Manual PPB 2016 PDF

Universidad del Zulia
Facultad de Medicina
Escuela de Bioanlisis
Prctica Profesional de Bacteriologa
Centro de Referencia Bacteriolgica SAHUM
Procesamiento de Muestras Clnicas para

Estudios Bacteriolgicos
Autores:
M Sc Amrica Paz Montes
Dr. Armindo Perozo Mena
M Sc Eyilde Pia Reyes
Dra. Lisette Sandrea Toledo
Enero 2016
Tabla de Contenido
Captulo 1. Procesamiento de Hemocultivos ............................................................................ 1
Nmero de Hemocultivos ............................................................................................... 1
Volumen de Sangre ......................................................................................................... 1
Envo de los frascos al laboratorio .................................................................................. 2
Inspeccin inicial de los frascos...................................................................................... 3
Mtodos para el Procesamiento de Hemocultivos .......................................................... 3
Mtodo Manual o Convencional. .................................................................................... 3
Sistemas Automatizados. Sistema BacT/Alert ............................................................... 3
Manejo de Hemocultivos Positivos ................................................................................ 4
Informe de los Resultados...5
Captulo 2. Cultivo de Catteres y otros Dispositivos Intravasculares .................................. 9
Diagnstico Microbiolgico de las Infecciones Asociadas a Catteres .......................... 9
Mtodos que Requieren la Remocin del Catter (Mtodos No Conservadores) .......... 9
Mtodos que No Requieren la Remocin del Catter (Mtodos Conservadores) ........ 14
Captulo 3. Procesamiento de Muestras de Lquidos Orgnicos Estriles .......................... 15
Diagnstico Microbiolgico ......................................................................................... 15
Procesamiento ............................................................................................................... 15
Tcnicas Adicionales en Muestras de LCR.16
Reporte de los Resultados.18
Captulo 4. Procesamiento de Cultivos de Piel y Tejidos Superficiales ............................... 21
Tipos de Infecciones ..................................................................................................... 21
Tipos de Muestras ......................................................................................................... 21
Procesamiento de las Muestras ..................................................................................... 22
Preparacin de extendidos para la coloracin de Gram: ............................................... 22
Tcnicas de Cultivo....................................................................................................... 23
Cultivos Cualitativos ..................................................................................................... 23
Cultivos Semicuantitativos ........................................................................................... 27
Cultivos Cuantitativos ................................................................................................... 28
Consideraciones Generales sobre la Lectura de los Cultivos ....................................... 30
Consideraciones Generales Sobre la Interpretacin y Reporte de los Resultados ........ 30
Captulo 5. Procesamiento de Muestras para el Diagnstico Microbiolgico de
Infecciones Oculares ............................................................................................................. 33
Diagnstico Microbiolgico ......................................................................................... 33
Consideraciones Generales sobre la Recoleccin de las Muestras ............................... 33
Criterios para la Interpretacin de los Cultivos34
Reporte de Resultados ................................................................................................... 35
Captulo 6. Procesamiento de Muestras de Tracto Respiratorio Superior.......................... 37

Exudado farngeo .......................................................................................................... 37
Exudado nasofarngeo ................................................................................................... 37
Exudado nasal ............................................................................................................... 37
Procesamiento inicial de las muestras ........................................................................... 37
Interpretacin y Reporte de los resultados .................................................................... 39
Diagnstico de Otitis..................................................................................................... 40
Toma de muestras ......................................................................................................... 40
Procesamiento de la muestra ......................................................................................... 41
Interpretacin de cultivos de secreciones de Odo Externo .......................................... 42
Interpretacin de cultivos de secreciones de Odo Medio ............................................ 42
Reporte de los resultados .............................................................................................. 43
Captulo 7. Procesamiento de Muestras de Tracto Respiratorio Inferior ........................... 45
Diagnstico Microbiolgico de las Infecciones del TRI .............................................. 45
Muestras Obtenidas por Procedimientos No Invasivos ................................................ 45
Muestras Obtenidas por Procedimientos Invasivos ...................................................... 55
Lineamientos Generales para el Reporte de Microorganismos en Muestras del TRI... 53
Captulo 8. Procesamiento de Muestras del Tracto Urinario ............................................... 63
Diagnstico Microbiolgico de las Infecciones del Tracto Urinario ............................ 63
Mtodos de Recoleccin de la Orina ............................................................................ 63
Conservacin y Transporte de las Muestras ................................................................. 63
Cultivo........................................................................................................................... 64
Consideraciones Generales sobre Lectura e Interpretacin de los Urocultivos............60
Reporte de los resultados .............................................................................................. 71
Captulo 9. Procesamiento de Muestras del Tracto Genital ................................................. 73
Infecciones del Tracto Genital investigadas de rutina .................................................. 73
Vulvovaginitis candidisica .......................................................................................... 73
Vaginitis tricomonisica (Tricomoniasis) ..................................................................... 74
Vaginitis aerbica (VA): ............................................................................................... 75
Gonorrea67
Vaginosis....................................................................................................................... 76
Diagnstico de Laboratorio........................................................................................... 80
Criterios Generales para la Lectura e Interpretacin de Cultivos Genitales ................. 82
Criterios Generales para el Reporte de los Resultados ................................................. 83
Captulo 10. Procesamiento de Muestras Fecales .................................................................. 87
Agentes Bacterianos Productores de Diarrea ................................................................ 87
Lectura Inicial de los Medios de Cultivo..79
Reporte de resultados....80
Bibliografa Consultada.............................................................................................. 93
Procesamiento de Hemocultivos
Captulo
1
La deteccin de la bacteriemia constituye una de las prioridades del Laboratorio de

Bacteriologa Clnica, dada su importancia diagnstica y pronostica, debido a que la presencia de
bacterias en sangre puede representar una amenaza para cada rgano y dar lugar a consecuencias
tales como: shock, insuficiencia de mltiples rganos, coagulacin intravascular diseminada (CID) y
muerte. El diagnstico definitivo de la bacteriemia se establece cuando el microorganismo causal se
asla en la sangre del enfermo, se identifica y se determina su sensibilidad a los agentes
antimicrobianos, con el propsito de instaurar el tratamiento o de realizar las modificaciones
necesarias a la terapia emprica ya establecida. Por otra parte, los cultivos sanguneos permiten, en la
mayora de las ocasiones, diferenciar los casos de bacteriemia verdadera de aquellos en los que la
positividad es debida a un inadecuado procedimiento de extraccin y/o procesamiento de la muestra.
Nmero de Hemocultivos
El protocolo de trabajo del laboratorio, debe recomendar el envo de ms de un
hemocultivo por paciente, para aumentar la sensibilidad diagnstica y facilitar la interpretacin del
significado clnico de un resultado positivo. El nmero de extracciones considerado ptimo para la
documentacin de un episodio de bacteriemia es de 2 a 3, utilizando siempre para la venopuncin
lugares diferentes. De esta manera logran detectarse ms del 95% de las bacteriemias.
Un mayor nmero de extracciones es desaconsejable desde el punto de vista costo/beneficio
e incrementa innecesariamente el trabajo del laboratorio. No obstante, en los pacientes con sospecha
de endocarditis debidas a prtesis, donde puede ser difcil interpretar el aislamiento repetido de
Staphylococcus coagulasa negativa (SCN), o en casos de endocarditis con hemocultivos
inicialmente negativos que pueden ser debidos a microorganismos de crecimiento fastidioso, puede
ser til la disponibilidad de un nmero mayor de extracciones.
Volumen de Sangre
El volumen de sangre cultivada, es una de las variables la ms importante en el aislamiento
de microorganismos en un hemocultivo, debido al bajo nmero en el que pueden estar presentes en
el torrente sanguneo. En adultos, el volumen recomendado por cada venopuncin es de 10-20 mL.
En neonatos y nios, lo ideal es que, el volumen de sangre a cultivar sea proporcional al peso y a la
edad del nio, para cultivar un volumen aproximadamente del 4,5% del volumen total de sangre del
paciente, lo que equivale a 1- 5 mL de sangre. En nios prematuros muy pequeos, pueden
cultivarse volmenes de sangre inferiores a 1 mL.
Si se emplean mtodos comerciales o sistemas automatizados, se deben seguir
estrictamente las recomendaciones especficas de cada fabricante, en cuanto a los volmenes de
sangre a cultivar.
Medios de cultivo empleados
Ningn medio de cultivo empleado para hemocultivo detecta ptimamente todos los
patgenos potenciales, los medios ms ampliamente usados son el Caldo Soya Tripticasa (CST) para
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la recuperacin de bacterias aerbicas y anaerbicas facultativas y el caldo Tioglicolato (CT) para la

recuperacin de bacterias anaerobias estrictas. Otros medios incluyen: caldo infusin cerebro
corazn, caldo suplementado con peptona, caldo Columbia y caldo Brucella. La mayora de los
medios en caldo comerciales permiten recuperar bien los patgenos comnmente aislados de sangre.
Tambin existe disponibilidad de caldos comerciales para la deteccin de bacterias anaerobias,
hongos y micobacterias.
Aditivos
Los frascos deben contener polianetol sulfonato sdico (SPS, Liquoid), en una
concentracin del 0,025 al 0,05% (El SPS es un anticoagulante, anticomplementario, antifagocitario
e interviene con la actividad de algunos antimicrobianos, principalmente aminoglicsidos). La
adicin a los frascos de gelatina al 1,2% neutraliza los efectos inhibitorios del SPS sobre el
desarrollo de algunas cepas de Neisseria spp, Gardnerella vaginalis, Streptobacillus moniliformis y
todas las cepas de Peptostreptococcus anaerobius, pero puede disminuir la recuperacin de otros
microorganismos. No se recomienda el empleo de heparina, EDTA, citrato y oxalato como
anticoagulantes, porque inhiben el crecimiento de muchos microorganismos.
Estabilizadores osmticos
La adicin de sucrosa, manitol o sorbosa en concentraciones del 10 al 20%, permite crear
un medio hiperosmtico o hipertnico (osmticamente estable), para aquellas bacterias que han
perdido o tienen deficiencia de su pared celular (formas L o protoplastos), debido muchas veces a la
terapia antimicrobiana con cefalosporinas, o penicilina; permitindoles sobrevivir en este medio y
ser recuperadas, incluso como clulas reconstituidas completas. Sin embargo, se debe tener presente
que los frascos con medios hipertnicos son difciles de inspeccionar visualmente en busca de
evidencias de desarrollo bacteriano, debido a que los eritrocitos se lisan y no forman un sedimento
en el fondo, lo que confiere al caldo un aspecto barroso.
Resinas y carbn activado
Ambos aditivos tienen generalmente una funcin equivalente, inactivan de forma no
selectiva a la mayora de los antibiticos por adsorcin de estos a su superficie. En comparacin con
los medios basales, mejoran la recuperacin de microorganismos, incluyendo Staphylococcus,
enterobacterias y levaduras; as como la recuperacin de microorganismos en pacientes que reciben
terapia antimicrobiana tericamente efectiva, pero tambin detectan ms contaminantes,
especialmente Staphylococcus coagulasa negativa (SCN).
Relacin sangre y caldo
La dilucin de la sangre en el caldo es necesaria para reducir o neutralizar las
concentraciones de sustancias inhibitorias presentes en la sangre (complemento, lisozimas y
leucocitos fagocticos), as como reducir las concentraciones de antimicrobianos, que pueda estar
recibiendo el paciente, hasta concentraciones sub-inhibitorias. La dilucin final recomendada es de
1:5 a 1:10. Diluciones menores a 1:5 pueden reducir la recuperacin de los microorganismos e
incrementar la coagulacin de la sangre. Por lo cual, debe evitarse el empleo de un volumen de
sangre mayor al recomendado. Para los sistemas de hemocultivos comerciales debe usarse la
dilucin especificada por los fabricantes.
Envo de los frascos al laboratorio
Una vez tomados los hemocultivos, los frascos deben enviarse inmediatamente al
laboratorio. De no ser posible, pueden incubarse a 35-37C. Nunca deben ser refrigerados.
Inspeccin inicial de los frascos

En el caso de frascos de hemocultivo con demoras importantes en su envo al laboratorio,
deben ser examinados cuidadosamente para detectar macroscpicamente signos de crecimiento, en
cuyo caso deben procesarse de inmediato. En el caso de los frascos que van a ser procesados en
sistemas automatizados en los que la introduccin en estos sistemas se haya demorado ms de 18
horas, y especialmente si los frascos fueron incubados previamente a 35-37C, debe realizarse un
subcultivo ciego para evitar un posible resultado falso negativo, debido a que los microorganismos
pueden haber crecido hasta llegar a la fase de meseta y no ser detectados por el sistema. En el caso
de frascos de sistemas en los que adicionalmente se detecta la positividad colorimtricamente
(BacT/Alert), esto se facilita, ya que solo se procesaran de inmediato aquellos frascos en los que se
detecten cambios en el indicador. Si no existen signos de positividad, los frascos deben introducirse
rpidamente en los aparatos automatizados para evitar retrasos en el crecimiento de los
microorganismos.
Mtodos para el Procesamiento de Hemocultivos
Mtodo Manual o Convencional.
Se basa en la observacin macroscpica de los signos de crecimiento microbiano presentes
en una pareja de frascos con medio de cultivo lquido en los que se ha inoculado la sangre del
paciente. Incluye un frasco para la recuperacin de bacterias aerbicas y uno para bacterias
anaerobias, a los que se le adiciona igual volumen de sangre. Los frascos se incuban a 35-37C
hasta 7-10 das. En el caso de sospecha de microorganismos, como hongos, Brucella y ciertos
agentes causantes de endocarditis que precisan ms tiempo para su crecimiento (como
Cardiobacterium spp. y Eikenella spp.), la incubacin debe prolongarse hasta 4 semanas.
Los frascos deben observarse diariamente para detectar signos visibles de crecimiento
bacteriano, tales como: turbidez, hemlisis, produccin de gas o formacin de colonias en el fondo o
en la superficie del frasco. No obstante, debe tenerse presente que hay causas ajenas al crecimiento
bacteriano que pueden enturbiar el medio o hemolizar los hemates y, por el contrario, hay
microorganismos que pueden crecer sin producir ningn signo macroscpico de crecimiento. Ello
obliga, cuando se sospecha de bacteriemia por microorganismos de crecimiento fastidioso, a
complementar la observacin de los frascos con la coloracin de Gram, la cual permite la
visualizacin de los microorganismos cuando su concentracin se aproxima a las 105 UFC/mL.
Puede emplearse tambin la coloracin fluorescente Naranja de Acridina para incrementar la
sensibilidad del examen directo.
Sistemas Automatizados. Sistema BacT/Alert
Estos sistemas eliminan la manipulacin de los frascos, debido a que efectan una
monitorizacin continua de stos mediante tcnicas no invasoras. Uno de los sistemas automatizados
ms utilizados es el BacT/Alert (BioMrieux), el cual detecta el aumento y/o nivel total de CO2
producido por el crecimiento microbiano, mediante un sensor colorimtrico interno pegado al fondo
de los frascos y separado del medio lquido por una membrana que solo es permeable al CO2. A
medida que los microorganismos se multiplican, liberan CO2 que difunde a travs de la membrana y
se disuelve en el agua presente en la matriz del sensor, lo cual hace que se generan iones hidrgenos
libres, que causan un cambio de color en el sensor (de azul a verde claro y amarillo a medida que
disminuye el pH) y este cambio de color hace que la cantidad de luz reflejada se incremente y sea
cuantificada por el instrumento como un aumento del voltaje (Figura 1). Las seales se analizan en
un ordenador por medio de un algoritmo que utiliza tres criterios como evidencia de crecimiento. La
lectura se realiza cada 10 minutos. La positividad, una vez captada por el sensor del instrumento,
activa una alarma y se enciende una luz en la celda del frasco respectivo. El perodo de incubacin
mximo recomendado para los frascos de sistemas de hemocultivo de monitoreo continuo es de 5-7
das.
Figura 1. Fundamento del Sistema BacT-Alert
Manejo de Hemocultivos Positivos

Cuando, por el mtodo convencional se observan signos de crecimiento en cualquier frasco,
o bien, el sistema automatizado empleado seala algn frasco como positivo, inmediatamente debe
mezclarse suavemente el frasco y aspirar aspticamente con una jeringa o pipeta estril una pequea
cantidad para realizar un extendido coloreado con Gram y el subcultivo a medios slidos.
Extendido coloreado de hemocultivos positivos
Se prepara colocando una gota del contenido del frasco en un portaobjeto y se extiende
ligeramente con el asa. Dejar secar, fijar y colorear con Gram. Observar con el objetivo de 100X. Si
se observa la presencia de levaduras debe realizarse una coloracin con tinta china, con el objeto de
descartar Cryptococcus neoformans.
Los hemocultivos que presenten signos de positividad pero una coloracin de Gram
negativa, deberan examinarse con la coloracin Naranja de Acridina, para visualizar bacterias como
Mycoplasma, Campylobacter y Brucella que se tien pobremente con la coloracin de Gram, o para
reducir la necesidad de subcultivar hemocultivos falsos-positivos.
Para el reporte de la coloracin de Gram de hemocultivos positivos, deben usarse trminos
lo ms descriptivos posibles y sin ambigedades, de modo que no d lugar a confusiones. Por
ejemplo: un reporte de Cocos Gram Positivo, puede indicar una variedad de microorganismos
(Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus), pero un reporte de Cocos Gram Positivo en pares,
es ms especfico. Esta informacin puede detallarse posteriormente para una mejor diferenciacin,
definiendo si los cocos presentes estn en pares y cadenas cortas (sugestivos de neumococos,
enterococos o estreptococos grupo B) o en cadenas largas (sugestivos de otros estreptococos betahemolticos o Streptococcus del grupo viridans).
Asimismo, debe evitarse el uso del trmino: difteroides, debido a que puede ser
malinterpretado por los mdicos como un contaminante. Hay que tener en cuenta que varios
microorganismos potencialmente patgenos, como Rhodococcus o especies de Mycobacterium,
pueden presentar caractersticas morfolgicas similares a la de las bacterias corineformes. Por lo
tanto, deben ser descritos como Bacilos Gram Positivo corineformes.
Subcultivos de hemocultivos positivos

El material aspirado de frascos con signos de positividad, independientemente de los
resultados microscpicos, debe ser subcultivado en medios slidos apropiados. Los medios bsicos
empleados son agar sangre de carnero al 5% (SC) o agar sangre humana (SH) como medio de todo
propsito, y agar Chocolate (GC) para el aislamiento de microorganismos fastidiosos.
Opcionalmente puede incluirse agar MacConkey (MC) o esperar los resultados de la coloracin de
Gram para su inclusin. Estos medios se inoculan sembrando unas gotas del hemocultivo bien
mezclado. Se incuban a 35-37C y se examinan diariamente por un mnimo de 48 h.
Si ocurre crecimiento slo en el frasco anaerbico que sugiera la presencia de bacterias
anaerobias, debe incluirse adems de las placas de SC SH, GC, y MC, una placa de Agar Sangre
Anaerobiosis (SHA), la cual debe ser incubada en anaerobiosis por 48-72 h.
En base a los resultados de la coloracin de Gram, pueden adicionarse otros medios
especficos o selectivos, tales como: el agar Sabouraud (SB) para el aislamiento de levaduras y el
agar buferado con carbn activado y extracto de levadura (BCYE) para organismos fastidiosos.
Debe tenerse en cuenta que ciertas levaduras, tales como especies de Malassezia, pueden
verse en los extendidos como levaduras pequeas, pero no crecen en los medios de rutina debido a
su naturaleza lipoflica. En tal caso, debe aadirse una capa fina de aceite de oliva estril como
factor de crecimiento sobre los medios de cultivo, despus de su inoculacin.
Por otra parte, debido a que algunas micobacterias de crecimiento rpido crecen bien en los
medios de cultivo de rutina y a la coloracin de Gram pueden parecer bacilos corineformes, u
observarse como bacilos puntiagudos Gram positivos, o no tomar bien la coloracin y verse como
bacilos fantasmas, en estos casos debe hacerse el descarte de micobacterias mediante la coloracin
de Ziehl-Neelsen a partir de las colonias.
Informe de los Resultados
Informe provisional de hemocultivos positivos
Los resultados de hemocultivos positivos deben ser reportados y entregados tan rpido
como sea posible. En el caso de los resultados de la coloracin de Gram, debe informarse
inmediatamente al mdico, la morfologa, agrupacin y afinidad tintorial del microorganismo.
Ejemplos:
Informe Provisional Positivo de Extendido Coloreado con Gram:
FRASCO (A o B): Al examen microscpico con coloracin de Gram, se observaron (describir
la morfologa, afinidad tintorial y agrupacin bacteriana).
Informe Provisional de Cultivo Positivo:
Se enva cuando al microorganismo aislado se le atribuye importancia clnica, pero solo se conoce
el gnero o grupo al que pertenece. Reportar:
Frasco (A, B o A=B): Gnero:
Especie: en estudio
Antibiograma: en estudio
Informe definitivo de hemocultivos positivos

Se enva una vez que se conozca la identificacin definitiva del microorganismo y la
susceptibilidad a los antimicrobianos. Ejemplo:
Informe Definitivo de Cultivo Positivo:
Frasco (A, B o A=B): Gnero:
Especie:
Antibiograma:
Nota: Los microorganismos considerados como contaminantes se identifican slo a nivel de gnero
y salvo algunas excepciones, no se les realizan pruebas de susceptibilidad.
Informe de los hemocultivos negativos
Los hemocultivos en los que no se aslan microorganismos, transcurrido el perodo de
incubacin establecido, tanto para el envo del informe provisional (72 h para hemocultivos
procesados por sistemas automatizados y 96 h por el mtodo convencional) como del resultado
definitivo (5 das para hemocultivos procesados por sistemas automatizados y 7 das por el mtodo
convencional), se informarn por escrito como negativos especificando los das de incubacin, por
ejemplo:
Informe Provisional Negativo:
FRASCO (A, B o A=B): No se ha observado crecimiento de bacterias (aerbicas,
anaerbicas o aerbicas ni anaerbicas) despus de 72 96 horas de incubacin.
Informe Definitivo Negativo:
FRASCO (A, B o A=B): No se observ crecimiento de bacterias (aerbicas, anaerbicas o
aerbicas ni anaerbicas) despus de 5 7 das de incubacin.
Figura 2. Esquema para el Procesamiento de Hemocultivos Convencionales
Frasco A:
Repicar a GC, SH y MC*

*Opcional, dependiendo de los resultados del
Gram
Incubar a 35-37C. Observar diariamente. En cualquier momento que se

detecte la aparicin de signos de positividad, mezclar el frasco
suavemente y extraer aspticamente con jeringa o pipeta una pequea
cantidad para realizar coloracin de Gram y subcultivo a medios slidos
Realizar examen coloreado

con Gram y reportar
inmediatamente
Frasco B:
Repicar a GC, SH, MC* y SHA (si existe la

sospecha de anaerobios)
Gram
Las placas de SH y GC se incuban a 35-37C por 18-24 horas en microaerofilia, la placa de MC se incuba en
aerobiosis, mientras que SHA se incuba en anaerobiosis por 48-72 horas.
El subcultivo ciego del frasco A a las 24 horas de incubacin y del frasco B a las 48 horas es opcional. La
recomendacin es realizar stos slo cuando se sospeche de microorganismos de crecimiento fastidioso no
aislados mediante los procedimientos de rutina y en hemocultivos de pacientes con sospecha de endocarditis.
Si los frascos permanecen negativos incubar hasta 7 das. No se realizan repiques finales, excepto que los
frascos estn turbios o tengan algn indicio de crecimiento, se investiguen microorganismos de crecimiento
fastidioso o se trate de hemocultivos de pacientes con sospecha de endocarditis.
Figura 3. Esquema para el Procesamiento de Hemocultivos Automatizados. Sistema BacT/Alert
Frasco A y frasco Peditrico:
Repicar a GC, SH y MC*

Gram
Frasco A y Frasco Peditrico
Introducir los frascos en el Sistema Automatizado BacT/Alert.

Inmediatamente que el sistema detecte signos de crecimiento en
alguno de los frascos, deben sacarse del Sistema. Mezclar el frasco
suavemente y extraer aspticamente con jeringa una pequea
cantidad para realizar coloracin de Gram y subcultivo a medios
slidos
Realizar examen coloreado

con Gram y reportar
inmediatamente
Frasco B:
Frasco B
Repicar a GC, SH, MC* y SHA (si existe la

sospecha de anaerobios)
Gram
Incubar las placas en las mismas condiciones especificadas para los hemocultivos convencionales.
Si los frascos permanecen negativos incubar hasta 5das. Cada laboratorio debe establecer el tiempo total de
incubacin de los frascos.
Slo est indicada la realizacin de extendidos coloreados con Gram o Naranja de Acridina y subcultivos
ciegos de frascos negativos despus de completar el perodo de incubacin, cuando se sospeche de
microorganismos de crecimiento fastidioso no aislados mediante los procedimientos de rutina y en
hemocultivos de pacientes con sospecha de endocarditis.
Cultivo de Catteres y Otros Dispositivos Intravasculares
Captulo
2
Cultivo de Catteres y otros Dispositivos

Intravasculares
Los catteres intravasculares son dispositivos que permiten acceder al compartimiento

intravascular a nivel central. Varan en su diseo y estructura segn se utilicen en forma temporal
(das) o permanente (semanas, meses), as como tambin en el material con que son fabricados, en el
nmero de lmenes, y el motivo por el cual se instalan. El uso de estos dispositivos es de gran
utilidad clnica, especialmente en pacientes en situacin crtica o con patologas agudas o crnicas
graves, ya que permiten un acceso rpido y seguro al torrente sanguneo, pudiendo ser utilizados
para tomar muestras de sangre, administrar productos sanguneos, medicamentos, nutricin
parenteral total y otros fluidos; y en el caso de los catteres arteriales pulmonares, permiten el
monitoreo hemodinmico de la funcin cardiaca.
Debido a que estos catteres penetran el integumento, ellos colocan al paciente en riesgo de
desarrollar infeccin local, y en un nmero significativo de casos, la infeccin puede progresar a
bacteriemia, fungemia, flebitis supurativa o trombosis sptica. La infeccin relacionada a catteres
venosos centrales (CVC) constituye la primera causa de bacteriemia nosocomial primaria y est
asociada a un incremento de la morbimortalidad, a una estancia hospitalaria prolongada y a un
incremento de los costos mdicos asociados.
Dada la importancia de las infecciones asociadas a catteres, el objetivo principal de este
captulo, es presentar los mtodos diagnsticos disponibles rutinariamente en los laboratorios
microbiolgicos, de acuerdo a los lineamientos establecidos por los comits de consenso para el
diagnstico de las infecciones relacionadas a catteres.
Diagnstico Microbiolgico de las Infecciones Asociadas a Catteres
El simple retiro de un catter infectado puede ser suficiente para que desaparezca la fiebre,
lo que constituye una evidencia indirecta de infeccin; pero la confirmacin de que una bacteriemia
est relacionada a un catter, se basa en la demostracin de la presencia del germen responsable
tanto en la sangre como en el catter. Tradicionalmente esto se realiza mediante el retiro del catter
y su posterior procesamiento microbiolgico, sin embargo, muchos estudios han demostrado que en
ms del 70% de los catteres retirados por sospecha de infeccin, el cultivo es negativo, por lo que
su retiro no estaba justificado. Adems en pacientes crticos o nios pequeos, con accesos
vasculares difciles, el retiro del catter puede ser una decisin comprometedora y por ello se han
desarrollado diversos mtodos conservadores de diagnstico que permiten demostrar la infeccin del
catter sin la obligatoriedad "a priori" de su retiro. Estos mtodos se clasifican en:
Mtodos que Requieren la Remocin del Catter (Mtodos No Conservadores)
Precisan que el retiro del catter se realice bajo estrictas normas de asepsia, tanto en la
desinfeccin de la piel, como en la manipulacin posterior del catter, ya que slo de este modo
podrn interpretarse correctamente los resultados microbiolgicos. Pueden usarse varios segmentos
del catter para el cultivo, pero los ms tiles son la punta y la conexin; y entre stos, el cultivo de
la punta (2-3 cm. del extremo distal) es el de mayor rendimiento.
Para todos los mtodos que requieren la remocin del catter:

Deben tomarse dos hemocultivos, uno a travs del catter y uno a partir de un sitio
perifrico, al momento de que el catter vaya a retirarse para ser enviado al laboratorio para su
cultivo.
Limpiar la piel con alcohol al 70% previo a la remocin del catter.
Observando una tcnica asptica, sostener el extremo expuesto del catter y retirar
ste del paciente cuidadosamente con un instrumento estril, evitando el contacto con la piel
expuesta, sostener el extremo distal sobre un tubo o un envase estril, cortar la punta del catter
con una tijera estril y colocar los ltimos 2 a 3 cm. en el envase.
Evitar la desecacin del catter cerrando bien el envase y enviar al laboratorio tan
pronto como sea posible.
Entre los mtodos ms usados que requieren el retiro del catter estn los siguientes:
Cultivo Cualitativo de la punta del catter

Consiste en incubar el segmento del catter en un medio lquido (CST CT). Es una
tcnica sensible, pero no proporciona informacin sobre el nmero de microorganismos presentes.
Adicionalmente, la presencia de un nico microorganismo viable, que inclusive pudiera haberse
transferido al catter durante su retiro, puede dar lugar a un cultivo positivo tras 18 horas de
incubacin a 35C. Su utilidad est restringida a orientar sobre la flora presente en el catter, pero no
permite diferenciar entre colonizacin y verdadera infeccin, por lo antes expuesto. Actualmente no
se recomienda su uso.
Cultivo Semicuantitativo (Mtodo de Maki)
Es un mtodo sencillo, pero tiene el inconveniente de no valorar la superficie interna del
catter, por lo que algunos microorganismos que progresan por va endoluminal a partir de
contaminaciones de la conexin, pueden no detectarse. Sin embargo, por su rapidez y sencillez,
sigue siendo el mtodo ms utilizado. Algunos autores recomiendan que se consideren de valor
recuentos de 5 UFC en catteres venosos centrales (CVC) si hay la presencia de sntomas clnicos de
infeccin. Sin embargo, la disminucin del umbral de positividad de la prueba de 15 a 5 UFC
mejora la sensibilidad del mtodo, aunque disminuye su especificidad.
Procedimiento
Introducir las pinzas en alcohol al 95% y esterilizarlas por flameado. Dejar enfriar.
Si la punta del catter es demasiado larga para ser rotada por la placa, cortarla por la mitad con
unas tijeras estriles y cultivar cada segmento por separado.
Utilizar pinzas estriles para transferir la punta del catter desde el envase de transporte hasta una
placa de Agar Sangre Humana (SH).
Con ayuda de la pinza, presionar ligeramente la superficie externa del catter sobre la superficie
del agar mediante movimientos rotativos hacia delante y hacia atrs, por lo menos 3-4 veces, a
todo lo ancho de la placa, como se muestra en la siguiente figura:
Figura 4. Siembra de catter por el mtodo de Maki

10
Sumergir nuevamente las pinzas en alcohol y esterilizarlas por flameado.

Incubar la placa por lo menos hasta 72 horas a 35C en atmsfera de CO2.
No investigar rutinariamente bacterias anaerobias, hongos y micobacterias.
Despus del perodo de incubacin, contar el N de unidades Formadoras de Colonias
(UFC) de cada tipo de colonias crecidas en SH.
Punto de corte: >15 UFC de bacterias.
Reportar el N de colonias contadas, la identificacin y las pruebas de susceptibilidad de
los microorganismos presentes en contaje >15 UFC. Si el crecimiento es confluente reportar,
Cultivo en crecimiento incontable.
Anexar al reporte el valor de referencia (>15 UFC).
Guardar las cepas aisladas por lo menos durante una semana para comparar en caso de
que los hemocultivos resulten positivos y se requieran estudios adicionales.
Figura 5. Placa sembrada por el mtodo de Maki:

Cultivo en crecimiento incontable
Interpretacin
Si un contaje >15 UFC en el cultivo del catter se acompaa de signos de infeccin local o
sistmica, es indicativo de infeccin relacionada al catter.
En el cuadro 1 se alistan algunas situaciones que pueden presentarse, su interpretacin y
reporte.
Debido a que el diagnstico de bacteriemia relacionada al catter se establece cuando se
asla el mismo microorganismo tanto en el catter como en los hemocultivos, tomados al momento
de su retiro, no deberan realizarse rutinariamente pruebas de susceptibilidad a los aislamientos
obtenidos slo de la punta del catter o que no se correspondan con los microorganismos aislados a
partir de hemocultivos, para no incurrir en el sobrediagnstico de infecciones relacionadas al catter.
11
Cuadro 1. Informe de los Resultados. Mtodo de Maki

Morfologas con contajes
>15 UFC
Contar el N real de colonias (Ej. 18 UFC) y reportar
gnero y especie.
Para bacilos Gram positivos corineformes no es
necesario reportar hasta el nivel de especie. Reportar:
Bacilos Gram positivos corineformes.
Si hay diferentes colonias de SCN. Reportar el N total
de UFC de los mismos, especificando que es un
cultivo mixto de SCN.
Si el crecimiento es confluente reportar: Cultivo en
crecimiento incontable.
Si se obtienen cultivos positivos y no se recibieron
cultivos sanguneos aadir al reporte la siguiente nota:
Deben enviarse cultivos sanguneos para establecer el
diagnstico de bacteriemia asociada al catter
Morfologas con contajes

<15 UFC
Patgenos
potenciales
como
C.
albicans,
Streptococcus del grupo A, S. aureus y BGN deben
reportarse en cualquier contaje con gnero y especie.
Agrupar mezcla de microorganismos de la microbiota
de piel (Ej. 25 UFC de microbiota de piel)
Reportar los cultivos puros de microorganismos de la
piel (Ej. Staphylococcus o Bacilos Gram positivo),
anexando el valor de referencia (>15 UFC), para
indicar que fueron aislados en contaje no significativo.
Los cultivos negativos se reportan: No se observ
crecimiento despus de 72 horas de incubacin
Limitaciones
Este mtodo posee una sensibilidad del 85% para el diagnstico de Bacteriemia
Asociada a Catter (BAC), pero su especificidad es baja (76%). Debe acompaarse de
hemocultivos de sangre perifrica tomados al momento de retirar el catter.
Permite recuperar slo microorganismos extraluminales.
En el cultivo de catteres impregnados con antispticos, se ha demostrado que puede
ocurrir la inhibicin de la capacidad de los microorganismos para crecer en SH, dando como
resultado cultivos negativos o con contajes no significativos, por lo que se requiere desarrollar
mtodos alternativos para el diagnstico de bacteriemia asociada a este tipo de catteres.
Cultivo cuantitativo (Mtodo de Cleri)

Esta tcnica combina el cultivo de la superficie extraluminal y endoluminal, mediante
lavados sucesivos del lumen del catter con caldo de cultivo para remover los microorganismos
adheridos. Posteriormente a partir de este lavado se hacen diluciones seriadas para la siembra de las
placas. Un contaje 1.000 UFC se considera indicativo de infeccin por catter.
Procedimiento
Transferir aspticamente el segmento de catter, del envase de transporte a un tubo estril (12x75
mm).
Aspirar 1 mL. de CST con una jeringa estril e insertar la aguja dentro del lumen del catter para
dejar fluir el caldo dentro de ste. Repetir este procedimiento 3 veces.
Tapar el tubo y agitar para desprender las bacterias adheridas.
Hacer diluciones seriadas 10-2 y 10-4 a partir del CST.
Inocular 0,1 mL del CST sin diluir (SD), y de las diluciones 102 y 104 en placas de SH y MC.
Distribuir el inculo para obtener colonias aisladas.
Incubar las placas por un mnimo de 72 horas a 35C, el agar SH en atmsfera de CO 2 y el MC
en aerobiosis.
12
No investigar rutinariamente bacterias anaerobias, hongos, ni micobacterias.

Despus del perodo de incubacin, contar el N de cada tipo de colonias crecidas en SH. El MC
se utiliza para ayudar a diferenciar los tipos de colonias.
Calcular el nmero de UFC/mL multiplicando el N de colonias por el factor de dilucin (10) y
por la dilucin en la cual se haga el contaje de las colonias.
Punto de corte: 1.000 UFC/mL. Con este criterio de positividad, la sensibilidad del mtodo es
de un 100% y la especificidad del 92,5% para el diagnstico de BAC.
Identificar (gnero y especie) y realizar las pruebas de susceptibilidad a todos los
microorganismos presentes en contaje 1.000 UFC/mL. Reportar el contaje y el valor de
referencia o punto de corte.
Recuentos inferiores a 1.000 UFC, son considerados como posible contaminacin o una fase
temprana de colonizacin.
Guardar las cepas aisladas por lo menos durante una semana para compararlas con los
aislamientos obtenidos en los hemocultivos o para realizar estudios adicionales, si stos son
requeridos.
Figura 6. Siembra de catter por el mtodo cuantitativo de Cleri
SH
MC
SH
MC
SH
MC
Interpretacin
Si un contaje 1.000 UFC/mL se acompaa de signos de infeccin local o sistmica, es
indicativo de infeccin relacionada al catter.
Limitacin
Posee una sensibilidad del 75-88% en el diagnstico de bacteriemia asociada a CVC, siendo
necesario complementar el diagnstico con hemocultivos de sangre perifrica.
13
Mtodos que No Requieren la Remocin del Catter (Mtodos Conservadores)

Se basan en que, si la va o catter central constituye el foco de la bacteriemia, en las
muestras de sangre tomadas a travs del catter infectado debera estar presente una alta
concentracin del microorganismo implicado. Estos mtodos incluyen:
Tiempo Diferencial de Hemocultivos (Mtodo de Blot)
Esta tcnica utiliza la ventaja que poseen los sistemas automatizados de hemocultivos para
determinar el tiempo transcurrido desde el inicio de la incubacin de los frascos hasta el momento
en que se detecta crecimiento significativo. Tericamente, los hemocultivos que parten de un mayor
inculo bacteriano (los sembrados con sangre obtenida por la luz del catter) deben hacerse
positivos ms rpidamente que los inoculados con sangre perifrica. Por lo tanto, las diferencias en
el tiempo de crecimiento, entre hemocultivos tomados simultneamente por el catter y a travs de
una va perifrica, pueden orientar si el origen de la bacteriemia est relacionado con el catter. Blot
y col. establecieron 120 minutos (2 horas) como una diferencia significativa entre las muestras
pareadas. El mtodo permite el uso de hemocultivos ordinarios cualitativos y no requiere maniobras
especiales en el laboratorio para su procesamiento. Posee una sensibilidad del 94% y una
especificidad del 91% en el diagnstico de bacteriemia asociada al catter y ha sido propuesto para
el uso en la prctica rutinaria en aquellos hospitales que dispongan de sistemas automatizados para
la deteccin de bacteriemia. Recientemente, otros estudios sugieren establecer el punto de corte
ptimo en tres horas o ms de diferencia entre los tiempos de cultivo para aumentar la sensibilidad
del mtodo.
14
Procesamiento de Lquidos Orgnicos Estriles
Captulo
3
Procesamiento de Muestras de Lquidos

Orgnicos Estriles
Los lquidos orgnicos, como su nombre lo indica, son aquellos producidos por nuestro
organismo. Estos lquidos son considerados normalmente estriles, por lo que cualquier
microorganismo encontrado en ellos puede ser significativo. Dentro de estos lquidos, los que con
mayor frecuencia se estudian desde un punto de vista microbiolgico son (adems de la sangre y la
orina) el lquido cefalorraqudeo, peritoneal, pleural, pericrdico y sinovial, cuyas consideraciones
anatmicas y aspectos microbiolgicos sern considerados en este captulo.
Diagnstico Microbiolgico
Las muestras de lquidos orgnicos se consideran muestras microbiolgicas de primer
orden, por reflejar el patrn infeccioso de los tejidos colindantes, por lo que deben ser manejadas
con extremo cuidado.
Transporte y Manejo de Muestras
Las aspiraciones percutneas de lquido cefalorraqudeo, pleural, pericrdico, peritoneal y
sinovial deben realizarse bajo anestesia local y previa asepsia de la piel de las diferentes regiones
anatmicas implicadas, con alcohol y solucin de povidona-yodada, para evitar la contaminacin de
las muestras y prevenir la introduccin de cualquier microorganismo en espacios anatmicos
estriles.
Para el aislamiento de la mayora de las bacterias es suficiente un volumen de 2-5 mL, pero
a mayor volumen habr mayores posibilidades de aislar aquellos patgenos que se encuentren en
pequeas cantidades. Las muestras de lquidos orgnicos deben ser recolectadas directamente en
tubos estriles con tapa de rosca. Si se sospecha de infeccin por bacterias anaerbicas, se debe
colocar la muestra rpidamente en viales anaerbicos preparados en una atmsfera libre de oxgeno
y cerrados con un tapn de goma a travs del cual se inyecta el lquido. En el caso de lquido
peritoneal y sinovial pueden utilizarse frascos de hemocultivo y procesarse como tal.
Procesamiento
El procesamiento bacteriolgico de todos lquidos orgnicos es similar. Los lquidos claros
o ligeramente turbios deben centrifugarse, a 1.500 revoluciones por 15 minutos, con el fin de
concentrar los microorganismos. Luego se retira el sobrenadante con una pipeta estril y se coloca
en un tubo estril con tapa de rosca, dejando alrededor de 1 mL de lquido para resuspender el
sedimento, lo cual se realiza por agitacin del material, preferiblemente en un vortex. Este
sedimento se utiliza para hacer el frotis directo y la siembra de los medios de cultivo. En el caso de
lquidos purulentos, el extendido y la inoculacin de los medios de cultivo se hacen directamente sin
centrifugar el lquido.
Las muestras de lquido pleural y sinovial frecuentemente se coagulan, los cogulos que se
forman pueden atrapar en su interior los microorganismos presentes en la muestra, lo que dificulta
su deteccin. Para evitar esto se puede agregar al tubo una pequea cantidad de sulfonato sdico de
polianetol (SPS) o de heparina estril antes de la toma de la muestra.
15
Examen Directo Coloreado con Gram

Todos los lquidos deben ser examinados de rutina mediante la coloracin de Gram. Deben
reportarse los siguientes elementos: polimorfonucleares, bacterias (morfologa, afinidad tintorial y
agrupacin), levaduras, etc. Si el mdico lo solicita puede realizarse tambin coloracin de Ziehl
Neelsen y si el laboratorio dispone de microscopio de fluorescencia pueden hacerse de rutina
extendidos coloreados con Naranja de Acridina.
Tcnicas Adicionales en Muestras de LCR
Otros procedimientos que ayudan a detectar la presencia de diversos microorganismos, as
como antgenos o sustancias bacterianas en muestras de LCR son los siguientes:
Phadebact
Es una tcnica de coaglutinacin en lmina que permite la identificacin rpida y directa en
muestras de LCR de antgenos capsulares de S. pneumoniae, H. influenzae tipo b, N. meningitidis
Grupos A, B, C, Y, W135 y S. agalactiae (estreptococo B).
Fundamento: los anticuerpos desarrollados en conejo y especficos contra S. pneumoniae,
N. meningitidis, H. influenzae tipo b y S. agalactiae, que se encuentran acoplados a la protena A
presente en la superficie de estafilococos no viables, al mezclarse con una muestra de LCR infectada
con uno de estos microorganismos, forman una red de coaglutinacin visible a simple vista, puesto
que ocurre el reconocimiento de los antgenos especficos de la superficie celular del
microorganismo investigado, con los anticuerpos especficos del reactivo.
Procedimiento: La muestra se centrifuga slo si presenta eritrocitos (debido al dao
accidental de los vasos capilares durante la puncin lumbar). Calentar la muestra en bao de Mara a
80C durante 5 minutos y dejar enfriar. El calentamiento tiene como objetivo separar los complejos
inmunes (uniones antgeno-anticuerpo) y exponer mejor los antgenos bacterianos, adems de
destruir los anticuerpos que puedan producir reacciones falsas positivas (este procedimiento no
afecta el polisacrido bacteriano debido a que es un antgeno termoestable). El tiempo y temperatura
de calentamiento pueden variar dependiendo del equipo comercial que se emplee. Agitar bien los
reactivos antes de usarlos y colocar una gota de cada reactivo en diferentes valos de la lmina.
Aadir una gota de la muestra en cada gota de reactivo. Mezclar suave y completamente con un
palillo o un asa desechable, usando uno para cada reactivo. Balancear la lmina y leer el resultado
dentro de un minuto (Figura 7). Aunque la reaccin de coaglutinacin es estable, la desecacin de
los reactivos puede ser malinterpretada como una reaccin positiva.
Figura 7. Procedimiento para la realizacin del Phadebact

16
Resultados:
No Reactivo: La ausencia de reaccin indica que la muestra no est infectada con los
microorganismos investigados o que la cantidad de antgeno en la muestra es insuficiente (Figura
6.1).
Reactivo: Una reaccin significativamente ms intensa de uno de los reactivos en comparacin
con los otros tres reactivos constituye un resultado positivo (Figura 8).
Resultados indeterminados: ocurren cuando la coaglutinacin con dos o ms reactivos es de igual
intensidad y rapidez. En este caso debe emplearse un test diferente o esperar los resultados del
cultivo.
Figura 8. Lectura de la reaccin del Phadebact
Limitaciones del Procedimiento:

Como los reactivos contienen anticuerpos dirigidos contra los antgenos capsulares de los
microorganismos investigados, los microorganismos desposedos de cpsula no reaccionan en el
test.
Aunque raramente, pueden ocurrir reacciones cruzadas. Hasta ahora, estas reacciones se han
descrito entre cepas de S. pneumoniae con H. Influenzae tipo b y K. pneumoniae; de H.
influenzae con E. coli K1, y de N. meningitidis y H. influenzae con P. mirabilis.
Examen al Fresco con Tinta China

Si se sospecha de meningitis por Cryptococcus, debe mezclarse una gota del sedimento del
LCR con una gota de tinta china sobre un portaobjeto limpio, se cubre con una laminilla y se
observa al microscopio con baja intensidad de luz con el objetivo de 40X. La presencia de clulas
con apariencia de levaduras, en gemacin y encapsuladas, son presuntamente diagnsticas de
criptococosis (ver Figura 9). Debe tenerse cuidado en la diferenciacin de levaduras no
encapsuladas, eritrocitos, leucocitos y burbujas de aire.
Figura 9. Examen al fresco con Tinta China: Formas capsuladas de C.

neoformans (Visualizados con el objetivo de 10X y 40X, respectivamente).
17
Cultivo Bacteriolgico
Las muestras de los diferentes lquidos orgnicos (LCR, Pericrdico, Pleural, Sinovial y
Peritoneal) son cultivadas rutinariamente en los siguientes medios:
Agar Chocolate (GC)
Sangre Humana (SH)
Agar MacConkey (MC)
Agar Sabouraud (SB)
Agar Sangre Humana Anaerobiosis (SHA)
Caldo Tioglicolato Suplementado con hemina y menadiona (CTs)
Caldo Soya Tripticasa Suplementado con Isovitalex (CSTs). Ver figura 10.
Las placas de SH y GC se incuban en microaerofilia para favorecer la recuperacin de
microorganismos exigentes como neiserias patgenas, Streptococcus spp., Haemophilus spp. y
Listeria spp. El CTs y el CSTs permiten recuperar microorganismos presentes en bajo nmero y
microorganismos de crecimiento fastidioso; stos se incuban en aerobiosis, al igual que las placas de
MC y SB. En el caso de lquido peritoneal se aconseja utilizar una placa de sangre Humana
Anaerobiosis con Gentamicina (SHAG) para la investigacin selectiva de bacterias anaerobias, ya
que esta muestra puede contaminarse fcilmente con el contenido intestinal. Las placas para
investigacin de bacterias anaerobias deben incubarse por un mnimo de 48-72 horas en
anaerobiosis. Todos los medios de cultivo se incuban a 35-37C. En el caso de sospecha de M.
tuberculosis o de otras micobacterias debe incluirse la coloracin de Ziehl-Neelsen y el cultivo para
micobacterias.
Figura 10. Esquema para el Procesamiento de Lquidos Normalmente Estriles
Sembrar placas de SHA, GC, SH, MC , SB , CTs

y CSTs
Realizar un Frotis Directo coloreado con Gram
Reporte de los Resultados del Examen Directo y Cultivo

Informe provisional negativo del Examen Directo Coloreado con Gram: Al examen
microscpico directo coloreado con Gram no se observ morfologa bacteriana. Reportar siempre la
presencia de polimorfonucleares y su cantidad (escasos, moderados o abundantes).
Informe provisional positivo del Examen Directo Coloreado con Gram: Al examen
microscpico directo coloreado con Gram, se observaron (describir la morfologa, afinidad tintorial
y agrupacin bacteriana). Reportar siempre la presencia de polimorfonucleares y su cantidad
(escasos, moderados o abundantes).
18
Cultivo negativo: No se observ crecimiento bacteriano despus de 48 horas de incubacin

(especificar si fue mayor el tiempo de incubacin).
Cultivo positivo: Reportar: Gnero, Especie y resultado de las pruebas de susceptibilidad.
Reporte del Examen al Fresco con Tinta China:

Negativo: No se observ morfologa compatible con el gnero Cryptococcus.
Positivo: Se observ morfologa compatible con el gnero Cryptococcus.
Reporte del Phadebact:

El reporte de los resultados debe hacerse de manera individual para cada uno de los
microorganismos investigados.
Ejemplos:
Phadebact Negativo:
Haemophilus influenzae tipo b: No Reactivo
Streptococcus pneumoniae: No Reactivo
Streptococcus Beta Hemoltico del Grupo B (S. agalactiae): No Reactivo
Neisseria meningitidis: No Reactivo
Phadebact Positivo:
Haemophilus influenzae tipo b: Reactivo
Streptococcus pneumoniae: No Reactivo
Streptococcus Beta Hemoltico del Grupo B (S. agalactiae): No Reactivo
Neisseria meningitidis: No Reactivo
19
Procesamiento de Cultivos de Piel y Tejidos Superficiales
Captulo
4
Procesamiento de Cultivos de Piel y Tejidos

Superficiales
Las infecciones de piel y tejidos superficiales engloban todas aquellas infecciones que
afectan la piel y anexos cutneos, tejido celular subcutneo, fascias y msculo estriado. Constituyen,
junto con las de las vas respiratorias, las infecciones ms frecuentes en la prctica clnica. Afectan a
pacientes de todas las edades y el espectro de infecciones abarca desde procesos leves hasta cuadros
graves, con gran afectacin sistmica, que precisan de una intervencin inmediata. Su diagnstico en
general es clnico y no microbiolgico. El diagnstico microbiolgico se reserva slo para los casos
en los que se precisa conocer la etiologa de la infeccin, porque sea de particular gravedad, porque
se sospeche la presencia de microorganismos infrecuentes (por ejemplo, en enfermos
inmunodeprimidos), porque haya habido mala respuesta a tratamientos antimicrobianos previos, o
en el caso de heridas de larga evolucin que no cicatrizan dentro de un periodo de tiempo razonable.
Tipos de Infecciones
Infeccin de Herida Quirrgica
Infecciones de Piel y Tejidos Superficiales
Abscesos cutneos
Heridas traumticas
Infecciones necrotizantes
Linfangitis
Linfadenitis
Infecciones de mordeduras
Infecciones de Quemaduras
Infeccin del Pie Diabtico
Infecciones de lceras por Presin y lceras Vasculares Venosas
Tipos de Muestras
Aspirados de lesiones cerradas: vesculas, abscesos, ndulos o ganglios que flucten.
Pus de lesiones abiertas.
Biopsias y tejidos.
Hisopados de heridas abiertas.
Desde el punto de vista microbiolgico las mejores muestras son las biopsias de tejidos y
las obtenidas por aspiracin. En general, no se recomienda tomar muestras superficiales mediante
hisopados. Pero si ese es el caso, deben remitirse al laboratorio dos hisopados de la misma herida,
uno para inocular los medios de cultivo y el otro para realizar un extendido coloreado con Gram.
Previo a la toma de la muestra es indispensable hacer la limpieza y desinfeccin del rea
involucrada. En biopsias y heridas cerradas, se debe desinfectar la piel con clorohexidina al 2% o
etanol al 70%, seguido de povidona yodada al 10%, dejar secar y eliminar el yodo con etanol. En
heridas abiertas, se debe eliminar el material necrtico y los tejidos desvitalizados y lavar "a chorro"
con solucin salina estril. Las muestras deben enviarse al laboratorio lo antes posible,
preferiblemente dentro de las 2 horas posteriores a su recoleccin. Antes de su envo al laboratorio
deben mantenerse a temperatura ambiente. No deben refrigerarse debido a que las bajas
temperaturas aumentan la difusin del O2, perjudicando as la recuperacin de bacterias anaerobias.
21
Tampoco deben preincubarse (colocarlas en la estufa), ya que esto favorece el sobrecrecimiento de

unos microorganismos en detrimento de otros, al enmascarar o impedir su crecimiento.
Procesamiento de las Muestras

Preparacin de extendidos para la coloracin de Gram: Depende del tipo de muestra:
Material purulento: Preparar el extendido por aposicin, colocando una porcin de la muestra
sobre un portaobjeto, se coloca encima otro portaobjeto y se presionan las dos lminas. Desplazar
el portaobjeto superior sobre el que contiene la muestra hasta separarlos, repetir este ltimo paso
hasta conseguir un extendido fino.
Figura 11. Confeccin de frotis por aposicin
Lquidos: Depositar con una pipeta estril una gota del lquido sobre un portaobjeto. Dejar secar
y colorear con Gram.
Hisopados: Rotar el hisopo suavemente sobre la lmina portaobjeto para evitar la destruccin de
elementos celulares y la alteracin de la disposicin bacteriana, dejar secar, fijar y colorear. Si se
recibe un slo hisopo, colocarlo en 1 a 2 mL de caldo estril, realizar movimientos rotatorios,
exprimiendo el hisopo contra las paredes del tubo. A partir de esta suspensin se coloca una gota
en cada medio de cultivo y se prepara el frotis como en el caso de los lquidos estriles.
Figura 12. Confeccin de frotis de hisopado
Tejido: Colocar el tejido en una placa de Petri y cortar una porcin con una hoja de bistur, tomar
con unas pinzas la pieza cortada y realizar impresiones sobre un portaobjetos por la superficie del
corte realizado.
Figura 13. Confeccin de frotis de tejido mediante impronta
Homogeneizado de tejido: Colocar 0,1 mL de ste sobre un portaobjeto en un rea de 1 cm., dejar
secar y fijar con metanol por 5 minutos. Colorear con Gram y examinar un mnimo de 10 campos
con objetivo de 100X. Los microorganismos son visibles en el Gram cuando hay al menos 105
UFC por gramo de tejido.
Consideraciones Generales sobre la Coloracin de Gram
Evaluar la calidad de las muestras clnicas, de acuerdo a la presencia de leucocitos
polimorfonucleares (PMN) y de clulas epiteliales (CE). La presencia de PMN se considera, por
lo general, indicativa de inflamacin o infeccin, mientras que, la presencia de CE es indicativa
de contaminacin superficial de la muestra.
22
La coloracin de Gram de estas muestras es til:

Para decidir cuntos microorganismos deben valorarse en cultivos polimicrobianos
[Identificacin bioqumica (ID) + Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos (PSA)].
Para orientar la realizacin de procedimientos especiales de acuerdo a la observacin de
morfotipos sugestivos de microorganismos fastidiosos (empleo de otras coloraciones, inoculacin
de medios de cultivo especiales, incubacin en condiciones especiales, incubacin prolongada,
etc.).
En cuanto a su lectura e interpretacin:
Se debe examinar un mnimo de 10 campos con el objetivo de inmersin (100X).
La visualizacin de microorganismos se correlaciona con una carga bacteriana 105 UFC/g de
tejido.
La observacin de microorganismos intraleucocitarios es patognomnica de infeccin por dichos
microorganismos.
Los resultados de este examen deben informarse rpidamente cuando las muestras sean tomadas
por tcnicas invasivas.
En muestras tomadas mediante procedimientos no invasivos en las cuales se supone puede ocurrir
contaminacin con la microbiota normal asociada de piel (Ej. hisopados, heridas abiertas, etc.), la
coloracin de Gram debe valorarse primeramente con el objetivo de 10X mediante la aplicacin
del ndice Q (ver ms adelante).
Tcnicas de Cultivo
Dependiendo del tipo de muestra, se pueden realizar cultivos cualitativos, semicuantitativos
o cuantitativos.
Cultivos Cualitativos
Finalidad: Evaluar la microbiota presente en la herida o lesin, proporcionando
informacin sobre la diversidad de microorganismos existentes y la posibilidad de sinergia entre
ellos. Para la aplicacin de estos mtodos se requiere optimizar la toma de la muestra, de manera
que los resultados que se obtengan sean confiables, de lo contrario, si la muestra ha sido mal tomada
o contaminada, se aslan slo microorganismos que dificultan la correcta interpretacin de los
cultivos.
Aplicacin: Se realizan tanto a muestras no invasivas, (tomadas por hisopados y aspirados
con aguja y jeringa de pus de heridas superficiales o abiertas), como a muestras invasivas.
Procedimiento
Para hisopados y muestras tomadas por aspiracin
Sembrar los medios Sangre Humana Anaerobiosis (SHA), Agar chocolate (GC), Sangre
Humana (SH), MacConkey (MC) y Agar Sabouraud (SB) en este orden, por el mtodo de los 4
cuadrantes. Para ello, se coloca el inculo principal en el primer cuadrante de cada una de las placas
y luego con un asa estril se realizan estras desde la zona de descarga (cuadrante 1) por el resto de
los cuadrantes de la placa (cuadrantes 2, 3 y 4), sin esterilizar el asa entre cuadrante y cuadrante, en
cada una de las placas inoculadas (ver Figura 14).
Sembrar un Caldo Tioglicolato (CT) slo si la muestra ha sido tomada por aspiracin
(muestra sin contaminacin superficial).
Preparar un extendido para la coloracin de Gram e incubar los medios a 35-37C en la
atmsfera correspondiente.
23
Figura 14. Siembra de muestras por la tcnica de los 4 cuadrantes
SHA
GC
SH
MC
SB
Para homogeneizados de muestras de biopsias y tejidos

Una vez realizado el homogeneizado de la muestra mediante la tcnica que ms se ajuste al
trabajo del laboratorio, inocular 0,1 mL del homogeneizado en cada uno de los medios de cultivo
(SHA, GC, SH, MC, SB, CT). Inocular los medios en placas de la manera anteriormente descrita y
colocar 0,1 mL de la alcuota del homogeneizado sobre la lmina portaobjeto en un rea de 1 cm.,
dejar secar, fijar y colorear con Gram (Figura 15). En el caso de muestras de tejido de gran tamao
que no precisen trituracin, se colocan en una placa de Petri estril y se fraccionan con bistur. Se
toma con una pinza estril la pieza de tejido cortado, con la cual se siembran por impronta los
medios de cultivo y se prepara de la misma forma el extendido para el Gram. En el caso de muestras
de biopsia excesivamente pequeas se inoculan directamente en CT.
24
Figura 15. Cultivo Cualitativo de Muestras de Tejidos y Biopsias
Valoracin microbiolgica de cultivos cualitativos de muestras tomadas por tcnicas no

invasivas
Valoracin de la coloracin de Gram: aplicar primeramente el ndice Q.
ndice Q o ndice de calidad (Matkoski y col.): es el nmero (N) que se obtiene al
determinar la relacin entre las CE y los PMN observados en el examen directo con Gram, e indica
el nmero de patgenos que deben valorarse en el cultivo (ID y PSA). Se determina contando el
nmero de CE y de PMN por campo microscpico de bajo aumento (10X). Debe examinarse un
mnimo de 10 campos microscpicos. Las CE puntan negativamente: -1, -2, -3. Mientras que los
PMN puntan positivamente: +1, +2, +3. Para calcular el ndice Q se emplea el siguiente cuadro:
Cuadro 2. Clculo del ndice Q
N de Clulas Epiteliales
N de PMN/cmba
0
-1
-2
-3
+1
+2
+3
(PMN) leucocitos polimorfonucleares; (CE) clulas epiteliales; (cmba) campo

microscpico de bajo aumento; (0) no se observan clulas; (1) 1-9 clulas por cmba; (2)
10-24 clulas por cmba; (3) 25 clulas por cmba.
Nota: El clculo del ndice Q no est basado en la presencia de PMN, sino fundamentalmente en que la
presencia de clulas epiteliales es indicativa de contaminacin superficial de la muestra, por ello, en muestras en las que
no se observen CE ni PMN, se permite la identificacin de hasta 3 microorganismos potencialmente patgenos, debido
a que la ausencia de PMN no necesariamente excluye la observacin de microorganismos al examinar el extendido con
el objetivo de inmersin.
25
Ejemplos:
Si en el examen directo coloreado con Gram se observan como promedio con el objetivo de 10X,
de 10-24 CE (esto correspondera a una puntuacin de -2) y de 1-9 PMN (esto correspondera a
una puntuacin de +1); al llevar estos valores a la tabla, nos dara un ndice Q= 0, indicativo de
una muestra de mala calidad, en la cual no debe valorarse ningn microorganismo.
Si en el examen directo coloreado con Gram se observa como promedio con el objetivo de 10X,
de 1-9 CE (puntuacin de -1) y ms de 25 PMN (puntuacin de +3), al llevar estos valores a la
tabla, nos dara un ndice Q= 2, indicativo de que pueden valorarse hasta 2 microorganismos
potencialmente patgenos (PP).
Valoracin del cultivo empleando el ndice Q
Si al valorar el Gram se obtuvo un ndice Q= 1 Q= 2: ID y PSA a 1 2 patgenos potenciales,
respectivamente.
Si el ndice Q= 0: la muestra se considera no apta para cultivo. Debe solicitarse una nueva
muestra indicando las condiciones precisas para su recoleccin y transporte y reportar los
resultados del Gram con el objetivo de 100X.
Si se aslan ms patgenos probables en el cultivo, que los sealados por el ndice Q, se debe
revisar nuevamente el Gram para comprobar cuntos patgenos se observaron. Debe prevalecer
el resultado del Gram. Otros criterios de interpretacin se muestran en el siguiente cuadro:
Cuadro 3. Criterios para la Valoracin Microbiolgica de Cultivos Cualitativos
Microorganismo
S. aureus, SBH, P. aeruginosa, BGN

y B. anthracis
Enterobacterias y otros BGNNF
Salmonella, Shigella, Yersinia y
Campylobacter spp.
Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio spp.
y aislamientos pigmentados de C.
violaceum y Sphingobacterium
Streptococcus del grupo viridans y
Enterococcus spp.
Difteroides, SCN, neiserias saprfitas
y estreptococos y no hemolticos
SCN
Bacilos Gram positivos

Listeria
spp.,
Erysipelothrix
rhusiopathiae,
Bacillus
cereus,
Arcanobacterium spp., Actynomices
spp,
Corynebacterium
ulcerans,
Nocardia spp. y Corynebacterium
jeikeium
BGN fastidiosos que crecen en SH
Comentario
Accin
Considerar siempre como PP
Valorar (ID + PSA)
3 especies: Significativo slo si es una muestra

de calidad
>3 especies: Identificar slo morfolgicamente
Valorar (ID + PSA)

Informar como flora
mixta Gram negativa
Valorar (ID + PSA)
Valorar (ID + PSA)
Considerar significativo en muestras invasivas,

en cultivo puro o claramente predominante y si
el Gram sugiere su implicacin
Considerar como microbiota habitual, salvo
algunas excepciones
Significativo slo en cultivo puro, especialmente
en muestras invasivas si el Gram sugiere su
presencia y en muestras de esternotoma,
implantes
protsicos
y
pacientes
inmunocomprometidos
Tienen valor slo si se aslan de sitios anatmicos
habitualmente estriles o de muestras invasivas
Investigar su presencia cuando se trate de la

puerta de entrada de un catter central
Investigar
su
presencia,
especialmente
en
Valorar (ID + PSA)

slo en estos casos
Valorar (ID + PSA)

slo en estos casos
ID slo en estos casos
Valorar (ID + PSA)
26
y/o GC pero no en MC: Brucella,

Haemophilus,
Pasteurella
y
Francisella spp., etc.
Levaduras
Anaerobios
muestras de heridas por mordeduras
Considerar como microbiota comensal. Valorar

slo si se asla en cultivo puro o claramente
predominante de sitios anatmicos estriles o de
muestras invasivas y cuando el Gram sugiere su
implicacin
Identificar slo a nivel de morfotipos de acuerdo

al Gram
Suelen informarse
como "Microbiota
mixta aerobiaanaerobia", con la
excepcin de C.
perfringens
ID: Pruebas de identificacin; PSA: Pruebas de susceptibilidad; PP: Microorganismos potencialmente patgenos; BGN: Bacilos
Gram negativo; SBH: Streptococcus Beta-hemolticos; BGNNF: Bacilos Gram negativos No Fermentadores. SCN: Staphylococcus
coagulasa negativa
Valoracin microbiolgica de Cultivos Cualitativos de muestras tomadas por tcnicas invasivas

(abscesos cerrados, biopsias y tejidos)
Valoracin de la coloracin de Gram: Informar todos los morfotipos observados.
Valoracin del cultivo: Valorar (ID + PSA) todos los microorganismos aislados.
Cultivos Semicuantitativos
Finalidad: Ofrecen informacin acerca de la densidad o carga bacteriana de la herida. En trminos
cualitativos, la microbiota de una herida permanece constante, pero la probabilidad de infeccin
aumenta a medida que la carga bacteriana aumenta hasta llegar a un punto crtico en el que la
infeccin o la ausencia de cicatrizacin es inevitable.
Aplicacin: Se realizan a muestras tomadas por tcnicas invasivas o no invasivas.
Procedimiento
Para Heridas Quirrgicas: Hacer una estra de descarga de la muestra con el hisopo a lo largo del
dimetro de una placa de GC y extender el inculo perpendicularmente sobre toda la superficie de la
placa con un asa estril (Figura 16). Sembrar el resto de los medios (SHA, SH, MC y SB) por el
mtodo de los 4 cuadrantes.
Figura 16. Inoculacin de la placa de GC en muestras de heridas quirrgicas
Preparar un extendido para la coloracin de Gram.

Incubar las placas a 35-37C en la atmsfera correspondiente.
No se emplean caldos enriquecidos (slo estn indicados en muestras obtenidas por procedimientos
invasivos).
27
Para el resto de las muestras: Sembrar todas las placas por el mtodo de los 4 cuadrantes (SHA, GC,
SH, MC y SB). Incluir CT slo en muestras tomadas por procedimientos invasivos. Preparar un
extendido para la coloracin de Gram.
Valoracin microbiolgica de los cultivos semicuantitativos:
Valoracin de la coloracin de Gram: La visualizacin de microorganismos en el Gram se
correlaciona con una carga bacteriana significativa en el cultivo 106 UFC y por tanto deben
reportarse.
Valoracin del cultivo:
De heridas Quirrgicas: se interpretan igual que los cultivos semicuantitativos de catteres
sembrados por el mtodo de Maki. Recuentos de >15 UFC/placa de un mismo microorganismo se
consideran diagnsticos de infeccin y deben valorarse (ID + PSA). Los microorganismos que no
superan este punto de corte deben considerase como simples colonizadores.
.
Para el resto de las muestras: crecimiento en el 1er, 2do, 3er y 4to cuadrante se correlacionan con
recuentos de 103, 104, 105 y 106 UFC/g, respectivamente. Slo se valoran (ID + PSA) los
microorganismos recuperados en recuento significativo: 105 UFC (microorganismos que crezcan
en el 3er y 4to cuadrante), ya que estos recuentos predicen infeccin o ausencia de cicatrizacin en el
caso de injertos.
Interpretacin de los resultados de cultivos semicuantitativos:
La presencia de S. aureus, Streptococcus -hemolticos y P. aeruginosa, se valora (ID + PSA) en
cualquier recuento.
Los anaerobios slo se identifican a nivel de morfotipos segn el Gram.
El laboratorio debe ser estricto en la valoracin microbiolgica de los aislamientos, ya que si se
emite un informe con la ID y las PSA de uno o ms microorganismos, estos resultados se
interpretarn como diagnsticos de infeccin, lo que puede provocar que se administre
tratamiento antimicrobiano innecesario.
Los cultivos negativos se reportan como No se observ crecimiento bacteriano despus de (X)
horas de incubacin.
Cultivos Cuantitativos
Finalidad: Al igual que los cultivos semicuantitativos ofrecen informacin acerca de la densidad o
carga bacteriana de la herida.
Aplicacin: Se emplean slo para muestras de biopsias y tejidos.
Procedimiento:
Pesar en una balanza el envase que contiene la muestra.
Preparar una dilucin 1:5 de la muestra, para ello colocar la muestra en 5 mL de solucin salina
estril (NaCl al 0,85 %) o CT si se va a realizar investigacin de bacterias anaerobias. El cultivo
cuantitativo de bacterias anaerobias puede hacerse, pero los resultados no son satisfactorios,
debido a que las diluciones seriadas pueden afectar su viabilidad.
Pesar el envase vaco y restar ste peso al primero, para obtener el peso de la muestra.
Homogeneizar la muestra durante 15-30 segundos segn el mtodo que se prefiera (mediante
trituracin, homogeneizando el tejido en 1-2 mL de caldo enriquecido; utilizando una hoja de
bistur, para lo cual se traspasa con una pinza estril la muestra de tejido a una placa de Petri
28
estril y se desmenuza con la hoja de bistur hasta obtener una consistencia homognea y una vez
logrado esto, se traspasa con una pipeta Pasteur a un envase estril y se homogeniza nuevamente
en 1-2 mL de caldo enriquecido durante 30; mediante trituracin en un mortero estril con 1-2
mL de caldo de cultivo o mediante un Stomacher con 1-2 mL de caldo de cultivo por 5 min).
A partir del homogeneizado obtenido, inocular 0,1 mL (dilucin 10-1) en placas de GC y MC. Si
se desean investigar anaerobios debe incluirse una placa de SHA.
Preparar el extendido para el Gram con 0,01 mL del homogeneizado en un rea aproximada de 1
cm. sobre una lmina portaobjeto.
A partir del homogeneizado realizar diluciones seriadas 10-2, 10-3 y 10-4, colocando 0,5 mL del
homogeneizado en 4,5 mL de solucin salina estril y as sucesivamente, hasta obtener las tres
diluciones.
Sembrar con pipeta estril 0,1 mL de cada una de las diluciones en placas de GC y MC, rotulando
cada placa con su dilucin correspondiente (10-2, 10-3 y 10-4).
Incubar todas las placas a 35-37C en su atmsfera correspondiente.
Valoracin microbiolgica de los cultivos cuantitativos

Valoracin de la coloracin de Gram
Examinar al menos 10 campos del extendido del homogeneizado de la muestra con el objetivo de
100X. La visualizacin de microorganismos se considera significativa, ya que se correlaciona con
una carga bacteriana en el tejido 105 UFC/g y por tanto, deben informarse.
Valoracin del cultivo
El recuento de colonias para la mayora de los microorganismos se efecta a las 48 horas de
incubacin. El contaje de cada tipo de colonia se realiza a partir de la dilucin en la que se observe
un crecimiento de entre 30 y 300 UFC. Para obtener el recuento definitivo de cada microorganismo
por gramo de tejido se realiza el siguiente clculo:
Ejemplo: para un peso de biopsia de 0,3 g y un recuento de 50 colonias en la placa de la dilucin 103
(1:1000), al aplicar la frmula se obtendra el siguiente recuento:
Interpretacin de los resultados

La presencia de microorganismos en los extendidos coloreados con Gram de las muestras para
cultivo cuantitativo debe informarse, ya que se correlaciona con recuentos bacterianos significativos.
Recuentos bacterianos superiores a 105 UFC por gramo de tejido en una herida (tanto aguda como
crnica) predicen infeccin o ausencia de cicatrizacin en caso de injerto. Por ello, todos los
microorganismos en recuento >105 UFC deben valorarse (ID y PSA), con excepcin de S. aureus,
Streptococcus -hemolticos y P. aeruginosa que se valoran en cualquier contaje. Los anaerobios
slo se identifican a nivel de morfotipos, segn el Gram. Los cultivos negativos se informan cmo
se seal previamente.
29
Consideraciones Generales sobre la Lectura de los Cultivos

Las placas y los caldos se leen diariamente, excepto las placas incubadas en anaerobiosis, cuya
primera lectura debe realizarse a las 48 h de incubacin.
Los medios de cultivo para anaerobios se deben reincubar hasta 7 das.
Las placas de cultivos de heridas de mordeduras deben reincubarse por un mnimo de 7-10 das,
ya que algunos agentes etiolgicos de este tipo de infeccin son de crecimiento lento.
Cuando se investiguen microorganismos fastidiosos, el tiempo y las condiciones de incubacin de
los medios de cultivo deben adecuarse a cada uno de ellos.
Si se sospecha de actinomicosis el tiempo de incubacin debe ser entre 2-4 semanas.
Los caldos enriquecidos se siembran slo para muestras obtenidas por procedimientos invasivos.
Se incuban durante un mnimo de 4 das y se subcultivan a medios slidos slo en las siguientes
situaciones:
En el caso de muestras muy pequeas de tejido y en cultivos de fragmentos seos, en los que
slo se inocula el caldo enriquecido.
Cuando en las placas originales no se observa crecimiento, pero hay indicios de positividad en
el caldo.
Cuando el crecimiento en el caldo sugiere la presencia de microorganismos diferentes de los
aislados en las placas. En este caso slo est indicado el subcultivo del caldo si a partir de las
placas se han recuperado <3 microorganismos. Si ese es el caso, se hace un Gram del caldo
para verificar la presencia de morfotipos diferentes de los microorganismos aislados en las
placas y si los hay, se subcultiva a medios en placa apropiados en funcin de lo observado en
el Gram.
Consideraciones Generales Sobre la Interpretacin y Reporte de los Resultados
Cada laboratorio debe seleccionar las tcnicas y establecer los criterios microbiolgicos a aplicar
en funcin del tipo de muestra y de sus recursos o disponibilidades.
La interpretacin de los resultados vara en funcin del tipo de herida que se evale.
Debe existir una comunicacin abierta entre el clnico y el microbilogo para lograr una
interpretacin apropiada de los resultados.
El reporte de un microorganismo seleccionado de un cultivo mixto puede conducir a errores en la
interpretacin de los resultados.
Cuando se aslan ms de 3 microorganismos potencialmente patgenos y slo se describen
morfolgicamente los que no se observaron en la coloracin de Gram, se recomienda incluir la
siguiente observacin en el informe: "Se aislaron varios microorganismos potencialmente
patgenos. La correlacin entre lo observado en la coloracin de Gram y los resultados del
cultivo no permite asignar un papel patgeno claro a ninguno de los aislamientos. Estos
aislamientos pueden representar colonizacin o contaminacin".
Reportar los cultivos de heridas como: Nmero total de organismos o UFC, acompaado de la
identificacin del microorganismo y las PSA, si es el caso.
Los cultivos en los cuales slo se asla microbiota comensal del rea anatmica se informan como
Microbiota saprfita de
Los cultivos negativos se informan como No se observ crecimiento bacteriano despus de (X)
horas de incubacin.
30
Limitaciones de los Cultivos para el Diagnstico de Infecciones de Piel y Tejidos

Superficiales
Si el paciente es inmunocomprometido, las clulas inflamatorias pueden no estar presentes en el
examen directo coloreado con Gram, por lo que no se tendra este indicador como gua para la
realizacin e interpretacin del cultivo.
Los microorganismos fastidiosos presentes en la muestra en bajo nmero pueden no ser
recuperados en los cultivos.
31
Cuadro 4. Cultivo de piel y tejidos superficiales.

Procesamiento recomendado para cada tipo de infeccin
Tipo de
Infeccin
Tipo de
Muestra
Heridas
Quirrgicas
Superficial
Invasiva
Heridas
Agudas
Superficial
Invasiva
Heridas
crnicasa
(PP, UVV)
Superficial
Invasiva
Quemadurasb
Superficial
Cultivo Cualitativo
Gram
Cultivo
Observar
con obj.
de 100X y
reportar
ID + PSA de los
microorganismos
aislados
Aplicar
ndice Q
ID+ PSA de hasta

3 PP
Observar
con obj.
de 100X y
reportar
Aplicar
ndice Q
ID + PSA de los
microorganismos
aislados
ID+ PSA de hasta
3 PP
Observar
con obj.
de 100X y
reportar
ID + PSA de los
microorganismos
aislados
Aplicar
ndice Q
ID+ PSA de hasta

3 PP
Invasiva
Pie
Diabticoc
Superficial
Invasiva
Aplicar
ndice Q
Observar
con obj.
de 100X y
reportar
Cultivo Semicuantitativo
Gram
Observar
con obj. de
100X y
reportar
Cultivo
ID + PSA de los
microorganismos
que se aslen en
recuento >15 UFC
Observar
con obj. de
100X y
reportar
Observar
con obj. de
100X y
reportar
Observar
con obj. de
100X y
reportar
Observar
con obj. de
100X y
reportar
ID + PSA de los
microorganismos
que se aslen en los
cuadrantes 3 y 4.
ID + PSA de los
microorganismos
que se aslen en los
cuadrantes 3 y 4.
ID + PSA de los
microorganismos
que se aslen en los
cuadrantes 3 y 4.
ID + PSA de los
microorganismos
que se aslen en los
cuadrantes 3 y 4.
Observar
con objetivo
de 100X y
reportar
ID + PSA de los
microorganismos
que se aslen en los
cuadrantes 3 y 4.
Cultivo Cuantitativo
Gram
Cultivo
Observa
r con
obj. de
100X y
reportar
Significativos
Recuentos
106 UFC/g
Observa
r con
obj. de
100X y
reportar
Significativos
Recuentos
106 UFC/g
Observa
r con
obj. de
100X y
reportar
Significativos
Recuentos
106 UFC/g
ID+ PSA de hasta

3 PP
ID + PSA de los
microorganismos
aislados
ID: Pruebas de identificacin; PSA: Pruebas de susceptibilidad; PP: Microorganismos potencialmente patgenos; UFC/g: Unidades
formadoras de colonias/gramo de tejido: UPP: lceras por presin; UVV: lceras vasculares venosas.
a
Las muestras para cultivo pueden ser: aspiracin percutnea, biopsias, tejidos e hisopados. Debe muestrearse el tejido celular subcutneo de
los bordes de la lcera en la zona donde los signos de infeccin sean ms evidentes. La aspiracin percutnea es el mtodo preferido por su
sencillez y facilidad.
b
En infecciones de quemaduras es necesario realizar tanto el cultivo cuantitativo como la valoracin histolgica de la quemadura. La
combinacin de ambos es la tcnica de referencia o Gold Standard para el diagnstico de infeccin. La presencia de infeccin invasiva se
confirma cuando se aslan ms de 105 UFC/g, y mediante histologa se confirma la presencia de microorganismos en la dermis por debajo de
la escara y alrededor de los tejidos sanos adyacentes. Tambin es necesario tomar tanto muestras superficiales (hisopados) y muestras de
biopsias o tejido, para diferenciar entre colonizacin de la quemadura e infeccin invasiva. Se recomienda recoger ms de una muestra de
diferentes zonas de la quemadura, porque una nica muestra puede no reflejar todos los microorganismos productores de la infeccin.
c
El principal problema en la interpretacin de los cultivos de pie diabtico es la exposicin de las lesiones a la microbiota habitual de la piel,
dificultando la diferenciacin de contaminacin, colonizacin crtica e infeccin. La valoracin de los resultados depende en gran
medida de los datos precisos sobre el tipo de muestra y la extensin de la lesin (superficial o profunda). Se recomienda recoger ms de una
muestra, de diferentes zonas de la lesin, porque una nica muestra puede no reflejar todos los microorganismos productores de infeccin. Se
debe evitar tomar muestras superficiales mediante hisopados. Estas muestras estn contaminadas con microbiota colonizadora e incluso con
microorganismos potencialmente patgenos que no participan en la infeccin, y no reflejan toda la microbiota que produce infeccin en la
profundidad de la lesin. No se recomienda el cultivo cuantitativo de las muestras del pie diabtico.
32
Procesamiento de Muestras de Tracto Respiratorio Superior
Captulo
5
Procesamiento de Muestras para el Diagnstico

Microbiolgico de Infecciones Oculares
Las infecciones oculares constituyen una de las principales causas de ceguera en los pases
en vas de desarrollo. Durante los ltimos aos estas infecciones han alcanzado mayor relevancia,
debido al aumento de las intervenciones quirrgicas oculares y a las complicaciones asociadas al uso
de lentes de contacto.
En la mayora de las infecciones oculares las manifestaciones clnicas suelen ser
inespecficas, por lo que es importante realizar el diagnstico microbiolgico para conocer el agente
etiolgico implicado y aplicar el tratamiento adecuado. Sin embargo, esto constituye un reto. El
manejo de estas infecciones debe hacerse lo ms pronto posible, debido a que los tejidos oculares
son muy vulnerables a la respuesta inflamatoria y su lesin conduce a la prdida irreversible de la
agudeza visual. Por lo general, se instaura un tratamiento antibitico emprico: en primer lugar,
porque la anatoma de las estructuras oculares no permite la fcil obtencin de muestras apropiadas,
como biopsias o aspirados por puncin ocular; y en segundo lugar, porque el cultivo de los exudados
oculares posee una sensibilidad baja o moderada (alrededor del 60%), a lo que hay que aadir el
tiempo requerido para obtener los resultados. Sin embargo, siempre que sea posible, deben tomarse
muestras oculares para su anlisis microbiolgico, teniendo presente que un requisito indispensable
para ello, es que la toma de la muestra se realice antes de instaurar el tratamiento antibitico
emprico.
Diagnstico Microbiolgico
Consideraciones Generales sobre la Recoleccin de las Muestras
Toda muestra para cultivo debe referirse al laboratorio junto con un frotis o extendido para la
coloracin de Gram, confeccionado al momento de tomar la muestra. Si se sospecha de
microorganismos inusuales que requieran de otro tipo de coloracin deben referirse varios
extendidos al laboratorio (2 a 3).
Las muestras recogidas por tcnica invasiva deben acompaarse de una muestra de hisopado de
conjuntiva para determinar y evaluar la presencia de microbiota.
An en los casos de sospecha de conjuntivitis unilateral, los cultivos bilaterales son obligatorios
para determinar y evaluar la microbiota.
Tipos de Muestras
Hisopados y raspados conjuntivales
Exudado palpebral
Raspados y biopsias cornales
Humor vtreo
Muestras del aparato lagrimal
Lente intraocular
Procedimientos No Aceptables
No deben procesarse muestras oculares si han transcurrido ms de 24 horas de su

recoleccin, o han sido enviadas al laboratorio sin medio de transporte.
No deben aceptarse para cultivo bacteriano o fngico: lentes de contacto, soluciones oftlmicas,
ni el contenido de las cajas conservadoras de lentes, debido a que: 1) En la queratitis bacteriana o
fngica el cultivo de stos no aporta ninguna informacin al diagnstico microbiolgico. 2) Los
33
lquidos conservantes o la superficie de la lente de contacto pueden estar contaminados por

microbiota mixta saprfita debido a las costumbres higinicas del usuario y al contenido del
lquido y 3) En menos del 25% de los casos coincide el microorganismo aislado en la lente o en
el lquido de lentillas con el aislamiento de la lcera corneal.
Examen microscpico
Coloracin de Gram
Es fundamental realizar este examen en el caso de conjuntivitis hiperaguda, oftalmia neonatorum,
queratitis y endoftalmitis, ya que la evolucin de la infeccin puede ser muy rpida. La posibilidad
de diferenciar clulas bacterianas o estructuras fngicas puede orientar un tratamiento precoz.
Tambin es importante en las muestras cornales, conjuntivales y palpebrales para evaluar la
significacin clnica de los aislamientos y descartar la microbiota colonizante.
Tiene una sensibilidad baja en los raspados cornales, aproximadamente de un 30% en las lceras
tempranas o pequeas (<2 mm) y entre un 40-60% en las lceras ms avanzadas, debido a que por
lo general los pacientes han recibido antibiticos previamente. Tambin tiene baja sensibilidad en
las muestras vtreas.
Seleccin de los medios de cultivo y condiciones de incubacin

Sembrar GC y Agar Sangre de Carnero (SC) al 5% en su defecto SH, MC y SB. Incubar los dos
primeros en atmsfera con 5% de CO2 y los dos ltimos en aerobiosis. Incubar todas las placas a
35-37C.
En caso de sospecha de infeccin fngica se recomienda incubar el SB a 25-30C por 5-7 das.
En muestras tomadas por tcnicas invasivas, incluir medios para anaerobios (SHA), e incubar en
condiciones de anaerobiosis por 5 das.
Excepto en las muestras de exudado palpebral y conjuntival, las muestras oculares deben
inocularse en Caldo Tioglicolato, incubado a 37C, por un mnimo de 5 das, y a 25C durante un
periodo entre 5-14 das si existe sospecha de hongos. En los casos de canaliculitis y sospecha de
actinomicosis hay que mantener la incubacin dos semanas.
En lesiones oculares crnicas con cultivos negativos reiterados y sospecha de etiologa infecciosa
se debe incluir el cultivo del material en medio slido y lquido para micobacterias.
Criterios para la Interpretacin de los Cultivos
Deben valorarse los aislamientos que crezcan en cultivo puro y que coincidan con los hallazgos del
examen microscpico en fresco o en extendidos coloreados. Los microorganismos considerados
como parte de la flora ocular normal, especialmente SCN o estreptococos del grupo viridans, slo
se reportarn cuando se aslen en cultivo puro que coincida con los hallazgos del examen
microscpico, o cuando se detecten en varios medios de cultivo o en varias muestras en
crecimiento abundante.
Siempre se debe valorar (ID + PSA) y reportar la presencia de patgenos reconocidos como S.
aureus, S. pyogenes, S. pneumoniae, P. aeruginosa, N. gonorrhoeae, H. influenzae, P. acnes,
Actinomyces spp., Nocardia spp., levaduras y hongos filamentosos, aunque algunos de ellos, como
S. aureus, estreptococos, Haemophilus y Moraxella pueden estar en pequeas cantidades en la
conjuntiva ocular normal, produciendo en las placas de cultivo generalmente menos de 10
colonias, mientras que cuando son el agente responsable de conjuntivitis aguda se aslan en
cantidad abundante.
La deteccin de C. trachomatis es siempre significativa.
34
En muestras del aparato lagrimal se debe valorar la presencia de microbiota mixta anaerobia.
En las muestras intraoculares y biopsias todos los aislamientos son significativos.
Para valorar los cultivos cornales se debe tener en cuenta, en primer lugar, que un resultado
negativo no descarta el origen infeccioso de la lcera, ya que en algunos casos no es posible
detectar el agente causal debido a retrasos en la toma de muestra, a la cantidad insuficiente de
muestra obtenida, o al uso previo de antibiticos; y en segundo lugar, que la superficie de la crnea
puede estar cubierta transitoriamente de microbiota vehiculizada por el flujo lagrimal, que no
guarda relacin con el proceso infeccioso.
Reporte de Resultados
Debido a la importancia en las infecciones oculares de un adecuado tratamiento precoz, debe
emitirse un informe preliminar de forma urgente cuando se detecten al examen microscpico
directo microorganismos intracelulares, levaduras, hifas o quistes amebianos mediante el examen
microscpico.
Los cultivos en los que se asle slo microbiota comensal del rea palpebral se informan como
"Flora Ocular Normal en cantidad (escasa, moderada o abundante)".
Los cultivos negativos se reportan: "No se aislaron microorganismos despus de (X) horas de
incubacin".
Figura 17. Recoleccin y Procesamiento de Hisopados y Raspados Conjuntivales
35
Figura 18. Recoleccin y Procesamiento de Hisopados y Raspados Cornales
36
Captulo
6
Procesamiento de Muestras de Tracto

Respiratorio Superior
Las infecciones de las vas respiratorias superiores constituyen una de las causas ms
frecuentes de consulta en la prctica clnica y las que ms ausencia escolar y laboral producen. El
sistema respiratorio se divide arbitrariamente en vas altas o superiores, que comprenden las reas
anatmicas anteriores a la laringe, incluyendo la nasofaringe, orofaringe, laringe, epiglotis, odo
externo y medio, y los senos paranasales, y vas bajas o inferiores que incluyen todas las reas
anatmicas posteriores a la laringe. En ocasiones es difcil separar la etiologa y la clnica en muchos
de los procesos infecciosos del Tracto Respiratorio Superior (TRS), los cuales frecuentemente
acaban involucrando a ambas reas, comportndose como un nico cuadro microbiolgico y clnico.
En este captulo slo se presentar el diagnstico microbiolgico de los principales sndromes
clnicos que afectan a las vas respiratorias superiores como son la faringitis y la otitis.
Muestras:
Exudado farngeo
En este tipo de muestra, deben buscarse rutinariamente solo estreptococos beta hemolticos. El
laboratorio debe ser notificado si se desea investigar cualquier otro microorganismo en particular, ya
que el aislamiento y reporte de otros microorganismos no reconocidos como productores de
faringitis primaria debe hacerse de manera prudente.
Exudado nasofarngeo
La muestra de exudado nasofarngeo es til para el diagnstico de faringitis y tos ferina, as como
para la deteccin de portadores de meningococo. Estas muestras no se deben utilizar de rutina para
el aislamiento de otros microorganismos. Tampoco se deben utilizar para el diagnstico de infeccin
de los senos paranasales.
Exudado nasal
El cultivo de muestras de exudado nasal debe emplearse slo para: detectar portadores de
Staphylococcus o Streptococcus, cuando se investiga el foco de un proceso infeccioso (lesiones de
piel, sepsis, etc.) y cuando existen lesiones nasales.
Procesamiento inicial de las muestras
De rutina se debe inocular una placa de agar sangre de carnero al 5%, rotando el hisopo de
modo que toda su superficie quede en contacto con el primer cuadrante de inoculacin en la placa,
luego se extiende la muestra con un asa estril por los tres cuadrantes restantes, con el fin de obtener
colonias aisladas y por ltimo, se hacen varias punciones o incisiones en el medio con la misma asa
de siembra, sobre zonas estriadas y no estriadas, para favorecer la visualizacin de la beta hemlisis
que sugiere la presencia de Streptococcus Beta Hemoltico del Grupo A (SBHA). Con este mismo
propsito, sembrar adicionalmente, un medio selectivo como SCG (Sangre de Carnero con
Gentamicina) para aumentar la sensibilidad del cultivo para estreptococos beta hemolticos. Incubar
estas placas a 35C durante 24 h preferentemente en anaerobiosis, en caso de negatividad, reincubar
hasta 48 h. en las mismas condiciones. Esta incubacin prolongada es importante cuando se utilizan
37
medios selectivos, los cuales pueden inhibir el crecimiento de algunas cepas de SBHA. Las placas
tambin pueden incubarse en CO2, ya que esta atmsfera es til para aislar tanto SBHA como SBH
de los grupos C y G relacionados con faringitis aguda (Streptococcus dysagalactiae subesp.
equisimilis Grupo C y subesp. zooepidemicus; y Streptococcus dysagalactiae subesp. equisimilis
Grupo G, respectivamente).
Para determinar la colonizacin de las vas respiratorias altas por H. influenzae tipo b o
detectar portadores de Neisseria meningitidis, debe incluirse una placa de GC y en el caso de
sospecha de infeccin por Neisseria gonorrhoeae debe emplearse adems un medio selectivo como
el VCN. Tanto el GC como el VCN se incuban a 35C en atmsfera con 5% de CO 2 durante 48 h.
En el caso de sospecha de infeccin por N. gonorrhoeae prolongar la incubacin hasta 72 h.
De rutina las muestras de TRS se siembran tambin en agar MacConkey (para investigar
colonizacin por Bacilos Gram negativo); y agar Sabouraud (sospecha de lesiones orales por
Candida y otros hongos), en ambos casos, el reporte de estos microorganismos debe evaluarse bien.
Usualmente su reporte slo se justifica en pacientes inmunosuprimidos y en pacientes
hospitalizados. Las placas de MC y SB se incuban en aerobiosis, las primeras 24 horas a 35C y 24
horas adicionales a temperatura ambiente.
Todas las placas se siembran por la tcnica de los 4 cuadrantes.
De rutina no debe investigarse la presencia de Corynebacterium diphtheriae, debido a que
la difteria es una enfermedad erradicada. Su bsqueda se recomienda nicamente en pacientes con
alguna de las siguientes circunstancias:
Faringitis membranosa.
Viaje reciente a pases de la antigua Unin Sovitica, frica, o Sudeste Asitico, o contacto con
personas que hayan viajado a estos pases.
Consumo de productos lcteos sin pasteurizar o contacto con animales domsticos (C. ulcerans).
Personal de laboratorios donde se manipulen cepas de C. diphtheriae.
Paciente con lceras crnicas o lesiones cutneas y alguno de los factores de

riesgo anteriores.
Ante la sospecha clnica y dada la rareza de la enfermedad y su potencial gravedad, el
mdico debe alertar al laboratorio, para su investigacin. El diagnstico se confirma con el
aislamiento de C. diphtheriae en el cultivo y la comprobacin de su capacidad toxignica, mediante
el test de Elek o bien mediante inoculacin animal, en el caso de que el primero sea negativo.
Figura 19. Procesamiento de Muestras de TRS
(Exudado Farngeo, Exudado Nasofarngeo y Secrecin Nasal)
Sembrar
Inmediatamente
Sembrar placas de SC, SCG, GC, MC y SB por cuadrantes

Incubar en sus respectivas condiciones
Realizar slo a las muestras de exudado nasal, para evaluar la presencia
de leucocitos polimorfonucleares. Esto se realiza con la finalidad de
Frotis coloreado con Gram
38
determinar la importancia de los aislamientos de Moraxella catarrhalis a

este nivel.
A las muestras de exudado farngeo que se procesan como requisito para un Certificado de
Salud, se les investiga nicamente SBHA y C. diphtheriae, por lo tanto, la muestra se siembra en
SCG y en medio de Leffler (Figura 20). La SCG se incuba en anaerobiosis y el Leffler en
aerobiosis. Ambos a 35C por 24 h.
Figura 20. Procesamiento de Exudado Farngeo para Certificado de Salud
Sembrar
Inmediatamente
SCG
Leffler
A partir del medio de Leffler realizar

coloracin con Azul de Metileno de Leffler
para detectar la presencia de grnulos
metacromticos. Deben observarse, bacilos
teidos de color azul claro y los grnulos
metacromticos de color prpura o azul
intenso.
C. diphtheriae, coloracin de Azul de

Metileno de Leffler
Interpretacin y Reporte de los resultados

Resultados positivos
SBHA: identificar y reportar siempre.
SBH de los grupos C y G: reportar siempre si estn en crecimiento abundante o moderado.
Reportar con una nota si crecen en cantidad escasa.
Identificar y reportar Arcanobacterium haemolyticum en muestras farngeas, si se asla en
crecimiento abundante o moderado. Puede causar faringitis aguda, principalmente en
adolescentes y adultos jvenes. A. haemolyticum crece lentamente en el medio de SC, por lo que
se requiere incubar las placas hasta 72 horas, es un bacilo Gram positivo aerobio, no mvil,
catalasa negativa, es beta-hemoltico y se distingue por ser positivo en la prueba del CAMP
inverso, utilizando una cepa de Staphylococcus aureus productora de beta-hemolisina. Se han
descrito dos morfotipos de colonia, siendo el tipo rugoso el que se asla con ms frecuencia a
partir de muestras respiratorias.
En el caso de cultivos farngeos, si se aslan microorganismos infrecuentemente implicados en
cuadros de faringitis, tales como: Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus,
Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, enterobacterias y otros bacilos Gram negativo
fermentadores y no fermentadores de la glucosa en crecimiento abundante acompaado de flora
normal disminuida, se debe consultar con el mdico tratante para evaluar la posibilidad de
infeccin por tales microorganismos. Si se considera pertinente, reportar Gnero, especie,
cantidad y pruebas de susceptibilidad, acompaado de una nota en la que se indique: Este
microorganismo no se considera productor de faringitis. Se reporta por aislarse en crecimiento
abundante, acompaado de flora farngea normal disminuida, lo cual sugiere colonizacin
39
farngea por este microorganismo. Interpretar con cautela estos resultados de acuerdo a la clnica
del paciente y la administracin previa de agentes antimicrobianos.
En el caso particular de N. meningitidis, su presencia en cultivos farngeos slo debe informarse
si se asla en crecimiento abundante o si el mdico ha solicitado su investigacin con fines
epidemiolgicos. Su reporte en cultivos sin una solicitud expresa para su investigacin implicara
que el microorganismo es patgeno y que requiere tratamiento, cuando de hecho la mayor parte
de las veces forma parte de la microbiota comensal.
De manera similar, no se recomienda la bsqueda y recuperacin de H. influenzae a partir de
cultivos de rutina, ya que un alto porcentaje de adultos y nios poseen este microorganismo en la
orofaringe. Por lo tanto, para H. influenzae, los hisopados farngeos slo son tiles para
determinar colonizacin persistente de las vas respiratorias altas con este microorganismo para
fines epidemiolgicos y clnicos, cuando esta colonizacin pueda suponer un riesgo para el
desarrollo de enfermedad invasiva para el paciente y para sus contactos familiares susceptibles.
De modo, que su aislamiento slo debe reportarse en estos casos.
En muestras de exudado farngeo que resulten positivas para SBHA, reportar: gnero, especie o
grupo serolgico y las pruebas de susceptibilidad a penicilina, eritromicina y clindamicina.
En muestras de exudado farngeo positivas para Corynebacterium diphtheriae, reportar: gnero,
especie y prueba de toxigenicidad in vivo o in vitro. Si no es posible la realizacin de las pruebas
de toxigenicidad, reportar: Investigacin para C. diphtheriae presuntivamente positiva, enviar a
un laboratorio de salud pblica para confirmacin y pruebas de toxigenicidad. Notificar al
mdico, a epidemiologa y control de infecciones el posible resultado positivo, debido a que la
difteria es una enfermedad de denuncia obligatoria.
Resultados negativos
Flora Orofarngea (Naso-farngea o Nasal) Normal en cantidad (abundante, moderada o escasa).
En muestras de exudado farngeo para Certificado de Salud negativas para SBHA reportar el
cultivo como: Cultivo para la investigacin de Streptococcus beta hemoltico del grupo A
negativo.
En muestras de exudado farngeo para Certificado de Salud negativas para C. diphtheriae,
reportar: Cultivo para la investigacin de Corynebacterium diphtheriae negativo.
Diagnstico de Otitis
Toma de muestras
Se realiza en funcin de la sospecha clnica:
Otitis externa
Para tomar esta muestra se debe insertar un hisopo en el canal auditivo externo (de 1 a 2 cm. de
profundidad), luego se debe rotar el hisopo y se debe permitir que se impregne de las secreciones.
Las muestras de furnculos deben tomarse por aspiracin, si es necesario tambin podran tomarse
muestras por desbridamiento quirrgico. Si se toman hisopados, se recomienda usar dos: uno para
coloracin de Gram y otro para cultivo.
Otitis media
La muestra ms representativa es la obtenida por timpanocentesis. El contenido del odo medio se
debe extraer por aspiracin despus de limpiar el canal auditivo externo con un detergente suave
para evitar la contaminacin con la microbiota habitual del canal auditivo externo. Debido a la
naturaleza invasiva de este procedimiento, esta muestra es utilizada para el diagnstico de
40
infecciones del odo medio, slo si el tratamiento previo ha fallado. En el caso de que exista
perforacin timpnica espontnea puede utilizarse un hisopo para tomar el exudado o pus que fluye
del odo medio al canal auditivo externo.
Procesamiento de la muestra
En el caso de otitis externa, con uno de los hisopos se inoculan placas de GC, SH, MC y SB (Figura
21), que se estran por la tcnica de los 4 cuadrantes, con el fin de obtener colonias aisladas.
En el caso de muestras lquidas obtenidas por timpanocentesis se deben depositar tres o cuatro gotas
en la superficie de los siguientes medios: SHA, SHAG, GC, SH, MC y SB. Extender el inculo con
el asa de cultivo en cuadrantes, y sembrar un caldo CT. Realizar un extendido directo coloreado con
Gram para buscar la presencia de clulas inflamatorias (PMN). Ver Figura 21.
Incubar en aerobiosis las placas de MC, SB y el CT, y en atmsfera enriquecida en CO 2 las placas
de SH y GC por un mnimo de 48 h. Los medios de cultivo para anaerobios deben incubarse durante
cinco das. En todos los casos la temperatura de incubacin es de 35-37C. Si se considera
necesario se puede prolongar el tiempo de incubacin del SB (hasta 5 das), as como el de la placa
de SH, sta ltima en el caso que se desee descartar la presencia de Alloiococcus otitidis, el cual
crece como colonias muy pequeas alfa hemolticas No obstante, para favorecer el aislamiento de A.
otitidis se recomienda utilizar agar infusin cerebro corazn suplementado con 5% de sangre de
conejo, el cual debe incubarse por 5 das, ya que la mayora de las cepas no crecen en sangre de
carnero o humana, GC ni en Caldo Tioglicolato. Dentro del grupo de bacterias corineformes, deben
investigarse a partir de las placas de SH y GC, Corynebacterium auris y Turicella otitidis.
Figura 21. Procesamiento de Muestras de Secrecin de Odo Externo
Con el primer hisopo inocular cada una de
las placas y sembrar por cuadrantes
GC
SH
MC
SB
Con el segundo hisopo

realizar un extendido
coloreado con Gram
Examinar con objetivo de
100X para observar los
morfotipos presentes y
PMN
41
Interpretacin de cultivos de secreciones de Odo Externo

Debe evaluarse el tipo y nmero relativo de microorganismos potencialmente patgenos aislados
en el cultivo, junto con el resultado de la coloracin de Gram, en la que se evaluar adems la
presencia de polimorfonucleares.
Las bacterias que se aslen y se consideren de importancia clnica, deben identificarse y
reportarse hasta el nivel de especie y realizar, si estn indicadas, pruebas de susceptibilidad a los
agentes antimicrobianos.
Generalmente los cuadros de otitis externa son producidos por un solo patgeno.
Identificar y reportar bacilos Gram negativos entricos, Pseudomonas, vibrios, estreptococos,
corineformes, estreptococos y S. aureus en crecimiento predominante.
Si las bacterias aisladas reflejan la presencia de microbiota mixta sin predominio de ningn
microorganismo debe indicarse as en el informe.
En el caso de bacterias cuyo carcter patgeno an no est claro, que se aslen en cultivo puro en
cantidad abundante, debe informarse con cautela su presencia en el cultivo, explicando en una
nota el posible significado clnico-microbiolgico del aislamiento. Ejemplo: Reportar: Gnero,
especie, cantidad y pruebas de susceptibilidad, acompaado de una nota en la que se indique:
Este microorganismo no se considera productor de otitis. Se reporta por aislarse en crecimiento
abundante y cultivo puro, lo cual sugiere colonizacin por este microorganismo. Interpretar con
cautela estos resultados de acuerdo a la clnica del paciente y la administracin previa de agentes
antimicrobianos.
Cultivos mixtos de bacilos Gram negativos deben identificarse mnimamente. Ejemplo: Bacilos
Gram negativos entricos mixtos en cantidad
Identificar levaduras (Candida) y hongos (Aspergillus) si estn presentes, por su implicacin en
otitis crnica.
Figura 22. Procesamiento de Muestras de Secrecin de Odo Medio

Colocar 3-4 gotas
con una pipeta estril en cada placa
y sembrar por cuadrantes
SHA
GC
SH
MC
SB
Caldo Tioglicolato (CT)
Realizar un extendido
coloreado con Gram
Examinar con objetivo de
100X para observar los
morfotipos presentes y PMN
Interpretacin de cultivos de secreciones de Odo Medio

En el caso de otitis media, los medios deben leerse diariamente hasta 4 das. Debe valorarse e
identificarse cualquier microorganismo presente, por ser una muestra normalmente estril
obtenida mediante una tcnica invasiva.
42
S. pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis o A. otitidis, son los agentes etiolgicos ms

frecuentes.
Un cultivo de odo medio negativo no descarta la presencia de otitis media, ya que en infecciones
crnicas generalmente no se logra el aislamiento del agente etiolgico.
Si se observ morfologa bacteriana en el examen microscpico directo y en el cultivo no hay
crecimiento, se debe extender el tiempo de incubacin de los medios de cultivo.
Reporte de los resultados
Reporte de la coloracin de Gram:
Se debe informar la presencia de clulas inflamatorias, morfotipos bacterianos, levaduras o
estructuras fngicas observadas, as como la cantidad de cada uno de manera semicuantitativa
(escaso, moderado y abundante).
Reporte del cultivo negativo:
Reportar: No se observ crecimiento bacteriano despus de (X) horas o das de incubacin.
Reporte del cultivo positivo:
Reportar gnero, especie y pruebas de susceptibilidad a las bacterias que se consideren de
importancia clnica. Si es el caso, adicionalmente, indicar la presencia y cantidad de la flora
normal.
43
Procesamiento de Muestras de Tracto Respiratorio Inferior
Captulo
7
Procesamiento de Muestras de Tracto

Respiratorio Inferior
Las infecciones del tracto respiratorio inferior (TRI) se encuentran entre las enfermedades
infecciosas ms frecuentes y con mayores tasas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial. El
diagnstico microbiolgico de estas infecciones es esencial para determinar el agente etiolgico e
instaurar un tratamiento antimicrobiano adecuado. Sin embargo, en la actualidad, el papel del
laboratorio de microbiologa en el diagnstico de las infecciones del TRI presenta importantes
limitaciones, ya que en el 40-60% de los casos no se asla el agente etiolgico responsable, siendo su
rendimiento muy limitado en el diagnstico etiolgico de Bronquitis Aguda y Neumona Adquirida
en la Comunidad (NAC), mientras que ofrece mejores perspectivas en el diagnstico de neumona
nosocomial.
Por otra parte, existe controversia sobre los diferentes mtodos diagnsticos empleados,
debido a que el valor de stos depende del diagnstico clnico presuntivo y de la administracin
previa de tratamiento antibitico. Adicionalmente, muchos agentes productores de neumona son
difciles de cultivar (Legionella spp., Chlamydiophila pneumoniae y Mycoplasma pneumoniae), ya
que requieren medios y procedimientos diagnsticos especficos para su deteccin.
La baja sensibilidad de los cultivos tambin obedece, por una parte, a la contaminacin de
las muestras del TRI con secreciones y microbiota colonizadora del tracto respiratorio superior
(TRS), lo que dificulta el crecimiento y enmascara la presencia de los verdaderos patgenos
procedentes de localizaciones anatmicas ms bajas, resultando difcil establecer con seguridad si
los microorganismos aislados de las muestras respiratorias tienen un verdadero papel en la infeccin
o si por el contrario, son slo colonizantes.
Diagnstico Microbiolgico de las Infecciones del TRI
Muestras Obtenidas por Procedimientos No Invasivos
Incluyen: esputo, aspirado endotraqueal (pacientes intubados) y secrecin bronquial.

1- Muestras de Esputo
Transporte
El transporte al laboratorio debe realizarse de forma rpida. No debe demorarse ms de 1-2 horas.
En los casos en que esto no sea posible, las muestras deben refrigerarse a temperaturas entre 2-8C
hasta su procesamiento.
Procesamiento
Debe hacerse lo ms rpidamente posible para evitar la prdida de la viabilidad de los
microorganismos patgenos.
Preparar un extendido para la coloracin de Gram, seleccionando para ello la porcin ms
purulenta o sanguinolenta de la muestra.
Examinar la coloracin de Gram mediante los criterios estandarizados para determinar el grado
de contaminacin y la calidad de la muestra para cultivo.
45
Criterios Microscpicos para determinar la calidad de muestras de Esputo para su Cultivo

Estos criterios se aplican a muestras de esputo y secreciones traqueales. Se basan en que las
muestras aptas para cultivo son aquellas que presentan numerosas clulas inflamatorias (PMN) y
clulas epiteliales ausentes o escasas, las cuales se consideran indicadoras de contaminacin
orofarngea superficial. Varios autores han descrito criterios celulares cuantitativos que difieren en
el nmero lmite de leucocitos y clulas epiteliales aceptables. As, Murray y Washington (1975)
establecen como esputo de calidad aceptable para el cultivo aquellas muestras que contienen: >25
leucocitos/campo de 100X y <10 clulas epiteliales escamosas/campo de 100X. Mientras que
Heineman y Radano (1979) establecen como criterio de aceptacin el ndice de >10 leucocitos/1
clula epitelial. De estos criterios, los de Murray y Washington son los ms empleados.
Adicionalmente, en la evaluacin microscpica de las muestras debe tenerse en cuenta que,
la deteccin de un morfotipo bacteriano claramente predominante sobre el resto de la microbiota
(que usualmente son contaminantes), en muestras consideradas aptas por los criterios citolgicos
anteriores, permite sugerir el agente etiolgico de la neumona y ayuda en la valoracin de los
microorganismos que crecen en los cultivos.
Procedimiento:
Examinar de 20 a 40 campos del extendido coloreado con Gram con el objetivo de

10X (campo de 100X).
Realizar un promedio del nmero de clulas observadas en los campos

representativos de la muestra y aplicar los criterios de Murray y Washington (>25
leucocitos/campo 100X; < de 10 clulas epiteliales/campo de 100X).
Aceptar para cultivo:
Muestras con >25 leucocitos/campo de 100X y <10 clulas epiteliales

escamosas/campo de 100X.
Muestras con >25 leucocitos/campo de 100X y >10 clulas epiteliales/campo de

100X, cuando el cociente leucocito/clula epitelial sea >10 y exista un predominio franco de un
nico morfotipo bacteriano al observar la lmina con el objetivo de 100X (campo de 1.000X).
Figura 24. Muestra de esputo apta para Figura 25. Muestra de esputo no apta para
cultivo. Obj. 10X
cultivo. Obj. 10X
Notas:
o En muestras con leucocitos abundantes y detritos celulares en las que no se observen
microorganismos, puede ser til colorear el extendido con Naranja de Acridina y observarlo
con microscopio de fluorescencia para confirmar la ausencia de microorganismos.
46
o Pseudomonas spp. y Haemophilus spp. pueden no observarse en el Gram por la dificultad de

diferenciarlos entre los detritos celulares.
o Legionella spp. se puede observar con coloracin de Naranja de Acridina, pero debe tenerse en
cuenta que en la legionelosis a menudo hay ausencia de leucocitos en el esputo.
Rechazar e informar como muestras no aptas para cultivo o no compatibles con procesos
infecciosos bacterianos, segn corresponda, las muestras de esputo con >10 clulas
epiteliales/campo de 100X.
No rechazar esputos con solicitud de cultivo para Legionella, Mycobacterium, Nocardia y
Rhodococcus, ni de pacientes con fibrosis qustica y neutropenia cuando no cumplan los criterios
citolgicos de calidad.
Realizar el examen microscpico de los morfotipos presentes en las muestras que cumplan los
criterios citolgicos de calidad. Para ello, examinar el extendido con el objetivo de 100X
(1.000X) y describir el tipo de microbiota presente como:
Predominio franco de algn morfotipo concreto (aproximadamente 50 o ms organismos/campo
1000X), tal como diplococos Gram positivos (morfotipo compatible con S. pneumoniae); bacilos
Gram negativos (morfotipos compatibles con Haemophilus, enterobacterias, Pseudomonas);
cocos Gram positivos en racimo (morfotipo Staphylococcus); diplococos Gram negativos
(morfotipo Moraxella) y la presencia de bacilos Gram positivos cortos, en cadenas y con formas
ramificadas (morfotipo compatible con Nocardia).
Morfotipos bacterianos mixtos (Si por ejemplo, se observan cocos Gram positivos en pares,
cadenas o racimos, cocos Gram negativos, bacilos Gram positivos (morfotipo Corynebacterium o
anaerobios) etc., pero sin predominio franco de ningn morfotipo. Aumento en la microbiota
mixta compuesta por organismos Gram positivos y Gram negativos (bacilos con morfotipo
compatible con anaerobios) acompaada por la presencia de organismos intracelulares, debido a
que esto es sugerente de neumona por aspiracin.
Tambin pueden realizarse lminas adicionales para colorear con Ziehl Neelsen y Giemsa.
Figura 26. Muestra de esputo con predominio

de bacilos Gram negativos. Objetivo de 100X
(1.000X)
Figura 27. Muestra de esputo donde se

observan morfotipos bacterianos mixtos.
Objetivo de 100X (1.000X)
Medios de cultivo
Los medios de cultivo convencionales para el aislamiento de bacterias respiratorias
comunes incluyen: agar sangre de carnero 5% (SC), agar chocolate (GC), agar MacConkey (MC),
agar Sabouraud (SB) y agar Sangre de Carnero con Gentamicina (SCG) para inhibir la flora
47
contaminante de TRS y facilitar la recuperacin de S. pneumoniae (Figura 28). Adicionalmente,

puede incluirse agar BCYE en caso de sospecha de infeccin por Legionella spp. y medios de
cultivo especficos para M. pneumoniae o C. pneumoniae si se sospecha de infeccin por estos
microorganismos.
Sembrar todas las placas por cuadrantes e incubar a 35-37C durante 48 a 72 horas. Las
placas de SC y GC se incuban en 5% de CO2 y MC en aerobiosis. El medio de Sabouraud se
recomienda incubarlo durante 3 semanas a 30C. Si se incluye el medio BCYE incubarlo hasta 7
das al 5% de CO2. Si se investiga Nocardia y Rhodococcus, las placas de SC y GC deben incubarse
hasta 2 semanas antes de descartarlas como negativas y adicionalmente pueden incluirse medios de
cultivo especficos para su aislamiento.
Opcionalmente, se pueden realizar los siguientes procedimientos:
Aadir un disco de bacitracina de 10 UI a la placa de GC para inhibir la microbiota respiratoria
superior y mejorar la deteccin de H. influenzae.
Inocular una estra de S. aureus (ATCC 25923) en la placa de SC para demostrar el satelitismo de
Haemophilus directamente en la placa.
Aadir un disco de optoquina en el segundo cuadrante de la placa de SC para observar la
inhibicin de S. pneumoniae, para realizar su deteccin directa en las placas primarias.
Como las muestras de esputo pueden estar muy contaminadas con microbiota normal del
TRS, no deben utilizarse caldos enriquecidos, ni medios para anaerobios. El cultivo para anaerobios
slo est indicado en muestras obtenidas por aspiracin percutnea (lo cual raramente se realiza) o
en muestras de CTP (cepillado por catter telescopado protegido) en los que se solicite
especficamente su investigacin.
48
Figura 28. Procesamiento de Muestras de Esputo
Realizar un extendido
coloreado con Gram para
evaluar la calidad de la
muestra.
Observar con objetivo de 10X y aplicar

los criterios de Murray y Washington
Tambin pueden realizarse lminas
adicionales para colorear con Ziehl
Neelsen y Giemsa
Sembrar placas de BCYE*, SCG, SC, GC, MC y SB

Incubar en sus respectivas condiciones e interpretar el cultivo.
*Opcional, si hay sospecha clnica de neumona atpica por
Legionella
Muestra no apta para cultivo,

reportar y repetir muestra
Muestra apta para cultivo,

sembrar la muestra y
procesar
Examinar la lmina con objetivo de 100X

para observar los morfotipos presentes y
elaborar el reporte
Criterios para la Interpretacin de Cultivos de Esputo

Los cultivos de esputo deben interpretarse con cautela, incluso cuando la muestra sea de buena
calidad. Primeramente, debe utilizarse como gua la informacin del morfotipo bacteriano
predominante observado en el Gram, con el fin de seleccionar los microorganismos
potencialmente patgenos para su posterior identificacin y realizacin de las pruebas de
sensibilidad. Si hay ausencia de correlacin entre el cultivo y el examen directo coloreado con
Gram, la informacin que proporciona el cultivo conlleva a una mala interpretacin clnica.
Identificar e informar los microorganismos no pertenecientes a la microbiota normal de
TRS, tales como S. pyogenes, estreptococos del grupo B en neonatos, Bordetella (especialmente
B. bronchiseptica), M. pneumoniae, C. pneumoniae, Legionella, Nocardia, F. tularensis, Bacillus
anthracis, Cryptococcus neoformans y hongos filamentosos no considerados contaminantes.
Identificar e informar los microorganismos pertenecientes a la microbiota de colonizacin
cuyo morfotipo sea predominante en el examen directo coloreado con Gram y que crezca en
el segundo o tercer cuadrante de la placa, aunque no sea el microorganismo predominante en
el cultivo. En este grupo se incluyen: S. pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis, P.
aeruginosa, S. maltophilia, Acinetobacter spp. y Burkholderia, stos ltimos de particular inters
en pacientes hospitalizados y en pacientes externos con bronquiectasia.
Identificar e informar los microorganismos que se encuentren en cantidad significativa y
predominante en el cultivo, especialmente si se ha observado su morfotipo en el examen
directo coloreado con Gram. En este grupo se incluyen S. aureus, estreptococos del grupo B en
adultos, estreptococos -hemolticos de los grupos C o G, bacilos Gram negativos cuando crezca
un solo morfotipo (en especial Klebsiella pneumoniae), especies de Corynebacterium (urea
positiva o aisladas en pacientes intubados) y Rhodococcus equi (en inmunodeprimidos).
Considerar el crecimiento de especies bacterianas presentes en el cultivo en cantidad escasa
si coinciden con el morfotipo bacteriano predominante observado en la coloracin de Gram
del esputo, as como tambin el crecimiento de colonias en el primer cuadrante de la placa en
cultivo puro o prcticamente puro.
49
No debe identificarse y hacer pruebas de susceptibilidad a:

El crecimiento de ms de un morfotipo de bacilos Gram negativos en el MC (E. coli, Proteus
spp, etc.). En este caso, deben ser informados slo como crecimiento de bacilos Gram
negativos entricos.
El aislamiento de Enterococcus spp., a menos que se asle en cultivo puro y sea el morfotipo
predominante en el Gram.
Especies de levaduras, ya que no son causa de neumona (habitualmente slo colonizan la
cavidad bucal), excepto cultivos puros o abundantes en pacientes oncolgicos, hematolgicos,
trasplantados de pulmn y neonatos.
H. parainfluenzae.
Streptococcus beta-hemoltico del grupo F.
Reporte de los Resultados de Cultivos de Esputo

Si la muestra de esputo no es apta para cultivo de acuerdo con los criterios de la coloracin de
Gram, reportar:
Muestra no apta para cultivo. Favor, enviar una nueva muestra si existe indicacin clnica.
En las muestras procesadas informar el resultado de la coloracin de Gram, indicando el
morfotipo predominante.
Si se aslan microorganismos patgenos informar la especie identificada, su cantidad y los
resultados de las pruebas de susceptibilidad.
Si no se asla ningn patgeno informar como Flora Normal de Tracto Respiratorio Superior en
Cantidad (escasa, moderada o abundante).
Limitaciones de los Cultivos de Esputo

La coloracin de Gram de muestras de esputo posee una escasa reproducibilidad, as como una
sensibilidad y especificidad variable, dependiendo de la calidad de la muestra y del
entrenamiento o experiencia del observador.
En la Neumona Adquirida en la Comunidad (NAC), algunos de sus agentes etiolgicos no
crecen en los medios de cultivo rutinarios.
Pueden obtenerse cultivos falsos negativos debido al tratamiento previo con antibiticos, o
debido a la contaminacin del esputo con microbiota normal de orofaringe, la cual puede
enmascarar al agente etiolgico.
Pueden obtenerse cultivos falsos positivos por la sobrevaloracin de los microorganismos que
crezcan en las placas.
En la neumona nosocomial, la purulencia del esputo no es indicacin especfica de neumona, ya
que en situaciones de intubacin o ventilacin mecnica prolongada, como en la entidad clnica
denominada traqueobronquitis nosocomial, se produce una proliferacin de leucocitos sin que
exista infiltrado pulmonar.
El esputo no es una muestra adecuada para el diagnstico de la Neumona Asociada a Ventilacin
Mecnica (NAV).
2- Muestras de Aspirado Traqueal o Endotraqueal y Muestras Tomadas Mediante Catter

La aspiracin traqueal o endotraqueal es el mtodo ms sencillo para la obtencin de secreciones
respiratorias en los pacientes intubados y con ventilacin mecnica. La recoleccin de la muestra se
realiza por aspiracin a travs del tubo endotraqueal. La muestra se debe aspirar en una trampa
estril (trampa de Luken), y luego transferirse aspticamente a un recipiente estril con tapa de rosca
que cierre hermticamente antes de su transporte al laboratorio, ya que la trampa de Luken
frecuentemente gotea en su transporte al laboratorio, favoreciendo la contaminacin de la muestra.
50
En ocasiones puede ser necesario diluir con solucin salina las secreciones viscosas y
facilitar de este modo su recoleccin. Las secreciones que se obtienen de esta manera
frecuentemente son denominadas errneamente como Broncoaspirado Selectivo (BAS), pero en
realidad, tales secreciones son aspirados traqueales. Mientras que el BAS, son secreciones
bronquiales obtenidas mediante fibrobroncoscopia o mediante tcnicas ciegas no broncoscpicas por
aspiracin tras enclavamiento de un catter, telescopado o no, en un bronquio distal, por lo cual no
deben catalogarse como tal, aspirados traqueales.
Para muestras de aspirado traqueal o endotraqueal se aplican los mismos requerimientos para el
transporte y evaluacin de la coloracin de Gram sealados para las muestras de esputo. Por ello,
no deben cultivarse las muestras contaminadas segn los criterios de interpretacin del Gram.
No deben cultivarse secreciones de la traqueostoma (tcnica quirrgica que comunica a la
trquea con el medio ambiente, a travs de un puente de piel o de trquea, durante un tiempo
parcial o definitivo segn sea su necesidad), ya que el traqueostomo en las 24 primeras horas de
su insercin se coloniza con mltiples bacterias que no corresponden a las causantes de la
infeccin pulmonar.
En los neonatos, infantes y nios pequeos, debido a que no pueden proporcionar una muestra de
esputo expectorado, se debe tomar la muestra a travs de las vas areas superiores mediante un
catter para recolectar pequeas cantidades de esputo o secreciones. Estas muestras deben ser
enviadas al laboratorio lo ms pronto posible, directamente en el catter colocado dentro de un
recipiente estril.
Procesamiento
Evaluar la calidad de la muestra mediante la coloracin de Gram y determinar si es apta para
cultivo siguiendo las mismas indicaciones sealadas para las muestras de esputo.
Rechazar e informar como muestra no apta para cultivo o no compatible con procesos infecciosos
bacterianos, segn corresponda, las siguientes muestras:
Aspirados traqueales de adultos con >10 clulas epiteliales/campo de 100X, o los aspirados en
los que no se observen microorganismos.
Aspirados traqueales de pacientes peditricos en los que no se observen microorganismos,
independientemente del nmero de clulas epiteliales.
No rechazar aspirados endotraqueales con solicitud de cultivo para Legionella, Mycobacterium,
Nocardia y Rhodococcus, ni de pacientes con fibrosis qustica y neutropenia, aunque no cumplan
los criterios citolgicos de calidad.
En las muestras consideradas aptas para cultivo, examinar el extendido coloreado con Gram para
evaluar los morfotipos presentes, de igual manera que en las muestras de esputo.
Los AT no deben cultivarse cualitativamente, por su falta de especificidad para el diagnstico de
neumona asociada a ventilacin mecnica (14-47%), mientras que el cultivo cuantitativo
proporciona resultados similares a los obtenidos en muestras tomadas mediante tcnicas
invasivas, como el cepillado por catter telescopado protegido (CTP) y el lavado broncoalveolar
(LBA).
51
Figura 29. Procesamiento de Muestras de Aspirado Traqueal o Endotraqueal
Realizar un extendido y
colorear con Gram para evaluar
la calidad de la muestra.
Aplicar una tcnica de

cultivo cuantitativo
utilizando cualquiera de
los dos mtodos
disponibles
Observar con objetivo de 10X y

aplicar los criterios de Murray y
Washington
Tambin pueden realizarse lminas
adicionales para colorear con Ziehl
Neelsen y Giemsa
Muestra no apta para cultivo,

reportar y repetir muestra
Muestra apta para cultivo,

sembrar la muestra y procesar
Examinar la lmina con objetivo de

100X para observar los morfotipos
presentes y elaborar el reporte
Cultivos Cuantitativos de Muestras de Aspirado Traqueal o Endotraqueal

Una vez determinad la calidad de la muestra, el cultivo cuantitativo puede efectuarse por el mtodo
de diluciones seriadas o de forma ms prctica y sencilla mediante el mtodo de las Asas Calibradas.
Mtodo de diluciones seriadas
Sembrar 100 microlitros (l) de la muestra en placas de GC, SH, MC y SB. Incluir BCYE si se
considera oportuno. Marcar las placas x10. Cada colonia que se asle en cualquiera de estos
medios equivale a 10 UFC/mL.
Pasar 100 l de la muestra a un tubo que contenga 9,9 mL de solucin salina fisiolgica estril.
Agitar en un vortex y sembrar 100 l en placas de GC y SH. Marcar las placas x1000 Cada
colonia que se asle equivale a 1000 UFC /mL.
Pasar 100 l de la dilucin anterior a un tubo que contenga 9,9 mL de solucin salina fisiolgica
estril. Agitar en el vortex y sembrar 100 l en placas de GC y SH. Marcar las placas
x100.000. Cada colonia que se asle equivale a 100.000 UFC/mL (Figura 30).
Extender el inculo colocado en cada placa por toda la superficie con ayuda de una pipeta Pasteur
doblada en ngulo recto o con un asa desechable.
Incubar las placas en sus respectivas condiciones.
52
Figura 30. Cultivo Cuantitativo de Muestras de Aspirado Traqueal o Endotraqueal

por el Mtodo de Diluciones Seriadas
100 L de la muestra
Sembrar placas de BCYE, GC, SH, MC y SB,

marcarlas como x10 (10-1)
100 L de
la muestra
100 L de la dilucin
Sembrar placas de GC y SH,

marcarlas como x1000 (10-3)
9,9 mL de SSF
(dilucin 1/100)
100 L de la
dilucin
100 L de la dilucin
9,9 mL de SSF
(dilucin 1/100)
Sembrar placas de GC y SH,

Marcarlas como x100.000 (10-5)
Mtodo de las Asas Calibradas

Se emplean asas de diferentes calibres para sembrar volmenes de muestra que permitan realizar en
las placas de cultivo recuentos de colonias bacterianas, los cuales se comparan con los puntos de
corte propuestos para este tipo de muestra.
Procedimiento:
Tomar muestra con un asa calibrada de 10 l y sembrar directamente en placas de GC, SH y
MC, respectivamente (dilucin 1/100). Marcar las placas x100. Cada colonia que se asle en
cualquiera de estos medios equivale a 100 UFC/mL.
Tomar la muestra con asa calibrada de 1 l y sembrar directamente en placas de GC, SH y MC,
respectivamente (dilucin 1/1000). Marcar las placas x1000. Cada colonia que se asle en
cualquiera de estos medios equivale a 1000 UFC/mL.
Opcionalmente, si se considera oportuno, sembrar 100 l de la muestra en placas de agar BCYE
y agar Sabouraud. Cada colonia que se asle en cualquiera de estos medios equivale a 10
UFC/mL (Figura 31).
Extender el inculo colocado en cada placa por toda la superficie con ayuda de una pipeta Pasteur
doblada en ngulo recto o con un asa desechable e incubar las placas en sus respectivas
condiciones.
53
Figura 31. Cultivo Cuantitativo de Muestras de Aspirado Traqueal o Endotraqueal

por el Mtodo de las Asas Calibradas
10 L de la muestra
Sembrar placas de GC, SH y MC,

Marcar como x100 (10-2).
1 L de la muestra
Sembrar placas de GC, SH y MC,

Marcar como x1.000 (10-3).
Opcionalmente, si se considera oportuno, sembrar 100 L

de la muestra en placas de BCYE. y SB
Interpretacin y Reporte de Cultivos Cuantitativos de Aspirados Traqueales o Endotraqueales

Contar las colonias de la dilucin en la que haya un mayor nmero de colonias sin que confluyan.
Multiplicar el nmero obtenido por el factor de dilucin correspondiente a esa placa. Por ejemplo, si
se cuentan 50 colonias en una placa marcada x100, el resultado ser 5 x 103 UFC/mL. Contar de
forma individual cada morfotipo de colonias diferentes.
Se consideran indicadores de neumona bacteriana recuentos de microorganismos potencialmente
patgenos de 10.000 ms UFC/mL. Recuentos inferiores suelen corresponder a contaminacin
orofarngea. Recuentos superiores o inferiores pero de microorganismos no potencialmente
patgenos, se informan como Flora Normal del TRS sin reportar el nmero de UFC/mL.
Limitaciones de Cultivos Cuantitativos de Aspirados Traqueales o Endotraqueales
A pesar de que estos mtodos establecen los puntos de corte para el diagnstico de neumona
bacteriana, en algunas ocasiones es difcil interpretar el resultado cuando los recuentos estn
cerca del punto de corte. En tales casos, es necesario tener en cuenta los factores que pueden
influir en la cantidad de microorganismos presente en las muestras, tales como:
Distribucin irregular de los microorganismos en la secrecin.
Errores en los volmenes inoculados.
Retrasos en el transporte o procesamiento de las muestras.
Tratamiento antibitico, sobre todo el instaurado o modificado en las 24 a 48 horas previas a la
toma de la muestra, puede disminuir o negativizar el crecimiento.
Tiempo de evolucin de la neumona. En los estadios iniciales de la enfermedad pueden
obtenerse recuentos inferiores al punto de corte.
54
Muestras Obtenidas por Procedimientos Invasivos

1.- Lavado bronquial
Consiste en la instilacin de suero fisiolgico estril en un bronquio principal,

seguida de una aspiracin inmediata para recoger la muestra. La muestra recogida no representa
material bronquiolar ni alveolar y es equivalente a un aspirado endotraqueal.
Su utilidad es limitada. Proporciona informacin confusa debido a que, con

frecuencia, se asla microbiota orofarngea, sobre todo en enfermos no intubados, por lo que
generalmente no se considera apropiado para el cultivo bacteriano, excepto en casos en los que se
sospechen infecciones por M. tuberculosis, Legionella, virus u hongos.
En enfermos intubados no presenta ninguna ventaja sobre el aspirado traqueal.
Deben enviarse al laboratorio de manera separada las muestras de lavado bronquial

de diferentes localizaciones pulmonares (bronquio izquierdo y derecho, por ejemplo),
inmediatamente despus de su recoleccin para mantener la viabilidad de los patgenos.
Si se reciben muestras de LBA y lavado bronquial, slo debe cultivarse

cuantitativamente la muestra de LBA, por ser de mayor calidad, ya que sta recoge secreciones
de los espacios bronquiolares y alveolares, a diferencia del lavado bronquial que corresponde a
las secreciones aspiradas de las vas areas de mayor tamao.
Procesamiento
Preparar varios extendidos de la muestra para las coloraciones de Gram, Giemsa, Ziehl
Neelsen, etc.
Las muestras de lavado bronquial no se consideran apropiadas para cultivo, excepto en
casos en los que se sospechen infecciones por M. tuberculosis, Legionella y hongos.
55
Cuadro 7. Lineamientos para el Reporte de Patgenos que Forman Parte de la Flora Normal de TRS en Cultivos del TRI
Microorganismo
Cantidad
(semicuantitativo)a
Contaje (UFC/mL)
(cuantitativo)b
Conducta
Comentarios
S. pyogenesd
(Streptococcus del
grupo A)
Cualquiera
Cualquiera
Identificacin. No realizar
PSA de rutina
Las PSA se deben realizar solo en pacientes alrgicos a la

penicilina. Debido al aumento de la resistencia a eritromicina y
clindamicina, se debe realizar la prueba de D-Test
<flora normalc
<103
No identificar. Reportar
como flora normal
Moderado a abundante o
>flora normal
>103-104
Identificar y PSA
S. pneumoniae
<flora normal
<10
Descartar la presencia de
SARM
Reportar como flora
normal si no es SARM
S. aureus
>flora normal
>103-104
Identificar y PSA
<flora normal
<103
como flora normal
M. catarrhalis
>flora normal
>103-104
Identificar y PSA
<flora normal
<103
como flora normal
H. influenzae
N. meningitidis
>flora normal
>10 -10
<flora normal
<103
>flora normal
>103-104
Identificar y PSA. Detectar

produccin de betalactamasa
como flora normal
Identificar y PSA. Detectar
produccin de betalactamasa
Las PSA se deben realizar solo para detectar resistencia a

penicilina y eritromicina, tambin se han reportado cepas
resistentes a levofloxacina
SARM debe ser investigado debido al aumento de cepas

invasivas adquiridas en la comunidad
Las pruebas de susceptibilidad se deben realizar en cepas betalactamasa negativas.
Determinar el serotipo en neonatos, infantes y nios pequeos.
Determinar serotipo cuando sea necesario.
56
(Cont.)
Microorganismo
Streptococcus de los
grupos B, C y G
Otros microorganismos
de la flora normalc
Bacterias anaerbicas
Cantidad
(semicuantitativo)a
Contaje (UFC/mL)
(cuantitativo)b
Conducta
<flora normal
<103
No identificar. Reportar como flora

normal
>flora normal
>103-104
Identificar y PSA
<103
No identificar. Reportar como flora

normal
>103-104
Identificar y PSA de los

microorganismos presentes en cultivo
puro
Solo en CTP
<103
Identificacin limitada para listar los

anaerbicos presentes
>103-104
Identificar y PSA
NA
NA
Comentarios
Las PSA se deben realizar solo en pacientes

alrgicos a la penicilina. Debido al aumento de
la resistencia a eritromicina y clindamicina, se
debe realizar la prueba de D-Test
El reporte de flora normal en muestras del

tracto respiratorio inferior puede conducir a
tratamientos antimicrobianos inadecuados.
SCN, enterococos y otros miembros de la flora
normal solo deben ser reportados en muestras
de LBA o CTP si se encuentran en cantidad
abundante o en cultivo puro.
Solo las muestras de CTP son aceptables para el

cultivo de anaerbicos.
Los anaerbicos son una causa importante de
neumona obstructiva o por aspiracin.
Se debe correlacionar lo observado en la coloracin de Gram realizada directamente de la muestra con el crecimiento en los medios de cultivo. El crecimiento significativo
de un patgeno se define como, crecimiento de moderado a abundante en el medio de cultivo, presente del segundo cuadrante de la placa en adelante, y que se encuentre en
mayor cantidad que la flora normal. Las cantidades escasas de un patgeno pueden ser clnicamente importantes si se encuentra en cultivo casi puro (la flora normal no
creci o se encuentra en cantidad muy escasa), y el microorganismo es consistente con el morfotipo asociado a PMN observado en la coloracin de Gram.
b
Contajes >103 UFC/mL son considerados significativos en cultivos cuantitativos de CTP, y contajes >104 UFC/mL son significativos en muestras de LBA.
c
La flora normal del tracto respiratorio est conformada por Streptococcus del grupo viridans, especies comensales de Neisseria spp., N. meningitidis, difteroides, SCN,
Rothia, Streptococcus del grupo F, anaerbicos, Haemophilus spp., (no H. influenzae), enterococos, Candida spp., Eikenella, Actinobacillus, Capnocytophaga y Moraxella.
d
. S. pyogenes es generalmente patgeno en TRS, pero existe un % de individuos que son portadores sanos de este microorganismo.
SARM: S. aureus resistentes a meticilina.
SCN: Staphylococcus coagulasa negativa.
NA: no aplicable.
PSA: pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos.
LBA: lavado broncoalveolar
CTP: cepillado por catter telescopado protegido.
57
58
Cuadro 8. Lineamientos para el Reporte de Bacilos Gram negativos Patgenos en Cultivos del TRI
Microorganismo
Cantidad
(semicuantitativo)a
Contaje (UFC/mL)
(cuantitativo)b
<flora normalc
Moderado a abundante
o >flora normal
<103
Pasteurella spp.
>103-104
Conducta
Comentarios
Identificar y PSA
Enviar inmediatamente al laboratorio de referencia

para estudios adicionales.
No identificar. No realizar
PSA a menos que sea un
paciente de UCI o
inmunocomprometido
K. pneumoniae es ms comn en pacientes alcohlicos,

la colonizacin de las vas areas superiores con
bacterias entricas es ms comn en pacientes
Enterobacteriaceae
hospitalizados. Las PSA se deben realizar para
detectar la presencia de BLEE, beta-lactamasa Amp-C
3
4
>10 -10
Identificar y PSA
y carbapenemasas.
o >flora normal
La neumona por P. aeruginosa posee una alta tasa de
P. aeruginosa
Cualquiera
Cualquiera
Identificar y PSA
letalidad. Las PSA deben incluir deteccin de metalobeta-lactamasas en pacientes hospitalizados.
Otros Bacilos No
B. bronchiseptica es causa infrecuente de neumona
fermentadores
adquirida en la comunidad. Otros BGNNF son causa
3
<flora normal
<10
(Bordetella
importante
de
neumona
nosocomial.
Estos
bronchiseptica,
microorganismos pueden ser transmitidos dentro del
Identificar y PSA
Stenotrophomonas
hospital, y el departamento de control de infecciones
maltophilia,
hospitalarias debe ser notificado al obtenerse un
3
4
>10 -10
o >flora normal
Acinetobacter spp., B.
cultivo positivo para estos agentes. B. cepacia, se asla
cepacia, etc.)
principalmente en pacientes con fibrosis qustica.
Listar todos los tipos de bacilos Gram negativos
3
<flora normal
<10
No identificar ni realizar PSA presentes (Ej.: Crecimiento mixto de bacilos Gram
Bacilos Gram
negativos, incluyendo 2 fermentadores de la lactosa y
negativos mixtos (ms
uno no fermentador de la lactosa que no es P.
Identificacin limitada a
de 2 morfotipos)
aeruginosa). Incluir un comentario acerca de que la
>103-104
menos que sea un paciente de placa se conservar por si otros estudios son
o >flora normal
UCI o inmunocomprometido
requeridos clnicamente.
a
Se debe correlacionar lo observado en la coloracin de Gram realizada directamente de la muestra con el crecimiento en los medios de cultivo. El crecimiento significativo de un
patgeno se define como, crecimiento de moderado a abundante en el medio de cultivo, presente del segundo cuadrante de la placa en adelante, y que se encuentra en mayor
cantidad que la flora normal. Un patgeno en cantidad escasa puede ser clnicamente importante si se encuentra en cultivo casi puro (flora normal de TRS ausente o en cantidad
muy escasa), y el microorganismo es consistente con el morfotipo asociado a leucocitos polimorfonucleares observado en la coloracin de Gram.
b
Contajes >103 UFC/mL son considerados significativos en cultivos cuantitativos de CTP, y contajes >104 UFC/mL son significativos en muestras de LBA.
c
La flora normal del tracto respiratorio est conformada por Streptococcus del grupo viridans, especies comensales de Neisseria spp, N. meningitidis, difteroides, SCN, Rothia,
Streptococcus del grupo F, anaerbicos, Haemophilus spp. (no H. influenzae), enterococos, Candida spp., Eikenella, Actinobacillus, Capnocytophaga y Moraxella.
BLEE: beta-lactamasa de espectro extendido.
UCI: Unidad de Cuidados Intensivos. BGNNF: Bacilos Gram negativos No Fermentadores.
<flora normal
<103
59
Cuadro 9. Lineamientos para el Reporte de Bacilos Gram positivos, Hongos y Levaduras Patgenas en Cultivos del TRI
Microorganismo
Cantidad
(semicuantitativo)a
Contaje
(UFC/mL)
(cuantitativo)b
Conducta
<flora normalc
<103
No identificar
Reportar como flora normal.
>flora normal
>103-104
Identificar
Realizar PSA
Corynebacterium spp.
Comentarios
Cepas urea positiva como

C. pseudodiphtheriticum pueden causar
neumona.
Rhodococcus equi
Cualquiera
Cualquiera
Identificar
Realizar PSA
Causa importante de neumona asociada a la

comunidad en pacientes
inmunocomprometidos, particularmente
aquellos con HIV/SIDA. Los pacientes deben
poseer al antecedente de contacto con
caballos.
Actinomicetos
aerbicos (Nocardia
spp., Streptomyces
spp.)
Cualquiera
Cualquiera
Identificar
Realizar PSA
Causa importante de neumona en pacientes

inmunocomprometidos
Cryptococcus
neoformans
Cualquiera
Cualquiera
Identificar
Puede causar neumona tanto en pacientes

aparentemente sanos como en
inmunocomprometidos. Debe realizarse
subtipaje de los aislados para determinar la
presencia de C. neoformans serotipo gattii.
Hongos filamentosos no
considerados
contaminantes
saprofticos (Aspergillus
spp., Mucor spp.,
agentes de micosis
sistmica)
Cualquiera
Cualquiera
Identificar
Causa importante de neumona en pacientes

inmunocomprometidos. Pacientes con
fibrosis qustica pueden ser colonizados por
Aspergillus spp.
60
61
Procesamiento de Muestras del Tracto Urinario
Captulo
8
Procesamiento de Muestras del Tracto

Urinario
Las infecciones del tracto urinario (ITU) son una de las ms frecuentes. Pueden afectar
tanto a pacientes hospitalizados como ambulatorios. Se presentan en nios y adultos, alcanzando
su mayor prevalencia en las mujeres, aunque su incidencia aumenta en hombres mayores de 45
aos y en cualquier enfermo con factores urolgicos predisponentes. En los nios las ITU tienen
una connotacin especial, debido a que son un factor desencadenante de cicatrices renales que
pueden resultar en insuficiencia renal, razn por la cual, el diagnstico y manejo oportuno de estas
infecciones puede ser determinante del futuro de su funcin renal. Por otra parte, el
sobrediagnstico de infecciones urinarias puede inducir a la utilizacin de procedimientos
invasivos.
Tradicionalmente se ha considerado que la presencia en orina de 100.000 o ms unidades
formadoras de colonias/mL representa una bacteriuria significativa, indicativa de ITU. Sin
embargo, este criterio slo es aplicable a ciertos grupos de poblacin y actualmente no se puede
considerar un criterio absoluto. La presencia real de cualquier nmero de bacterias en orina
puede representar una ITU cuando existen sntomas especficos y piuria y la orina ha sido
correctamente recogida.
Diagnstico Microbiolgico de las Infecciones del Tracto Urinario
Aunque la orina es normalmente estril, existen microorganismos en la uretra, regin genital y
perin que pueden, accidentalmente, contaminarla y multiplicarse en ella, incluso a temperatura
ambiente, pudiendo dar lugar a interpretaciones errneas cuando sta se analiza
microbiolgicamente. Por otra parte, en algunas ocasiones, hay que emplear tcnicas especficas
para detectar microorganismos de crecimiento fastidioso poco habituales.
Mtodos de Recoleccin de la Orina
La orina puede ser recogida mediante diferentes mtodos:
Mitad de la miccin
En bolsa adhesiva en pacientes peditricos
Por sondaje vesical transuretral
Cateterismo con sonda permanente
Aspiracin suprapbica
Situaciones especiales (enfermos con vejigas de sustitucin, insuficiencia renal terminal, anuria
obstructiva y prostatitis crnica).
Conservacin y Transporte de las Muestras
Las muestras deben transportarse al laboratorio lo ms pronto posible, ya que despus de 2 horas a
temperatura ambiente, la multiplicacin de los microorganismos presentes puede dar lugar a
resultados microbiolgicos errneos. Si el transporte no puede realizarse inmediatamente, es
necesario refrigerar las muestras a 4C, lo que permite su conservacin durante unas 24 horas. Lo
ideal es el envo de la muestra al laboratorio dentro de un contenedor con hielo.
63
Cultivo
Se realiza para cuantificar el nmero de bacterias por mL de orina, el cual se expresa
como Unidades Formadoras de Colonias por mL (UFC/mL). El mtodo ms empleado es el
mtodo del Asa Calibrada.
Mtodo del Asa Calibrada
Consiste en sembrar la orina sin centrifugar con un asa calibrada de 0,01 mL o de 0.1 mL.
La orina se siembra en un medio enriquecido como el Agar Sangre Humana (SH) y un medio
selectivo como el agar MacConkey (MC). En nios menores de cinco aos, se recomienda el
empleo adicional del medio Agar Chocolate (GC) y su incubacin en microaerofilia para la
recuperacin de H. influenzae. El empleo de GC tambin est indicado en muestras recolectadas
quirrgicamente de rin, por aspiracin suprapbica, muestras colectadas por cistoscopia para
investigar otros microorganismos de crecimiento fastidioso, y en orinas recolectadas despus de
masaje prosttico para investigacin de N. gonorrhoeae.
Procedimiento
1)
Mezclar bien la orina.
2)
Esterilizar el asa calibrada (0.01 mL.) y dejar enfriar.
3)
Introducir el asa en posicin vertical en la orina para asegurar que la cantidad apropiada
de muestra se adhiera al asa (sumergir el asa justo por debajo de la superficie de la orina). Evite
cualquier burbuja en el menisco del lquido. Si las hay deben eliminarse flameando el asa y
repitiendo el procedimiento.
4)
Colocar el asa cargada con la muestra en la parte superior de la placa de SH, repartir el
inculo en lnea recta a todo lo largo del dimetro de la placa y rayar toda la placa a partir del
trazo central.
5)
Sin flamear, introducir nuevamente el asa verticalmente en la orina para transferir otra
asada a la placa de MC y sembrar por la tcnica de los 4 cuadrantes, para obtener colonias
aisladas, con el propsito de minimizar retrasos, as como resultados falsos negativos debido a
la inhibicin antimicrobiana. Cualquier otra placa que se incluya se siembra por cuadrantes
(Figura 32).
6)
Incubar a 35-37C, la placa de SH en microaerofilia y la de MC en aerobiosis.
Una vez procesada la muestra de orina, sta debe refrigerarse hasta realizar la primera lectura del
cultivo (24 horas mximo). En caso de resultados discordantes se debe repetir la siembra a partir
de la muestra refrigerada.
Nota: A partir de la placa de SH realizar el contaje de colonias. Cuando el contaje de colonias no
puede realizarse debido a la presencia de velo de Proteus, se puede hacer un contaje estimado en
las placas sembradas por cuadrantes.
64
Figura 32. Mtodo del Asa Calibrada (Mtodo Semicuantitativo)
Verifique los datos del paciente

y mezcle bien la orina
Realice un trazo central a

todo lo largo de la placa
Esterilice el asa
calibrada y espere que
se enfre
Introduzca el asa calibrada (0,01 mL)

verticalmente en la muestra de orina y
verifique tomar el volumen correcto
Sin flamear el asa calibrada, introdzcala

Realice los trazos laterales
verticalmente de nuevo en la muestra de orina,
de la parte superior a la
verifique tomar el volumen correcto y siembre la placa
inferior de la placa
de MC
Lectura
Una vez transcurrido el perodo de incubacin se informan semicuantitativamente el
nmero de Unidades Formadoras de Colonias por mL de orina (UFC/mL) para cada morfotipo
colonial observado, multiplicando el factor de dilucin de la alcuota tomada (100) por el nmero
de colonias contadas en la placa de SH. Para el reporte de los resultados se deben utilizar los
rangos especificados en el cuadro 10.
Cuadro 10
Escala para el Reporte por Rangos de UFC/mL segn el Mtodo del Asa Calibrada
Nmero de UFC contadas
Nmero de UFC/mL
1-10
<103 (<1000 = negativo)
10-100
103-104 (1000-10000)
100-1000
104-105 (10000-100000)
>1000
>105(>100000)
0,01 mL = volumen de orina que dispensa el asa calibrada.

0,01 mL x 100 = 1mL (Factor de dilucin = 100)
UFC = unidades formadoras de colonia
FD = factor de dilucin
UFC/mL de orina= N UFC x FD

65
Ejemplo 1: Si slo crecen 3 colonias de microbiota normal urogenital o de piel:

UFC/mL de orina = 3 UFC x 100 = 300 UFC
300 UFC equivalen a 3x102 UFC/mL (<103)

Se debe reportar: Microbiota normal urogenital o de piel en contaje menor de 1.000
UFC/mL orina.
Ejemplo 2: Si crecen 200 colonias de un nico morfotipo correspondiente a un bacilo Gram

negativo:
UFC/mL de orina= 200 UFC x 100= 20.000 UFC
20.000 UFC equivale a 2x104 UFC/mL (104 - 105)

Reportar: Contaje: de 10.000 a 100.000 UFC/mL orina, identificacin del
microorganismo (gnero y especie) y pruebas de susceptibilidad a los
antimicrobianos
Consideraciones Generales sobre la Lectura e Interpretacin de los Urocultivos

Despus de las primeras 24 horas de incubacin, las placas se deben reincubar por 24 horas
adicionales: la placa de MC a temperatura ambiente y las de SH y GC en microaerofilia a 35C;
esto se realiza con el fin de detectar microorganismos de crecimiento lento, crecimiento tardo
en muestras de pacientes con tratamiento antimicrobiano y en el caso especfico del MC
favorecer el desarrollo de bacterias cuya temperatura ptima de crecimiento es de 22-25 C
(temperatura ambiente).
Una vez transcurrido el perodo de incubacin:
Para los cultivos negativos:
Las placas se reincuban de rutina hasta 48 horas. Sin embargo, el perodo de incubacin puede
prolongarse en las siguientes situaciones: muestras obtenidas por aspiracin suprapbica, cultivos
de pacientes inmunocomprometidos (incluyendo pacientes con trasplantes de rganos), y cuando
se investiguen hongos o levaduras (ya sea porque el mdico solicite su investigacin o porque sta
sea apropiada, por ejemplo en pacientes de la unidad de cuidados intensivos neonatal).
En algunos pacientes, es posible observar una marcada piuria en el sedimento urinario, y sin
embargo, no se aslan bacterias en el cultivo de la orina (piuria estril). Estos resultados pueden
corresponder: a infecciones urinarias por bacterias de crecimiento lento o que requieran medios
especiales para su deteccin; a infeccin por Chlamydia o Mycoplasma, en cuyo caso la
procedencia de los leucocitos puede ser uretral o vaginal; finalmente, la piuria puede representar
una manifestacin de una reaccin inmunolgica, o una respuesta ante agresores no bacterianos
como analgsicos u otros frmacos.
Para los cultivos positivos:
Se informa el nmero de UFC/mL para cada morfotipo, utilizando los rangos especificados en
el cuadro 10.
No identificar a nivel de gnero y especie microorganismos de la microbiota normal urogenital
aislados en contaje no significativo (Cuadro 12).
66
Utilizar los cuadros 11, 13 y 14 para determinar el esquema de trabajo para cada
microorganismo aislado.
La definicin de bacteriuria significativa propuesta por Kass en 1956 de 100.000 o ms
UFC/mL, sigue siendo vlida para los grupos de pacientes para los que se defini (mujeres con
pielonefritis aguda, y mujeres asintomticas cuando se confirma con un segundo urocultivo o
con una prueba de nitritos positiva en la segunda muestra), y es un criterio que puede aplicarse
a la mayora de las muestras de orina cultivadas. Sin embargo, debe tenerse presente que:
Un cultivo mixto en este contaje, en pacientes ambulatorios no complicados, indica
sencillamente una probable contaminacin. En estos casos, si el laboratorio no dispone de
suficiente informacin, debe solicitar en el reporte de los resultados el envo de una nueva
muestra, para descartar entre infeccin mixta o contaminacin. Debe tenerse presente que las
bacteriurias polimicrobianas (salvo en portadores de catteres permanentes o infecciones
complicadas que las justifiquen), suelen representar contaminacin de la muestra.
En pacientes asintomticos, recuentos menores de 100.000 UFC/mL suelen representar
contaminacin y no deben valorarse. No obstante, la deteccin de una bacteriuria
asintomtica requiere una interpretacin en el contexto clnico de cada paciente. As,
mientras en la embarazada se recomienda la deteccin y el tratamiento de la bacteriuria
asintomtica, ya que en ausencia de tratamiento el riesgo de desarrollar pielonefritis es
superior al 30%, en el anciano y en el paciente sondado su deteccin no est indicada y no se
precisa tratamiento, ya que la bacteriuria asintomtica pocas veces cursa con complicaciones
(sepsis), recurre a las pocas semanas y el tratamiento slo condiciona la seleccin de cepas
resistentes que dificultan la antibioticoterapia ulterior.
Recuentos iguales o superiores a 102 UFC/mL deben considerarse significativos en:
Mujeres con sospecha de sndrome uretral agudo.
En varones sintomticos, donde la contaminacin de la muestra es poco probable, las
bacteriurias de 103 UFC/mL se consideran significativas.
Los recuentos bajos pueden corresponder a una autntica infeccin urinaria en las
siguientes circunstancias: orinas muy diluidas, orinas con pH extremo (incompatible con la
vida bacteriana), infecciones causadas por microorganismos de crecimiento lento que
requieren ms de 48 horas para su desarrollo (como Corynebacterium urealyticum), casos
de uretritis o prostatitis, casos de obstruccin ureteral o pielonefritis crnica; y
especialmente en el sndrome uretral femenino y en pacientes que ya han recibido terapia
antibitica (Cuadro 13).
Para muestras obtenidas a travs de catter vesical, el rango de recuentos bacterianos
considerado como criterio de bacteriuria significativa es ms amplio: 102-105 UFC/mL.
En orina obtenida mediante aspiracin suprapbica cualquier recuento bacteriano se considera
significativo.
S. agalactiae debe reportarse en mujeres en edad reproductiva y en pacientes diabticos,
independientemente de su contaje. Su presencia en muestras de orina de mujeres gestantes
siempre debe ser informada, aunque forme parte de un cultivo polimicrobiano, pues puede estar
indicando un alto grado de colonizacin vaginal, lo cual es un factor de riesgo de infeccin
neonatal.
Identificar siempre microorganismos oxidasa positiva e indol positivo, como Vibrio y
Aeromonas, hasta el nivel de especies, independientemente de su contaje.
La investigacin de bacterias anaerobias est indicada slo cuando la orina se obtenga por
aspiracin suprapbica, o cuando el mdico lo solicite debido a la sospecha de una fstula
esticuloentrica.
67
La incidencia real de las infecciones del tracto urinario por especies de Haemophilus ha sido
poco estudiada, debido a que en la mayora de los laboratorios no se emplean habitualmente los
medios necesarios para su deteccin en orina. Tanto H. influenzae como H. parainfluenzae han
sido descritos como agentes etiolgicos de infeccin urinaria, especialmente en pacientes
peditricos. Su aislamiento en cultivos de orina no debe ser subestimado, ya que debe tenerse
en cuenta su poder patgeno para causar pielonefritis, cistitis aguda, prostatitis, as como otras
complicaciones. En la mayora de los casos reportados en la literatura, existe una estrecha
relacin entre la infeccin urinaria por Haemophilus y la presencia de alteraciones del tracto
urinario, por lo que su aislamiento podra ser indicativo de una posible uropata crnica de base
o de alguna malformacin de las vas urinarias.
Cuadro 11. Criterios Generales para la Interpretacin de Urocultivos
Situacin
Conducta a seguir*
Cultivos puros de S. aureus, Candida spp.,

Salmonella spp., Haemophilus influenzae,
Gardnerella vaginalis, Aeromonas y Vibrio
spp. en cualquier contaje
Cultivo puro de un microorganismo
uropatgeno en contaje 1.000 UFC/mL
Cultivo puro de un microorganismo

uropatgeno en contaje < 10.000 UFC/mL
Cultivo con 1 microorganismo uropatgeno
en contaje >10.000 UFC/mL
Cultivo con dos microorganismos en contajes
10.000 UFC/mL
Cultivo con dos microorganismos en contajes

de 1.000-10.000 UFC/mL
Tres o ms microorganismos
Procesar (ID y PSA)

Procesar (ID y PSA) dependiendo del tipo de paciente (ejemplo en
mujeres sexualmente activa con sospecha de sndrome uretral agudo y
en hombres sintomticos) y en pacientes que
recibe terapia
antimicrobiana.
Ver los cuadros complementarios 12 y 13.
Procesar (ID y PSA) dependiendo del tipo de paciente y si recibe
terapia antimicrobiana.
Ver los cuadros complementarios 12 y 13.
Procesar (ID y PSA)
Procesar (ID y PSA) dependiendo del tipo de paciente y si recibe
terapia antimicrobiana.
Reportar el contaje global y la nota: Aislamiento Polimicrobiano.
Se recomienda seguir estrictamente las recomendaciones para la
recoleccin adecuada de la muestra y su envo inmediato al
laboratorio.
Si se obtienen resultados similares con la nueva muestra: Procesar (ID
y PSA). Retener el resultado hasta hablar con el mdico o el paciente
para ajustar la interpretacin y reporte.
Se considera un urocultivo mal tomado o contaminado. Reportar el
contaje global y la nota: Aislamiento Polimicrobiano. Se
recomienda seguir estrictamente las recomendaciones para la
recoleccin adecuada de la muestra y su envo inmediato al
laboratorio.
Si se obtienen resultados similares con la nueva muestra: Procesar (ID
y PSA). Retener el resultado hasta hablar con el mdico o el paciente
para ajustar la interpretacin y reporte.
Si el urocultivo proviene de pacientes con catter permanente (24
horas o ms) procesar.
S. agalactiae en edad reproductiva y en

pacientes diabticos, independientemente de
su contaje. En mujeres embarazadas su
presencia siempre debe ser informada,
Procesar (ID y PSA)
aunque forme parte de un cultivo
polimicrobiano, pues puede estar indicando
un alto grado de colonizacin vaginal, lo cual
es un factor de riesgo de infeccin neonatal.
Cualquier microorganismo y en cualquier
contaje en orina obtenida por aspiracin
Procesar (ID y PSA)
suprapbica
ID: Identificacin PSA: Pruebas de susceptibilidad a los agentes antimicrobianos.
68
*Para muestras de orina tomadas mediante tcnicas invasivas ver el cuadro complementario 14.
69
Cuadro 12. Microbiota Urinaria Contaminante e Infectante

Microbiota
Microorganismo
Urogenital
Streptococcus grupo viridans, Neisseria

spp., Lactobacillus spp., anaerobios.
Piel
Difteroides, Staphylococcus spp.

Bacilos Gram negativo
Conducta
Si se aslan en contaje no significativo, reportar como
microbiota urogenital (para aislamientos puros en contaje
significativo de cualquiera de estos microorganismos ID y
PSA)
Reportar como microbiota de piel o urogenital a menos que
est presente en una cantidad 10 veces mayor que el resto
de la microbiota, en tal caso se trata como el uropatgeno.
Identificar a nivel de especie y PSA.
S. aureus: ID y PSA
Staphylococcus
Levaduras
Streptococcus Beta-hemoltico
Uropatgenos
Enterococcus spp.
G. vaginalis
Aerococcus urinae
Corynebacterium (ureasa positivo)
S. saprophyticus: ID y PSA en mujeres en edad

reproductiva
Identificar, especialmente para determinar si es Candida
albicans y C. glabrata.
Identificar, especialmente Streptococcus del grupo B en
mujeres embarazadas, en edad reproductiva y en pacientes
diabticos.
Identificar a nivel de especie y PSA (en pacientes
hospitalizados hacer siempre el screening a vancomicina)
Identificar si est en cultivo puro o si est en un nmero 10
veces mayor que otra microbiota
Identificar slo si est en cultivo puro o en nmero 10 veces
mayor que otra microbiota
ID y PSA, si est en un nmero 10 veces mayor que otra
microbiota o en contaje >105 UFC/mL
ID: Identificacin
PSA: Pruebas de susceptibilidad a los agentes antimicrobianos.
SCN: Staphylococcus coagulasa negativa
Cuadro 13.
Casos de Infeccin Urinaria y Bacteriuria con Contajes <103 UFC/mL de Orina
Pacientes bien hidratados
Orina con pH menor de 5.0
Orina con peso especfico menor de 1.003
Pacientes recibiendo terapia antimicrobiana
Obstruccin renal completa
Pielonefritis crnica
Prostatitis
Sndrome uretral agudo
Muestras tomadas por aspiracin suprapbica
Pacientes cateterizados
Pacientes con pielonefritis adquirida por va hematgena, principalmente por Candida spp., Salmonella spp.
S. aureus y M. tuberculosis.
Infeccin por G. vaginalis y H. influenzae
Recin nacidos y nios
70
Reporte de los resultados

Resultados negativos:
Si no se observa crecimiento en los medios de cultivo, reportar:
Mtodo del Asa Calibrada (lmite de deteccin: 102-105 UFC/mL de orina):
Negativo.
Resultados Positivos:
Si slo crece microbiota urogenital o de piel en cultivo puro, pero en contaje no significativo
(<100.000), reportar como tal. Por ejemplo: 10.000 UFC/mL de orina de microbiota normal
urogenital. Los cultivos mixtos, se reportan con el contaje en UFC/mL, seguido por:
Aislamiento Polimicrobiano. Se recomienda seguir estrictamente las recomendaciones para la
recoleccin adecuada de la muestra y su envo inmediato al laboratorio.
Si se aslan patgenos, reportar el contaje de colonias para cada uno por separado, seguido por
la identificacin y las pruebas de susceptibilidad.
Cuando se observa inhibicin antimicrobiana en el rea primaria, no reportar el contaje.
Reportar este como: Contaje de colonias no confiable debido a inhibicin antimicrobiana.
Notificar al mdico hallazgos positivos inusuales (Ej. Salmonella Typhi o Burkholderia
pseudomallei).
Limitaciones de los Urocultivos

Debido a que el contaje bacteriano en orina depende de la presentacin de la enfermedad,
pueden emplearse diferentes criterios para determinar si ste es significativo y si el paciente
requiere tratamiento. Sin embargo, generalmente el laboratorio desconoce otros detalles, aparte
del sexo o la edad del paciente y el tipo de muestra, limitando esto la interpretacin de los
cultivos.
En casos de piuria estril, la coloracin de Gram realizada directamente de la orina es
importante para orientar el diagnstico microbiolgico: si en sta se observan microorganismos,
pero no se obtiene crecimiento en los medios de cultivo y estos hallazgos persisten, estara
indicado un cultivo anaerbico o la investigacin de micobacterias, en cuyo caso debe
cultivarse la primera orina del da por 3 das consecutivos. En mujeres sexualmente activas con
disuria y piuria pero cultivos de orina estriles, debe sospecharse de sndrome uretral agudo
debido a uretritis. Asimismo, debido a que la presentacin clnica de las ITU puede ser similar a
la de algunas infecciones del tracto genital, estas ltimas deben descartarse y considerar la
investigacin de microorganismos, tales como: N. gonorrhoeae y Chlamydia, as como agentes
productores de vaginitis y vaginosis, como: G. vaginalis, Mycoplasma, Trichomonas vaginalis,
C. albicans y otras levaduras.
Pueden obtenerse resultados falsos negativos en los urocultivos, debido a: interferencia de
sustancias presentes en la orina, pH de orina bajo, orina muy diluida, o interpretacin subjetiva
de los criterios de lectura de estos cultivos.
71
Procesamiento de Muestras del Tracto Genital
Captulo
9
Procesamiento de Muestras del

Tracto Genital
El diagnstico microbiolgico de las Infecciones del Tracto Genital (ITG), depende en gran
medida del conocimiento de los microorganismos que forman parte de la flora normal y su
diferenciacin de aquellos considerados como patgenos. As como de la adecuada recoleccin de
las muestras y su transporte al laboratorio.
Las ITG, tanto femenino como masculino, son producidas por una amplia variedad de
microorganismos, incluyendo bacterias, hongos, virus y parsitos. Diversos factores pueden estar
involucrados en la incidencia de estas infecciones, incluyendo: edad, actividad sexual promiscua,
uso de contraceptivos orales en las mujeres, instrumentacin del tracto genital, partos, composicin
de la flora genital e infecciones previas.
Las ITG en las mujeres incluyen: Cervicitis, Vulvovaginitis, Vaginosis Bacteriana (VB),
Salpingitis, Enfermedad Inflamatoria Plvica (EIP), Endometritis y lceras genitales; y en los
hombres: Uretritis, Epididimitis, Prostatitis y lceras genitales.
Infecciones del Tracto Genital investigadas de rutina

Vulvovaginitis candidisica
En su etiologa participan levaduras del gnero Candida, especialmente C. albicans,
responsable del 80-90% de los casos. Otras especies de Candida responsables de candidiasis
vulvovaginal, son: C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis, y C. krusei. Tambin se han reportado
vulvovaginitis producidas por Saccharomyces cerevisiae, que representan aproximadamente un 1%
de los casos.
Para el diagnstico microbiolgico de esta entidad clnica, deben observarse
microscpicamente en el exudado vaginal, las formas filamentosas (hifas y/o pseudohifas) o las
blastoconidias de las levaduras, mediante examen al fresco o tras coloracin de Gram. Esta tcnica
tiene la ventaja de ser rpida, pero su sensibilidad es baja (50%). La confirmacin diagnstica se
realiza mediante cultivo en agar Sabouraud. En la mayora de los laboratorios los cultivos positivos
para levaduras slo son evaluados mediante coloracin de Gram y la prueba de tubos germinales.
73
Figura 33. Imgenes de C. albicans: (izquierda) visualizacin de tubos germinales en fresco (objetivo
40X), (centro) blastoconidias y pseudohifas coloreadas con Gram (objetivo de 100X); (derecha)
colonias en agar SB.
Para la realizacin de la prueba de tubos germinales se resuspenden en 0,5 mL de plasma

sanguneo contenido en un tubo varias colonias crecidas en agar Sabouraud (SB), la suspensin se
incuba a 37C y al cabo de 2 a 3 horas se extraen una o dos gotas que se colocan entre lmina y
laminilla; este preparado se observa al microscopio con el objetivo de 40X. La presencia de tubos
germinales es indicativa de C. albicans. Las levaduras que no demuestran la presencia de tubos
germinales (tubos germinales negativo) se identifican slo como Candida spp (Figura 34).
Figura 34. Prueba de tubos germinales
Positiva (C. albicans)
Negativa (Candida spp.)
Vaginitis tricomonisica (Tricomoniasis)

Es causada por Trichomonas vaginalis, un protozoario que puede alojarse en la uretra,
prstata, vescula seminal o en el surco balano-prepucial del varn, generalmente en ausencia de
sntomas. Se transmite por va sexual a la mujer, colonizando la vagina, la uretra y las glndulas
parauretrales
El diagnstico microbiolgico se realiza, frecuentemente, por la observacin de clulas
mviles del protozoario en el flujo genital, durante el examen al fresco con solucin salina fisiolgica
(Figura 35) o bien puede establecerse por cultivo o por mtodos de amplificacin de cidos nucleicos.
74
Figura 35. Trofozotos de Trichomonas vaginalis en preparacin al fresco:

Izquierda (40X), Derecha (100X)
Vaginitis aerbica (VA):

Representa alrededor del 10% de los casos de vaginitis. Es causada por algunas bacterias
aerobias intestinales, como E. coli, S. agalactiae (Streptococcus Beta Hemoltico del Grupo B),
Enterococcus faecalis y Staphylococcus aureus, las cuales pueden colonizar la vagina debido a
hipoestrogenismo, prolapsos, o hbitos higinicos incorrectos que exponen la mucosa vaginal a la flora
perineal. Para diagnosticar una VA, estas bacterias deben ser aisladas en cultivo puro o crecimiento
predominante en pacientes con sntomas irritativos (tales como ardor y dispareunia) e inflamatorios
(presencia de leucocitos polimorfonucleares en la secrecin vaginal), siendo evidente la ausencia o
disminucin marcada de lactobacilos. Ver la coloracin de Gram de exudado vaginal de paciente con
vaginitis aerbica que se muestra en el figura 36. El flujo vaginal presenta un olor desagradable (pero
no olor a pescado) y el pH al igual que en la VB y la tricomoniasis es >4.5.
Figura 36. Coloracin de Gram de exudado vaginal de paciente

con vaginitis aerbica. Se observa la presencia de abundantes
PMN y cocos Gram positivo (objetivo 100X) y la ausencia de
lactobacilos
Gonorrea
Para su diagnstico, en el caso de la uretritis masculina, la coloracin de Gram es una de las
tcnicas ms utilizadas por su rapidez y sensibilidad, comparable a la del cultivo bacteriolgico,
pero es poco sensible para el diagnstico de N. gonorrhoeae en otras localizaciones. El extendido de
la secrecin uretral, coloreado con Gram, debe observarse con el objetivo de inmersin, buscando la
presencia de leucocitos polimorfonucleares (PMN), (ncleo rosa oscuro y citoplasma claro). El
gonococo aparece como cocos Gram negativos ovales, arrionados y en parejas intra y
75
extracelularmente. Se debe notificar la presencia del nmero de leucocitos PMN por campo de
inmersin, as como de diplococos Gram negativos intracelulares o extracelulares.
El aislamiento de N. gonorrhoeae se realiza mediante el uso de medios selectivos (agar
Thayer-Martin, Martn-Lewis o medio New York City) y medios no selectivos (agar chocolate),
debido a que algunas cepas pueden inhibirse en los medios selectivos que contienen vancomicina
(2g/mL). Adems, una pequea proporcin de cepas denominadas atpicas o auxotipos AHU
(deficientes en arginina, hipoxantina y uracilo), fallan en crecer en los medios selectivos; estas cepas
se caracterizan por un crecimiento ms lento, produccin de colonias ms pequeas e identificacin
bioqumica ms difcil. Las placas para la investigacin de neiserias se incuban en ambiente hmedo
y microaeroflico (3 a 5% de CO2 a 37C) y se examinan cada 24 h durante al menos 72 horas.
Figura 37. Coloracin de Gram de

exudado uretral de paciente con uretritis
gonoccica (objetivo 100X)
Vaginosis
Es un proceso infeccioso que involucra slo la superficie de la mucosa vaginal, por lo que
hay ausencia de inflamacin. Se considera atribuible a un desequilibrio de la flora vaginal.
El ecosistema vaginal es un ambiente complejo, en el que ocurren interrelaciones entre la
microflora endgena y sus productos metablicos, los productos metablicos del hospedero, los
estrgenos y el pH. Las bacterias normalmente predominantes son los lactobacilos, particularmente
Lactobacillus acidophilus, responsables de mantener un pH vaginal cido (3,8 a 4,2) y de producir
perxido de hidrgeno, con el fin de crear condiciones inhspitas para algunas especies bacterianas
(anaerobios facultativos y anaerobios estrictos Gram negativo y Gram positivo), y otros
microorganismos. El equilibrio del ecosistema vaginal puede ser afectado por diversos factores,
tales como: los cambios hormonales, el uso de medicamentos, el coito, el stress, las infecciones, las
duchas vaginales y algunos hbitos higinicos, dando lugar a diferentes tipos de vaginosis.
1. Vaginosis bacteriana (VB)
Constituye una alteracin masiva de la flora vaginal, donde el gnero predominante,
Lactobacillus, es reemplazado por una gran proporcin de G. vaginalis y bacterias anaerobias,
fundamentalmente Bacteroides spp., Prevotella spp., Porphyromonas spp., Peptostreptococcus spp.
y Mobiluncus spp., as como por micoplasmas genitales. La VB se caracteriza, adems, por la
presencia de grandes concentraciones de enzimas bacterianas, tales como: fosfolipasa A2, mucinasas
y neuraminidasas, as como endotoxinas e interleucina-1.
76
Recientemente, se han descrito nuevas especies asociadas a vaginosis como Atopobium

vaginae (coco Gram positivo elipsoidal anaerobio). Muchas de las manifestaciones clnicas de la VB
estn relacionadas con la formacin de biocapas bacterianas sobre la superficie vaginal, cuya masa
est constituida en ms del 90% por Gardnerella y Atopobium. Probablemente, la VB es el resultado
de la colonizacin por comunidades bacterianas complejas, muchas de ellas no cultivables, que
tienen metabolismos interdependientes (sintrpicos).
El diagnstico de la VB se establece fundamentalmente por criterios clnicos basados en las
caractersticas del flujo vaginal (Criterios de Amsel), y puede confirmarse por criterios
microscpicos (Criterios de Nugent) en la coloracin de Gram del exudado vaginal. Los criterios
clnicos de Amsel estn basados en la presencia de tres de los siguientes signos: a) flujo vaginal
fino, homogneo, blanco, uniforme, adherido a las paredes vaginales; b) pH vaginal > 4,5; c) olor a
pescado tras aadir a la muestra KOH al 10% (Test de Whiff o KOH); y d) ms de un 20% de
clulas clave en preparaciones microscpicas al fresco (objetivo de 40X), lo cual es considerado un
criterio altamente significativo. Sin embargo, en la prctica mdica rutinaria no siempre resulta
posible evaluar todos estos criterios.
Figura 38. Coloracin de Gram mostrando clulas clave (clulas epiteliales

cuya superficie est recubierta por numerosos bacilos o coco-bacilos), como
resultado de la adherencia de G. vaginalis, u otras bacterias a las clulas
vaginales
El diagnstico microbiolgico se realiza mediante la aplicacin del criterio de

interpretacin de Nugent y col., el cual se describe a continuacin.
Criterio microbiolgico o criterio de Nugent y col.
Se basa en el recuento de los morfotipos bacterianos presentes en los extendidos de flujo
vaginal coloreados con Gram. Los morfotipos de inters para el recuento son: bacilos Gram positivo
(Lactobacillus spp.), bacilos Gram negativo o Gram variable pequeos (G. vaginalis,
Porphyromonas spp. /Prevotella spp.) y bacilos pequeos curvos Gram variable (Mobiluncus spp.),
y la presencia de clulas clave (clulas epiteliales tapizadas de morfotipos Gram positivos y/o Gram
negativos que pierden los contornos. Este criterio permite clasificar las muestras de acuerdo a
puntajes que oscilan entre 0 y 10. Las muestras con mayor puntaje sern aquellas que tengan un
elevado recuento de bacilos pequeos Gram negativo o Gram variable y un bajo recuento de
77
Lactobacillus spp., de esta manera, el diagnstico de VB se establece cuando el puntaje total

obtenido es igual o superior a 7. Se considera un estado intermedio (microbiota vaginal alterada)
cuando el puntaje total oscila entre 4 y 6, y un resultado normal (microbiota vaginal normal) para
puntajes de 0 a 3.
En el siguiente cuadro se muestra el sistema de recuento para cada uno de los morfotipos a
evaluar (cantidad observada por campo microscpico) y el puntaje correspondiente al recuento de
cada uno de ellos. El puntaje total se obtiene al sumar el puntaje de cada uno de los morfotipos que
se evalan.
Cuadro 14. Criterios de Interpretacin de Nugent y col.:
Sistema de Puntaje en la Coloracin de Gram para el Diagnstico de Vaginosis Bacteriana (VB)
Morfotipos
Bacilos pequeos Gram - o Gram
variable (G. vaginalis/Prevotella
spp. /Porphyromonas spp.)
Puntaje
Bacilos Gram positivos

(Lactobacillus spp.).
4+ (>30/campo)
3+ (5- 30/campo)
1+ (<1/campo)
1+ 2+ (<5/campo)
2+ (1 - 4/campo)
2+ (1 - 4/campo)
3+ 4+ (>5/campo)
1+ (<1/campo)
3+ (5- 30/campo)
4+ (>30/campo)
4
a
Bacilos curvos Gram Variable

(Mobilluncus spp.).
Cantidad de clulas observadas por campo.
Ejemplo: Si en un extendido se observan como promedio:

Menos de un lactobacilo por campo (1+), a este recuento le corresponde un puntaje de 3,
Ms de 30 morfotipos de Bacilos pequeos Gram negativo o Gram variable (4+), a lo cual
corresponde un puntaje de 4 y
Menos de 5 morfotipos de bacilos curvos Gram negativo o Gram variable (1 o 2+), a lo cual
corresponde un puntaje de 1.
La suma del puntaje de cada uno de estos morfotipos sera: 8 (3+4+1), diagnstico de VB.
Para el aislamiento de G. vaginalis se emplea de rutina Agar Sangre Humana (SH), el cual
es incubado por 24-48 horas a 35-37C en atmsfera microaerofilica, donde puede observarse su
morfologa colonial caracterstica (colonias puntiformes de 0.3 a 0.5 mm de dimetro, convexas,
opacas, grises y con betahemlisis difusa, generalmente visible despus de 48 horas de incubacin
(no ocasiona el enverdecimiento del agar a diferencia de los lactobacilos). La deteccin de esta
bacteria en las muestras de tracto genital femenino tiene inters, principalmente, cuando la
coloracin de Gram del exudado vaginal es consistente con el diagnstico de VB.
2. Vaginosis Citoltica (VC)

En algunas mujeres la proliferacin excesiva de lactobacilos puede resultar en la lisis de las
clulas del epitelio vaginal, un desorden denominado Vaginosis Citoltica (VC), el cual se
caracteriza por secrecin abundante con apariencia de queso blanco; la vulva puede presentar una
apariencia normal o estar eritematosa y edematizada, hay prurito, dispareunia y disuria vulvar, con
78
un aumento cclico en los sntomas, los cuales son ms pronunciados en la fase ltea, similar a los
sntomas de la candidiasis vaginal. Por lo general, la VC se diagnostica incorrectamente como una
infeccin crnica por levaduras, particularmente cuando el diagnstico se ha basado exclusivamente
en las apreciaciones clnicas de los sntomas de las pacientes. El pH de la descarga vaginal suele
estar entre 3,5 y 4,5. Su prevalencia e incidencia son desconocidas. Existen adems muy pocos datos
sobre las variables asociadas con este trastorno, aunque se ha informado una alta incidencia en
mujeres con niveles aumentados de stress. El tratamiento requiere el uso de duchas alcalinizantes
con bicarbonato de sodio.
Las preparaciones microscpicas revelan escasos PMN, un nmero aumentado de
lactobacilos y evidencia de citlisis (clulas epiteliales fragmentadas o lisadas, exhibiendo ncleos
desnudos, parcial o totalmente), sin evidencia de Trichomonas, Gardnerella, o Candida. Los
cultivos vaginales slo revelan el crecimiento abundante de lactobacilos, a los cuales se atribuye la
sintomatologa.
Fragmentos
citoplasmticos
Ncleos
desnudos
Figura 39. Coloracin de Gram de exudado

vaginal, mostrando imagen caracterstica de
VC.
3. Lactobacilosis (LB)
En la LB hay una transformacin en la longitud de los lactobacilos, los cuales se describen
como formas bacilares sinuosas y largas que corresponden probablemente a especies anaerobias.
En mujeres sanas los lactobacilos vaginales miden entre 5 y 15 micras de longitud,
mientras que en las pacientes sintomticas los lactobacilos miden entre 40 y 75 micras (pudiendo
ser confundidos con hifas de levaduras). Se desconoce la causa de esta transformacin morfolgica
pero a ella se atribuye el desarrollo de la descarga vaginal y la incomodidad que refieren las
pacientes.
La secrecin vaginal es espesa, blanca y cremosa. Hay prurito y sensacin de irritacin
vaginal. Los sntomas se presentan cclicamente: aparecen en la segunda mitad del ciclo menstrual,
alcanzan un pico poco antes de la menstruacin, y se repiten 7 a 10 das aproximadamente antes de
la prxima menstruacin. No hay alteraciones en la apariencia de la vulva, la vagina o el crvix. El
pH vaginal es aproximadamente de 4,5. Al igual que en la VC, existen pocos estudios respecto a la
prevalencia de LB. Los cultivos vaginales generalmente son negativos.
79
Figura 40. Coloracin de Gram de exudado

vaginal, mostrando imagen caracterstica de LB
Diagnstico de Laboratorio
Muestras del Tracto genital bajo
Incluyen: hisopados y exudados vaginales, secrecin uretral, exudado parauretral, secrecin
cervical, semen, exudado de glndula de skene y de Bartolini, secrecin prosttica, secreciones
balano-prepucial y de epiddimo.
Cultivo bacteriolgico de rutina
Las muestras procedentes del tracto genital bajo se inoculan en los siguientes medios:
Vancomicina, Colimicina y Nistatina (VCN)
Agar Chocolate (GC)
Sangre Humana (SH)
Agar MacConkey (MC)
Agar Sabouraud (SB)
Los medios de cultivo de SH, GC y VCN son incubados en atmsfera de microaerofilia (3
5 % CO2), y las placas de MC y SB en atmsfera de aerobiosis. Todas las placas se incuban a 35
37C, durante 18 a 24 horas. Slo en las muestras de aspirados de glndula de Bartolino, fluido del
epiddimo y balano-prepucial, se realiza la investigacin rutinaria de bacterias anaerbicas, en cuyo
caso se incluye una placa de SHA, incubada en anaerobiosis a 35C, durante 48 a 72 horas.
Examen directo coloreado con Gram
A todas las muestras procedentes del tracto genital, una vez inoculados los medios de
cultivo, se les debe realizar un frotis coloreado con Gram con el propsito de investigar la presencia
de agentes patgenos comunes (G. vaginalis, N. gonorrhoeae y levaduras) y en el caso de
secreciones vaginales de mujeres en edad reproductiva, para evaluar alteraciones del ecosistema
vaginal (vaginosis bacteriana, vaginosis citoltica, lactobacilosis, y vaginitis aerbica), para ello
debe reportarse cuantitativamente la presencia de:
Clulas epiteliales superficiales, parabasales o basales (ver nota).
Leucocitos polimorfonucleares (PMN).
Blastoconidias e hifas de levaduras para el diagnstico de candidiasis.
Diplococos Gram negativo intra o extracelulares para el diagnstico de gonorrea.
Otros morfotipos bacterianos observados (afinidad tintorial y agrupacin).
80
Clulas clave y determinacin de los morfotipos bacterianos predominantes en stas (ver criterios
de Nugent), para el diagnstico de VB.
Citlisis o lisis celular (leve, moderada o acentuada). Especificar si sta se acompaa de un
franco predominio de lactobacilos y ausencia de leucocitos, clulas clave y levaduras, lo que
sugiere el diagnstico de VC.
Lactobacilos sinuosos y largos (40-75 micras de longitud). Especificar si estn en cantidad
abundante y en ausencia de leucocitos, clulas clave y levaduras, lo que sugiere el diagnstico de
LB.
Nota: En mujeres postmenopusicas las clulas epiteliales planas son sustituidas gradualmente por
clulas parabasales y basales. La presencia de estas clulas en mujeres en edad reproductiva
indica una descamacin profusa inusual del epitelio vaginal.
Examen al fresco
Se realiza a las muestras de secreciones vaginales y secreciones uretrales (uretritis no
gonoccica) para la investigacin de Trichomonas vaginalis. Con uno de los hisopos empleados
para la toma de la muestra se hace una suspensin en un tubo conteniendo 0,5 mL de solucin salina
fisiolgica y se incuba a 3537C durante 30 minutos para activar la motilidad del parsito. Una vez
transcurrido este tiempo, se coloca una gota de la suspensin en una lmina portaobjeto, se cubre
con una laminilla y se observa al microscopio con el objetivo de 40X, para la bsqueda de
trofozotos mviles de T. vaginalis. Adicionalmente, esta preparacin al fresco permite la
visualizacin de clulas clave, levaduras o sus hifas.
Reporte del Examen al Fresco: Su reporte depender de los criterios establecidos por cada
laboratorio. Puede reportarse nicamente la investigacin de trofozotos de T. vaginalis o realizar el
reporte semicuantitativo de todos los elementos que se observen. Ejemplos:
Examen al fresco: Investigacin de T. vaginalis: Negativa. O bien,
Examen al fresco: Se observaron (clulas epiteliales, leucocitos, clulas claves, bacterias, T.
vaginalis, levaduras, etc.), especificando la cantidad para cada uno de los elementos observados.
Figura 4. Procesamiento de Muestras de Tracto Genital Bajo
Sembrar placas de VCN, GC, SH, MC y SB

Sembrar placas de VCN, GC, SH, MC y SB
Realizar examen directo al fresco a secreciones

Realizar examen
al fresco
a secreciones
vaginalesdirecto
y secreciones
uretrales
(para investigacin
vaginales ydesecreciones
(para investigacin
uretritis no uretrales
gonoccica)
de uretritis no gonoccica)
*Incluir SHA en aspirados de glndula de Bartolino, fluido del epiddimo y balano-prepucial.
81
Muestras de tracto genital alto

Estas muestran incluyen: material de trompas de Falopio, ovarios, tero, entre otros. En
este tipo de muestras deben investigarse de rutina bacterias anaerbicas.
Cultivo Bacteriolgico de Rutina
Las muestras procedentes del tracto genital alto se inoculan en los siguientes medios:
Agar Sangre Humana Anaerobiosis (SHA)
Vancomicina, Colimicina y Nistatina (VCN)
Agar Chocolate (GC)
Sangre Humana (SH)
Agar MacConkey (MC)
Agar Sabouraud (SB)
Caldo Tioglicolato (CT)
Los medios de cultivo de SH, GC y VCN son incubados en atmsfera de microaerofilia (3
5% CO2), y las placas de MC, SB y CT en atmsfera de aerobiosis, todas a 3537C, durante 18 a 24
horas. La placa de SHA, es incubada en atmsfera de anaerobiosis a 3537C, durante 48 horas.
Figura 42. Procesamiento de Muestras de Tracto Genital Alto
Sembrar placas de SHA, VCN, GC, SH, MC, SB y CT

Examen Directo coloreado con Gram

Una vez inoculados los medios de cultivo, se debe realizar un frotis coloreado con Gram directo de
la muestra, para enviar un informe provisional del proceso infeccioso.
Criterios Generales para la Lectura e Interpretacin de Cultivos Genitales
Examinar las placas luego de 18 a 24 horas de incubacin.
Correlacionar el crecimiento con los resultados de la coloracin de Gram para determinar la
extensin del trabajo.
Para muestras quirrgicas y de sitios normalmente estriles, considerar significativa la presencia
de cualquier microorganismo.
Identificar los siguientes patgenos si estn presentes:
Shigella spp., u otros patgenos entricos, especialmente en pacientes peditricos.
Streptococcus agalactiae.
Streptococcus pyogenes.
82
Listeria monocytogenes.
Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis.
Candida albicans y otras levaduras
Los siguientes microorganismos slo se identificarn: cuando la muestra sea recolectada de
forma invasiva, o cuando se encuentren presentes en cantidad abundante y sean los
microorganismos predominantes en el cultivo:
Haemophilus spp.
Bacilos Gram negativos:
Bacilos Gram negativo entricos (con excepcin de Enterobacteriaceae que son parte de la
microbiota normal de la vagina y no deben ser reportados. La excepcin a esta regla aplicara
slo a cultivos cervicales o vaginales de pacientes con sospecha de vaginitis aerbica por E.
coli, en cuyo caso la coloracin de Gram debe correlacionarse con su presencia en el
cultivo).
Pasteurella bettyae (grupo HB-5 de la CDC), la cual ha sido asociada con infecciones
genitales, especialmente en neonatos. Es un bacilo Gram negativo indol positivo, catalasa
negativo, oxidasa variable, que no crece en MC o crece como colonias en forma de puntos de
alfiler.
Capnocytophaga spp., se asocia con infecciones genitales. Son bacilos Gram negativos
fermentadores de la glucosa, catalasa negativo, oxidasa negativo, que no crecen en MC. La
fermentacin de la glucosa puede no ser detectada en el TSI. Son generalmente esculina
positiva.
Campylobacter fetus.
S. aureus.
Streptococcus pneumoniae.
G. vaginalis:
Si es el microorganismo predominante en el cultivo y se asla en cantidad moderada o
abundante.
Actualmente no se recomienda el uso de medios selectivos para su aislamiento a partir de
muestras vaginales, debido a que su importancia est determinada por su cantidad en el
cultivo, comparada con la de lactobacilos. G. vaginalis crece bien tanto en SH como en GC.
Cuando se asla en cantidades menores que el resto de la microbiota normal, debe ser
incluida como parte de la microbiota vaginal normal, excepto en nias, en quienes se reporta
independientemente de su cantidad.
Con respecto a las pruebas de susceptibilidad:
No son tiles y no estn indicadas debido a la predecible susceptibilidad y

resistencia a los agentes antimicrobianos de la mayora de los microorganismos implicados en
infecciones genitales, excepto para BGN aislados en cultivo predominante y abundante y cuyo
aislamiento se corresponda con los resultados de la coloracin de Gram.
Para bacilos Gram negativos aerbicos y anaerbicos fastidiosos, realizar y

reportar los resultados de la prueba de -lactamasa.
Criterios Generales para el Reporte de los Resultados

Si no se aslan patgenos pero hay presencia de microbiota normal
Reportar:
En muestras vaginales y cervicales: Flora Genital Normal en cantidad (escasa, moderada o
abundante).
83
En muestras uretrales masculinas: Flora Cutnea Normal en cantidad (escasa, moderada o

abundante).
No reportar de forma individual la microbiota normal como gnero y especie.
Cultivos positivos para los patgenos potenciales (N. gonorrhoeae, S. agalactiae, H. ducreyi,
Shigella spp., C. albicans, L. monocytogenes)
Reportar gnero, especie y cantidad. Notificar pruebas de susceptibilidad si estn indicadas.
Notificar al mdico sobre la presencia de patgenos de significancia mayor: por ejemplo: L.
monocytogenes en embarazadas y N. gonorrhoeae en enfermedades de transmisin sexual (ETS).
Notificar al servicio de Epidemiologa el aislamiento de agentes productores de enfermedades de
denuncia obligatoria.
Si se solicita la investigacin de un patgeno especfico y este no se asla
Reportar: Cultivo negativo para la investigacin de (el nombre del patgeno solicitado).
Notificacin de resultados sobre la investigacin de levaduras:
Examen microscpico directo: informar la presencia o ausencia de blastosporas y/o pseudohifas.
Cultivo: si es positivo, reportar la cantidad (crecimiento escaso: <10 colonias por placa,
moderado: entre 10-99 o abundante: 100).
En el caso de Vaginosis Bacteriana (VB)
Reportar el Gram y la interpretacin del mismo, segn la puntuacin obtenida al aplicar los
criterios de Nugent.
Puntuaciones entre 0 y 3: Microbiota vaginal habitual en cantidad (escasa, moderada o

abundante).
Puntuaciones entre 7 y 10: Coloracin de Gram compatible con vaginosis bacteriana.
Puntuaciones intermedias entre 4 y 6: Microbiota vaginal alterada. Sin embargo, la

observacin de ms de un 20% de clulas clave es aceptado como indicativo de VB
independientemente de los criterios de Nugent. Las puntuaciones intermedias deben
interpretarse con mucha precaucin en mujeres postmenopusicas, en quienes el recuento de
lactobacilos disminuye progresivamente.
En el caso de Vaginosis Citoltica (VC)
Se consideran como casos positivos de VC slo aquellos que renen los aspectos
microbiolgicos y clnicos caractersticos de esta condicin. En ese caso, si los resultados del Gram
y del cultivo son compatibles con VC (los cultivos vaginales slo revelan el crecimiento abundante
de lactobacilos), el laboratorio debe informar el resultado de la coloracin de Gram de la manera
ms descriptiva posible e indicar el grado de citlisis observado (leve, moderado o acentuado).
Ejemplo:
Examen al fresco: Investigacin de T. vaginalis: Negativa
Examen Directo con Coloracin de Gram: Se observaron clulas epiteliales abundantes con
evidencia de lisis celular moderada y bacilos Gram positivo (Lactobacilos) abundantes.
Cultivo: Lactobacillus spp. en cantidad abundante.
Incluir en el reporte la siguiente nota explicativa:
84
NOTA: Este microorganismo es flora normal de vagina. En este caso se reporta debido a que la
imagen microscpica y los resultados del cultivo son compatibles con Vaginosis Citoltica. Se
recomienda manejar el caso segn la clnica de la paciente.
En el caso de Lactobacilosis (LB)
Se consideran como casos positivos de LB slo aquellos que renan los aspectos microbiolgicos y
clnicos caractersticos de esta condicin. Si los resultados del Gram y del cultivo son compatibles
con LB (los cultivos vaginales generalmente son negativos, debido a que los lactobacilos
implicados en esta alteracin suelen corresponder a especies anaerobias), el laboratorio debe
informar el resultado de la coloracin de Gram de la manera ms descriptiva posible.
Ejemplo:
Examen al fresco: Investigacin de T. vaginalis: Negativa
Examen Directo con Coloracin de Gram: Se observaron clulas epiteliales abundantes y bacilos
Gram positivo alargados y sinuosos (Lactobacilos) abundantes.
Cultivo: No se observ crecimiento bacteriano despus de 48 horas de incubacin.
NOTA: Imagen microscpica y resultados del cultivo compatibles con Lactobacilosis. Se
recomienda manejar el caso segn la clnica de la paciente.
En el caso de secrecin uretral procedente de pacientes masculinos para la
investigacin de N. gonorrhoeae
- Ejemplo de informe negativo: Al examen microscpico directo coloreado con Gram no se
observaron diplococos Gram negativos intra o extra celulares. Indicar la presencia y el nmero de
leucocitos PMN por campo de inmersin.
Nota: El reporte de la presencia de clulas inflamatorias en el exudado uretral en ausencia de
diplococos Gram negativos es importante, ya que orienta el diagnstico hacia una uretritis no
gonoccica.
- Ejemplo de informe positivo: Al examen microscpico directo coloreado con Gram se observaron
diplococos Gram negativos intra y/o extra celulares en cantidad (abundante, moderada o escasa).
Indicar la presencia del nmero de leucocitos PMN por campo de inmersin.
Cultivo: Si el cultivo de secrecin uretral es solicitado, reportar el resultado del Gram y del examen
al fresco, junto con el resultado del cultivo.
En muestras de tracto genital alto
Examen Directo coloreado con Gram:
- Ejemplo de informe negativo: Al examen microscpico directo coloreado con Gram no se
observ morfologa bacteriana.
- Ejemplo de informe positivo: Al examen microscpico directo coloreado con Gram se observaron
[bacterias (especificando morfologa, afinidad tintorial, agrupacin y semicuantificacin), clulas
(especificando tipo y semicuantificacin), otros elementos, Ej. Polimorfonucleares (especificando su
semicuantificacin).
Cultivo:
- Si es negativo, reportar: No se observ crecimiento bacteriano despus de 48 horas de incubacin
(especificar si el tiempo de incubacin fue mayor).
85
- Si es positivo para los potencialmente patgenos investigados, reportar: Gnero, Especie, Cantidad
y resultado del Antibiograma si est indicada su realizacin.
86
Captulo
10
Procesamiento de Muestras Fecales
La alta incidencia de los procesos infecciosos entricos en la poblacin general junto con
sus elevados ndices de morbi-mortalidad en determinados grupos etarios (nios y ancianos) hace
que este tipo de patologa sea de gran inters tanto clnico como microbiolgico. Ante un cuadro de
infeccin gastrointestinal debe hacerse una historia clnica detallada que incluya la presencia de
signos y sntomas clnicos, el tipo de diarrea (acuosa, mucosa o sanguinolenta), los antecedentes
epidemiolgicos (edad, historia reciente de viajes, aparicin espordica o como parte de un brote,
tipo de alimento sospechoso, perodo de incubacin) y si existen factores predisponentes (SIDA,
inmunosupresin, etc.), debido a que esta informacin puede orientar acerca del microorganismo
implicado. No obstante, el diagnstico etiolgico definitivo se logra mediante el estudio
microbiolgico, para detectar los agentes etiolgicos implicados: virus, parsitos y bacterias.
En este captulo se describe slo la metodologa a seguir para el diagnstico de las bacterias
enteropatgenas investigadas de forma rutinaria en nuestro medio. Otras bacterias asociadas a
determinadas situaciones clnicas y/o epidemiolgicas, tales como las causantes de intoxicacin
alimentaria y colitis pseudomembranosa, as como las diferentes categoras enteropatgenas de E.
coli, no sern consideradas aqu, puesto que requieren de tcnicas especiales y su identificacin
queda fuera de la prctica rutinaria de la mayora de los laboratorios clnicos.
Agentes Bacterianos Productores de Diarrea
Actualmente se reconocen los siguientes:
Cuadro 15. Agentes Bacterianos Productores de Diarrea
Enterobacterias
Aeromonas
Vibrio
Salmonella spp
Shigella spp
Yersinia enterocolitica
Escherichia coli (serotipos
enteropatgenos):
E. coli enteropatgenica (ECEP)
E. coli productora de toxina shiga
(ECTS)
E. coli enteroinvasiva (ECEI)
E. coli enterotoxignica (ECET)
E. coli enteroagregativa (ECEA)
E. coli enteroadherente difusa (ECAD)
Plesiomonas shigelloides
A. hydrophila
A. caviae
A. veronii biovar sobria
V. cholerae
V. parahaemolyticus
V. furnissii
V. fluvialis
V. mimicus
V. hollisae
V. metschnikovii
Campylobacter
Arcobacter
Otros
Campylobacter jejuni subsp jejuni

Campylobacter coli
Campylobacter lari
Campylobacter upsaliensis.
Campylobacter fetus subsp fetus
Campylobacter hyointestinalis
A. cryaerophilus
A. butzleri
Productores de diarrea por
Intoxicacin Alimentaria:
Clostridium perfringens
Staphylococcus aureus
Bacillus cereus
Productores de colitis
pseudomembranosa posttratamiento antimicrobiano:
Clostridium difficile
87

Para el estudio de las infecciones del tracto gastrointestinal se recomiendan las muestras de
heces frescas; si no es posible su obtencin, pueden emplearse hisopados rectales. Las muestras
deben tomarse durante la fase aguda de la enfermedad, en la cual las bacterias enteropatgenas se
excretan en mayor cantidad, y antes de la administracin de la terapia antimicrobiana.
Las muestras de heces para la investigacin de bacterias enteropatgenas convencionales
pueden ser estudiadas mediante examen microscpico directo y cultivo bacteriolgico.
Cultivo
El cultivo bacteriolgico de las heces es complejo, debido a que stas normalmente
contienen una gran cantidad de flora normal. Por ello, se requiere el empleo de diversos medios de
cultivo: diferenciales, selectivos y de enriquecimiento, con la finalidad de inhibir gran parte de la
flora normal y aumentar las probabilidades de aislamiento de las bacterias enteropatgenas, adems
de visualizar en algunos de estos medios ciertas caractersticas particulares de los enteropatgenos,
que permiten su diferenciacin de los miembros de la flora. En el siguiente cuadro se muestran los
medios de cultivo utilizados de rutina para la siembra de coprocultivos.
Cuadro 16. Medios de Cultivo Utilizados de Rutina
Para la Siembra de Muestras de Heces o Hisopados Rectales
Medio de Cultivo
Incubacin
Finalidad
Medios de cultivo en Placas

Campy Bap Modificado
(CBM)
Tiosulfato-Citrato-BilisSucrosa (TCBS)
Salmonella-Shigella-Agar
(SSA)
Xilosa-Lisina-Desoxicolato
(XLD)
5% 02/10% CO2, (Microaerofilia)

48 horas a 42C
Medio altamente selectivo para Campylobacter
Aerobiosis, 24 horas a 35-37C
Medio altamente selectivo para Vibrio
MacConkey Agar (MC)
Agar Nutritivo Gelatinado

al 2,5% (ANG)

Medio selectivo y diferencial para Salmonella

y Shigella
Medio selectivo y diferencial para Salmonella
y Shigella
Medio diferencial y selectivo para Salmonella
y Shigella
Medio basal para investigar Vibrio,
Aeromonas y Plesiomonas
Caldos de Enriquecimiento
Caldo Selenito F (CS)
Aerobiosis, 6-12 horas a 35-37C
Agua Peptonada Alcalina

(APA)
Aerobiosis, 6-12 horas a 35-37C
Medio de enriquecimiento para Salmonella y

Shigella.
Repicar a placas de SSA, XLD y MC
Medio de enriquecimiento para investigar
Vibrio, Aeromonas y Plesiomonas
Repicar a placas de TCBS y ANG
Mtodo de Siembra
Para heces frescas, tomar con un hisopo estril una porcin representativa de la muestra y
realizar el trazo central de todos los medios en placa, comenzando por el medio ms selectivo hasta
el menos selectivo (Figura 43). Introducir este mismo hisopo en el Caldo Selenito F. Posteriormente
con un nuevo hisopo, tomar otra porcin de la muestra e inocular el Agua Peptonada Alcalina
(APA).
88
Figura 43. Orden de siembra de medios de cultivo en placa.
CBM
TCBS
SSA
XLD
MC
ANG 2,5%
Figura 56. Orden de siembra de medios de cultivo en placa.
Figura 44. Caldos de enriquecimiento para muestras fecales.
Caldo Selenito F
APA
Una vez inoculados los caldos, rayar las placas con un asa en aro estril, comenzando en
sentido contrario al orden de inoculacin (del medio menos selectivo al ms selectivo). Las muestras
que se reciben en medio de transporte, por lo general contienen dos hisopos, los cuales se emplean
de la manera anteriormente descrita.
Incubar las placas de 18 a 24 horas a 35-37C en aerobiosis, excepto la placa de CBM que
se incuba por 48 horas a 42C en atmsfera microaeroflica. El caldo selenito y el APA se incuban
en aerobiosis a 35-37C de 6 a 12 horas y se repican a placas, de la siguiente manera:
Figura 32. Repique de los caldos de enriquecimiento
Caldo Selenito F
APA
Figura 45. Repique de los caldos de enriquecimiento
Lectura Inicial de los Medios de Cultivo
TCBS: las especies del gnero Vibrio pueden o no fermentar la sucrosa. Crecen a las 24
horas como colonias medianas a grandes. A partir de colonias fermentadoras de la sucrosa
(amarillas) o no fermentadoras (verde-azuladas) sembrar TSI-LIA-ANP. Las placas en las que no
se observe crecimiento despus de 24 horas de incubacin se descartan.
89
SSA: deben buscarse los siguientes tipos de colonias: fermentadoras con H2S (caractersticas
de Salmonella grupo III), no fermentadoras con H2S (caractersticas de la mayora de los
serotipos de Salmonella), y no fermentadoras sin H2S (caractersticas de Shigella y Salmonella no
productoras de H2S). De estos tipos de colonias sembrar TSI-LIA. Si a las 24 horas de incubacin
no se evidencia produccin de H2S en este medio, debe reincubarse a 35C hasta las 48 horas.
XLD: deben buscarse los siguientes tipos de colonias: amarillas con H2S (caractersticas de
Salmonella grupo III), rojas con H2S (caractersticas de la mayora de los serotipos de
Salmonella), y rojas sin H2S (caractersticas de Shigella y Salmonella no productoras de H2S). De
estos tipos de colonias sembrar TSI-LIA. Si a las 24 horas de incubacin no se evidencia
produccin de H2S en este medio, debe reincubarse a 35C hasta las 48 horas.
MC: deben seleccionarse colonias no fermentadoras de la lactosa que pudieran corresponder
a Shigella o Salmonella. A partir de cada tipo de colonias no fermentadoras sembrar TSI-LIA.
Las colonias fermentadoras nicamente se toman en cuentan cuando se investigan las categoras
enteropatgenas de E. coli. Si estas categoras no se estn investigando y no hay colonias no
fermentadoras, puede descartarse la placa a las 24 horas.
ANG ANP: practicar la prueba de oxidasa directamente a nivel del trazo central. Si el
resultado es positivo, debe sospecharse de Vibrio, Aeromonas o Plesiomonas. Posteriormente, se
debe realizar la oxidasa a colonias aisladas y de aquellas que sean oxidasa positiva sembrar TSILIA-ANP. En caso de que no se encuentran colonias aisladas oxidasa positiva, debe agotarse de
donde se detect la prueba positiva a un nuevo ANP. En el caso de que el crecimiento en AN sea
oxidasa negativo descartar la placa.
CBM: se lee a las 48 horas de incubacin en busca de colonias caractersticas de
Campylobacter (grises, no pigmentadas y no hemolticas). Las colonias pueden crecer de manera
confluente (esparcidas a lo largo de la lnea de inoculacin) si el medio es fresco o recin
preparado y por tanto con un alto contenido de humedad; o como colonias circulares de bordes
delimitados, cuando el medio ha perdido humedad. A toda colonia sospechosa de Campylobacter
debe realizrsele la prueba de oxidasa por el mtodo de Kovac (la cual debe ser positiva) y un
frotis coloreado con Gram modificado, para observar su morfologa celular caracterstica (bacilos
Gram negativos curvos en forma de alas de gaviota).
Observaciones:
No debe descartarse ninguna placa de la cual se hayan seleccionado colonias sospechosas.
Los medios de cultivo sembrados a partir de los caldos de enriquecimiento se procesan de igual
forma que los medios sembrados directamente de la muestra.
Lectura e Interpretacin de las Combinaciones de TSI-LIA. Conducta a Seguir.
Aunque las combinaciones de TSI-LIA sembradas a partir de los medios de MC, SSA y
XLD tienen como finalidad aislar enteropatgenos de la familia Enterobacteriaceae, debe tenerse
presente que en estos medios pueden crecer tambin P. shigelloides (actualmente clasificada en la
familia Enterobacteriaceae) y las especies de Vibrio y Aeromonas. Por lo tanto, al leer las
combinaciones de TSI-LIA provenientes de estos medios, debe considerarse la posibilidad de que
est presente alguno de estos enteropatgenos, especialmente cuando la prueba de oxidasa
practicada en el AN sembrado a partir de la muestra sea positiva. En el siguiente cuadro se presentan
las combinaciones de TSI-LIA que pueden corresponder a bacterias enteropatgenas y la conducta a
seguir para cada una de ellas.
Reporte de los Resultados
Cultivo Negativo:
90
Si no se aslan enteropatgenos, reportar: No Se Aislaron Bacterias Enteropatgenas

Cultivo Positivo:
Si se asla algn enteropatgeno, reportar: Gnero:
Especie:
Antibiograma:
Grupo
Serolgico:
(si
es
el
caso)
91
Cuadro 16. Combinaciones de TSI-LIA que pueden Corresponder a Bacterias Enteropatgenas

Bisel
Taco
G
as
H2S
Sospechar de:
Conducta a seguir
TSI
LIA
Ac
Alc
Ac
Ac
A. caviae
V. fluvialis
ANP
TSI
LIA
Ac
Alc
Ac
Ac
TSI
LIA
Ac
Alc
Ac
Alc//N
Salmonella Grupo III
Indol+Urea+Citrato+ Motilidad+
Bioq. completa de Enterobacterias+ANP+ANT+ CST+
PSA
TSI
LIA
Ac
Alc
Ac
Alc//N
A. hydrophila
A. veronii biovar sobria
ANP
TSI
LIA
Ac
Alc
Ac
Alc//N
V. cholerae
ANP
TSI
LIA
Alc
Alc
Ac
Ac
Shigella
V. hollisae
Indol+Urea+Citrato+Motilidad+Ornitina +
DC+Manitol+ Acetato de Sodio+ANT+ANP+CST+ PSA
TSI
LIA
Alc
Alc
Ac
Ac
Shigelas productoras de gas

Salmonella Paratyphi A
Indol+Urea+Citrato+Motilidad+Ornitina+
Manitol+Acetato de sodio+ANT+ ANP+ CST+ PSA
TSI
LIA
Alc
Alc
Ac
Alc//N
Salmonelas H2S negativo

Aeromonas
Indol+Urea+ANP
TSI
LIA
Alc
Alc
Ac
Alc/N
Salmonelas productoras
de H2S
Alc
Alc
Ac
Alc/N
P. shigelloides
V. parahaemolyticus
V. mimicus
Aeromonas
ANP
Alc
Alc
Ac
Alc/N
Salmonella Typhi
Indol+Urea+Citrato+Motilidad+Bioq. completa de
Enterobacterias+ANP+ANT+CST+ PSA
TSI
LIA
TSI
LIA
V. furnissii
ANP
Indol+Urea+Citrato+Motilidad+Bioq. completa de
Enterobacterias+ANP+ANT+CST+ PSA
(TSI) agar triple azcar hierro; (LIA) lisina, hierro agar; (Ac) reaccin cida; (Alc) reaccin alcalina; (N) reaccin neutra;
(ANP) agar nutritivo en placa; (ANT) agar nutritivo en tubo; (CST) caldo soya tripticasa; (DC) control de decarboxilacin;
(PSA) pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos.
92
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