METODOLOGIA PARA EL ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS

INTRODUCCION
La proliferacin masiva cada vez ms frecuente de organismos Fito
planctnicos que da origen a episodios txicos est determinada por
las condiciones ambientales del medio en el que vive y la influencia
de un gran nmero de factores fsicos (salinidad, temperatura, luz) y
qumicos como la presencia de nutrientes (nitrgeno, fosforo, etc),
debido al aumento de la contaminacin de aguas.
Entre las contaminaciones ms importantes de alimentos de origen
marino por proliferaciones de algas toxicas y consecuentemente de
humanos

consumidores

intoxicaciones

PSP

de

los

Intoxicacin

mismos
Paraltica

se

encuentran

por

Mariscos,

las
DSP

Intoxicacin Diarreica por Mariscos y ASP Intoxicacin amnsica por

mariscos.
En este documento se hizo un protocolo de anlisis para la
determinacin de biotoxinas marinas.

PROCEDIMIENTO (MOLUSCOS BIVALVOS)

Preparacin de la muestra

Lavar cuidadosamente el exterior del marisco con agua dulce.

Abrir cortando el msculo aductor.
Se lava el interior con agua dulce para eliminar arena y otras sustancias
extraas.
Se separa la carne de las valvas.
Se recoge de 150 a 200 gramos y se coloca en un tamiz para dejar
escurrir 5 minutos. El lquido filtrado se desecha.
Se procesa en una licuadora hasta consistencia homognea.

Preparacin del extracto cido

Se coloca 100 gramos del material bien mezclado en un recipiente

resistente al calor.
Se aade solucin acuosa 0.1N de HCl: 100 ml
Se calienta la mezcla y se hierve suavemente durante 5 minutos
Se deja enfriar

Se toma pH del lquido. Debe ser menor de 4.5 con papel medidor del pH.
Si se necesita disminuir el pH: utilizar una solucin 5 N HCl gota a gota
Si se necesita aumentar el pH: utilizar una solucin 0.1 NaOH gota a gota
Se traslada la mezcla a una probeta graduada y se completa a 200 ml
con agua pura o
levemente acidulada
Se agita, se coloca en tubos de centrfuga y se centrifuga a 3000 rpm
durante 5 minutos
El lquido sobrante es el extracto cido

Prueba en ratones (Respuesta biolgica- SOMMER- MAYER 1957)

Extracto cido de moluscos: pH 3-4

Unidad Ratn: Cantidad de toxina para matar un ratn de 20 gramos de
peso en 15
minutos
Estandarizacin: tiempo de muerte 5-7 minutos
Se utilizan ratones sanos, hembras, de 19- 21 gramos, cepa CF1. Si pesan
menos de 19 ms de 21 se aplica el factor de correccin de masa del
mismo (tabla de SOMMER)
Va intraperitoneal: 1 ml de extracto cido. Se anota el momento de
inoculacin y el tiempo de muerte (ltimo movimiento respiratorio).
Si el tiempo de muerte es menor a 5 minutos de varios ratones, se diluye
con solucin fisiolgica acidulada pH 3 para obtener un tiempo de 5 a 7
minutos.

Clculo de toxicidad

Determinar tiempo medio de muerte de los ratones y usar tabla de

SOMMER
Clculo para determinar unidades ratn:

VALOR TIEMPO MUERTE * FACTOR DE CORRECCIN DE PESO * 200= U.R. (si

se realizan
diluciones se agrega el FACTOR DE DILUCIN)

STX/100 g de tejido de marisco, con una precisin de 15-20 por ciento. Un

elevado contenido de sal en la muestra produce interferencias al inhibir los
efectos txicos. Las dificultades prcticas que presenta este mtodo son:

Es necesario contar con una colonia de ratones de entre 19 y 22 g de

peso.
El lmite de deteccin del ensayo vara segn la cepa.
La relacin entre el tiempo hasta la muerte y la concentracin de toxinas
no es lineal.
La determinacin exacta del tiempo hasta la muerte es muy trabajosa; y
conlleva el sacrificio de un gran nmero de animales.

Intoxicacin Diarreica por Mariscos (DSP)

Bioensayo en ratn
Extraer las toxinas con acetona del tejido de marisco, evaporar y disolver el
residuo obtenido en un volumen pequeo de 1% Tween 60. El extracto se
inyecta intraperitonealmente a ratones de 20 g de peso corporal y se
registra la supervivencia entre 24 y 48 horas. Una unidad ratn (UR) es la
cantidad mnima de toxina necesaria para causar la muerte de un ratn en
24 horas. La toxicidad de la muestra (UR/g de tejido entero) se determina a
partir de la dosis ms pequea que causa la muerte de dos o ms ratones,
de un grupo de tres, en 24 horas. Este ensayo probablemente detecta todos
los componentes DSP, incluidas aquellas toxinas DSP que no causan diarrea
(las PTX e YTX) y cuya toxicidad en seres humanos se desconoce.
Las principales desventajas de este ensayo son, la falta de especificidad (no
hay diferenciacin entre los distintos componentes de las toxinas DSP), la
subjetividad del tiempo de muerte de los animales y la necesidad de contar
con animales de laboratorio para sacrificarlos posteriormente. Adems, el
ensayo requiere mucho tiempo, es costoso y puede resultar en falsos
positivos por interferencias de otros lpidos.
Ensayo con Daphnia magna
Vernoux et al., (1994) desarrollaron un ensayo con Daphnia magna para
analizar el AO en extractos de mejilln. Los autores concluyeron que el
mtodo es sensible y poco costoso. Adems, puede utilizarse en lugar del
bioensayo en ratn para separar el cido ocadaico y algunas toxinas
coextractantes en el mejilln. El mtodo de extraccin utilizado permite
determinar el cido ocadaico y la DTX1. El bioensayo con Daphnia mide
concentraciones de AO hasta 10 veces inferiores al umbral del bioensayo en
ratn. ()

Intoxicacin amnsica por mariscos (ASP)

Bioensayo en ratn
El ensayo en ratn para las PSP impone la extraccin con agua en medio
cido del tejido (animal entero u rganos seleccionados), seguido de
inyeccin intraperitoneal de 1 ml del extracto en ratones. Se registra el

tiempo transcurrido (en general menos de 15 minutos) desde la inyeccin

inicial a la muerte del ratn.

Intoxicacin neurolgica por mariscos (NSP)

Bioensayo en ratn
En el bioensayo en ratn se evala la toxicidad inyectando
intraperitonealmente extracto lpido en bruto de mariscos en ratones. Los
resultados se expresan en unidades ratn (UR), (Hokama, 1993). Una UR se
define como la cantidad de residuo txico en bruto que promedialmente
matar al 50 por ciento de los animales de laboratorio (ratones de 20 g) en
930 minutos (Dickey et al., 1999). El mtodo de preparacin de muestras
empleado est basado en la extraccin con acetona de estos componentes
lipfilos seguido por separacin con diclorometano.
Bsicamente, cualquier nivel detectable de brevetoxinas por 100 g de tejido
de marisco es considerado como potencialmente inseguro para consumo
humano. En la prctica, se adopt una toxicidad residual de 20 UR por 100
g de tejido de marisco, que permanece como el valor gua para prohibir la
cosecha de mariscos (Dickey et al., 1999).

Intoxicacin por azaspiracida en mariscos (AZP)

Bioensayo en ratn
Los ratones se inyectan intraperitonealmente con extractos de mejillones
igual que en los inmunoensayos para determinar DSP. Los resultados
sugieren que las azaspiracidas pueden extraerse de la carne cruda con
acetona debido a una mayor solubilidad por la presencia de agua y lpidos
en la carne (EU/SANCO, 2001).

Intoxicacin ciguatera por pescados (CFP)

Bioensayo en ratn
El mtodo consiste en inyectar por va i.p. en los ratones (intraperitoneal)
extractos txicos crudos o semi purificados diluidos serialmente, observando
los sntomas durante 24 horas. Ha sido descrito para detectar ciguatoxinas
en hasta 20 mg de extracto etreo de carne de pescado. La fraccin de
eterdietlico que contiene la ciguatoxina se suspende en 5 ml de una
solucin salina 1-5% Tween 60/0.9% y se inyecta intraperitonealmente en
ratones de ambos sexos (20 2 g). Los ratones son continuamente
observados durante las dos primeras horas y pasadas stas se realizan
inspecciones regulares. Se ensayan dos ratones para cada fraccin. Los
ratones se mantienen a 23 2 o C y se observan durante siete das,
registrndose los sntomas y los tiempos que tardan en morir.
Intermitentemente se toma la temperatura rectal. Para cuantificar cada
fraccin se emplea la relacin entre la dosis y el tiempo que les toma morir.
La letalidad total se expresa en unidades ratn (UR). Para las mezclas de

ciguatoxinas encontradas en los peces carnvoros (Lewis y Sellin, 1992;

Lewis et al. 1991) esta relacin la aproxima log UR = 2,3 log (1 + T-1),
donde UR es el nmero de unidades ratn de ciguatoxina inyectada y T es el
tiempo en horas que tarda en morir (ver tambin el Cuadro 7.2).

METODOLOGA PARA LA DETERMINACIN DE CIDO DOMOICO

(BIOTOXINA ASP) EN MOLUSCOS BIVALVOS POR CROMATOGRAFA
LQUIDA DE ALTO RENDIMIENTO (HPLC)
Preparacin de la muestra
-

Se tomara 1000 gramos aproximadamente de moluscos bivalvos.

(concha de abanico).

limpiar con agua dulce los bivalvos para eliminar la arena.

Separar la carne de la concha, seccionando los msculos aductores y

el tejido junto a la charnela recogiendo en un rango de 100-150 g.

Se acondicionara para permitir su drenado durante 5 minutos, se

eliminara el drenado, y se homogenizara la con una licuadora hasta
obtener una masa homognea.
Proceso de extraccin

Se pesara 4 g de muestra preparada directamente en un tubo de

centrfuga adicionando 16 mL de metanol 50%.

Homogenizar durante 3 minutos en el vortex y despus se centrifugar

a 5000 rpm durante 15 minutos.

Filtrar 1-5 mL del sobrenadante a travs de filtros de membrana de

0,45 mm.

Inyectar soluciones patrn de cido domoico dentro del rango de 5-30

mg/L.
Diseo Experimental

Los ensayos se realizaran con las muestras previamente homogenizadas en

das diferentes, para cuantificar el cido domoico expresado en mg/g. Se
trabajara con 3 niveles de concentracin diferentes, adicionados a la
muestra dejando asi en contacto la solucin estndar con las muestras
durante unas horas bajo refrigeracin, se realizara el tratamiento y se hara
las

lecturas

de

los

resultados

de

las

muestras.

La especificidad del mtodo se represent mediante los espectros de los

estndares y el reporte de su correspondiente pureza en las muestras. Para
evaluar la especificidad del sistema se trabajara con la solucin estndar,
mediante el software del equipo.