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Metodos de esterilizaci6n
del medio de cultivo y del aire
ESTERILIZACION
DEL MEDIO
Existen muchos metodos para efectuar la esterilizacion del medio, ya sea par
eliminacion fisica de los posibles contaminantes 0 por destrucci6n de los
mismos. Sobre la base de estos criterios, Cooney2 indica los siguientes
metodos:
[ 115)
116
A. Eliminacion flsica
a. Filtracion *
b. Centrifugacion
c. Flotacion
d. Atraccion electrosta tica
e. Intercambio ionico
f. Adsorcion de virus par carbon
B. Destruccion
a. Calor humedo*
b. Calor seco*
c. Radiaci6n electromagnetic a*
d. Radiacion sonica
e. Agentes quimicos*
De los metodos anteriores la filtracion es eficaz para la eliminacion de
bacterias y fagos, aunque las caidas de presion son altas y los flujos son bajos;
se emplea comercialmente pero este metodo esta limitado por el tamano de la
particula; tiene la ventaja de que no dana el medio de cultivo.3,4
La destruccion de los microorganismos es mejor y mas faclL generalmente
se utiliza la esteriJizacilm par calor, pero se suelen emplear agentes quimicos
cuando en el medio hay sustancias sensibles al calor, en la industria alimentaria el uso de la radiacion electromagnetica (principalmente radiacion LJV) esta
muy extendido.5
La esterilizacion por calor ha sido estudiada par muchos investigadores,
entre los que destacan Aiba et at.. 6 Deindoerfer 7 y Humphery8 por haber
propuesto diversos modos de aplicaci6n considerando el punto de vista de
ingenier!a.
Primero se tratani eI concepto basico de mortalidad termica de los
microorganismos y despues los aspectos teoricos y practicos de su aplicacion,
as! como algunos problemas encontrados.
MORT ALIDAD
TERMICA
DE LOS MICROORGANISMOS
Se han planteado muchas teorias para explicar el mecanismo de la inactivacion termica de Jos organismos, pero aqui solo se tratara Sll aspecto cinetico.
La destrucci6n de los microorganismos depende de muchas variables: pH
del medio, estado vegetativo de las celulas, iones metlilicos.6 En la figura
7.1 b aparecen 3 tipos de curvas de tasas de mortalidad. La curva A representa
celulas vegetativas en una solucion buffer; la curva B es tfpica de esporas, y
la C es caracteristica de organismos dafiados 0 particularmente sensibles al
calor. Sus tasas de mortalidad tambien varian, siendo constantes para las
celulas vegetativas A; para B la tasa es menor al principio del tratamiento pero
aumenta con el tiempo. En el caso C, una vez eliminadas las celulas
defectuosas 0 sensibles, las sobrevivientes tienen una tasa similar a la de A.
Ley logaritmica de rnortalidad
La dcstruccilJD de microorganismos
Impliea
aplicaeion
industrial
117
[1 )
-kN
c
b
Tiempo
Figura 7.1. Curvas que i1ustran el proceso de destruccion
B, esporas; C, organismos
daiiados.
microbiana.
A, celulas vegetativas;
118
10'
=
~
~
:J
:m
.!d.
co
'">
'>
'"co
:J
:m
u
106
10'
10103
102
10'
23456
Tiempo (min)
In(N~) -k
=
ahora si No/N
(t)
[2]
= 10, se tiene:
In 10
2.3/k
[5]
k t
[6]
en k,
119
- A 0 e -E/RT
k -
[7]
Teoria
QIO
kT
[8]
~-10
Temperatura
110
115
105
40
20
10
7
.S'
E
c.:
2.55
2.6
~
2.65
(0 K
2.7
10-3
120
zona en que se
destruye men os
de 10% de la tiamina
Temperatura
de calentamiento
Figura 7.4 Determinacion de una zona de esterilizacion en que se destruyen las esporas de
y menos dellO% de la tiamina del media de cultivo.
Bacillus thermoacidurans
TABLA 7.1
TIC)
k(ser'
10 -3)
110
450
121.1
95.100
95-100
95-100
104
131.4
104
121.1
104
127
60.5-68
5(}'60
4(}'50
51.2
820
14.77
6.51
0.57
250
7.0
29.5
1.04
193
0.105
0.028
0.113
E(cal./mol)
74000
70398
50034
77 314
67700
67 700
82 100
72 400
72 400
76900
40800
46000
121
celulas/ml. Se fija un nivel de esterilidad, por 10 general una celula por cada
1 000 corridas, 0 sea 10-3 celulas/volumen total.
Generalmente no se conoce la especie 0 especies contaminantes y es preciso
defmir una k, para casos generales:
I min-1 (esporasa 115).
1010 min-I (celulas vivas a I ISe).
k espora
k celula
In --
donde No =
O~;el)
Ao
e -E/RT dt
[9]
122
150
~
~
'Q";
100
Q.
'"
f-
temperatura
-- de
fermentaci6n
50
temperatura
del medio
Esterilizaci6n continua
150
~
~
E
'"E
Q.
'"
f-
50
---
temperatura
--de
fermentaci6n
B
234
Esterilizacion batch
para diferentes
tipos de esterilizacion.
flujo tap6n que evite el retromezcIado con 10 cual los tiempas de esterilizaci6n
son continuos. En la figura 7.Sa se muestra el perfil temperatura-tiempo para
esterilizaci6n continua. La ecuaci6n [9] se emplea para disefio, aunque en este
casu el periodo de calentamiento y el de enfriamiento contribuyen muy poco
alcanzar el nivel de esterilidad deseado. Lin lOy atros han analiza do te6ricamente este tipo de esterilizador y sus estudios permiten hacer cam bios en el proceso
y establecer los panimetros de escalamiento.
Probablemente, entre los factores que limitan el uso de la esterilizaci6n
continua, el mas importante sea el de las plantas de fermentaci6n. EI numero
de productos y el tamafio de los fermentadores es tal, que resulta inconveniente desde el punto de vista econ6mico operar un esterilizador continuo.
EFECTO
COMBINADO
DE CALOR
Y ALCALIll
123
Y ESTERILIZACION
DEL AIRE
Perfiles tiempo-temperatura
Tipo de transferencio
de calor
de esterilizacion en lote6
a."
Perfil tiempo-temperatura
'Y
hs
Vapor directo
MepTo
S/M
(hiperbolico)
q
Calentador
electrico
T = To (l +
at)
=
MCpTo
(lineal)
VA
a
Calentamiento
con
vapor en la camisa
Enfriamiento
refrigerante
con
(exponencial)
{3
T = T r (l. + 13e -a t)
13 = To - TrlTr
(exponencial)
To
Tv
temperatura
temperatura
Tr
temperatura
del refrigerante
T
h
S
M
Cp
C'p
q
V
A
temperatura
de periodo estacionario
entalpia del vapor
flujo masico del vapor
masa inicial del medio
calor especifico del medio
calor especifico del refrigerante
tasa de transferencia
de calor
coeficiente total de transferencia
de calor
area de transferencia
de calor
124
TABLA 7.3
Ancho (Il)
Largo (Il)
Bacillus cereus
B. licheniforms
B. megaterium
B. mvcoides
B. su'btitis
Aerobacter aerogenes
Aficrococcus atucus
Proteus vulgaris
1.3 - 2.0
0.5- 0.7
0.9-2.1
0.6 - 1.6
0.5 - 1.1
1.0 - 1.5
0.5 - 1.0
0.5 - 1.0
8.1 - 25.8
1.8 - 3.3
2.0 _. 10.0
1.6 - 13.6
1.6 - 4.8
1.0 - 2.5
0.5 - 1.0
1.03.0
0.6 - 1.2
0.8 - 1.2
0.5 - 1.0
Esporas
Bacillus megaterium
B. mycoides
B. subtitis
1.7
1.8
1.8
125
104 particulas/m3,
pero este mimero depende en gran medida del medio
ambiente (ciudad, montana, epoca del ano, etc.) y debe ser considerado para
cada caso particular. 12
Tipos de filtros
Los tipos de (dtros para aire no difieren mucho de los utilizados para
filtraci6n del medio de cultivo. Su cJasificacion se puede hacer considerando la
escala de operaci6n. En escala pequefia se em pie an fiItros millipore. de
asbesto a de porcelana; todos ellos dan buenos resultados y su operacion y
regeneracion es seneilla. En escalas mayores se utilizan filtros granulares,
compuestos generalmente de partfculas de carbon (6-30 mallas); su uso es
limitado 'f aunque tienen la ventaja de no producir una caida de presion
importante presentan peligro de ignici6n a temperaturas mayores de 50C.
Los ftltros fibrosos son de uso general en todas las escalas; son camas
empacadas de lana de vidrio 0 materiales similares. Su diseno y operacion son
muy sencillos y su confiabilidad es buena si se revisan y remplazan peri6dicamente. El dhimetro de la fibra utilizada varia entre 3 y 15 J.l. y la caida de presion en estos fittros es ligeramente mayor que en los flItros de camas empaca.
das con carbon.
Mecanismos de filtracion
La tcoria de la filtraci6n ha sido estudiada detalladamente; se recomienda al
interesado revisar las referencias 6, 8, 12 y 13. El comportamiento
de un
filtro para aire se deflne de la siguiente manera:
N . No
100 (%)
[10]
No
dande ii es la eficieneia total de retencion del fiitra. Sin embargo el concepto
de eficieneia. ii.no es eonveniente para estudiar la relaeion entre ii, y el
meeanismo de reteneion debido a factores como el largo del lecho compacta
(L), la fraecion volumetrica (a), el diametro de la fibra (Of), etc. Por 10 que
para fines de investigacion se introdujo la idea de eficiencia de una sola fibra, 7).
Los mecanislllos de reteneion de partieulas finas par filtros de aire son:
a) impaeto.
b) intercepcion.
c) difusion,
d) sedimentacion. y
e) atraecion electromagnetiea.
Los tres primeros tienen efectos mas pronuneiados, sobre todo en 10 que se
refiere al uso directo en fermentacion, pues el aire que recibe el filtro (previa
compresi6n) ha sido limpiado parcialmente de particulas mayores. por 10 que
la sedimentacion tiene un efecto menor. La carga electrostatica afecta la
retencion de organismos. pero todavia no hay suficiente informacion para
poder emplear el mecanismo (e) en las ecuaeiones de disefio.
La figura 7.6 representa esquematicamente
Iineas de corriente de aire
Metodos de esterilizaci6n
126
t
b
Figura 7.6. Diagrama del t1ujo alrededor de una sola fibra cilfndrica.
producidas por el flujo alrededor de una fibra cilindrica. Las lineas continuas
indican que, en ausencia de otras fuerzas, se produce una region curva n la
vecindad de la fibra. Sin embargo, las partlculas que se mueven con las
corrientes no pueden seguir exactamente ese patron debido a su propia inercia
(lfneas discontinuas).
Habra pues tres casos: particulas que choquen directamente con la tibra
(impacto inercial); otras que aunque no choquen directamente, debido al
cambio del patron de lineas tambien seran colectadas por el cilindro (intercepcion), y fmalmente las particulas que, sin chocar contra la fibra, debido a su
movimiento irregular l!eguen a estar en contacto con ella y las retenga
(difusion ).
Impacto inerciai
(Til)
Til
[ 11]
-----
[12]
donde Vc es la velocidad superficial crltica del aire, JJ.a es la viscosidad del aire,
Pp es la densidad de la particula y C es un factor de correccion de la Ley de
Stokes. Para bacterias de 1 JJ. de diametro, Vc es igual a:
Limpieza y esterilizacion
127
del aire
[13]
donde Vc est.i en pies/segundo y Df en mieras.
Intereepcion (rl2)
5i la partieula es esferiea y sus eentros eoineiden con las lineas de corriente de
aire que pasan a una distaneia Dp/2 de la fibra, choeanin con ella y tambien
senin detenidas. La eficiencia de este tipo de retenci<'ln depende del tamafio de
la particula y del patron de flujo alrededor del cilindro. La expresion
matematica es:
--_._-2(2 - In NRe)
+ -NR:
donde V
((1 + NRe)
In (l + NRJ-(1
+N
Re
[14 ]
Df Vp
+1)
Difusi6n (r/3)
La difusividad de las particulas finas, 15, puede expresarse como una funcion
de Dp' y si consideramos a Do como el diametro efectivo de las partlculas,
debido a la difusion tendremos:
(2(K) InK- K
L)
[ 15]
en donde
l16]
i1 y
las eficiencias
7)0,
[ 17]
Para una eama empaeada y porosa de un filtra real el valor de 170 y la ~17i
pueden diferir por depender de condiciones de operacion diferentes. Para un
filtro real la efieiencia 1701 se define asi:
128
In [_1. ]
1T (l - a) Dr
-------
4aL
[ 18]
1-'1
que:
+ 4.5 a) ii
In (~)
-k'N
[19]
= -k'L
(20]
bacteria
~fagO
"
0.Q1
'70
0.001
0.000 1 L..-.......
-J'---'-_L..-..J....
2 4 df 10 20
B. Eficiencia de una fibra para la colecci6n de particulas de lit de diametro. por intercepci6n
directa
TJo
Limpieza
129
donde k es funcion de la velocidad del aire, densidad del ftltro, tamafio de las
fibras y tamafio y densidad del microorganismo eliminado.
Se puede expresar la constante de filtraci6n, k', en terminos de la
profundidad del filtro como la longitud para eliminar 90% de No, es decir L90
In
2.3
No
[21]
(L)
In
No
+ 4.5)a
1.27 7]0 (1
-------------
[22]
(1 -a) Df
TABLA
7.4
Df
(Ii)
Lana de
vidrio
16
Fibra de
vidrio
8.5
Microorganism
os
V
(cm/seg;
J4
3
15
30
150
300
4
9
11.5
1.5
0.4
Escherichia
coli (fago T-2r)
3
15
30
150
300
0.4
0.6
0.7
0.8
1.1
1.7
1.5
15
17.0
8.75
13
3.1
3.0
16
Esporas de
B. cereus
1.4
6.4
Carbon activado
(4-9 malla)
Esporas de
B. su btilis
18
28.5
18.5
Referencia
Esporas de
B. subtilis
Carbon negro
(15-30 malla)
Lana de
vidrio
L.o
(em)
Serratia
marcescens
3.9
7.8
130
El disefio se hace tomando en cuenta las condiciones que producen la eficieneia minima del mtra. La retencion es minima cuando los efectos de in.
tercepcion son calculados a una velocidad menor que Vc (velocidad crtiea en
la eual los efectos inereiales se vuelven cera). Se apliea entonces la ecuacion
[14] escogiendo un tamafio de partlcula (v. gr. 0.6 Jl), Y una densidad de las
particulas micrabianas, a una veloeidad calculada con la ecuaci6n [12], obteniendose una grafica de 7]0 vs D f' de la cual se puede derivar una ecuacion de
disefio en la que la efectividad del mtra se expresa en terminos de D f Y Q. La
figura 7. 7b se obtuvo para particulas de una micra de diametro con una densidad igual a la de una espora de bacteria; la velocidad eritica fue de 0.066 Dc
Finalmente el diseno debe considerar los costos del material (tamano del
mtro) y los costos de operaci6n (caida de presion) para poder seleccionar el
tamafio optimo del mtra.
NOMENCLATURA
Ao
b
Cp
Cp
D
D
Do
Df
Dp
E
h
k
k
k'
K
L
L90
M
N
No
NRe ---
I"c
q
R
S
T
131
Referencias
To
Tv
Tr
t
U
V
Vc
0:
1]
1]1
1]2
1]3
1]
1]i
1]0
1]",
Ila
Pp
temperatJra
inicial del media
temperatura
de la fuente de calor
temperatura
del refrigerante
tiempo
coeficiente total de transferencia
de calor (kcal(m2 hOC)
velocidad del aire
vclocidad superficial cr{tica del aire (cm(seg, ft(seg)
fraccioll volumetrica
eficiencia de una sola fibra
retencion par irnpacto inercial
retencion par intcrcepcion
retencion por difusi6n
eficiencia
eficicncia
etlcicncia
REFERENCIAS
1. E.L. Gadc'1 (en) Manufacture
of Chemicals hy Fermentation,
ONUDI, Viena, diciembre de 1969.
2. c.L. Cooney. "Fermentation
Technology",
curso en cJlnstituto
Tecno16gico de Massachusetts, EU A, julio de 1972.
3. 1l.L. Sadoffy .LW. Almolof,lnd.
Eng. Chern., 40 (12), 2199 (1956).
4. D.B. Pa11,Process Biochem., enero: 9 (1975).
5. S.A. Goldblith. Process Biochem., julio: 37 (1969).
6. S. Aiba, A.F. Humphrey
y NY. Mi11is, Biochemical
Engineering,
2a. ed .. Academic
Press, Nueva York, 1973.
7. F. H. Deindoerfer,Appl.
MIcro biul., 5,221 (1957).
R. A.E. Humphrey y F.H. Deindoerfer.Appl.
Microbiol., 7, 256 (1959).
9. K. Kinoshita (en) K. Yamada ('( at. (eds), The Microbial Pruduction
of A minoacids,
Kodansha, Tokio, 1972.
10. S.H. Lin, J
10.
II.
12.
13.
Press, Nueva