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ANTICUERPOS MONOCLONALES Y SU
APLICACION EN HEMATOLOGIA.
RAMON F. MONTAO y EGIDIO L. ROMANO.
Ramn Montao, bilogo venezolano con postgrado en Inmunologa. Profesional de Investigacin del
IVIC, en el Centro de Medicina Experimental. Actualmente finaliza estudios a nivel de Doctorado en
Inmunologa en el IVIC y su ms reciente rea de trabajo ha sido el desarrollo, la produccin y
caracterizacin de anticuerpos monoclonales humanos. Direccin: Centro de Medicina Experimental,
IVIC, Apartado 21827, Caracas 1020-A, Venezuela.
Egidio Romano: Mdico venezolano con postgrado en Bioqumica e Inmunologa. Investigador Titular
del IVIC, en el Centro de Medicina Experimental Sus campos principales de trabajo son la
Inmunohematologa y la Inmunoqumica aplicadas fundamentalmente a enfermedades de la sangre.
Direccin: Laboratorio de Fisiopatologa, Centro de Medicina Experimental, IVIC, Apartado 21827,
Caracas 1020-A.
RESUMEN
Desde su descubrimiento hacia finales del siglo pasado, los anticuerpos han
sido considerados molculas con una enorme potencialidad analtica debido a
su exquisita especificidad. Pero fue solo despus de la introduccin por Khler
y Milstein en 1975 de la tcnica para producir in vitro anticuerpos con una
especificidad predeterminada, que estos reactivos pusieron de manifiesto su
tremenda versatilidad prctica. La posibilidad de producirlos en grandes
cantidades y en forma pura y adems el estar bien caracterizados
qumicamente ha permitido que los anticuerpos monoclonales (as se llama al
producto obtenido de la aplicacin de la mencionada tcnica) sean objeto de
mltiples aplicaciones. Las ms tempranas, afines de los aos setenta y
principios de los ochenta, se relacionaron con pruebas de histocompalibilidad y
reconocimiento de molculas de diferenciacin en clulas normales o
tumorales y con el reconocimiento de eptopos especficos en virus, bacterias y
otros microorganismos, o en molculas individuales de protenas,
carbohidratos, cidos nucleicos, etc. Ello redund en un conocimiento ms
detallado de distintas subpoblaciones celulares, de los diferentes estadios de
diferenciacin celular en diversos tejidos, en un mejor tipeaje celular, en una
mejor identificacin de microorganismos y de sus variedades tanto para
diagnstico como para epidemiologa y en una gran cantidad de pruebas
diagnsticas tipo ELISA y radioinmunoensayo. En su versin original la tcnica
descrita por Khler y Milstein permite la produccin de anticuerpos
monoclonales de origen mrido, los cuales han sido y son actualmente de gran
utilidad dentro del campo de la hematologa y medicina en general.
Desgraciadamente, su uso en aplicaciones teraputicas y en el diagnstico in
idnticos unos a otros, "monoclonales", todo lo que hace falta es poder cultivar
en forma continua, en condiciones de laboratorio, un clon de linfocitos B. En el
sobrenadante de esos cultivos, se tendrn secretados los anticuerpos
monoclonales deseados.
Desgraciadamente, dada su naturaleza "mortal", los linfocitos B son incapaces
de crecer en cultivo ms all de una semana. De esta manera, el obstculo
fundamental para producir anticuerpos en el laboratorio reside en lograr cultivar
en forma continua los linfocitos B. A principios de los aos setenta ya se
dispona de la capacidad tcnica para el cultivo in vitro de ciertas clulas
malignas, entre ellas los linfocitos B provenientes de un tipo de tumor llamado
mieloma mltiple o plasmacitoma. Estas clulas tienen la capacidad de crecer
continua y cionognicamente, es decir, de forma que una sola clula puede
multiplicarse y originar muchas otras idnticas. En 1975, George Khler y
Csar Milstein, en un trabajo seminal que les vali posteriormente el Premio
Nobel, demostraron que es posible fusionar o hibridar clulas de mieloma con
linfocitos B, que los hbridos resultantes heredan la capacidad para crecer
indefinidamente en cultivo y para producir anticuerpos, y que adems es
posible aislar del producto heterogneo de fusin. aquellos hbridos
productores del anticuerpo en el que se est interesado (Khler y Milstein,
1975).
En su forma inicial, la tcnica descrita por Khler y Milstein permite la obtencin
de anticuerpos monoclonales de ratn. Mediante el uso de tcnicas similares
se han preparado reactivos monoclonales provenientes de otras especies e
incluso de origen humano (James y Bell, 1987; Glassy, 1993). La presente
revisin pretende desarrollar, en una forma accesible al lector no especialista,
los aspectos ms resaltantes de estas metodologas, haciendo nfasis en las
tremendas posibilidades prcticas de estos reactivos y en los avances
recientes para su produccin.
El proceso de produccin de un anticuerpo monoclonal implica entonces la
generacin de los hbridos o, ms apropiadamente, de los hibridomas
productores del mismo y ello involucra una serie de pasos o etapas esenciales,
las cuales se describen a continuacin.
Produccin de Anticuerpos Monoclonales de origen Mrido
Inmunizacin
En teora, es factible producir anticuerpos monoclonales especficos para
cualquier antgeno capaz de ser reconocido por los linfocitos B. Para la
inmunizacin es conveniente el uso de preparaciones puras de antgeno en las
cuales el peligro de competencia antignica, que pudiese desviar la respuesta
inmune humoral hacia una molcula irrelevante, no existe. Pero en muchos
casos el antgeno de inters se encuentra en una molcula de la superficie
celular difcil de aislar, lo que obliga a la utilizacin de clulas Completas o
extractos de membranas para la inmunizacin (Goding, 1980). En otros casos,
por ejemplo cuando se trata de drogas o molculas pequeas, stas deben ser
Clonamiento
Para obtener una preparacin monoclonal de anticuerpos, es necesario aislar
clones de clulas, en los que cada una es rplica exacta de la otra. El
procedimiento mediante el cual se obtienen muchas clulas idnticas por
replicacin a partir de una sola se denomina clonamiento. El mtodo ms
comn consiste en sembrar suspensiones celulares a gran dilucin de manera
que en un volumen dado pueda haber en promedio de ninguna a unas pocas
clulas. Una dificultad de este mtodo llamado de dilucin al lmite (Harlow y
Lane, 1988), es que las clulas no crecen bien cuando estn aisladas. La
manera usual de resolver este problema es utilizar clulas nodrizas,
generalmente fibroblastos o macrfagos, que proveen la ayuda necesaria para
el crecimiento a baja densidad (James y Bell, 1987). Otro procedimiento menos
empleado para el aislamiento de los hibridomas es la siembra en medios
semislidos de cultivo, la posterior toma de las colonias y su siembra en medio
lquido (Freshney, 1987).
Escalamiento de la produccin de anticuerpos monoclonales
Una vez que se han superado todos los inconvenientes y se ha logrado obtener
el hibridoma productor del anticuerpo deseado, el prximo paso es su cultivo a
escala para obtener el anticuerpo en las cantidades deseadas. La produccin a
mediana escala de los anticuerpos se puede efectuar inoculando el hibridoma
correspondiente en la cavidad peritoneal de ratones singnicos a la lnea de
mieloma utilizada para la fusin y hacindolo crecer como un tumor
mielomatoso, obtenindose el anticuerpo en forma de lquido asctico
(Gavilondo, 1990). A ora escala de produccin, el cultivo se puede hacer en
botellas rotatorias, en fibras huecas o en fermentadores especiales diseados
para tal fin (Freshney, 1987; Corrigan, 1988; Lubiniecki, 1990). Para
aplicaciones clnicas el anticuerpo debe estar caracterizado tanto qumica como
funcionalmente y con un alto grado de pureza (Sullman, 1989; Lucas, 1989;
Ronneberger, 1989). Otro aspecto de importancia para la produccin es et
almacenaje de los hibridomas. Esto se logra mediante congelamiento en
tanques especiales de nitrgeno lquido, en los cuales las clulas son
congeladas cuando se encuentran creciendo en fase exponencial y con un alto
ponerle de viabilidad. (Daggett y Simione, 1987).
Resumen del Proceso de Produccin de un Anticuerpo Monoclonal
Mrido
En la figura 1 se esquematizan los pasos necesarios para el desarrollo de
hibridomas productores de anticuerpos monoclonales de ratn.
"galactosa (alfa 1-3) galactosa" (Galili et al., 1984). El problema con los
anticuerpos anti-Gal es que el azcar galactosa (alfa 1-3) galactosa se
encuentra presente en el componente glicosdico de las Igs de ratn (Thall y
Galili, 1990; Borrebaeck et al., 1993; Lund et al., 1993). En consecuencia, se ha
postulado que las Igs de ratn, al ser administradas pasivamente en un ser
humano, seran rpidamente reconocidas por los anticuerpos anti-Gal,
pudiendo neutralizarse los efectos teraputicos buscados, incluso antes de la
aparicin de la mencionada respuesta HAMA (Borrebaeck et al., 1993).
Estudios recientes indican que la enzima responsable de la incorporacin del
azcar Gal (alfa 1-3) Gal en glicoprotenas y otras biomolculas no es activa en
los seres humanos y en consecuencia las Igs humanas no poseen esta
estructura (Galili y Swanson, 1991).
Ahora bien, las diferencias en el patrn de glicosilacin de las Igs entre el
humano y el ratn pudieran ser importantes en otro contexto, el de la fisiologa
y las funciones efectoras de estas molculas. Un nmero considerable de
evidencias indica que el componente glicosdico de los anticuerpos es un
elemento modulador de su capacidad para mediar la activacin de la cascada
del Complemento, la actividad citotxica dependiente de anticuerpos (ADCC), y
parmetros como la vida media biolgica en tejidos y en la sangre (Koide et al.,
1977; Walker et al., 1989; Tao y Morrison, 1989; Wright et al., 1990; Lund et al.,
1990; Dorai et al., 1991; Morrison, 1992; Wawrzynczak et al., 1992; Hand et al.,
1992). Por esta razn los anticuerpos de ratn pudieran resultar ineficientes
para mediar, en el cuerpo humano, las mencionadas funciones efectoras y/o
verse alterada su fisiologa.
Otro obstculo lo constituye la forma cmo el sistema inmune del ratn
"reconoce" a los antgenos. Cuando un ratn es inmunizado con una molcula,
su sistema inmune reconoce ciertas regiones llamadas eptopos, hacia las
cuales va dirigida la respuesta de anticuerpos. Ahora bien, para una molcula
dada estos eptopos no necesariamente son los mimos que reconoce el
sistema inmune humano y por tanto no siempre es posible obtener anticuerpos
de ratn con la especificidad requerida. Es as como por ejemplo, hasta los
momentos nadie ha logrado obtener anticuerpos monoclonales de ratn anti-Rh
(bien sea anti-D u ola especificidad dentro del sistema) (Thompson y HughesJones, 1990). Otra consecuencia de lo mencionado anteriormente se ilustra
con los anticuerpos monoclonales murinos dirigidos a especificidades dentro
del complejo principal de histocompatibilidad humano, HLA. Con frecuencia
stos carecen de la especificidad fina, restringida, que se observa con los
reactivos humanos (Pistillo et al., 1988).
Estas dificultades se han constituido en las motivaciones principales para el
desarrollo de los anticuerpos monoclonales humanos ya que, en principio,
stos deben ser mucho menos inmunognicos que los de origen mrido y
adems estarn exentos de los problemas funcionales antes mencionados. El
alcance potencial de utilizacin de estos reactivos es tremendamente amplio e
incluye campos como el tratamiento del cncer, facilitamiento de trasplantes de
rganos, imagenologa de tumores, entre otros. Adems, como ya se
mencion, los anticuerpos monoclonales humanos seran herramientas tiles
para la identificacin de antigenos que el sistema inmune del ratn reconoce en
forma diferente del sistema inmune humano, como es el caso del grupo
sanguneo Rh y los antgenos del complejo principal de histocompatibilidad
HLA.
Produccin de anticuerpos monoclonales humanos
La produccin de anticuerpos monoclonales humanos ha sido abordada desde
dos frentes principales. Uno es a travs de la inmortalizacin de las clulas
productoras de anticuerpos, aspecto que detallaremos a continuacin, y el otro
mediante el uso de tcnicas de biologa molecular y ADN recombinante, el cual
se describe ms adelante, en la seccin que hemos titulado "Anticuerpo de
segunda generacin"
Inmortalizacin de las clulas productoras de anticuerpos
La preparacin de anticuerpos monoclonales humanos mediante la
inmortalizacin de las clulas productoras de stos ha tenido que enfrentar dos
escollos importantes que vale la pena mencionar antes de detallar las tcnicas
por las cuales se ha abordado este objetivo. Uno es la fuente de donde obtener
los linfocitos B humanos. En la mayora de los casos, la sangre perifrica ha
sido la fuente prcticamente obligada (James y Bell, 1987). Desgraciadamente,
en la sangre perifrica la proporcin relativa de linfocitos B es baja si se
compara con rganos linfoides como el bazo y los ganglios. Adems, se cree
que en la sangre perifrica son pocos los linfocitos B que se encuentran en el
estadio adecuado de diferenciacin para rendir hbridos productores de
inmunoglobulinas (Schwaber et al., 1984).
El otro aspecto es la inmunizacin. A menos que uno cuente con la suerte de
tener individuos inmunizados de forma "natural", son pocos los casos en los
que deliberadamente se puede inmunizar a un ser humano para luego obtener
una muestra de sus linfocitos B inmunes y utilizarlos para la produccin de
anticuerpos monoclonales. Resultados obtenidos por Melamed en 1987
realizando estudios para la produccin de anticuerpos monoclonales humanos
con especificidad por el grupo sanguneo Rh ilustran la importancia que la
inmunizacin tiene para la generacin de un anticuerpo monoclonal. En estos
estudios se encontr que el tiempo para la obtencin de los linfocitos desde el
momento M ltimo "contacto con el antgeno" resulta crtico para el xito o
fracaso (Melamed et al, 1987).
La utilizacin de esquemas de inmunizacin in vitro se mantiene como una
alternativa promisoria para la resolucin de este problema. Haciendo uso de los
avances en el conocimiento de los mecanismos y seales solubles que se
ponen en juego durante la aparicin de la respuesta inmune humoral, como por
ejemplo la interaccin de linfocitos B con linfocitos T cooperadores activados
que expresan el ligando para CD40 (Banchereau et al., 1991) y con clulas
dendrticas foliculares, el efecto de ciertas interleucinas como las IL-2, IL-4, IL-5
(Phillips y Klaus, 1992; Morikawa et al., 1993), la IL-6 (Hirano y col., 1987;
Tosato et al., 1988), la IL-10 (De Waal et al., 1992; Briere et al., 1993; Burdin et
al., 1993) y la forma soluble de CD23 (Thorley-Lawson, 1988), en conjunto con
los avances en el desarrollo de nuevos agentes adyuvantes tipo P3C-X
Anticuerpos biespecficos
Es bien sabido que una molcula de inmunoglobulina reconoce dos
determinantes antignicos iguales, gracias a la existencia en su estructura de
dos puntos de combinacin idnticos. Pero sera muy til disponer de
inmunoglobulinas en las cuales cada sitio de unin (o punto de combinacin)
reaccione con un determinante antignico diferente, permitindoles as
interactuar simultneamente con dos antgenos distintos. Son estas molculas
las que han sido llamadas anticuerpos biespecficos. Su preparacin se ha
logrado mediante la fusin de, ya sea un hibridoma especfico para uno de los
antgenos con linfocitos de un animal inmunizado contra el otro antgeno
(generndose clulas hbridas llamadas triomas), o de dos hibridomas cada
uno con especificidad por un antgeno distinto (dando lugar a los llamados
cuadromas). Tanto los triomas como los cuadromas expresan los genes de las
inmunoglobulinas provenientes de ambas clulas progenitoras y en ambos
ocurre la combinacin aleatoria de los productos proticos de estos genes. Por
lo tanto, estas clulas producen anticuerpos monoespecficos para cada
antgeno pero adems producen molculas de anticuerpos especficas para
ambos antgenos (Gavilondo, 1990), A ttulo de ejemplo, en 1993 Kaneko y col.
publicaron en la revista "Blood" la generacin de un anticuerpo biespecfico de
uso potencial en el tratamiento en humanos de la leucemia mieloide aguda.
Este anticuerpo es especfico para la molcula CD3 presente en los linfocitos T
humanos y para la molcula CD13, la cual se expresa abundantemente en las
clulas leucmicas. In vitro, este monoclonal hbrido fue capaz de estimular la
lsis de clulas leucmicas provenientes de pacientes con leucemia mieloide
aguda, por parte de clulas mononucleares de sangre perifrica autlogas,
estimuladas con interleucina 2 o interleucina 7. Los autores proponen a este
monoclonal como una herramienta para la eliminacin de clulas CD13+ en
trasplantes de mdula sea autloga en pacientes con este tipo de leucemia
(Kaneko et al., 1993).
Anticuerpos recombinantes
Las tecnologas de ADN recombinante se han revelado como una herramienta
tremendamente poderosa y promisoria para la preparacin, modificacin y
mejoramiento de los anticuerpos monoclonales, tanto de origen mrido como
humano. Esto ha sido posible gracias al conocimiento detallado que se tiene en
la actualidad sobre la estructura y organizacin de los genes que codifican a las
molculas de inmunoglobulina (Max, 1993). La combinacin de este
conocimiento y estas tecnologas ha permitido hacer verdadera ingeniera
molecular para preparar molculas de inmunoglobulina en las que las regiones
que determinan la especificidad por el antgeno provienen de genes de ratn y
el resto de la molcula es codificado por genes humanos. Virtualmente todo el
trabajo de ingeniera molecular, cuyos detalles escapan de los alcances de esta
revisin, se realiza a nivel del ADN. El producto de este trabajo son genes
hbridos o, ms apropiadamente, recombinantes que ahora pueden ser
insertados en vectores adecuados los cuales permiten su expresin
(transcripcin a ARN mensajero y traduccin a protena) en bacterias o en
clulas eucariotas como ciertos hongos unicelulares o lneas celulares de
mamferos. Han surgido as los llamados anticuerpos "quimricos" y
Conclusin
El advenimiento de los anticuerpos monoclonales ha sido, en el mbito de las
ciencias biomdicas, uno de los desarrollos metodolgicos ms importantes de
los ltimos 20 aos. Su utilizacin parece no tener ms lmites que aquellos
que se imponga el usuario, como bien lo ha ilustrado la generacin de los
llamados anticuerpos monoclonales catalticos (Danishefsky, 1993; Janda et al.,
1993). El detallado conocimiento de la organizacin de los genes que codifican
estas protenas, en conjunto con las avanzadas tecnologas para la
manipulacin gentica de las que se dispone en la actualidad, ha permitido el
desarrollo de tcnicas para la elaboracin de genotecas combinatorias tanto de
origen humano como mrido (Winter y Milstein, 1991), las cuales se anticipa
sean de gran unidad en el entendimiento de enfermedades autoinmunes
relacionadas con la respuesta inmune humoral (Rapoport et al., 1995) y en la
elaboracin de reactivos teraputicos aplicables a una variedad de patologas
(Glassy, 1993).
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