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UNIDAD III: TAXONOMA Y CRECIMIENTO BACTERIANO

La taxonoma es la ciencia de la clasificacin y est constituida por dos
subdisciplinas: la identificacin y la nomenclatura.
Siguiendo el sistema binomial de nomenclatura, a todos los organismos
(incluidas las bacterias) se les asigna un nombre de gnero y otro de especie. Los
nombres de especies y gneros son derivados griegos o latinos de alguna propiedad
descriptiva apropiada a la especie en cuestin, y se escriben en cursiva. Una
particularidad en taxonoma microbiana es el concepto de cepa que, en general, no
se utiliza en organismos superiores. Debido a que los microorganismos se dividen
por fusin binaria, una cepa es una poblacin genticamente idntica obtenida a
partir de una sola clula.
Cuando se asla un nuevo organismo debe publicarse la descripcin y el
nombre propuesto en la publicacin oficial de registro para la taxonoma y
clasificacin de los microorganismos: International Journal of Systematic Bacteriology
(IJSB), y depositarse en una coleccin de cultivos aprobada por la World Intellectual
Property Organization (WIPO). Los microorganismos depositados se conservan
congelados o liofilizados y constituyen la cepa tipo de la nueva especie. El IJSB
publica peridicamente la lista de nuevos nombres aprobados en el Manual
Bergeys, uno de los principales tratados de taxonoma de los procariotas que est
permanentemente actualizado (on line). Este manual es un componente de
informacin clsica y molecular sobre todas las especies reconocidas de procariotas
y contiene claves dicotmicas que son tiles para la identificacin.
Taxonoma bacteriana convencional
La taxonoma bacteriana convencional consiste en clasificar las bacterias
mediante: a) caractersticas morfolgicas (carcter Gram, esporas, flagelos, etc.), b)
tipo de metabolismo (QOH, QLA, FLA, etc.), c) caractersticas bioqumicas (sustratos
y productos metablicos), d) tolerancia a condiciones ambientales (diferentes gases,
temperatura, pH, etc.), e) sensibilidad a los antibiticos, f) patogeneidad, g)
relaciones simbiticas, h) caractersticas inmunolgicas, e i) hbitat de origen.
Para identificar un organismo se sigue una secuencia desde las caractersticas
ms generales a las ms especficas mediante claves dicotmicas hasta llegar a
definir la especie. Esta metodologa de identificacin se emplea de rutina en
microbiologa clnica, pero a causa de la gran variabilidad y adaptacin de los
microorganismos en ambientes naturales resulta incompleta cuando se trabaja en
condiciones de campo.

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Ejemplo de una clave dicotmica utilizada en taxonoma bacteriana convencional

Eubacterias: Unicelulares, pared rgida, no fottrofas.

o Cocos
(Gram+): Lactobacilceas (bacterias del cido lctico).
Streptococcus, Leuconostoc, Micrococcus.
Micrococceas
Aerobios: Sarcina, Micrococcus.
Anaerobios: Sarcina, Methanosarcina, Thiosarcina.
(Gram-): Neisserlceas.
Aerobios: Neisseria
Anaerobios:Veillonella
o Bacilos
No formadores de esporas
(Gram+)
Aerobios----------------------Corynebacterium, Arthrobacter.
Anaerobios-------------------Propionibactericeas, Lactobacilceas.
(Gram-)
Flagelacin polar-----------Pseudomonas, Acetomonas, Acetobacter,
Nitrobactericeas,
Tiobactericeas.
Flagelacin peritrica-------Enterobactericeas, Azotobactericeas,
Rizobiceas.
Inmviles---------------------Parvobactericeas, Bacteroidceas.
Formadores de esporas (Bacilceas)
Aerobios----------------------Bacillus
Anaerobios-------------------Clostridium, Desulfomaculum.
o Espirilos (Espirilceas)-------------Spirillum, Vibrio, Desulfovibrio.
Bacterias prximas a las Eubacterias:
o Bacterias fottrofas: con pigmentos fotosintticos, luz como fuente de energa.
Bacterias purpreas del azufre (Tiorrodceas).
Bacterias purpreas (Atiorrodceas).
Bacterias verdes del azufre (Clorobiceas).
o Bacterias pedunculadas: con pedunculos.
o Bacterias con vaina: vainas tubulares (Clamidobacterias).
o Actinomicetes: con micelios.
o Rickettsias: parasitismo obligado.
Bacterias que se diferencian de las Eubacterias por caractersticas
importantes:
o Espiroquetas: pared celular delgada y flexible, movilidad por contraccin de
filamento axial.
o Bacterias reptantes: mviles pero nunca por flagelos.
o Mixobacterias: pared celular delgada y flexible.
o Micoplasmas: sin pared celular.

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Taxonoma molecular
La taxonoma molecular consiste en clasificar a los organismos mediante las
caractersticas de las principales biomolculas orgnicas, particularmente los cidos
nucleicos. Tiene la ventaja de ser muy especfica y sensible, por lo que en la
actualidad es una metodologa excluyente para la identificacin taxonmica.
Los mtodos biomoleculares ms utilizados son: a) composicin de bases del ADN,
b) secuenciacin de nucletidos, y c) hibridacin del ADN.
Composicin de bases del ADN
Consiste en establecer la proporcin de las bases del ADN, expresadas en
porcentajes moleculares (mol%) de Guanina+Citosina (G+C). Este mtodo se
fundamenta en que la cantidad relativa de G+C es caracterstica para cada especie y
que existe escasa variacin en la cantidad de G+C dentro de un mismo grupo
taxonmico (entre 3-5%). Adems, existe una cierta correlacin entre la composicin
de bases y el tipo fisiolgico, por ej. los organismos de respiracin aerbica tienen
una proporcin de G+C entre 60-75% mientras que los organismos fermentadores
poseen valores muy inferiores.
Sin embargo, este mtodo tiene algunas limitaciones porque lo que define las
caractersticas de un organismo no es la cantidad de algunas bases sino la
secuencia de las bases dentro del ADN. La determinacin del porcentaje de G+C
aporta informacin sobre la proporcin de cada nucletido del ADN de un organismo,
pero no revela ningn dato sobre la secuencia de esos nucletidos. Dos organismos
pueden tener idntica proporcin de bases y sin embargo no estar relacionados entre
s (ni taxonmicamente ni filogenticamente), ya que es posible tener secuencias
diferentes con una misma composicin global de bases del ADN. Por ejemplo, las
especies del genero Bacillus presentan un amplio rango de porcentaje de G+C,
mientras que bacterias de diferentes gneros dentro de las Enterobacterias tienen
proporciones de G+C prcticamente idnticas.
Secuenciacin de nucletidos
El mtodo consiste en establecer el orden en que estn colocados los
nucletidos dentro de las molculas de cidos nucleicos, basndose en el proceso
biolgico de replicacin del ADN, donde se utiliza un cebador o primer para
comenzar la amplificacin. Luego de la amplificacin se realiza una electroforesis
para obtener un patrn de bandas del que se deduce la secuencia del ADN
introducido. Esta informacin es clave para la diferencia entre organismos.
Metodolgicamente se trabaja con trozos cortos (pocos nucletidos) tanto de
ADN como ARN. Para la taxonoma de bacterias las molculas ms utilizadas son la
fraccin de 16S del ARN ribosmico (1500 nucletidos) y el ADN de los plsmidos.
Este ltimo es muy importante para organismos de inters funcional como los
fijadores de N2, cuya enzima nitrogenasa se informa en el ADN de los plsmidos.

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Para establecer la identificacin de los microorganismos se aplica un
programa de similitud gentica entre las secuencias de los nucletidos analizados y
los de otras especies conocidas. En la actualidad, toda la informacin sobre las
secuencias de nucletidos en especies identificadas est disponible en la Web en lo
que se conoce como banco de genes.

ADN
Secuencia de
ADN

Clulas

ADN
aislado

PCR

Anlisis de
las
secuencias

rbol
filogentico

Hibridacin de ADN
La hibridacin es la construccin artificial de ADN bicatenario a partir de dos
monocatenarios y por complementariedad de bases. El mtodo consiste en poner en
contacto molculas monocatenarias de ADN de organismos diferentes para
establecer su similitud a travs del porcentaje de hibridacin que se produce.
Generalmente, el ADN de una cepa desconocida se pone en contacto con trozos de
molculas de una secuencia de nucletidos conocida denominados primers.
Este es un mtodo muy verstil que permite estudiar el grado de relacin
gentica entre dos ADN. La proporcin de similitud gentica que se acepta para
asignar el nivel taxonmico a dos organismos es: a) 99% o 100% pertenecen a la
misma cepa (clon), b) mayor de 60% pertenecen a la misma especie; c) mayor de
20% pertenecen al mismo gnero, d) entre 1 y el 5% pertenecen a gneros no
relacionados.

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Organismos a
comparar

Organismo 1

Organismo 2

Organismo 3

Organismo 4

ADN cortado

ADN cortado

ADN cortado

Preparacin
del ADN
Cortar y marcar

Cortar y marcar
radiactivamente

Desnaturaliza
cin por calor

Experimento
de hibridacin

Mezclar ADN de dos organismos y aadir un exceso de ADN no marcado:

ADN hibridado

ADN hibridado

ADN no hibridado

ADN hibridado

ADN no hibridado

ADN hibridado

ADN no hibridado

Porcentaje de hibridacin
Resultados e
interpretacin:

ADN control
(misma cepa)

1 y 2 son de la
misma especie

1 y 3 son del mismo

gnero

1 y son de distintos
gneros

CRECIMIENTO BACTERIANO
El crecimiento bacteriano se establece a travs del incremento en el nmero
de clulas de una poblacin y por el consiguiente aumento de la biomasa microbiana.
La velocidad de crecimiento es el cambio en el nmero de clulas o masa
celular por unidad de tiempo. El tiempo requerido para que, a partir de una clula se
formen dos clulas, se denomina tiempo de generacin. El tiempo de generacin
vara ampliamente entre los microorganismos. Muchas bacterias tienen tiempos de
generacin de 1-3 horas, pero las de crecimiento rpido pueden hacerlo en 10
minutos, mientras que otras pueden tardar das.
Las bacterias tienen crecimiento exponencial debido a que el nmero de
clulas se duplica cada cierto perodo de tiempo. Si el crecimiento exponencial se
grafica en ejes de escala aritmtica, se obtiene una curva en la cual se va
incrementando progresivamente la pendiente, lo que dificulta el anlisis sobre la

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velocidad de crecimiento. Generalmente, se grafica el crecimiento bacteriano en
escala logartmica (base 10), que permite visualizar directamente el tiempo de
generacin.

Nmero de clulas

Logaritmo del nmero de clulas

Una caracterstica del crecimiento exponencial es que la velocidad de

incremento en el nmero de clulas es lenta inicialmente, para despus
incrementarse constantemente en una autntica explosin del nmero de clulas

Tiempo en horas

Clculo de tiempos de generacin

El incremento de nmero de clulas que tiene lugar en un cultivo creciendo
exponencialmente es una progresin geomtrica del nmero 2. Al dividirse dos
clulas (para dar cuatro) podemos expresar esto como 2 1
22. Al dividirse 4 para
2
3
dar 8 se puede poner como 2
2 y as sucesivamente. Debido a la progresin
geomtrica, hay una relacin directa entre el nmero de clulas iniciales y las finales
a un tiempo determinado:
N = N0 2n
Donde N = nmero final de clulas, N0 = nmero inicial de clulas y n = nmero de
generaciones que han ocurrido durante el perodo de fase exponencial.
El tiempo de generacin g de la poblacin celular se calcula como t/n, donde t
son las horas o minutos de crecimiento exponencial. Conociendo las poblaciones
final e inicial es posible calcular el nmero de generaciones y a su vez el tiempo de
generacin.
Para expresar la ecuacin N= N0 2n en trminos de n son necesarias las
siguientes transformaciones:

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Se aplica logaritmo
log N = log N0 + n log 2
y se despeja el nmero de duplicaciones

n=

logN - logNo
log2

Tambin se puede calcular la velocidad de duplicacin (v), o sea, el nmero

de duplicaciones en el tiempo, que es la inversa al tiempo de generacin: n/t 1/g.
Los tiempos de generacin son a menudo indicadores del estado fisiolgico de
una poblacin microbiana y es muy utilizado en microbiologa industrial para el
monitoreo del proceso de obtencin de diferentes productos.
Curvas de crecimiento
El crecimiento de una poblacin no presenta un crecimiento constante en el
tiempo. Generalmente la velocidad de duplicacin del nmero de clulas es muy
lenta inicialmente, despus se incrementa constantemente y posteriormente
disminuye. Por tal motivo la grfica de la curva de crecimiento presenta diferentes
fases:
1- fase de latencia.
2- fase exponencial.
3- fase estacionaria.
4- fase de muerte.

Exponencial
Exponencial

Estacionaria
Estacionaria

nmero
deldel
Logaritmo
Logaritmo
de clulas
nmero
de clulas

Latencia
Latencia

Tiempo

Tiempo

Muerte
Muerte

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1- Fase de latencia
Cuando se traslada una alcuota de una poblacin microbiana a un medio de
cultivo nuevo, no ocurre crecimiento inmediatamente, sino despus de cierto tiempo
que se llama fase de latencia. Esta fase puede ser ms larga o ms corta
dependiendo de muchos factores. Por ej., ser larga si el cultivo iniciador es viejo, si
la composicin del medio fresco es diferente al original, etc. La fase de latencia se
produce porque los organismos deben adaptarse a las nuevas condiciones antes de
reproducirse. Generalmente si el cultivo es viejo o en latencia, las clulas deben
comenzar a sintetizar enzimas o factores de crecimiento que ya no poseen.
Similarmente, si el medio tiene una composicin diferente la clula debe sintetizar las
enzimas necesarias para degradar los nuevos compuestos. Con fines prcticos
industriales, se persigue que esta fase sea lo ms corta posible para tener mayor
eficiencia y productividad del cultivo.
2- Fase exponencial
Es la verdadera fase de duplicacin celular. La pendiente de la fase
exponencial depende de las caractersticas genticas de los microorganismos y de
las condiciones del cultivo. En general, los procariotas crecen ms rpidamente que
los eucariotas y los eucariotas pequeos lo hacen ms rpidamente que los grandes.
Si en la industria se persigue la obtencin de gran cantidad de clulas (por ej.,
produccin de inoculantes), se manejan las condiciones de produccin tendiendo a
que la fase exponencial sea larga y de mucha pendiente (medio altamente nutritivo,
control del pH, temperatura y aireacin, etc.).
3- Fase estacionaria
Se denomina fase estacionaria al periodo de tiempo donde no se detecta
aumento o disminucin en el nmero de clulas. Generalmente esta fase se produce
por agotamiento de los compuestos nutritivos del medio de cultivo o por la
produccin de sustancias metablicas que inhiben el crecimiento celular (por ej.,
produccin de cido lctico que baja el pH). Que no se detecte crecimiento no quiere
decir que las clulas no se dividan, sino que la tasa de muerte y la de divisin celular
estn balanceadas. Cuando se pretende obtener un producto metablico, se
manejan las condiciones para que la fase exponencial sea corta y de mucha
pendiente y que el cultivo entre en fase estacionaria rpidamente, donde se registra
la mayor concentracin del producto buscado.
4- Fase de muerte
Cuando se desestabiliza el balance entre muerte y duplicacin y se producen
ms muertes que divisiones, comienza la fase de muerte del cultivo. Esta fase tiene
una pendiente exponencial negativa, que puede ser de la misma magnitud que la
fase de crecimiento exponencial. En la prctica industrial esta fase es importante

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Tiempo

Bacteriosttico

Logaritmo del
nmero de clulas

Logaritmo del
nmero de clulas

Logaritmo del
nmero de clulas

para evaluar el desarrollo de productos desinfectantes y esterilizantes, que pueden

ser: a) bacteriostticos, b) bactericidas o c) bacteriolticos. El efecto bacteriosttico es
el que detiene el crecimiento pero no mata a la clula. Los agentes bactericidas
matan a la clula pero no se produce la lisis o ruptura de la clula, mientras que los
bacteriolticos matan a la clula mediante la lisis lo que se observa como una
disminucin en el nmero de clulas o de la turbidez despus de aadir el agente.

Tiempo

Bactericida

Tiempo

Bacterioltico

Contaje de clulas totales

Contaje de clulas viables

Tres tipos de accin de agentes antimicrobianos. En el tiempo indicado por la flecha

se aadi una sustancia inhibidora del crecimiento a un cultivo en fase exponencial
de crecimiento.

Productos microbiolgicos de carcter industrial

Los productos industriales obtenidos por procesos del metabolismo bacteriano
son de dos grandes grupos: alimenticios y farmacuticos. En la actualidad tambin
existe un amplio desarrollo para la obtencin de productos para la agricultura como
son los inoculantes y los bioinsecticidas como el Bacillus turigiensis. Dentro de los
productos alimenticios se incluyen los de consumo directo como pan, cerveza, vino,
etc. y los insumos para la industria alimenticia (enzimas, alcoholes, cidos, etc.).
Los productos farmacuticos ms importantes son los antibiticos. El
descubrimiento y produccin de los antibiticos fue un hito en la lucha por la
salubridad humana. Los antibiticos son productos secundarios del metabolismo de
algunos microorganismos, sintetizados para poder competir en el suelo frente a las
bacterias. Por tal motivo no afectan a las clulas eucariticas y pueden ser utilizados
en organismos superiores sin daar las clulas del enfermo. Los antibiticos tpicos
son: la penicilina (inhibe la sntesis de la pared celular de las bacterias) producida por
el hongo Penicillium y la estreptomicina (inhibe la sntesis de protenas en bacterias)
producida por el actinomycete Streptomyces. En la actualidad muchos antibiticos
son sintetizados artificialmente y no a travs de cultivos microbianos.

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La produccin de inoculantes es uno de los objetivos de la Microbiologa
Agrcola y ser extensamente desarrollado en otras unidades.
Todos estos procesos microbiolgicos industriales se basan en la potenciacin
de reacciones metablicas que los microorganismos ya son capaces de llevar a
cabo, con el fin de aumentar la produccin del compuesto de inters.
Cultivos continuos
Para la produccin industrial de cualquiera de los productos biolgicos se han
desarrollado tecnologas de alta precisin para evitar contaminaciones y optimizar el
rendimiento. Los cultivos son realizados en equipos de fermentacin especiales con
condiciones controladas estrictamente.
Un cultivo continuo es esencialmente un cultivo de volumen constante, y para
mantener los cultivos de manera continua en fase exponencial se han desarrollado
equipos denominados quimiostatos, que consiste en evitar la fase estacionaria y de
muerte mediante la incorporacin de medio de cultivo fresco a medida que se va
utilizando el sustrato original. Simultneamente con la incorporacin de medio fresco
se retira el cultivo bacteriano ya crecido. Se denomina turbidostato cuando la
incorporacin de nuevo medio de cultivo se realiza segn la tasa de crecimiento,
evaluada por densidad ptica.

Medio fresco
Depsito
de medio
estril

Llave de
control
de flujo
Apertura
para la
inoculacin
y la salida
de aire

Recipiente
de cultivo

Entrada
para la
aireacin
forzada y la
agitacin

Aire
estril

Regulador
de flujo
Espacio
con aire

Cultivo

Rebosadero
Sifn de
rebosamiento

Efluente
con
clulas