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STRUCTURE ET CLASSIFICATION DES VIRUS

Dfinition dAndr Lwoff


Parasite intracellulaire obligatoire
Gnome = un seul type dAN ADN ou ARN
Une reproduction par rplication du gnome

Dfinition simplifie : un virus est un agent


pathogne ultramicroscopique, bien plus petit
quune bactrie, non cultivable
Structure des virus
Les virus sont composs de deux lments
constants :
Un acide nuclique qui constitue le gnome
Une structure protique entourant et protgeant le gnome = capside
Gnome + capside = nuclocapside (Core
pour les rtrovirus)
Parfois une 3me structure, entourant la capside -> enveloppe ou pplos (chez certains V)

Acides nucliques / Gnome : 1er critre de classification


Structure noble du virus porteuse de linformation gntique
et caractrise par :
Sa nature : ARN ou ADN
Sa taille : longueur, masse molculaire, nombre de paires de
base et la capacit approximative de codage
Sa composition en bases : notamment le %GC
Sa structure : monocatnaire, bicatnaire, ou bien avec des
fragments subgnomiques
Sa topologie : linaire ou circulaire
1. Les gnomes ADN
Les ADN des virus animaux, sont le plus souvent bicatnaires
et linaires et prsentent pour la plupart une structure tridimensionnelle classique en double hlice.

2. Les gnomes ARN


La variabilit des ARN viraux est sensibilit
moins grande que celle des ADN. Les ARN
viraux sont gnralement monocatnaires et
linaires. PM : 2x15.106 dalton
Capsides virales : 2me critre de classification
La capside est une coque de nature protique qui entoure le gnome. Elle est capable dassurer sa protection et sa survie dans le milieu extrieur. Elle est compose de plusieurs monomres appels capsomres.
Elle peut avoir plusieurs aspects :

2. Les virus icosadrique symtrie cubique


Icosadre : structure gomtrique avec 12 sommets,
20 faces et 30 artes. Il sorganise en sous-units protiques appeles capsomres.
Exemples : HSV, papillomavirus

3. Les virus symtrie complexe


Un certain nombre de virus ne semblent pas rpondre
aux types de description prcdente.
Exemple : les Poxviridae ont une forme paralllpipdique. La nuclocapside occupe une position centrale
dans le virion et prsente une forme en lentille biconcave , les concavits tant occupes par des structures
denses appeles corps latraux.

1. Les virus symtrie hlicodale


Un seul type de capsomre sembote pour former un
volume (la capside) selon une symtrie en hlice.
a. Virus de la mosaque du tabac : btonnets allongs rigides et creux de 300nm de long sur 15nm de
diamtre
b. Virus animaux symtrie hlicodale : La nuclocapside flexueuse, replie ou spirale, est toujours
entoure dune enveloppe.
Exemples :
* La nuclocapside du virus de la rage (rhabdoviridae) :
capsule tubulaire symtrie hlicodale, lARN est reli
aux sous-units dune protine de 52000 daltons
(protine N).
*
La
nuclocapside
des
virus
grippaux
(orthomyxoviridae) : capsule hlicodale tubulaire, gnome segment en 8 fragments lintrieur dune enveloppe, diamtre de la nuclocapside : 8nm, diamtre de
la particule virale entire : 100nm.

Enveloppes virales / pplos : 3me critre de


classification
Structure priphrique facultative, lipido-glucoprotique sensible aux actions physicochimiques
Rle :
Protection (nuclase, rsistance)
Antignicit (induction Ac neutralisants)
Infectiosit (interaction/rcepteur)
Activit enzymatique
Les virus acquirent leur enveloppe par bourgeonnement
travers la membrane nuclaire (herpesviridae),
travers la membrane du rticulum endoplasmique (Bunyaviridae)

travers
la
membrane
cytoplasmique
(orthomyxoviridae)

Classification des virus


Critres de classification des virus
La classification est base actuellement sur lensemble des
donnes biochimiques et morphologiques, propose en 1962
par Lwoff, Horne, et Tournier et appele systme L.H.T, elle a
t adopte par tous les virologistes.
Le gnome
1. Nature du matriel gntique :
ADN ou ARN
2. Structure de lacide nuclique :
Monocatnaire ou bicatnaire
3. Forme de lacide nuclique :
Linaire ou circulaire
Segment ou non

Nomenclature virale
Ecriture en italique avec 1re lettre majuscule
Niveau taxonomique Suffixes

Exemples

Ordre

-virales

Mononegavirales

Famille

-viridae

Paramyxoviridae

Sous-famille

-virinae

Paramixovirinae

Genre

-virus

Morbillivirus

Espce

(virus individuel)

Virus de la rougeole

Lenveloppe
Virus nus (N)
Virus envelopps (E)
Systme de la capside
Symtrie hlicodale (H)
Symtrie icosadrique (I)
Symtrie inconnue (?)

Principaux virus ARN ayant un pouvoir


pathogne chez lHomme
Les virus ARN+ ont un gnome sens , de
polarit +, directement traduit par lesvribosomes, except pour les Rtroviridae et
Reoviridae.
Les virus ARN- on un gnome anti-sens
, de polarit -, transcrire en brin + par
une ARN polymrase incluse dans le virion.
Les virus ARN (+/-) sont des ARN ambisens (une partie du gnome est + soude
une autre -)

Principaux virus ADN ayant un pouvoir pathogne chez lHomme

MULTIPLICATION INTRA CELLULAIRE DES VIRUS


Introduction
Les virus dintrt mdical sont nombreux. Certains
donnent des infections bnignes, tandis que
dautres provoquent des infections +/- graves, voire
mme mortelles.
Les virus sont des parasites intracellulaire obligatoire.
2. Chez les virus
Un virus est incapable de se diviser par lui-mme.
Par dfinition, cest un parasite intracellulaire obligatoire. En dehors dune cellule, la particule virale
ou virion existe sous une forme statique. Pour se
multiplier, un virus na que son gnome : pas de
systme enzymatique de production dnergie de
Lippmann ni de synthse protique.
Dans la cellule, le virus dtourne la machinerie cellulaire son profit pour sa propre multiplication.
3. Conditions de la multiplication virale
Parasiter une cellule
Trouver des sources de matire premire
Trouver des sources dE
Trouver des enzymes
Etapes du cycle de multiplication virales
Un cycle de multiplication comprend les mmes
tapes regroupes en 3 priodes :

Conditions ncessaires la multiplication dun virus


1. La multiplication dun tre vivant
Se reproduire est un processus la fois trs complexe,
trs prcis et trs organis faisant intervenir 4 conditions :
Support de travail : information gntique, contenue
dans le gnome
Matire premire : petites molcules, acides amins,
acides gras, sels minraux
Source dnergie dATP : ncessaire toute dification
Systme enzymatique : ncessaire aux grandes voies de
synthse biologique.
La multiplication intra cellulaire des virus
Cycle de multiplication
La vie des virus est cyclique avec une succession
dtapes intra et extracellulaires.
La dure dun cycle viral dpend de la taille et de la
complexit du virus, ex : 4 8h pour le poliovirus alors
que plus de 40h pour lherpesviridae.
Etude sur culture cellulaire :
Phase dclipse : absence de virions dtects (intracel
et extracel)
- Disparition des virus inoculs
- Dgradation de la particule virale, exposition du gnome viral la machinerie cellulaire
Phase de latence : absence de virions (extracel), comprend le dlai de libration des virion

1. Etape initiale :
a. Attachement :
- Interactions protine virale-rcepteur cellulaire
- Cest le 1er facteur conditionnant le tropisme dun virus pour
une cellule, un tissu, un organe ou un hte particulier
(permissivit)
- Les rcepteurs cellulaires sont spcifiques ou non
- Les rcepteurs sont prsents sur certains types cellulaires
- Notion de Co rcepteurs
- Cet attachement se fait en plusieurs tapes
b. Pntration : Trois mcanismes : endocytose fusion des
membranes transfert du matriel viral travers la membrane
cellulaire
Lendocytose :
Virus envelopps : Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Togaviridiae, Flaviviridae
Virus non envelopps : Adenoviridae, Polyomaviridae
- Le virus est internalis au sein dune vsicule (endosome).
- Lacidification de lendosome modifie la conformation des protines virales dattachement (HA pour influenza A) qui sinsrent
dans la membrane cellulaire
- Lacidification du virus induite par une pompe protons (la
protine M2 pour le virus influenza A) entrane une dcapsidation et une dissociation des constituants viraux (M1 et RNP)
- Libration des gnomes qui pourront pntrer dans le noyau

La fusion des membranes :


Pour les virus envelopps, ex : Retroviridae,
Paramyxoviridae, Herpesviridae,
- Insertion dans la membrane cellulaire
dune protine virale de fusion
- Puis, fusion des 2 membranes virales et
cellulaire
- Cest un phnomne indpendant du pH
Ex du HIV :
- Attachement de la glycoprotine gp120 sur
la molcule CD4
- Interaction avec le 2me rcepteur (ici
CCR5) et modification de la conformation
des glycoprotines virales
- Insertion de la rgion hydrophobe de gp41
dans la membrane cellulaire
- Fusion des 2 mb et pntration de la capside dans le cytosol

Le transfert du matriel viral travers la membrane


cellulaire
Exemple : Picornaviridae
Insertion dune partie hydrophobe de VP1 dans la membrane.
Ralisation dun pore dans la membrane cellulaire qui permet le passage de VP4 et de lARN viral dans le cytosol.
c. Dcapsidation
Dgradation de la capside et libration du gnome viral dans
le cytoplasme cellulaire.
tape ncessaire pour que le gnome puisse fonctionner
(dtourner la machinerie enzymatique) et livrer son information gntique
a. Virus ADN :
Double brin, exemple : HPV (voie 1-2-3)
Simple brin, exemple : Parvo B19 (voie 7-1-2-3)
b. Virus ARN :
Le gnome des virus ARN peut prendre diffrents aspects :
segment ou non, bicatnaire ou monocatnaire, polarit (+)
(identique un ARNmessager) ou polarit () (lARN polymrase doit alors tre associe aux virions)
La synthse de nouvelles molcules dARN (gnomiques ou
messagers) fait intervenir une enzyme inconnue de la machinerie cellulaire : lARN polymrase-ARN dpendante
+ Virus ARN + (ex : Flaviviridae, virus hpatite C, Zika
virus) : voie 3
ARN gnomique directement messager -> synthse protique
+ Virus ARN (ex : Rhabdoviridae, virus de la rage) : voie
5 puis 3
ARN gnomique non directement messager, ncessite une
transcription ARN- en ARN+ grce une ARN polymrase
ARN dpendante (transcriptase).
LARN+ synthtis sert dARNmessager -> synthse protique
+ Rtrovirus (ex : HIV)
ARN+ -> ADN complmentaire par une transcriptase inverse
Intgration au gnome cellulaire par une intgrase -> provirus
Transcription en ARNm et ARN gnomique
Traduction des protines virales
3. Etapes tardives : maturation, assemblage, libration
a. Maturation :
+ Maturation des protines virales aprs traduction
- Protolyse -> protines fonctionnelles (rplicases, protines
de structure)
- Glycosylation dans appareil de
Golgi
+ Migration aux sites de rplication, dassemblage, la surface
cellulaire

2. Expression et rplication du gnome viral


Le gnome viral libr prend la direction des
synthses, dans la cellule. Il se substitue en
totalit ou en partie au gnome cellulaire qui
jusque l organisait les synthses cellulaires.
Le gnome cellulaire faisait en sorte que la cellule produise des scrtions, exocrines ou endocrines, et ventuellement des lments pour
faire une 2me cellule.
Dsormais, la cellule va produire des virus.
Plus prcisment : des copies du gnome viral
(rplication), des rpliques de protines virales,
protines de capside, glycoprotines de pplos
(pour les virus envelopp).
Le mcanisme de cette rplication virale varie
selon que le gnome est ARN ou ADN. Mais,
dans tous les cas, cest par des ARN messagers
viraux que les gnomes viraux transmettent
leur information et donnent leurs ordres la
machinerie cellulaire.
La stratgie de multiplication est dpendante
de la nature du matriel gntique : ADN ou
ARN, bicatnaire ou monocatnaire, segment
ou non, circulaire ou linraire. Au centre et en
trait gras, la voie classique que lon observe
chez toutes les cellules

b. Assemblage :
Les protines de structure sautoassemblent en capsomres puis en nuclocapside par intgration du gnome
rpliqu.
Lassemblage a lieu au niveau du :
- Noyau (virus ADN : Adnovirus, Herps)
- Cytoplasme (virus ARN : Picornavirus, ADN pox)
-> anomalies morphologiques de la cellule : inclusions contenant des virions

c. Libration :
+ Virus envelopps : libration par BOURGEONNEMENT
Ces virus acquirent leur enveloppe par bourgeonnement partir
de la membrane cellulaire (celle-ci peut-tre : la nuclaire interne,
membrane de Golgi, membrane endoplasmique, MP externe)
+ Virus nus : libration par LYSE
Aprs accumulation des virions en quantit importante, il y a rupture de la cellule hte et libration des particules virales compltes
et matures. Elles vont alors trouver une nouvelle cellule hte pour
perptuer le cycle.

Virus

Membrane travers
laquelle seffectue le
bourgeonnement

HSV

Nuclaire interne puis


Golgi

Poxvirus

Golgi

Flavivrus

Membrane endoplasmique

Orthomyxovirus

Membrane plasmique
interne

Consquence de la multiplication virale pour la cellule infecte


1. Mort de la cellule : infection lytique
Si la structure et la fonction cellulaires sont gravement
perturbes par laccumulation de matriel viral, la cellule meurt
soit par : ncrose ou apoptose.
Tout le problme est de savoir si ces cellules peuvent tre remplaces par dautres cellules au sein de lorganisme.
2. Tolrance de linfection : infection tempre
Le gnome viral et le gnome cellulaire se partagent le potentiel de
synthse cellulaire : le virus et la cellule coexistent selon un compromis acceptable => Modus vivendi
3. Transformation cellulaire maligne
La cellule se multiplie de faon anarchique. La cellule infecte acqurant des caractres gnralement attribus aux cellules cancreuses (perte de linhibition de contact).
Exemples : HPV, hpatite virale B et C

Paramyxovirus

MP externe

Rhabdovirus

MP externe

Retrovirus

MP externe

MCANISMES GNRAUX DES INFECTIONS VIRALES


Introduction
La Pathognse virale est lensemble des manifestations
cliniques dues une infection virale. Laction pathogne
rsulte de : laction directe du virus sur lorganisme ou
la rponse de lorganisme linfection virale.
La virulence sera donc lie :
Au virus lui-mme : quantit de virus, organes ou cellules cibles, cytopathognicit
Ou lhte : rponse adopte ou pathologique qui dpendra de lge, la nutrition, ltat humoral, la race

2. Les muqueuses
a. Loropharynx et le tractus intestinal :
+ Ingestion deau ou daliments souills
+ Porte dentre pour de nombreux virus
+ Seuls les virus rsistants peuvent infecter les cellules
du tube digestif
+ Certains se multiplient dans les cellules du tractus
intestinal et sont responsables dune infection localise
(gastroentrites)
+ Dautres diffuseront via le sang ou la lymphe vers un
organe cible (entrovirus) ou donneront une infection
systmique

Propagation du virus dans lorganisme :


LEntre du virus dans lorganisme : Conditionne
le mode de transmission du virus
1. La peau
La peau est une barrire naturelle assurant une
protection efficace. Elle peut tre franchie par les
virus lors des lsions superficielles (Herpesviridae,
Papillomaviridae), de morsures (rage, herpes simien
type B), de piqres ou blessures accidentelles AES
(HBV et virus delta, HCV, HIV, CMV), des piqres
de moustiques ou des morsures de tiques
(arbovirus)
Plusieurs virus peuvent se multiplier dans les cellules de la peau : Herpesviridae, Poxviridae, Papillomaviridae.

Mcanismes dentre au niveau du tractus intestinal :


Les virions sont incorpors par endocytose dans les
cellules M des plaques de Peyer et libres au niveau de la membrane basales. Les virions traversent les cellules pithliales par transcytose. Ce
mcanisme a t montr pour HIV au niveau du
rectum.

b. Muqueuses respiratoires :

c. Muqueuses gnitales :
+ La pntration est possible par les microtraumatismes de cette muqueuse.
+ Les HPV sy multiplient et sont responsables dune infection locale.
+ Les HSV sy multiplient et diffusent par les
voies nerveuses.
+ HIV et HBV peuvent pntrer dans lorganisme par cette voie sans se multiplier dans
les
cellules pithliales de la muqueuse gnitale.
d. Muqueuses conjonctivales :
+ lADV-8 est transmis par les instruments
ophtalmiques et les piscines, donne une conjonctivite saisonnire
+ lADV-37, HSV-1, virus de la vaccine et lentrovirus-70 donnent des viroses oculaires.

HPV= Human Papillomavirus
HSV= Herpes simplex virus : virus de lherps
HIV= human immunodeficiency virus

Diffusion dans lorganisme :


1. Diffusion loco rgionale :
Linfection peut tre localise au niveau de la
porte dentre (peau et muqueuses) ou diffuser aux tissus proches :
+ Le tractus respiratoire pour la grippe, rhinovirus, RSV
+ Digestif pout les rotavirus, calicivirus, adnovirus entriques
2. Diffusion gnralise :
partir du site dentre et souvent dune rplication initiale loco rgionale, les virus diffusent vers dautres tissus ou organismes par
voie hmatogne ou neuronale.

a. Voie hmatogne :
+ partir du site de pntration, le virus emprunte les canaux lymphatiques affrents et migre jusquaux ganglions
lymphatiques rgionaux o ils peut se multiplier.
+ Via les canaux lymphatiques effrents puis le canal thoracique, ils atteignent la circulation sanguine systmique o il
est responsable dune premire virmie de faible intensit.
+ Certains virus se multiplient dans les cellules de lendothlium vasculaire ou dans les cellules (monocytes, LB, LT, rarement des rythrocytes). Ils sont ensuite souvent librs dans
le plasma. Ainsi, la virmie peut tre plasmatique (particules
virales libres dans le plasma) et/ou cellulaire (virus intracellulaire).
+ La dissmination du virus entrane une virmie secondaire
avec des concentrations virales plus importantes.
+ La virmie est un phnomne dynamique avec en permanence une production et une limination. Les cellules du systme rticuloendothlial de la rate, du foie, des poumons et
des tissus lymphodes jouent un rle important dans llimination du virus. Ils peuvent aussi tre le lien de multiplication virale secondaire.
+ Dans la majorit des cas, la virmie est de courte dure
(quelques jours) disparaissant avec lapparition des anticorps
neutralisants.
+ Dans certains cas, la virmie persiste, la cause peut tre :
- La formation de complexes immuns (virus-Ac) qui conservent linfectivit initiale des virus
- Un phnomne de tolrance qui peut apparatre lorsque
linfection a eu lieu in utero avant la maturation du systme
immunitaire : exemple les infections HBV ou rubole.
b. Voie neuronale : voie de dissmination utilise soit exclusivement (rage, certains rovirus), soit une alternative la
voie hmatogne (HSV).
La pntration du neurone seffectue selon les mcanismes
dcrits pour les autres cellules.
A lintrieur du neurone, le virus se dplace grce aux systmes de transport de la cellule selon un sens rtrograde
dans les nerfs sensitifs ou antrograde dans les nerfs moteurs.

3. Les barrires :
a. Barrire hmato-encphalique :
Soppose la diffusion virale, elle est forme par
les cellules endothliales des capillaires sanguins
et est caractrise par lexistence de jonctions serres.
Les prolongements astrocytaires associs aux cellules endothliales participent la formation de la
BHE.
Le plexus chorode : Lpithlium chorode est compos dune range de cellules pithliales jointes
par des jonctions serres crant ainsi une barrire.
b. Passage transplacentaire :
+ Prnatal : rubole, CMV, parvovirus B19, VZV
(virus varicelle-zona)=> embryopathie, foetopathie
+ Prinatal : HSV, HBV, HIV, CMV, VZV, HPV?
CMV= cytomgalovirus => infection du Nn gnralise ou non
+ Postnatal : HTLV, HIV, HBV, CMV HTLV = Virus
T-lymphotropique humain => infection du nourrisson

Polymorphisme de lexpression clinique


1. Selon lintensit de la symptomatologie
La manifestation pathologique dune infection virale
est un phnomne variable dun virus lautre. Mais
pour beaucoup de virus, cest un phnomne relativement rare, la plupart des infections seront asymptomatiques.
2. Selon le virus
Infections aigus :
+ Localises : au niveau des tissus de la porte dentre
(gastroentrites, rhinites, condylomes)
+ Gnralises : grippe, atteintes neurologiques ou
cardiaque des entrovirus, HIV
Infections persistantes avec priodes de latence et de
rcurrences : Herpesviridae
Infections persistantes dvolution progressive : rougeole dans le cadre de la PESS
Infections chroniques :
avec infection aigu suivie dune volution lente vers
une maladie plus grave (cirrhose et carcinome hpatique pr HBV et HCV // SIDA pr HIV)
Infections lentes : sans manifestations cliniques ou
biologiques lors de la primo-infection

Organes cibles
Organe dont latteinte au cours de linfection virale
donne les signes cliniques caractristiques de la
maladie.
Facteurs de tropisme : sensibilit, permissivit
Voies dexcrtion
+ Tractus respiratoire : toux, ternuement
(rougeole, grippe, variole)
+ Peau : liquide vsiculaire HSV
+ Selles : entrovirus, VHA, rotavirus
+ Urine : R.O.R, HBV, CMV, arnavirus
+ Sperme : HIV, HBV, CMV
+ Lait : CMV, oreillons, rtrovirus
Facteurs intervenant dans la pathogense
1. Facteurs lis au virus
+ Quantit de virus, voie dinoculation, cytopathognicit, tropisme
+ chappement du virus la rponse immunitaire :
- Latence
- Variabilit gntique
- Inhibition de lexpression du CMH
+ Rsistance aux antiviraux
+ Bases molculaires de pathognicit
- Souches attnues
- Augmentation de la virulence
2. Facteurs lis lhte
+ Dficits immunitaires primaires ou acquis
(transplantations, SIDA)
+ ge, grossesse, tat hormonal, malnutrition
+ Rponse immunitaire vis--vis de linfection : maladies auto-immunes, bronchiolites VRS (virus
respiratoire syncytial)

VACCINATION ANTIVIRALE
Gnralits
Introduction
La vaccination est un moyen de prvention
efficace en sant publique. Elle permet llimination ou lradication de certaines infections
pidmiques
Dfinition
Immuno prophylaxie active spcifique une
maladie infectieuse virale ou bactrienne,
donnant une protection diffre et durable.
Principe
Introduction dans lorganisme dune prparation antignique drive dun agent pathogne
spcifique (ou apparent celui-ci), capable
dinduire, chez un sujet rceptif, une raction
immunitaire protectrice vis--vis de cet agent.
Bases immunologiques de la vaccination
Rponse cellulaire et humorale
Les macrophages phagocytent lantigne et le
p r se n te nt
aux
c e l l u le s
immunocomptentes :
+ LT : support de limmunit mdiation cellulaire et de la mmoire immunologique
+ LB : qui se diffrencient en plasmocytes scrteurs dimmunoglobulines spcifiques IgM
IgG IgA supports de limmunit humorale
Rponse primaire et secondaire
Le premier contact avec lantigne est suivi
dune rponse primaire caractrise par une
ascension diffre et lente des anticorps qui
culmine entre le 2me et 4me semaine un
niveau faible, pour dcrotre ensuite rapidement.
Tout contact ultrieur, mme trs lointain,
avec le mme antigne induira une rponse
secondaire, mettant en oeuvre la mmoire immunologique thymodpendante, caractrise
par une ascension rapide (en quelques jours)
importante et durable des anticorps protecteurs (effet rappel).

Objectifs gnraux et valuation des stratgies vaccinales


Objectifs gnraux de la vaccination
Eradication ou contrle de la maladie par le biais de programmes de vaccination contrles => objectif atteint pour la
variole, la poliomylite est candidate.
Prvention contre linfection ou prvention contre la maladie
Objectif thrapeutique et non prophylactique : rage, peut tre
HIV
Evaluation des stratgies vaccinales
Vrifier que la prparation vaccinale est immunogne et non
toxique
Vrifier lefficacit : comparaison du risque relatif de maladie
dans la population vaccine et non vaccine
Classification
Vaccins vivants attnus : vaccins rplicatifs
Virus ou bactries ayant perdu leur pouvoir pathogne, mais
capables de se multiplier dans lorganisme, provoquent une
vritable infection sans manifestations pathologiques
Induisent une rponse immunitaire cellulaire et humorale
Obtention : passage sur diffrents animaux ou des cellules et
mutation gntique
Avantages

Inconvnients

Immunit naturelle humorale


et cellulaire.
Plus longue protection rapide
Faible dose dAg
1 seule injection
Vaccins : bon march
Immunisent sans adjuvants

Mutation reverse virulence


Trs sensibles la chaleur
Contre indiqus chez la femme
enceinte et limmunodficient

Exemples :
* Vaccins bactriens : 1 seul commercialis : BCG -> tuberculose, compt parmi les + tolrs (la meilleure voie = intradermique)
* Vaccins viraux :
+ Rougeole : souche schwarz
+ Oreillon : souche jeryl-lynn dans ROR
+ Rubole : souche Wistal RA 27/3 M
+ Poliomylite : vaccin oral => 3 types sauvages : 1, 2 et 3; 3
administrations sont ncessaires
+ Fivre jaune : souche AMARIL 17D
+ Varicelle
Nouveaux vaccins :
Vaccins attnus empiriquement : varicelle (souche OKA),
dengue, CMV (souche TOWNE), rotavirus (souche WC3)
Vaccins obtenus par mutagnse dirige : shigellose, fivre
thyphode sont dispo // HSV et vibrion cholrique sont en
voie de recherche
Vaccins vivants recombins : (chimriques) linstitut pasteur
=> un vaccin (voie orale) contre la shigellose fait lobjet dessais chez lHomme

Vaccins inactivs : vaccins non rplicatifs


+ On distingue :
- Suspensions virales : infectivit dtruite par un agent chimique (formol ou betapropiolactone) ou physique (chaleur)
- Sous-units virales avec fraction protique ou polysaccharidiques
+ Ils induisent une immunit surtout humorale
Avantages

Inconvnients

- Facile prparer
- Excellente innocuit
- Excellente conservation :
stables la chaleur (avantage
dans les pays chauds)
- Peuvent tre administrs
limmunodprim, femme enceinte et peuvent tre administrs au nouveau n en prsence
dAc maternels ce qui permet
une vaccination prcoce

- Immunit surtout humorale


- Faible dure de protection
- Ncessit de plusieurs
doses ainsi que rappels
(cot ++)
- Faible rentabilit de production
- Adjuvants

Vaccins sous-units protiques : exemple vaccin de lhpatite B


A partir de 1985, la production de lAg HBs est assure par
gnie gntique partir de la levure de bire : Saccharomyces
cerevisiae ou par des cellules de mammifres, les cellules
CHO
(Chinese Hamster Ovary)
2. Vaccins sous-units polysaccharidiques/ glycosidiques
Pas de coopration LB et LT
Les LB produisent directement les Ac
Donc sont faiblement immunognes (immunit est thymodpendante)
Leur conjugaison un AG protique rponse immunologique T-dpendante
3. Vaccins sous-units conjugus
Fragments antigniques de courte taille qui sont de nature
saccharidique coupls chimiquement une protine porteuse
(anatoxine ttanique ou diphtrique par exemple) ou une
autre structure, pour les rendre immunognes
Ex : vaccin contre la mningite et les infections pneumocoques notamment DTC-Hib, DTCPHib

Vaccins du futur
+ Associations vaccinales + Amlioration de vaccins existants
+ Nouveaux vaccins : VRS, Helicobacter pylori, ETEC, Lyme,
Herpes, Papillomavirus
+ Exploiter limmunit muqueuse :
- Immunit systmique : humorale, cellulaire
- Immunit muqueuse : cellulaire, IgA scrtoires
Dans le but de mettre au point ces nouveaux vaccins, de
nouvelles stratgies vaccinales ont t dveloppes depuis
1980 :
+ Vaccins recombinants + Vaccins DNA
+ Peptides ou particules virales recombinantes

Virus entiers : grippe, hpatite A, poliomylite, rage, mningo-encphalite tiques deurope centrale, encphalite japonaise
Sous-units virales : grippe (Ag de surface),
hpatite B (Ag de surface)
Cas particulier du vaccin de la rage : le
vaccin anti-rabique
Vaccins de 2me gnration prpars partir
de cultures cellulaires permettent une utilisation prophylactique et thrapeutique
Utilisation thrapeutique aprs apprciation
du risque de contamination et dsinfection
5 injections : j0, j3, j7, j14, j28
+/- Ig antirabiques sous contrle mdical
(centre antirabique)
Utilisation prophylactique chez les sujets exposs : vtrinaires, forestiers, personnes
ayant ou voyageant en zones denzootie rabique 3 injections : j0, j7, j28, 1 rappel 1 an
puis tous les 5ans

Effets indsirables
+ Complications dues aux vaccins vivants,
dexpression retarde
+ Des vaccins inertes, immdiats ou prcoces
relevant de ractions dhypersensibilit ou
deffets toxiques
+ Complication mineure ou bnigne considre comme acceptable
- Raction locale (prcoces avec les vaccins
inactivs ou diffre BCG)
- pisode fbrile pendant 1 3 jours (prcoce
avec les vaccins inactivs ou diffr avec les
vaccins vivants)
- Convulsions hyperthermiques (avec les vaccins anti-coquelucheux et anti-rougeoleux)
- ruption
- Arthralgies, arthrites (chez adulte avec vaccin rubole, Hpatite B)
- Parotidite, raction mninge (vaccin antiourlien)
+ Les accidents :
- Lis au vaccin anticoquelucheux (inactiv
complet) : syndrome des cris persistants,
choc, convulsions,
- Lis la vaccination anti-polyomylitique
orale : paralysies
- Bcgites gnralises pouvant compliquer
le BCG quand il est inocul un sujet porteur dune immunodficience congnitale ou
acquise

Voies dadministration
Voie intradermique : BCG face externe du
bras
Voie intramusculaire : deltode ou face antrolatrale de la cuisse
Voie sous cutane : deltode ; recommande
pour vaccins viraux et vaccins polysaccharidiques (Hib, pneumocoque)
Voie orale : polio orale
Varicelle : personnes en contact avec les
nourrissons et petits enfants
Rage : vtrinaires, gardes-forestiers et
gardes-chasses, personnel des abattoirs
Hpatite A : personnels des crches et
coles, personnels en contact des eaux uses
et alimentation de collectivit
Leptospirose : recommande pour vtrinaires, bouchers, employs dabattoirs
Brucellose : conseille pour les employs
dabattoirs
Anti mningocoque ttravalent : A, C, Y, W.
plerins
+ Vaccins inutiles en cas dinfection ultrieure : antiourlien, antirougeoleux, antiruboleux, antipolio inj, antihpatite B et A
+ Vaccins CI chez lImmunodprims : BCG
et VVA

Indications et contre indications


Vaccins indications gnralises
Ce sont les vaccinations qui sont recommandes lensemble
de la population
Elles visent des maladies considres comme des priorits de
sant publique cause de leur frquence et/ou gravit. Au
Maroc, comme partout dans le monde, un calendrier des vaccinations est rgulirement publi qui entre dans le Programme National dImmunisation (PNI)
Vaccination de lenfant allergique
+ Vaccins prpars sur oeuf embryon sont CI chez les allergiques loeuf
+ Pas de vaccination lors dune pousse volutive de la maladie
+ Le vaccin ne doit pas contenir un ATB
+ Prescrire un anti-histaminique, sauf pour le BCG
Vaccination de lenfant malade/voyageur
+ Splnectomiss, drpanocytaires homozygotes : vaccination
pneumococcique est ncessaire ; renouveler tous les 5 ans
+ BCG est CI : SIDA ; les autres VVA : controvers // eczma : BCG en dehors des pousses
+ Voyageur : mettre jour DTCP, BCG, Hmophilus. Vaccin
de fivre jaune (voyage international) partir de 1an
+ Vaccins recommands : HVA, typhode: partir de 2ans,
HVB, mningiocoque A et C partir de 18 mois
Vaccination de ladulte
+ Mise jour : ttanos, polio, HVB, rubole, jusqu 45ans.
A partir de 65ans : grippe tous les ans

Personnel de sant
+ Mise jour des vaccinations anti-ttanique, du polio (tous les
10ans), Hpatite B, grippe, varicelle et ROR (non immuniss)
+ La polio orale et la variole sont CI lentourage des patients immunodprims
+ Vaccination anti-typhode pour personnel de labo
+ Contact direct avec malade atteint de mningite C : vaccination
urgente

Vaccination de la femme enceinte


Vaccins possibles sans risque : polio inj,
HB, grippe, antirabique, antittanique,
anti mningococcique, anti cholrique
Vaccins contre indiqus : polio orale,
rougeole, rubole, ourlien
Les autres sont dconseills

LA CHIMIOTHRAPIE ANTIVIRALE
Introduction
Substance virucide : substance visant obtenir
la mort ou llimination des micro organismes et/
ou linactivation des virus
Substances virostatique : inhibiteurs de la rplication virale, sans limination ni mort du virus
Activit compare de quelques produits dsinfectants
Gram
+

Gram MycoSpores
bactries

Champignons
et levures

Virus

Eau de javel

+++

+++

++

Aldhydes

+++

+++

++

++

++

++

Alcool 70

++

++

++

++

+++

Chlorhxidine +++

Antiseptiques et dsinfectants
Les antiseptiques et dsinfectants
sont des substances virucides
agissant par contact direct avec
les virions prsents sur la peau
(antiseptique), le matriel ou les
surfaces. Ils ne remplacent jamais les mesures dhygine universelles. Finalement, lobjectif
est de prvenir le danger biologique. Pour prvenir le risque biologique, il faut connatre le danger possder la carte didentit
de lagent pathogne manipuler
et connatre son niveau de scurit biologique situ entre 1 et 4.

Classement des agents biologiques pathognes selon


le groupe de risque dinfection
Niveau de scurit Niveau
bilogique/Level L

Exemple

L1

Risque faible

Bacillus subtillis

L2

Risque modr

Virus de la rougeole

L3

Risque fort

Virus de la rage

L4

Risque trs fort

Virus de la variole
SRAS Coronavirus
Virus Ebola

Inhibiteur de la pntration du virus

Mode daction des drogues bloquant la


pe ne tration des Picornaviridae

Picornaviridae : Ple conaril

Inhibiteurs de la fusion du HIV : T20 fuseon :

Antiviraux :
Les antiviraux sont des substances virostatiques
qui ne sont actifs in vivo que sur des virus en
phase de multiplication, et inactifs sur les virus
quiescents. La majorit des antiviraux inhibent
laction denzymes spcifiques.

Les antiviraux actifs sur les tapes initiales


Inhibiteur de lattachement du virus
Inhibiteurs de la liaison au co-rcepteur CCR5 :
SCH-C : petite molcule se fixant dans une cavit
hydrophobe de CCR5 et inhibant la liaison du virus
(en essai clinique)
Inhibiteur de la dcapsidation du virus

Les antiviraux actifs sur les tapes rplication/


transcription
Mdicaments agissant sur la rplication des virus :
Cibles : intgrase, DNA polymrase, Reverse transcriptase, Hlicase-primase, RNA rplicase
Inhibiteurs de lintgrase :
+ Naphtyridines : le dernier reprsentant est le
MK-0518 (phase III)
+ Hydroxyquinolines : le GS-9137 en est le premier reprsentant (phase II)
Les antiviraux actifs sur les
tapes tardives
Sur la maturation :
Anti-protases ou inhibiteurs de
protase : Atanazivir
Exemple : la protase HIV est cruciale pour la maturation de la polyprotine GAG et donc pour lassemblage des protines virales.

Inhibiteurs de DNA polymrase/Rtrotranscriptase :


+ Analogue nuclosidique :
La phosphorylation et lincorporation des analogues la
place des bases nuclosidiques normales a pour consquence : terminaison de llongation de la chane ADN
ou incorporation dun analogue mutagne perturbant la
rplication et gnrant ainsi des produits non viables.
+ Analogue non-nuclosidique :
Inhibition de la RT en se fixant proximit du site catalytique de lenzyme.

Sur la libration :
Neuraminidase des virus grippaux : alors que les protines de surface
des virus grippaux sont trs variables :
+ Le site actif des neuraminidases grippales est toujours trs conserv
+ La neuraminidase grippale est essentielle la multiplication virale et
la libration des nouveaux virus et constitue alors une cible idale pour
lintervention antivirale.
Exemple dinhibiteur de la neuraminidase : Zanamivir (Relenza), Oseltamivir (Tamiflu), Actifs sur les virus grippaux de type A et B

LE DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE
Introduction
Le diagnostic virologique est un ensemble de principes, de mthodes et de
stratgies visant dtecter, quantifier,
suivre et identifier prcisment les
infections virales humaines.

lments robustes

Principales
indications
du diagnostic virologique

Infection svre (ex : encphalite virale)


Infection survenant sur un terrain
ImmunoDprim (ex : fivre chez un
transplant CMV ) ou sur un terrain fragile (ex : bronchite asthmatiforme RSV ou gastro-entrite en
priode nonatale Rotavirus )
Confirmation de lorigine virale
dune infection justifiant un traitement (ex : herps gnital rcidivant)

Diagnostic direct : Dtection du virus


ou de ses composants dans fluides biologiques ou tissus
Diagnostic indirect : = diagnostic srologique = Srodiagnostic = dtection dAc
anti-viraux, produits/organisme infect
dans srum ou autre fluide biologique
Suivi de grossesse
Dtermination du statut immunitaire
dun sujet avant de le vacciner.
Suivi de lvolution dune infection
virale prolonge et de son traitement
(ex : infection HCV, HBV ou HIV)
Accident par exposition au sang (AES)
Identification dune pidmie
Criblage virologique des dons de sang,
organes, tissus ou cellules.

lments
beaucoup
plus fragiles

Ac, Ag extracellulaires, ADN, vi- Virus infectieux destirus nus rsistants dans le milieu ns culture, surtout
extrieur
virus envelopps, Ag
intracellulaires, ARN
Les conditions de conservation et
de transport ont peu dinfluence
sur la fiabilit des analyses : prlvements peuvent tre conservs
+4C pendant plusieurs jours
et transports temprature ambiante.

Les dlais de conservation sont plus courts et


le transport doit se faire
dans un milieu de
transport et rfrigr
+4C.

Diagnostic direct /
indirect
+ Napportent pas les
mmes informations
+ Ne doivent pas tre
s ys t m a tiqu e me n t
pratiques ensemble
+ La srologie est
base sur la raction
lmentaire Ag-Ac :
- Dtection dune
protine virale : Ac
de rfrence -> Diag.
direct
- Dtection dun Ac
srique : protines
virales de rfrence > Diag. indirect

Diagnostic direct Diagnostic indirect


P r a - Plus complexe
Plus simple
tique chantillons biolo- Srum facile obtenir
giques de nature et conserver
diffrente
Interprtat
ions
d e s
rsultats

Plus simple
Rsultat positif > infection virale
productive
Sensibilit et
spcificit de la
technique utilise

Plus complexe
Ex : variation physiologique chez le nouveau n chez qui des
Ac maternels peuvent
persister
jusquau
18mois ou variation
pathologique chez lID

LE DIAGNOSTIC DIRECT : DETECTION DU VIRUS/CONSTITUANTS


Isolement du virus

Microscopie
lectronique

Sur animal de laboratoire


Sur oeuf embryonn
Sur cultures cellulaires :
ECP

Immunocytodiagnostic

Dtection dAg

Dtection du
gnome

Immunocytodiagnostic ELISA
Immunodiffusion
(bandelette,
savonette)
Agglutination des
particules
Latex

Hybridation sans
amplification
Hybridation
aprs
amplification
(PCR et ses variantes)
Squenage

Trois sources de cellules vivantes


Cellules en culture +++

Animal de
laboratoire

OEuf de poule
embryonn

Seul systme utilis en pratique


courante
Base du diagnostic virologique.
Chaque virus possde un tropisme cellulaire propre => il
nexiste pas de systme de culture cellulaire universel (un seul
type de cellules ne va pas faire
pousser tous les virus)
Par consquent, un laboratoire
de virologie doit entretenir un
minimum de 2-3 lignes cellulaires permettant la rplication
du plus grand nombre de virus
pathognes pour lhomme.

Peu utilis en
routine.
Actuellement,
grand
intrt dans
la ralisation
des modles
exprimentaux.

Indispensable pour la
multiplication
de
certains
virus

Exceptionnel
Trs utilis
dans
pass
(virus
grippaux)
Actuellement,
il est utilis
pour la production de vaccins.

Dfinition de la culture cellulaire


Cest la multiplication de cellules dans un milieu strile, sur
un support en verre ou plastique auquel elles adhrent pour
former une couche monocellulaire ou une suspension.
AVANTAGES

INCONVENIENTS

- Pouvoir infectieux
- Sensibilit +++ Rfrence
- Etude ultrieure des
caractristiques
fonctionnelles et structurales de la souche virale.
- Etude de sensibilit
aux antiviraux

Dure souvent longue: 48h-10j


- Cots levs en ractifs, quipements, locaux et personnel
- Difficults techniques (cytotoxicit
des prlvements, contamination bactriologique ou fongique)
- Lecture subjective (dpend de lexprience de loprateur)
- Risque infectieux li lamplification
du virus (ncessit dun labo de haute
scurit pour un confinement strict)
- La culture ne peut se faire que sur
les virus cultivables.

Mise en vidence du virus


Culture virale
Le virus est un parasite intracellulaire obligatoire. Par consquent, La culture ne peut tre
obtenue que sur des cellules vivantes.
La culture virale est la mthode de rfrence : on va isoler
le virus, lidentifier et le purifier
=> obtention dune souche virale

Le prlvement : (cest une tape trs importante parce que linfectiosit du virus
doit tre conserve)
+ La qualit du prlvement conditionne les
chances disoler un virus
+ Tout type de prlvement
+ Le plus prcoce possible, pendant la
phase aigu de la maladie (excrtion virale
maximale).
+ Doit se faire de prfrence au niveau de
lorgane cible si accessible ou sinon de la
porte dentre (arbre respiratoire), du site
dexcrtion virale (les urines), du site de
multiplication primaire (le sang).
+ Prserver la viabilit lors de lacheminement au laboratoire, labri de la dessiccation (desschement), chaleur, variations de
pH, viter toute pullulation microbienne.
+ Les prlvements sont effectus lcouvillon (ressemble au coton-tige) : dcharger dans milieu de transport contenant des
ATB
+ Par contre, les chantillons de sang,
urine, selles, LBA (lavage bronchopulmonaire), LCR, biopsies dorganes sont
recueillis dans un rcipient strile.
+ Au labo, en attendant la culture 2-6C
+ Si > 36h conglation -80C ou en azote
liquide parce que la conservation -20C
ne permet pas de conserver linfectivit du
virus sur une longue priode.

Deux catgories de cultures cellulaires


Cellules issues de tissus normaux = Diplodes

Lignes continues =
Htroplodes

Cellules primaires et secondaires


Origine humaine ou animale
Prleves sur des organismes
adultes ou embryonnaires.
Cultures de cellules pithliodes
(morphologie polygonale) ou fibroblastiques (fusiformes)

Capacit de prolifration infinie


Proviennent soit de tumeurs
malignes soit de la transformation spontane ou viro-induite
de cultures primaires ou secondaires

EFFET CYTOPATHIQUE INDUIT PAR LES VIRUS


+ Nappe cellulaire dtruite
+ Foyers de lyse.
+ Cellules ballonises ou au contraire rtractes
+ Une fusion des cellules avec formation de syncytiums
Microscopie lectronique
Permet de visualiser les particules virales de 20 300nm dans le
prlvement (tissus, cellules, liquides acellulaires).
Selon la morphologie et la taille des particules virales, on peut dterminer la famille virale prcisment.
AVANTAGES

INCONVENIENTS

Dtection de virus non cultivables dans selles au cours des


gastro-entrites (rotavirus, calicivirus, astrovirus)
Identification de nouveau virus
lors de syndromes dallure virale
sans tiologie reconnue

Ne diffrencie pas morphologiquement 2 virus de la mme famille (ex : HSV et VZV)


Manque de sensibilit: cc virales +++ dans prlvement
Equipement adquat : cot,
maintenance et technicit +++

Dtection des Ag solubles viraux : (Dans liquides biologiques)


Techniques immuno-enzymatiques: EIA (Enzyme Immuno Assay) :
Le chef de file est lELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
Principe : Ac antiviraux souvent monoclonaux fixs sur phase solide (microplaque, bille de plastique, membrane de nylon...) permettent la capture de lAg viral.
ELISA sandwich :
1. Adsorption (fixation) des Ac spcifiques de lAg viral sur un
support solide
2. Adsorption du prlvement (addition de lAg)
3. Lavage (pour liminer ce qui na pas t fix aux Ac du support)
4. Ajout dun 2me Ac spcifique de lAg recherch conjugu
une enzyme
5. Lavage
6. Addition du substrat incolore de lenzyme qui le transforme =>
do lapparition dune raction colore visible loeil nu et quon
peut aussi mesurer au spectrophotomtre
Applications :
Ag HBs, Ag de HVC, Ag p24 dans le srum
Ag des rotavirus, adnovirus, calicivirus et astrovirus
dans les selles
Ag des virus grippaux, RSV sur prlvement nasal

Le virus est inocul sur culture de cellules permissives Rplication virale


cytolitique : on ralise alors un examen
direct (ED) quotidien, cd une dtection
ltat frais (sans coloration) au microscope optique invers (faible grossissement)
On va rechercher une rplication virale
cytolytique en observant des altrations
morphologiques de la nappe cellulaire
cest ce quon appelle un effet cytopathique ECP
qui dpend la fois du virus et de la
ligne cellulaire utilise.
Si on dtecte un ECP, on peut alors raliser une coloration des cellules prleves et tales sur lame pour visualiser
des inclusions virales ou des altrations
nuclaires et cytoplasmiques.
Immunomarquage spcifique du virus
et lecture au MO ou fluorescence
Mise en vidence des constituants
antigniques du virus
+ Immunocytodiagnostic par immunofluorescence (IF) ou immunoperoxydase
+ Dtection des Ag solubles par :
- Techniques immuno-enzymatiques
- Agglutination des particules de latex
- Immunochromatographie
Immunofluorescence (IF) et immunoperoxydase
Principe de lIF : visualiser directement la prsence dAg viraux dans les
cellules infectes laide dun Ac spcifique du virus rechercher, le plus
souvent monoclonal, marqu la fluorescine
+ IFD (=directe) : on utilise un seul Ac
marqu par le fluorochrome qui se fixe
directement sur lAg viral
+ IFI (=indirecte) : on utilise un 1er Ac
non marqu mais spcifique du virus et
un 2me AC marqu par le fluorochrome.
-> mission de fluorescence visible au
microscope fluorescence
Immunoperoxydase: marqueur fluorescent est remplac par une enzyme
peroxydase + substrat de lenzyme
Applications :
+ HSV et VZV sur lsions cutanes
+ CMV dans leucocytes
+ Virus respiratoires (VI, RSV, VPI) sur
scrtions rhinopharynges ou LBA

Agglutination
Principe : Ac anti virus fixs sur microbilles. En prsence du virus, agglutination visible loeil nu.
Avantage : ralisation trs rapide,
facile < 30min, se fait directement
sur le prlvement.
Inconvnient : moins sensible que
ELISA
Applications : rotavirus et adnovirus
dans les selles riches en virus

Immunochromatographie

Particularit par rapport ELISA


Dpt du prlvement sur une bandelette.
Applications : rotavirus et adnovirus
dans selles, dtection des virus respiratoires
Mise en vidence des constituants
gnomiques du virus
3 mthodes : hybridation molculaire et ses variantes, amplification
gnique, squenage nuclotidique
Hybridation molculaire et ses variantes
Dtection directe dADN ou dARN sur
divers supports (tube, microplaque,
membrane) par une sonde spcifique
du gnome viral recherch, sans amplification.

BILAN : Mise en vidence des Ag viraux


Avantages

Inconvnients

Excution rapide, simple.


+ Tests la disposition de laboratoires
danalyses mdicales non spcialiss en
Virologie
+ Tests spcifiques
+ Nexigent pas que le virus soit infectieux (pas de conditions de transport par
opposition la culture virale)
+ Automatisation (EIA)
+ Tests unitaires

Cot ++
+ Manque de sensibilit
(prlvement riche en virus)
+ ImmunoFluorescence: lecture en fonction de lexprience de lobservateur

Amplification gnique
Le chef de file de cette technique est la
PCR (Polymrase Chain Reaction)
+ Reproduction dune portion limite du
gnome viral, grce des amorces et
laction dune ADN polymrase.
+ Cette PCR constitue une rvolution du
diagnostic virologique puisquelle a la spcificit des techniques dhybridation et une
sensibilit celle de la culture cellulaire.
+ Applicable tous les agents viraux
Extraction
+ DADN ou ARN partir du prlvement.
+ Plusieurs mthodes :
- En routine: extraction par adsorption des
acides nucliques (chargs -) sur des particules de silice charges +, puis lution
- Extraction manuelle: colonnes dextraction
- Extraction automatise
Une PCR doit absolument se faire partir
dun ADN (donc si virus ARN, une RT le
transforme en ADN)

PCR Classique

Les lments utiliss pour faire une PCR :


Dans le tube PCR : ADN, donc des dsoxyribonuclotides
(bases: A-C-T-G) et des amorces qui vont encadrer la rgion
amplifier.
On place le tube dans le thermocycleur : un four dans lequel les
variations de T vont tre trs rapides.
On ajoute la TAQ polymrase, des ions Mg2+ qui vont tre des
activateurs de la PCR et un tampon.

Etapes de la PCR Dnaturation

Hybridation

Elongation

95

40-65

72

Description

Cette forte T
entraine une
sparation
des 2 brins
dADN.

On diminue la T pour
que
le
couple
damorces puisse se
fixer chacun sur le brin
complmentaire

En utilisant les dsoxyribonuclotides prsents


dans le tube PCR, la TAQ polymrase (une enzyme
rsistante la T) commence la polymrisation
pour llongation du brin dADN complmentaire.
Rsultat final du 1er cycle : 2 molcules dADN

La PCR en temps rel = la PCR quantitative


Intrt : mesure de la production de produits amplifis au fur et mesure de leur synthse.
Utilisation dune sonde fluorescente dont le signal est
valu en continu sans ouverture du tube de raction
( on vite de risque de contamination)
Indications : dfinir le pc dune infection, poser les
indications dun TRT, vrifier lefficacit thrapeutique
Quantification : utilisation dune gamme talon qui
permet dextrapoler partir dun signal de fluorescence, la quantit dacide nuclique cible
Cette sonde comporte 2 molcules : le Reporter (qui
met une fluorescence) et le Quencher qui absorbe
cette fluorescence.
Quand le R et le Q sont rapprochs, il ny a pas
dmission de fluorescence.
Quand le R et le Q sont loigns (aprs hydrolyse de la
sonde), il y a mission de fluorescence.
La TAQ polymrase commence la polymrisation en
ajoutant les dsoxyribonuclotides.
Une fois que la TAQ polymrase arrive la sonde, elle
va lhydrolyser -> et on aura une mission de fluorescence.
Avantages et inconvnients de lamplification gnique en temps rel
Avantages :
+ Sensibilit
+ Spcificit
+ Reproductibilit
+ Large gamme de linarit de signal
+ Rapidit dobtention des rsultats
+ Bonne rsistance aux contaminations (pas douverture du tube ractionnel)
Inconvnients : Cot +++

Squenage nuclotidique
+ Caractrisation des acides nuclotidiques = tude
de la squence des acides nucliques (squenage
de Sanger)
+ Plusieurs objectifs :
- Typage molculaire : reconnaissance au sein
dune mme espce virale, dou sous-groupe particulier / sa rpartition gographique, son pidmiologie ou son pouvoir pathogne, ex : gnotypes HCV
- Reconnaissance de mutations dans gnes cibles
des antiviraux, associes des phnotypes de rsistance, ex : HIV
- Reconnaissance dune souche virale implique
dans un cas de transmission nosocomiale (HDC,
HIV) ou dune pidmie communautaire
- Comprhension de lvolution des virus dans le
temps, de leur relation phylogntique et des conditions de leur mergence

LE DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE INDIRECT


Introduction-Dfinition
Diagnostic indirect : Dtection des marqueurs
immunologiques spcifiques, habituellement humoraux, produits par lorganisme en rponse
linfection virale
Cest la dtection dAc anti-viraux produits par
lorganisme infect dans le srum ou autre fluide
biologique
+ Srologie ou diagnostic srologique = dtection
dAc ou dAg
+ Diagnostic indirect = dtection dAc
+ Raction de base Ag-Ac

Prlvements
- Srum +++ - Plasma - LCR - Urine
- Salive - Humeur aqueuse, vitre - Liquide articulaire
+ Le plus tt possible aprs le dbut de linfection
+ Srodiagnostic initial: rfrence au cours de lvolution
+ Site du prlvement orient par les signes cliniques
+ Transport: but = maintien de la fonctionnalit des Ac
+ Ac : lments robustes conservation +4C pendant
plusieurs jours et transport temprature ambiante
+ Congeler les chantillons de srum : srothque

Techniques de diagnostic indirect


Agglutination
- Latex
- Hmagglutination
- Inhibition de lhmagglutination (IHA) : Ac IHA
inhibent la formation dun Hmagglutinat

Lyse
- Fixation du complement
- Neutralisation : Sroneutralisation
Principe : Ac "neutralisants" car inhibent lECP viral
Technique laborieuse ncessite un laboratoire de culture cellulaire et un virus induisant un ECP rapide

Immunoassays
Immunofluorescence Assay (IFA)
Radioimmunoassay (RIA)
Enzyme immunoassay (EIA)

Enzyme immunoassay EIA


+ Bonne sensibilit et spcificit
+ Dosage qualitatif ou quantitatif
+ Distinction IgG IgM + Simple
+ Automatisable
+ Petit ou grand nb dchantillons
Ex : rubeole IgG, HIV, oreillons, rougeole
IgG IgM

EIA techniques manuelles : ELISA = Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay


EIA Techniques automatises :
- Systmes ouverts : microplaques
EIA. Exemple ETIMAX.
- Systmes ferms

Interprtation :
Valeur seuil (VS) calcule
par rapport aux contrles
+ et - :
+ : DO > VS
- : DO < VS
douteux : DO = VS 10 ou
15%

Immunofluorescence indirecte (IFI)


Avantages
Rapide
Cot raisonnable
Distinction IgG IgM

Inconvnients
Microscope fluorescence
Lecteur expriment
Automatisation = 0
Utilise en 2 intention (confirmation) ou
pour des analyses avec nombre
dchantillons limite

WESTERN-BLOT :
Principe
+ Dtection Ac anti-HIV par immunoempreinte
+ Permet de caractriser les anticorps dirigs
contre chacune des protines virales trs spcifiquement
Electrophorse sur Gel
+ 1e tape : dnaturation du virus (V) par un
dtergent ou autre agent (SDS)
+ 2e tape: sparation protines du V (Ag) selon PM par lectrophorse sur gel de polyacrylamide
+ 3e tape : transfert des protines sur un buvard (blot) de nitrocellulose
Incubation :
+ La bandelette de nitrocellulose est incube
avec le srum du patient contenant (ou non!)
les Ac anti-HIV
+ Les Ac spcifiques se lient aux Ag du blot
+ La bandelette est rince pour liminer les Ac
non complexs Rvlation :
+ Les C* (complexes) Ag/Ac sont rvls par
un 2 Ac coupl une enzyme
+ Le nouvel Ac se lie au C* lors de lincubation
et les Ac non lis sont rincs
+ Au contact du substrat de avec lenzyme,
une couleur apparat
Bandes tmoins :
+ Contrle positif : mise en contact des Ag du
blot avec tous les Ac complexants emplacement sur le blot de chaque complexe
+ Contrle ngatif : sans prsence Ac
Interprtation du Western Blot
+ Positivit certaine : Au minimum 2 Ac antienv ET 1 Ac anti-gag ou anti-pol
+ Positivit probable : 1 Ac anti-gp24 ET 1 Ac
anti-gp 160, 2 Ac anti-en

Immuno-empreinte
+ Western-Blot (WB) + Immuno-Blot (IB)
+ RIBA : Recombinant IB Assay + SIA : Strip
IB Assay
Consiste analyser la spcificit antignique
des Ac
Principe du WB : Fractionnement pralable
des protines virales a partir dun lysat de cellules infectes (lectrophorse dnaturante
sur gel de polyacrylamide) transfert sur un
support ELISA (mais le support est une
bandelette)
Principe de lIB : Dpt directement sur
membrane de protines virales recombinantes
et/ou des oligopeptides synthtiques

Cintique des Ac
+ Infection rsolutive: aprs la gurison, les Ac permettent un diagnostic
rtrospectif (rougeole)
+ Infections latentes: les Ac signalent
la prsence du virus dans lorganisme
(Herpesvirus)
+ Infections chroniques: prsence dAc
avec rplication persistante du virus
(VIH, VHC)

Principales indications
Statut immunitaire
- Screening prnatal
- Screening pr et post vaccination
- Screening pr greffe
- Contact maladie contagieuse (ex : VZV femme enceinte)
Suivi :
- Femmes enceintes non immunes (Rubole, CMV)
- Patients greffs (ractivations, infections post-greffe)
- Accident par exposition au sang AES
Diagnostic infection rcente
- Virage des Ac: 2 srums prlevs 2 3 semaines dintervalle
- Dtection dIgM spcifiques sur un srum
Diagnostic infection congnitale
- Passage transplacentaire des IgG : reflet des Ac maternels
- Dtection dIgM
Epidmiologie, transfusion