Espectroscopa de Fluorescencia

Ana Denicola

DIAGRAMA DE JABLONSKI (1898-1980)

relajacin vibracional
conversin interna IC

S2

relajacin vibracional
cruce intersistemas ISC

T1

S1

kNR IC

hA

hF

kNR ISC

hP

S0
fluorescencia

fosforescencia

LUMINISCENCIA

emisin de luz desde un estado electrnicamente excitado

Se alcanza el estado excitado por absorcin de luz en:

FLUORESCENCIA

estado singulete excitado, transicin permitida, ns

FOSFORESCENCIA

estado triplete excitado, transicin prohibida, ms

QUIMIOLUMINISCENCIA se alcanza el estado excitado por una reaccin qumica

10-8 s
10-15 s
10-3 s

LA CLAVE ES LA ESCALA DE TIEMPO DE LOS PROCESOS:

ABSORCION: ~ 10-15 seg
CONVERSION INTERNA: ~ 10-11-10-9 seg
FLUORESCENCIA: ~ 10-10 a 10-7 seg
FOSFORESCENCIA: ~ 10-6 a 1 seg (es una transicin prohibida por
simetra)
RELAJACION VIBRACIONAL: ~ 10-12-10-10 seg
Los pasos propiamente dichos de absorcin y de emisin son extremadamente
rpidos, tanto que los ncleos no llegan a moverse (principio de Franck-Condon).
La absorcin slo da informacin del entorno inmediato a la molcula que
absorbe.
La relajacin vibracional por lo general es mucho ms rpida que la fluorescencia,
entonces la molcula se relaja completamente y (en general) slo vemos la
emisin desde el estado S1.
La escala de tiempo de fluorescencia es la misma que la escala de tiempo de
movimientos moleculares, por eso el espectro de fluorescencia posee
informacin de un entorno ms amplio que el de absorcin.

FLUORESCENCIA
1er. paso: absorcin o excitacin
energa suficiente para llegar a nivel
electrnico superior S1 o S2

exc

ESTADO EXCITADO

2do. paso: emisin de luz

energa radiativa emitida menor que la
absorbida, em > exc

Corrimiento de Stokes

RENDIMIENTO CUANTICO DE FLUORESCENCIA:

Q = # fotones emitidos / # fotones absorbidos
0 < Q < 1
en trminos de las constantes cinticas de cada proceso:
Q = kF / (kF + kNR)
donde kNR son todos los procesos de decaimiento no radiativos
TIEMPO DE VIDA: tiempo promedio que un fluorforo pasa en el
estado excitado antes de volver al estado basal (por cualquier
va)
= 1 / (kF + kNR)
TIEMPO DE VIDA NATURAL: es el tiempo de vida si slo
volviera por fluorescencia
n = 1 / kF
se puede calcular a partir de y Q:
n = / Q

Rendimiento (Q) = fotones emitidos

fotones absorbidos

<1

= constante de velocidad de emisin

= constante de velocidad de decaimiento no radiativo

= tiempo de vida intrnseca o natural,

sin ningn proceso no radiativo

= tiempo de vida medida

Parmetros a medir en fluorescencia

Intensidad de fluorescencia (ISS)

Espectros de excitacin y emisin (IF vs )

max(ex), max(em)

Rendimiento cuntico de fluorescencia (Q)

Vida media del fluorforo ()

Anisotropa (r) (tiempo de correlacin rotacional)

Eficiencia RET (E) (distancia de Fster)

Intensidad de fluorescencia
(estado estacionario) ISS

Iluminacin continua

Intensidad resuelta en el tiempo ()

Pulso de luz

ESPECTROFLUORMETRO

ESPECTROFLUORMETRO

FUENTE DE LUZ

Xe, Hg-Xe, Hg (high- low-P), Diodo (lase, LED)

MONOCROMADORES excitacin y emisin

ancho de banda
polarizadores
DETECTOR

vs FILTROS

tubo fotomultiplicador (PMT)

MUESTRA geometra de iluminacin de la muestra

La medida de IF es relativa
a la geometra del equipo

Usar soluciones diluidas A < 0..05

Control con solo solvente

Usar adecuada exc, filtro, conc. fluorforo

Filtrar la solucin

Intensidad de Fluorescencia y concentracin

del fluorforo

Efecto de filtro interno

Cuantificacin del fluorforo

midiendo Intensidad de fluorescencia IF
IF (ex, em) = IA Z

Z = factor instrumental
= rendimiento cuntico de F

IA = IT - I0 = I0 (1 exp(-2.3 c l)
= coef. Absortividad a exc
c = concentracin del fluorforo

Si A << 1

IA = I0 (2.3 c l)

IF (ex, em) = I0 Z 2.3 c l

IF es proporcional a la conc. Si trabajamos con conc. diluidas

Fluorforos en bioqumica
Fluorescencia intrnseca
fluorescencia natural, propia del sistema

Fluorescencia extrnseca
agrego a la muestra un fluorforo externo
(sonda fluorescente)

Fluorescencia en:
Protenas, fluorescencia intrnseca debido a residuos
aminoacdicos aromticos, predomina el triptofano.
Adems marcado con sondas fluorescentes (FITC,
DNS). GFP y derivados.

cidos nucleicos, sin fluorescencia intrnseca, se

agregan sondas fluorescentes catinicas planares (EtBr,
DAPI) o fosfolpidos marcados

Membranas, no fluorescentes, se agregan sondas

liposolubles con baja fluorescencia en agua (DPH, ANS)

Fluorescencia en:
NAD(P)H
FAD, FMN
Piridoxal fosfato (PLP)
Clorofilas
Indicadores fluorescentes
(pH, Na+, Cl-, Ca2+, O2)

4.7 ns en solucin
(2.3 ns FMN)
0.3-1 ns unido a prot.

0.4 ns en solucin
1-5 ns unido a DH

Phe

Abundancia: 3.5%

ex = 260 nm, em= 282 nm

(Q. ~ 5)
Insensible al entorno

Tyr

Abundancia: 3.5%

ex = 275 nm, em= 303 nm

(Q. ~ 220)
Insensible al entorno,
quencheable
Ionizable, tirosinato emite (<Q)

Trp

Abundancia: 1.1%

ex = 295 nm, em= 350 nm

(Q. ~ 770)
Sensible al entorno, quencheable
Varias

Sondas fluorescentes para protenas

Fluorescena (y Rodaminas) absorbe

y emite en el visible, alto rendimiento,

=80.000 M-1cm-1

DNS-Cl sensible a
polaridad del entorno,
fluorescencia polarizada

Compuestos de B (BODIPY) absorben y emiten en el visible, alto

rendimiento, =80.000 M-1cm-1, fotoestables, insensible al solvente y pH

Sondas fluorescentes para cidos nucleicos

Bases modificadas fluorescentes

GFP = Green Fluorrescent Protein

Formacin espontnea del fluorforo al plegarse

Relajacin por solvente

Transferencia de energa

X*

Quenching
Transferencia de carga
Disociacin de H+

(ns)

Formacin de complejos
Formacin de oligmeros

Efectos del solvente y del entorno local sobre la fluorescencia

H = hexano
CH = ciclohexano
T = tolueno
EA = acetato de etilo
Bu = butanol

Efectos del solvente y del entorno

k >> 1/

k 1/

Corrimientos de Stokes dinmicos

Ecuacin de Lippert-Mataga

2f
hc = 3 ( E G ) 2 + const
a

El fluoroforo es consideredo un dipolo en un medio

continuo de constante dielctrica (permitividad)
uniforme
Materiales dielctricos, conductores y medios biolgicos

Solvatacin de iones
Saturacin dielctrica en las cercanas del in

Cambio en la emisin por cambio de solvente

o cambio del entorno (ej. unin a protena)

HSA = albmina humana

ANS = Anilinonaftalensulfonato (fluorforo muy sensible a la polaridad entorno)

Cambio en la emisin por cambio de solvente

o cambio del entorno (ej. unin a protena)

Determinar constantes de unin de un ligando si

este es fluorescente y su fluorescencia cambia
con la unin o si la fluorescencia intrnseca
cambia por efecto de la unin de un ligando

Emisin del triptofano es sensible al entorno

(ej. desnaturalizacin de protena)

N = nativa
U = desplegada unfolded

Usos de fluorescencia en bioqumica

Localizacin subcelular
Cambios en la concentracin
Interacciones moleculares
Cambios conformacionales
Distancias intra/intermoleculares
Difusin rotacional
Caracterizacin estructural
Actividad enzimtica