travaux

Enseignement Les
pratiques

Le dosage de lure
Mthode enzymatique
Jean-Cyrille Hierso, Edmond Collange et Dominique Lucas
La manipulation de travaux pratiques prsente ici fait partie
de lenseignement de chimie analytique propose en
matrise de sciences et techniques contrle et analyse
chimiques [1] luniversit de Bourgogne. Elle sadresse
des tudiants de second cycle universitaire, pour lesquels la
chimie analytique et lanalyse quantitative de manire
gnrale prendront une place essentielle dans leur projet
professionnel final. Outre un rappel des notions de dosage
direct et dosage en retour et la comparaison de leur
exactitude respective, lintrt pdagogique rside dans
lutilisation de la pHmtrie pour slectionner un indicateur
color adquat qui servira lors du dosage final par
volumtrie. Lintroduction la notion de raction
enzymatique est galement intressante aussi bien du point
de vue scientifique que du point de vue de lhistoire de la
chimie. La manipulation ne prsente pas de difficult
particulire et ne ncessite pas de verrerie ou dquipement
spcifiques. Les conditions de scurit sont les conditions
standards des travaux pratiques de chimie : la manipulation
dacides et de bases impose le port de lunettes de protection
et dune blouse. La dure moyenne du TP est comprise entre
4 et 6 heures mais la rduction de ce temps est possible par
des modifications mineures des protocoles opratoires.
Lure de formule H2NC(=O)NH2 est un solide incolore,
inodore, cristallis en prismes quadratiques, soluble dans
leau ou lthanol et fond 132 C. Elle est prsente chez
lHomme comme le produit azot final majoritaire issu de la
dgradation des acides amins. Cette substance organique
existe normalement dans le sang raison de 0,20
0,50 g.L-1 et dans lurine (environ 2,5 g.L-1). Sa synthse par
voie chimique mene par Wlher en 1828 a montr pour la
premire fois quun constituant organique des tres vivants
pouvait tre obtenu indpendamment de tout principe vital,
une rvolution dans les concepts scientifiques de lpoque.
En tant que substance dchet dans le mtabolisme humain,
son dosage est une indication prcieuse de ltat de sant
dun sujet. Diffrentes mthodes de dosage de lure sont
connues :
(i) la mthode gazomtrique consiste mesurer le volume de
diazote dgag lors de la dcomposition de lure par
lhypobromite de sodium :
3 NaBrO + OC(NH2)2

H 3C

OH

C
O

Principe
Lure tant une base beaucoup trop faible pour tre
directement titrable en solution aqueuse (pKa = 0,3), laction
enzymatique de lurase permet une hydrolyse totale de
lure en carbonate dammonium (figure 1), lequel peut tre
titr par pHmtrie.
NH2

H 3C

24 lactualit chimique - juillet 2002

+ 2 H2 O

2 NH4++ CO32-

NH2
Figure 1 - Hydrolyse de lure.

N
C

H 3C

Au dbut du XIXe sicle, on savait dj que certaines

substances taient capables dacclrer des ractions
chimiques sans tre elles-mmes modifies par la raction.
Ces catalyseurs reconnus, pour la plupart des mtaux tels
que le platine, nul nen avait trouv chez les tres vivants.
Deux chimistes franais, Payen et Persoz, dmontrrent
alors, en 1830, quune substance extraite de lorge
germe est capable dinduire la dgradation de lamidon
dans des conditions compatibles avec la vie une vitesse
largement suprieure celle obtenue classiquement en
prsence dun acide fort plus de 100 C. Ce fut la
premire identification dune enzyme, nomme lpoque
diastase . Les dcouvertes denzymes se multiplirent,
puis on comprit en particulier que chacune dentre elles ne
catalyse, en gnral, quune seule raction chimique. En
consquence, il sagit de catalyseurs trs spcifiques. Les
enzymes sont des macromolcules protiniques constitues
dun enchanement seulement rduit dacides amins.
Cependant, elles permettent des ractions chimiques aussi
complexes que la fermentation ou la digestion. La premire
cristallisation denzyme eut lieu dans les annes 20, et ce fut
la cristallisation de lurase qui prsente deux atomes de
nickel au sein de son site actif [4]. Lurase est produite par
de nombreux tres vivants : bactries, levures ou mme des
organismes plus labors comme des vgtaux et animaux.
Les deux sources dextraction de lurase les plus
rpandues sont le Canavalia ensiformis dit jack bean , une
lgumineuse de la famille des pois, et le Bacillus pasteurii [5].

3 NaBr + CO2 + 2H2O + N2

(ii) les mthodes colorimtriques directes sappuient sur le

fait que lure donne des drivs colors avec des ractifs
tels que le diactyle CH3COCOCH3 ou le diactylmonoxime
CH3COCNOHCH3 :
H 3C

(iii) la mthode enzymatique, dont une utilisation est

propose ici, fait intervenir une enzyme vgtale, lurase (ou
ure amino hydrolase), pour hydrolyser lure en carbonate
dammonium [2-3].

Deux mthodes de dosage sont alors envisageables : (i) le

carbonate dammonium est dos directement par un acide
fort ; (ii) une quantit dtermine dacide fort qui ragit avec
le carbonate dammonium est ajoute en excs, et

Enseignement

dacide fort. Dans le mlange, on a alors

n H3 O+ = n CO2 = 10 -3 mol et n NH4+ = 2.10 -3
mol. Aprs avoir chass le CO2 par bullage
dazote, la solution est dose par une base
forte de concentration 0,1 mol.L-1, suivant les
deux ractions quantitatives prsentes
figure 6.

Figure 2 - pH des couples acido-basiques mis en jeu.

lexcdent est dos en retour par une base forte. La

manipulation consiste, en consquence, tablir la courbe
de pH en fonction du volume, pH = f(), rsultant de
lapplication de chaque mthode. Les tudiants peuvent
alors dduire quelle mthode est la plus prcise, puis choisir
lindicateur color adapt pour, finalement, raliser le dosage
volumtrique dune solution de titre inconnu en ure.

Titrage direct
Considrons le titrage dune solution aqueuse de 25 mL de
carbonate dammonium (NH4)2CO3 de titre 0,04 mol.L-1 par
un acide fort de concentration 0,1 mol.L-1.
Le positionnement sur une chelle de pH des couples
acido-basiques auxquels participent les espces introduites
(figure 2) fait apparatre quil se produit, avant lintroduction
du ractif titrant, une raction acide-base quantitative
conduisant la formation dammoniac et dhydrognocarbonate :
-9,2
10
NH4+ + CO32NH3 + HCO3- K = -----------------10,3 = 13
10
Ltat initial est donc quivalent un mlange quimolaire de
NH4+, NH3 et HCO3- sur lequel laddition de lacide fort
provoque successivement les deux ractions quantitatives
dcrites figure 3.

(1)

(2)

NH3 + H3O

HCO3 + H3O

NH4 + H2O

K1 =

(4)

CO2 + 2 H2O

K2 =

Ka2

Elles sont caractrises par lobtention de volumes

lquivalence que lon peut relier la quantit
dure initialement introduite, soit 25 mL dune solution
0,04 mol.L-1 (figure 4).
25 x 0,04

9,2

= 10
1

H3O+ + OH-

2 H2O

K3=

NH4+ + OH-

H2O + NH3

K4=

Ke
Ka2

Ke

Figure 6.

Ka1

Figure 3.

V(1) =

(3)

Figure 5 - Titrage par lacide chlorhydrique 0,1 mol.L-1 de 25 mL

dure 0,04 mol.L-1 aprs hydrolyse enzymatique.

Les quivalences interviennent V(3) = 10 mL et

V(4) = 30 mL. La courbe de titrage prsente
figure 7 montre que la premire quivalence est
lorigine du saut de pH le plus net.

= 106,3

Par la simple comparaison des deux graphes issus

des titrages, on retient prfrentiellement la
mthode du dosage en retour. Elle permet une
dtermination plus prcise de lquivalence de par
la grande amplitude et le faible talement en
volume du saut de pH obtenu comme terme du dosage.
Lindicateur color le plus adapt apparat tre le rouge de

25 x 0,04
= 10 mL

V(2) = V(1) +

0,1

= 20 mL
0,1

Figure 4.

La courbe de titrage pH = f() obtenue par simulation est

reprsente sur la figure 5.

Titrage en retour
Dans cette partie, on ajoute, aprs hydrolyse enzymatique
de lure, 30 mL dun acide fort de concentration
0,1 mol.L-1, ce qui conduit aux ractions (1) et (2)
prcdemment dcrites et laisse en solution un excs

Figure 7 - Titrage par la soude 0,1 mol.L-1 de 25 mL dure

0,04 mol.L-1 aprs hydrolyse et ajout de 30 mL dacide
chlorhydrique 0,1 mol.L-1.

lactualit chimique - juillet 2002

25

= 1014

= 104,8

Enseignement

mthyle dont la zone de virage de pH comprise entre 4,8 et

6,0 est exactement centre sur le pH quivalent calcul gal
5,4 (le vert de bromocrsol avec une zone de virage de 3,8
5,4 peut galement convenir). Linterception de la courbe
de titrage avec les valeurs de pH 4,8 et 6,0 permet de prvoir
pour le dosage volumtrique avec un indicateur color une
incertitude relative environ gale 1 o/oo alors que, pour le
dosage direct, dans des conditions identiques, on trouve une
valeur dincertitude vingt fois suprieure avec lindicateur
color hlianthine (zone de virage comprise entre 3,2 et 4,4
pour une valeur de pH de 3,9 lquivalence).
En complment, on pourra demander aux tudiants de
calculer, pour chacune des deux mthodes, le pH aux
points remarquables de la courbe pHmtrique (pH initial,
quivalents et final).

Exprience
Matriel et ractifs
Solutions et ractifs fournir aux tudiants
ure solide
solution dure de titre inconnu (compris entre 2,0 et
2,5 g.L-1)
solution durase dans le glycrol 554 units.L-1 (1 unit
libre 1 mole de NH3 par minute pH 7 et 25 C)
alcool octylique
hydroxyde de sodium talon 0,1 mol.L-1
acide chlorhydrique talon 0,1 mol.L-1
indicateurs pH rouge de mthyle et/ou vert de
bromocrsol, hlianthine
Verrerie et matriel pour un tudiant
3 bchers de 100, 150 et 200 mL
1 fiole jauge de 200 mL
2 erlenmeyers de 150 mL avec bouchons de lige
2 barreaux aimants et un agitateur magntique
2 verres de montre
1 sabot de pese
2 pipettes 2 traits de 25 et 30 mL
1 pipette gradue de 1 mL
1 burette gradue de 50 mL
Matriel commun
balance de prcision au mg
pH-mtre ; lectrode de verre et lectrode au calomel
satur
dispositif de barbotage de diazote N2 (bouteille et
distribution)

Dosage direct dune solution dure

de titre connu
Peser, laide dun sabot de pese, exactement la quantit
ncessaire dure dissoudre dans une fiole de 200 mL pour
obtenir une solution environ 0,04 mol.L-1. Pipeter 25 mL de
la solution dure dans un bcher de 150 mL de forme haute,
ajouter 0,5 mL de solution durase. Agiter quelques
secondes laide dun barreau aimant, couvrir dun verre
de montre et laisser ragir 30 min. La temprature doit
avoisiner 20 25 C pour que la raction dhydrolyse
seffectue dans le temps prvu. Le pH du milieu devient
progressivement basique, laction de lurase optimale pH
neutre nest cependant pas entrave jusqu une valeur de

26 lactualit chimique - juillet 2002

pH de 10. La solution rsultante est titre par pHmtrie

laide dune solution dacide chlorhydrique 0,1 mol.L-1
distribue la burette : la courbe de variation de pH en
fonction du volume dacide ajout prsente deux points
dinflexion correspondant 10 et 20 mL de ractif titrant.
Questions poses aux tudiants
1. Reprsenter la courbe pH = f() et lexpliquer. A partir des
volumes quivalents, retrouver la concentration de la
solution talon dure.
2. Pour effectuer ce dosage, peut-on envisager lutilisation
dun indicateur color ?
3. Quelle critique pourrait-on apporter cette mthode de
titrage direct avec indicateur ?
On devra fournir aux tudiants une liste de divers indicateurs
colors avec leur zone de virage.

Dosage en retour dune solution dure

de titre connu
Prparer et hydrolyser un nouvel essai en oprant comme
pour le dosage direct mais dans un bcher large de 200 mL.
Ajouter ensuite exactement 30 mL de la solution dacide
chlorhydrique 0,1 mol.L-1 au mlange hydrolys. Puis agiter
laide dun barreau aimant tout en dgazant la solution de
son CO2 par barbotage de diazote durant 5 min. On aura pris
soin dadditionner pralablement quelques gouttes doctan1-ol pour limiter la formation de mousse. On titre la solution
rsultante par une solution dhydroxyde de sodium
0,1 mol.L-1 distribue la burette. La courbe de variation de
pH en fonction du volume dhydroxyde de sodium ajout
prsente deux points dinflexion correspondant 10 et
30 mL de ractif titrant.
Questions poses aux tudiants
4. Reprsenter et interprter la courbe de dosage, et
retrouver la concentration initiale en ure.
5. Montrer que, dans le cas de ce titrage en retour, il est
possible dutiliser un indicateur color, en proposer un ou
plusieurs.

Application au dosage dune solution dure

de titre inconnu
En utilisant la mthode du dosage en retour, ltudiant
proposera un protocole permettant le dosage volumtrique
laide dun indicateur color de la solution dure de titre
inconnu. Une fois le protocole valid par lenseignant
(conditions dexprimentations semblables aux prcdentes
vide supra), deux essais concordants seront mens : avec
des prises dessais dans des erlenmeyers de 150 mL que le
manipulateur prendra soin de boucher pendant la dure de
lhydrolyse.

Rsultats pour une classe

Erreur constate sur le
Nombre
cart moyen
dosage de linconnue dure dtudiants la valeur relle
< 1 % derreur

1 2 % derreur

2 10 % derreur

1%

Enseignement

Rfrences
[1] Champion E., Blneau S., LAct. Chim., septembre 2001, p. 32.
[2] Fox E.J., Geldard W.J., Ind. Eng. Chem., 1923, 15, p. 743.
[3] Roche M., Desbarres J., Colin C., Jardy A., Bauer D., Chimie des

solutions, Tech & Doc, Lavoisier, Paris, 1990, p. 92.

[4] Ciurli S., Benini S., Rypniewski W.R., Wilson K.S., Miletti S., Mangani S.,
Coord. Chem. Rev., 1999, 190-192, p. 331.
[5] Varner J., The Enzymes, 2nd Ed., Boyer P., Lardy H., Myrback K. (ds.),
Academic Press, NY, 1960, p. 247.

Jean-Cyrille Hierso, Edmond

Collange et Dominique Lucas
sont matres de confrences dans
le Laboratoire de synthse et
lectrosynthse organomtalliqueLSEO*.
J.-C. Hierso

E. Collange

D. Lucas

* UMR-CNRS 5632, Universit de Bourgogne,

6 boulevard Gabriel, 21000 Dijon.
Tl. : 03 80 39 61 07. Fax : 03 80 39 61 00.
E-mails : Jean-Cyrille.Hierso@u-bourgogne.fr
Edmond.Collange@u-bourgogne.fr
Dominique.Lucas@u-bourgogne.fr

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