

papaatemperaturaambienteyaltubodeensayoconpapahervido.

Tubo1

Tubo2

Temperaturaambiente

Hervido

Despusde1530min

Lapapacambioaun

Lapapanocambide

deaadirleelTTC

colorrojizo

color,semantuvoigual

Fuente:EstudiantesdeLaboratoriodeFisiologaVegetal,ITCR.2015

Discusin.

Parael anlisisde laaccindeinvertasas,seconsiderquesuobtencinconel

centrifugado dela levaduracon agua destilada permiti adquirirladeuna manerams
precisa, las levadurastransforman lasacarosaen una mezcladeglucosayfructosa,y
sedenomina alamismacomoazcarinvertido,graciasalaenzimallamadainvertasa
que segregan las levaduras al medio. (Hidalgo, J. 2011). Las enzimas estuvieron
sometidas a la desnaturalizacin trmica en el tubo 1, por loque lavelocidad de una
reaccin catalizada por una enzima disminuye abruptamente al aumentar la
temperaturaporarribadelosoportadoporlaenzima.(Voet,D.
etal.
2006).
La actividad enzimtica depende de diversos factores entre ellos destaca la
temperatura,en la cual lavelocidaddelamayoradelasreaccionesqumicasaumenta
amedida que aumenta latemperatura. Las molculas se desplazan ms lentamentea
bajas temperaturas que a temperaturas elevadas, lo que implicaque en presenciade

bajas temperaturas la energa podra ser insuficiente para provocar una reaccin
qumica. (Case, C.
et al. 2007). Por lo tanto, como se mencion anteriormente en el
marco terico el reactivo Benedict permiti encontrar los carbohidratos simples. Al
habercalentado eltubodeensayo 2 seacelerlaaccindelasinvertasasysemostr
conel cambiodecolor naranjamarrn. Sin embargo,enel tubo 1 ladesnaturalizacin
de enzimas no provoc ningn cambio en el sustrato (sacarosa), por ello el color se
mantuvoazul.
Para la seccin de la actividad enzimtica de peroxidasas y su funcin
catalizadora de sustratos en el perxido de hidrgeno, se analiz de la siguiente
maneraparala solucinindicadora,lasperoxidasasfueronobtenidasapartirdeltejido
del rbano,el guayacol cumpli lafuncin de indicadordelapresenciadeperoxidasas
que actuaron sobre el H2O2 reducindolo a agua como se observa en la ecuacin:
H2O2 + AH2 2 H2O + A. Mientras que el blanco fue utilizado como control en la
lecturadelespectrofotmetro.
Este blanco en la calibracindel espectrofotmetro tienecomo findeterminar la
funcin matemtica que permite transformar su respuesta (la absorbancia) en el
contenido de ese componente. Su grficaeslarectadecalibracin,estacalibracines
especfica para cada anlisis en que intervenga el equipo. Los patrones son
disoluciones (en este caso es el blanco, con el guayacol puro y el extracto de
peroxidasas).(Canela,M.2002).
Por lo tanto, laFigura 1 queindicala absorbancia de la reaccin dela solucin
indicadorajuntocon peroxidasa, mostr quelos ltimostres valores enlaabsorbancia
comenzaron a ser constantes, esto a causa de que la velocidad de reaccin est
determinada por la cantidad de sustrato que se convierte en producto por unidad de
tiempo. En presencia de una concentracin de sustrato relativamente reducida, la
velocidad de la reaccin aument a medida que se increment la concentracin de
sustrato. Sin embargo, a partir de un punto dado, el incremento adicional de la
concentracin de sustrato ya no se acompaa de un aumento de la velocidad de

reaccin debido a que el sustrato debe combinarse con molculas de enzima para
formarelproducto.(Hill,R.
etal.
2006).
Por otro lado, el estudio de la actividad de las deshidrogenasas, las cuales
oxidan compuestos orgnicos debido a la transferencia de dos tomosdehidrgeno,
muchas transfierenlos hidrgenosseparadosaunoodosdelas siguientescoenzimas:
NADyNADP.Atravsdeestascoenzimaselhidrgenoentraenlacadenarespiratoria
o participa en procesos biosintticos de reduccin. Por lo tanto, la actividad
deshidrogenasa es un indicador de los sistemas redox biolgicos, y solo se da en
clulasvivas(Ferreiro,J.2006).EsutilizadoporqueestareduccindelTTCaformazn
(color rojizo,el cual se observ en eltuboatemperaturaambiente),esrealizadaporel
intercambio de los tomos de hidrgeno en la mitocondria de la clula, al haber
calentado la papa en el tubo 2 se perdi la actividad enzimtica a causa de su
desnaturalizacin, pero si hubo presencia de su actividad en el tubo 1 (temperatura
ambiente).(Voet,D.
etal.
2006).

Conclusiones
La actividad de las enzimasseveafectada al exponerlasatemperaturasaltas,
por eso en el experimento de la levadura, elindicadorBenedict enel tubo de ensayo
hervido no cambia de color al calentarlo por la desnaturalizacin de las enzimas. De
formasimilar enelexperimentocontrozosdepapa,alhervirlosysertratadosconTTC,
no hubo cambio de color ya que esta solucin no se redujo a formazn por la
desnaturalizacin de las deshidrogenasas. Respecto a la velocidad de reaccin, se
utilizunanlisis deespectrometraparamedirlareaccindelperxidodehidrgenoa
aguamediantelasperoxidasasenlasolucinderbanoyguayacolpuro.

Literaturacitada

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Anexos

Figura2.Tubosdeensayoconsupernatantedelevaduraybennedictdespusde
habersidocalentadosconmechero.
Fuente:EstudiantesdeLaboratoriodeFisiologaVegetal,ITCR.2015


Figura3.Tubodeensayocon1mldeperoxidasa,3mldeaguadestiladaylasolucin
indicadoradespusdehabersidocolocadoenelespectrofotmetro.
Fuente:EstudiantesdeLaboratoriodeFisiologaVegetal,ITCR.2015


Figura4.Tubosdeensayoconpapahervidayatemperaturaambiente30mindespus
dehaberaadidoelTTC.
Fuente:EstudiantesdeLaboratoriodeFisiologaVegetal,ITCR.2015