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PRESENTADO A:
NGELA MARA ESCUDERO R. MD.
FACULTAD DE SALUD
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS FISIOLGICAS
Resumen. En esta prctica realizamos procedimientos experimentales para la determinacin del efecto sobre la actividad
enzimtica en la variacin del pH y la temperatura en la enzima fosfatasa, utilizando el sustrato p-nitro-fenilfosfato (PNFP),
obteniendo la mayor absorbancia para una temperatura de 37 C y pH de 9.6.Adems se utiliz la ley de Beer-Lambert para
establecer la concentracin de una muestra realizando una curva de calibracin con un resultado de 0.11 mM en la muestra
problema.
Palabras clave: Enzimas, fosfatasas, pH, temperatura, tiempo.
INTRODUCCIN
Las fosfatasas son un conjunto de enzimas capaces de
hidrolizar los esteres fosfato de diversos fosfolpidos. Si
son activadas a un nivel de pH inferior a 7 se denominan
fosfatasas cidas mientras que si son activadas a un pH
superior a 7 se denominan fosfatasas alcalinas. Son
enzimas con actividad fosfomonoesterasa que se
encuentra en las membranas celulares de diferentes
rganos, entre ellos, en el hueso, placenta, intestino,
leucocitos y otros [1]. En el proceso de clasificacin de las
fosfatasas se han sealado cuatro diferentes tipos de esta
enzima:
PROCEDIMIENTO
1.
Solucin
Agua
Buffer
pH 9.6
Barbital
PNFP 2.0
nM
Absorba
ncia
Transmit
ancia
blanco
1.5
1.5
1
1.47
1.5
TUBO (mL)
2
3
1.44
1.41
1.5
1.5
4
1.35
1.5
Soluc
in
Probl
ema
--------
0.03
0.06
0.09
0.15
0.25
0.66
1.2
1.27
0.83
0.04
0.08
0.12
0.2
26.6
[1]
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
TUBO (mL)
blanc
o
2.7
Agua
2.4
2.4
2.4
2.4
2.4
2.4
Efecto de la temperatura.
Buffer
0.3 mL
0.3
pH
3.4
pH
8.8
pH
9.2
pH
9.6
pH
10.4
pH
10.8
PNFP
2.0 nM
--------
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
Enzima
FAL
Absorb
ancia
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
---
0.16
5
0.32
1
0.32
8
0.43
8
0.23
9
0.12
5
Solucin
TUBO (mL)
blanco
Agua
2.7
2.4
2.4
2.4
2.4
2.4
Buffer
pH 9.6
PNFP 2.0
nM
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
--------
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
25C
4C
30C
37C
50C
100C
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
---
0.08
0.204
0.279
0.189
0.112
Tempera
tura
Ex.
Enzima
FAL
Absorba
ncia
405nm
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
10
15
pH
Fig 2. Grafica de A vs pH
ABSORBANCIA
Efecto del pH
Se prepararon las soluciones indicadas realizando
preincubacin a cada tubo durante tres minutos
a 37C. Cumplidos los tres minutos con una
diferencia de tiempo de un minuto entre cada
tubo se agreg 0.1 mL de la enzima FAL y se dej
incubando por otros tres minutos, Seguidamente
se anexaron los datos obtenidos en la Tabla 3.
Soluci
n
CONCENTRACIN
ABSORBANCIA
ABSORBANCIA
3.
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
RESULTADOS
Tomando los valores obtenidos para la curva de
calibracin del p-nitrofenol (Tab. 1) y la ec. 1. se obtienen
los siguientes valores para la concentracin:
0,25
0,2
0,15
BLANCO
0,1
0,05
50
100
TEMPERATURA
Fig 1. Grafica de A Vs Temperatura
150
CONCENTRACIN
ABSORBANCIA
0.04
0.25
0.08
0.66
0.12
1.2
0.2
1.27
pH
BLANCO
0,3
0,165
3,4
0,321
8,8
0,328
9,2
0,438
9,6
0,239
10,4
0,125
10,8
BLANCO
ABSORBANCIA
TEMPERATURA
25
0,08
0,204
30
0,279
37
0,189
50
0,112
100
DISCUSIN DE RESULTADOS
Los resultados de la prctica experimental pese a que
fueron precisos, son susceptibles a errores; esto se debe
principalmente a errores humanos, dados por un inexperto
manejo de los equipos y mala calibracin de los mismos
por parte de los estudiantes, posibles fallas en el
espectrofotmetro debido a su tiempo de uso, posibles
errores debido a la prdida de calor al llevar el tubo del
bao de mara al instrumento y la falta de control sobre el
tiempo que pasaron las soluciones expuestas al calor. No
obstante, la prctica fue considerada como satisfactoria, ya
que permiti relacionar el pH y la temperatura con la
actividad de la fosfatasa alcalina, as como relacionarlo
con su efecto en el cuerpo humano.
En el cuerpo humano, la fosfatasa alcalina est presente
principalmente en las membranas plasmticas de
osteoblastos, clulas del hgado, rin, bazo y placenta y
su papel principal est asociado a la desfosforilacin de
nucletidos y protenas. Mediante la prctica experimental
su pudo determinar que la temperatura ptima para la
fosfatasa alcalina corresponde a 37 C, lo que en el
organismo del hombre se considera la temperatura normal.
Cuando dicha temperatura aumenta los niveles de esta
enzima aumentan y con ello su actividad, lo que a largo
plazo puede indicar infeccin de la va biliar, neoplasia
heptica, tuberculosis miliar, linfoma, hipernefroma,
mononucleosis o citomagalovirus.
El pH ptimo para la fosfatasa alcalina es de 9.6, ya que es
el punto donde existe la mayor absorbancia esto debido a
que la enzima funciona mejor en medios alcalinos, esto se
debe a la influencia del pH en el estado de ionizacin de
los grupos funcionales en la molcula de enzima y el
sustrato. El pH tiene una relacin intrnseca con el lugar
donde se encuentra la fosfatasa alcalina en el cuerpo ya
que como su nombre lo dice acta en un medio alcalino
(pH ptimo 8,6 a 9,1), est normalmente presente en la
sangre y los tejidos con cantidades ms altas de FA
abarcan el hgado, las vas biliares y los huesos.
REFERENCIAS
[1] J. Diaz, Portillo. M.T, Fernandez del barrio. F. P,
Salido.Aspectos bsicos de bioqumica clnica. Madrid
Estaa. 1997.
[2] Solrzano Martha. Prcticas de laboratorio
Metabolismo. Universidad del Valle. Facultad de salud.
Departamento de Ciencias fisiolgicas. Cali, 2016.
[3] Lehninger,A. Principios de bioquimica- Enzimas.
Ediciones Omega, S.L., 2014