Entamoeba histolytica

entamoeba histolica se relaciona con la presencia de numero de glicoproteinas que participan en la

adhesion y posterior lisis de la celula del huesped por el parasito, se ha centrado en la identificacin y
caracterizacin de amaeba glicosil transferasas que catalizan reacciones esenciales de la sntesis
glicoprotena http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=4RBN
Durante el montaje de las glicoprotenas asparagina la porcin de oligosacrido del intermedio Glc 3
Man 9 GlcNAc 2 -PP-Dol se transfiere en bloque a las cadenas de polipptido naciente en el lumen de
la retculo endoplsmico.
despus de la transferencia, la glucosidasa I y II retirar el terminal alfa-1,2-ligados y las dos fracciones
de glucosa alfa-1,3-vinculada, respectivamente.
http://biocyc.org/HUMAN/NEW-IMAGE?type=COMPOUND&object=CPD-13936
Las clulas se lavaron dos veces con 15 a 20 ml de solucin salina tamponada con fosfato (fosfato de
potasio 15 mM y cloruro sdico 175 mM, pH 7,2) y una vez con tampn de fosfato de potasio 20 ml de
10 mM, pH 7,5, suplementado con 2 M E- 64 [trans-epoxi-succinil L -leucylamido- (guanidino)
butano] (tampn de rotura). El sedimento celular se lav (1-2 ml) se mezcl con un volumen
equivalente de perlas de vidrio (0.40-0.50 mm de dimetro) y trofozotost fueron interrumpidas por
perodos alternos de agitacin en vrtex (20 s) y enfriamiento con hielo hasta que se completaron 2 min
de rotura.El homogeneizado se aspir con una pipeta Pasteur, tomada a 5 ml con tampn de rotura, y se
centrifug a 1500 g durante 10 min. El sobrenadante se guarda y se centrifuga a 105.000 g durante 60
minutos. El sobrenadante resultante se guarda y el sedimento de membrana se resuspendi en
aproximadamente 2 ml de tampn de rotura.Despus de las diluciones apropiadas, estas preparaciones
se utilizaron para ensayar la actividad de alfa-glucosidasa, ya sea con 4-metilumbeliferil-alfa glucsido D (MU alpha Glc) o p-nitrofenil alfa- D -glucopiranosido
figura1
con citrato de sodio y un ph mnimo de 4 con una actividad de 0.3 ,ph de 6 mximo se observa una
actividad de 2.5.
acetato de sodio ph mnimo de 4 y actividad de 0.3 y un max de ph 5.5 y actividad 1.51
fosfato de potasio ph minimo de 6 y actividad max de 7 o prxima y un ph max de 8 y una actividad de
1.2
TRIS/HCL ph7 act 0.25
citrato de fosfato ph4.7 0.1 ph 5.5 7.5
Los resultados de varios experimentos indicaron que la alfa-glucosidasa se distribuido tanto en la
membrana y en las fracciones solubles, este ltimo que representa alrededor del 70% de la actividad
total. Una distribucin muy similar se ha observado en Candida albicans (Torre-Bouscoulet 1997),
mientras que en Saccharomyces cerevisiae (Kilker et al. 1981) y tejidos de mamferos (Burns y Touster
1982), glucosidasa I y II, respectivamente, se distribuyen por igual en el membranas y en el citosol.
La hidrlisis de MU alpha Glc era ptima a pH 5,5 y 6,0 con tampn de citrato-fosfato por la enzima
soluble y unida a membrana, respectivamente, y en 47 C, ya sea para la fraccin de enzima (. Figs 1
y 2). El pH ptimo se ha utilizado como un parmetro para discriminar glucosidasas de procesamiento
de hidrolasas lisosomales, que generalmente son activas a pH ms cidos (Heitkamp et al. 1982)
.values oscilan desde 6,2 hasta 6,8 para la glucosidasa I de diferentes fuentes (Kilker et al. 1981 ;
Heitkamp et al 1982;. Bause et al 1986;.. Szumilo et al 1986) y de 6 a 7.5 para glucosidasa II de tejidos
de mamferos (Burns y Touster 1982;. Saxena et al 1987).

Por lo tanto, el pH ligeramente ms cido de la glucosidasa alfa soluble se debe esperar para un
galactosidasa menos especfica. Comparacin de la eficacia cataltica en MU alpha Glc indic que
tanto particulados y solubles fracciones hidrolizadas de manera eficiente el sustrato fluorognico como
una funcin del tiempo de incubacin (hasta 60 min) y la concentracin de protena (hasta 12 g de
protena / ensayo), aunque la actividad especfica de glucosidasa alfa soluble era 2,8 veces mayor que
la de la enzima unida a la membrana (Fig. 3)
Comparacin de la actividad en pNP alpha Glc revel, sin embargo, una diferencia ms drstica entre
las dos fracciones (Fig. 4). As, mientras que este sustrato se escindi fcilmente por la fraccin
soluble, slo cantidades traza fueron digeridos por la enzima de partculas, lo que indica una mayor
especificidad de sustrato de la actividad unida a la membrana. Ninguna fraccin enzimtica era activa
en los derivados de los enlaces glucopiranosidos correspondientes.
Diagramas de la actividad de la enzima alfa frente MU concentracin Glc revelaron la cintica de
Michaelis-Menten convencionales. Calculados los valores mximos de Km y V fueron 36 microM y
10,9 nmol MU / min / mg de protena y 73 microM y 20 nmol / min protena MU / mg para la
membrana y las glucosidasas solubles, respectivamente (Figs. 5 y 6).
Otros valores de Km reportados son 13 y 19 microM MU alpha Glc para la alfa glucosidasa II de la
glndula mamaria bovina (Saxena et al. 1987) y rin de cerdo (Brada et al. 1990), respectivamente.
De acuerdo con otros informes sobre glucosidasa I (Kilker et al 1981;. Bause et al 1986;.. Szumilo et al
1986) y II (. Saxena et al 1987), glucosidasas ameba no requieren iones metlicos para la actividad. Por
el contrario, Mn2 + y en menor medida Mg2 + fueron leves inhibidores de ambas fracciones de la
enzima (Fig. 7).Aqu, Triton X-100 y Brij 35 (al 0,12%) estimulan la actividad glucosidasa de
partculas de hasta 77 y 98%, respectivamente, mientras que octil glucsido reduce la actividad de 55 a
1%. especies inicas, tales como DOC y particularmente SDS, eran inhibidores potentes. Aqu, Triton
X-100 y Brij 35 (al 0,12%) estimulan la actividad glucosidasa de partculas de hasta 77 y 98%,
respectivamente, mientras que octil glucsido reduce la actividad de 55 a 1%. especies inicas, tales
como DOC y en particular SDS, eran inhibidores potentes Por el contrario, Brij 35 y Triton X-100 no
afectaron significativamente la fraccin soluble que, como la fraccin de partculas, tambin fue
inhibido por el DOC y octil glucsido y muy fuertemente por SDS (Fig.8)Muy probablemente, el
efecto activador observado aqu con algunos detergentes tambin puede estar relacionado con la
exposicin de la enzima presente en vesculas de membrana formados durante la homogeneizacin
trophozoite y / o el procesamiento posterior de las fracciones celulares. Adems de arilo sinttico alfaglucsidos, de mamfero glucosidasa II tambin est activo en maltosa, que puede ser utilizado como
un sustrato alternativo (Burns y tostadora 1982). Adems, la hidrlisis de MU alpha Glc es inhibida por
turanosa (Glc- alfa 1,3-fru) y maltosa, pero no por trehalosa (Saxena et al. 1987).A glucosidasa
parcialmente purificado de tipo II hidrolasa de Candida albicans se ha demostrado para escindir
nigerosa y maltosa con eficiencias comparables mientras que es inactivo en trehalosa (Torre Bouscoulet
1997). Por otro lado, kojibiosa se ha demostrado que competir distancia hidrlisis del oligosacrido Glc
2 Man 9 GlcNAc por glucosidasa planta I (Szumilo et al. 1986).
Aqu, partculas alfa glucosidasa preferentemente escinde la alfa disacrido 1,3-ligado (nigerosa), en un
orden decreciente de eficacia de la alfa 1,3> alfa 1,4> alfa 1,1 = alpha 1,2. Por el contrario, la enzima
soluble hidrolizado de maltosa con la tasa ms alta, aunque tambin digerido cantidades sustanciales de
la alfa 1,1 y alfa 1,3 disacridos unidos a, con kojibiosa ser el sustrato ms pobre (Tabla I).

Estos resultados son consistentes con la presencia de una actividad de tipo II glucosidasa en las
membranas de ameba, pero no descartan la presencia de otros activos glucosidasas a ambos alfa 1,1- o
sustratos alfa-1,2 servidumbre. Como alternativa, una glucosidasa de tipo II hidrolasa con una baja
especificidad tambin puede explicar estos resultados.
Otra prueba de la presencia de glucosidasas de procesamiento en las membranas de ameba vino de
estudios con inhibidores especficos de la glucosidasa I y II.
Desoxinojirimicina, un anlogo de la glucosa, inhibe fuertemente la glucosidasa I de diferentes
organismos con valores de Ki de 0,3 a 5 micras, dependiendo de la fuente, y glucosidasa II con valores
de CI50 en el intervalo de 2 a 50 micro M (Moorman et al. 1994 ).
La castanospermina, por otra parte, inhibe la glucosidasa I y II con valores de IC50 de 2 y 25 a 50
micras, respectivamente (Moremen et al. 1994). En este estudio, la actividad unida a la membrana era
extremadamente sensible a la inhibicin por DNJ, que reduce la hidrlisis de MU alpha Glc a 50% a
0,3 microM (Fig. 9)
Por el contrario, se requiri una concentracin 13 veces mayor del antibitico para inhibir la actividad
soluble en la misma medida. Castanospermina inhibir ligeramente (15% en 2-4 micro M) la enzima
unida a la membrana, mientras que no afect la actividad soluble. Un resumen de los resultados se
presenta en la Tabla II.

Un trofozoto es la forma vegetativa activada que se alimenta generalmente por fagocitosis y se reproduce,Se
caracterizan por tener uno o dos nucleos con una concentracin de cromatina llamada cariosoma, la cual puede ser
concntrica o en la periferia del ncleo.